PARTI Ⅱ: Prekondizzjonament U Postkondizzjonament ta' Metformin Biex Tnaqqas il-Ħsara ta' Riperfużjoni ta' Lskemija f'Mudell ta' Perfużjoni ta' Magni Normotermiku tal-Kliewi tal-Firien u Ħnieżer Ex Vivo Lsolated
Mar 26, 2022
Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tobias M.Huink,Leonie H.Venemal,Rene A.Posma,Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl,& et al.
INTRODUZZJONI
It-trapjant tal-kliewi huwa t-trattament magħżul għal pazjenti b'mard tal-kliewi fl-aħħar stadju. Sfortunatament, id-domanda hija ogħla mid-disponibbiltà ta’ organi.2 Dan in-nuqqas irriżulta f’użu akbar ta’ organi ta’ kwalità subottimali minn donazzjoni wara donaturi ta’ mewt ċirkolatorja (DCD).5 Il-kliewi minn donaturi ta’ DCD huma aktar suxxettibbli għal ħsara ta’ iskemija-riperfużjoni (IRl), li hija marbuta ma 'inċidenzi ogħla b'mod sinifikanti ta' funzjoni tat-tilqim ittardjat, li jaffettwaw kemm ir-riżultat għal żmien qasir kif ukoll fit-tul.45 IRI hija kkawżata mill-indeboliment tal-fluss tad-demm u r-riossiġenazzjoni sussegwenti, li tirriżulta fil-ġenerazzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS), tibda kaskata ta 'risponsi ċellulari detrimentali.67 Is-severità ta' iskemija tikkorrelata b'mod qawwi ma 'falliment bikri tat-trapjant tal-kliewi wara trapjant tal-kliewi u tikkontribwixxi għal żieda fil-morbidità. Għalhekk, iskemija sħuna (W) waqt l-irkupru u l-impjantazzjoni tal-organi, u l-ħin iskemiku kiesaħ waqt il-preservazzjoni, rispettivament, għandhom jinżammu għall-minimu. L-istrateġiji tal-perfużjoni tal-magni jistgħu jkollhom rwol ċentrali fit-tnaqqis tal-IRI billi jfornu l-ossiġnu matul il-fażijiet iskemiċi fid-donazzjoni tal-organi. Barra minn hekk, jipprovdi pjattaforma biex iżżid aġenti protettivi possibbli qabel ir-riperfużjoni (prekondizzjonament) jew waqt ir-riperfużjoni (wara l-kondizzjonament) u huwa metodu adattat biex jiġu vvalutati l-funzjoni renali u l-korriment għal żmien qasir.9-11
Il-biguanidemetforminahija l-iktar mediċina orali kontra l-ipergliċemija użata biex tikkura pazjenti bid-dijabete tat-tip 2. Il-mekkaniżmu ta 'azzjoni u l-effetti plejotropiċi ta'metforminaprimarjament jirriżulta mill-inibizzjoni tal-kumpless 1 fil-katina respiratorja mitokondrijali.12-14 Għalhekk,metforminajista' jnaqqas l-IRI lil hinn mill-azzjonijiet tiegħu li jbaxxu l-glukożju u ġie propost bħala aġent protettiv tal-organi waqt iċ-ċirkostanzi li fihom iseħħ l-IRI, bħal trapjant.15,16.
L-għan ta 'dan l-istudju kien li jevalwa l-effetti ta' benefiċċju potenzjali ta 'prekondizzjonament u postkondizzjonament ma'metforminafuq IRI f'żewġ mudelli differenti iżolati ex vivo tal-perfużjoni normotermika tal-magni (NMP) li jużaw kliewi tal-firien u tal-ħnieżer.
WEISS IL-KLIEW:CISTANCHE HERB DRAGON
METODI
Studju tal-firien
Annimali.Intużaw firien Lewis maskili li jiżnu 270-300 g (Harlan Laboratories, Boxmeer, l-Olanda). Il-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università ta 'Groningen approva l-protokoll ta' studju (DEC6708C). L-annimali rċevew kura skont il-Liġi Olandiża dwar Esperimenti tal-Annimali, wara l-Prinċipji tal-Kura tal-Annimali tal-Laboratorju tal-Istitut Nazzjonali tas-Saħħa.
Disinn sperimentali, irkupru ta 'organi, u preservazzjoni.Total ta' 31 firien ġew maqsuma f'6 gruppi (n=5-6 kull grupp; Figura 1). Fil-gruppi kollha, 15-il minuta ta' W u 24 siegħa ta' preservazzjoni kiesħa ntużaw biex jinduċu korriment iskemiku. Il-prekondizzjonament sar billi ngħata 300 mg/kgmetformina(1,1-dimethylbiguanide hydrochloride; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) maħlul fil-melħ (0.9 fil-mija NaCl) jew salin waħdu permezz ta 'gavage orali 12 u sagħtejn qabel nefrectomy. Salina, 30 mg/Lmetforminajew 300 mg/Lmetforminaġie miżjud mal-perfusate bħala aġent ta' wara l-kondizzjonament. Intgħażlet il-konċentrazzjoni ta' 300 mg/kg piż tal-ġisem, peress li din id-doża rriżultat fis-serummetforminakonċentrazzjonijiet li jikkorrispondu għal dawk misjuba fil-bnedmin waqt il-manutenzjonimetforminaterapija.17
L-akkwist tal-kliewi sar b'bidliet żgħar fil-proċedura DCD, kif deskritt qabel.18 Fil-qosor, il-firien ġew anestetizzati b'2-5 fil-mija isoflurane u l-laparotomija saret permezz ta 'inċiżjoni tal-linja tan-nofs. L-antikoagulazzjoni, bl-użu ta' 500 IU eparina (Leo Pharma, Ballerup, id-Danimarka), ingħatat permezz tal-vina dorsali tal-pene. Wara 15-il minuta ta 'WI, saret nefrectomija tal-kliewi tax-xellug. L-arterja renali u l-ureter kienu kkanulati. Il-kliewi tlaħlaħ in situ b'10 mL salina (37 grad) u 5 mL 4 grad Soluzzjoni ta 'Ħażna kiesħa tal-Università ta' Wisconsin (UW) (Bridge to Life, Columbia, SC). Ladarba tneħħew, il-kliewi ġew mlaħalħa b'5 mL UW għal darb'oħra u maħżuna f'UW għal 24 siegħa f'4 gradi.
Perfużjoni tal-magna normotermika.Il-metodu NMP tal-firien ġie deskritt b'mod estensiv qabel.18 Fil-qosor, NMP sar għal 90 minuta bl-użu ta' pompa tar-rombli (Ismatec ISM404, Zürich, l-Isvizzera). Il-pressjoni tal-perfużjoni kienet issettjata għal 102 mmHg, ikkontrollata fl-arterja renali. Fil-grupp ta 'kontroll, il-fluwidu tal-perfużjoni kien jikkonsisti f'100 mL William's Medium E supplimentat b'30 mmol/L HEPES, 50 g/L albumina, u 7 mmol/L krejatinina (kollha Sigma-Aldrich). Fil-gruppi sperimentali, jew 30 jew 300 mg/Lmetforminaġie miżjud mal-perfusate. Il-fluwidu tal-perfużjoni kien ossiġenat b'95 fil-mija ossiġnu u 5 fil-mija dijossidu tal-karbonju bi fluss ta' 0.5 L/ min. It-temperatura tal-fluwidu tal-perfużjoni nżammet f'37 grad bl-użu ta 'banju ta' l-ilma u skambjatur tas-sħana (Julabo, Seelbach, il-Ġermanja). Il-fluss ġie rreġistrat kull 10 minuti, bl-użu ta 'sensor tal-fluss kalibrat (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Wara l-NMP, il-bijopsiji tal-kliewi ġew mgħaddsa immedjatament f'4 fil-mija formaldehyde jew iffriżati snap fin-nitroġenu likwidu u sussegwentement maħżuna f'-80 grad.
Figura 1Rappreżentazzjoni skematika tal-gruppi sperimentali. Gruppi fihom 5-7 kliewi. HMP, perfużjoni tal-magna ipotermika; NMP, perfużjoni tal-magna normotermika; WIT, ħin iskemija sħun.
Studju tal-ħnieżer
Annimali.Il-kliewi minn ħnieżer nisa Landrace Olandiżi nġabru minn biċċerija. L-annimali ġew storduti u ssangwiti skont proċeduri standard lokali. Waqt it-tisfija, madwar 1 L ta' demm inġabar f'kontenitur li kien fih 25,000 IU eparina mhux frazzjonata (Leo Pharma). Minħabba li ntuża materjal ta' skart tal-biċċerija, ma kienet meħtieġa l-ebda approvazzjoni tal-kumitat tal-etika tal-annimali.
Disinn sperimentali, irkupru ta 'organi, u preservazzjoni.Biex tinduċi korriment iskemiku, intużaw 30 minuta ta 'WI. Wara dan il-perjodu, il-kliewi tlaħlaħ b'180 mL salina f'4 gradi. Immedjatament wara l-flushing, ittieħdet bijopsija kortikali (Invivo, Best, The Netherlands) u nħażen f'4 fil-mija buffered formaldehyde. Biex takkomoda t-trasport mill-biċċerija għal-laboratorju u bħala teknika ta’ preservazzjoni, l-arterja tal-kliewi ġiet ikkanulata u l-kliewi ġew imwaħħla ma’ setup ta’ perfużjoni ta’ magna ipotermika kkontrollata bi pressjoni pulsatile (HMP) (Kidney Assist Transport; Organ Assist, Groningen, l-Olanda ). Il-kliewi kienu mxerrda f'4 gradi bl-użu ta' 500 mL UW Machine Perfusion Solution għal 3 sigħat (Bridge to Life, Londra, UK) biż-żieda ta' 2 mg jew mingħajrhametformina, bi pressjoni arterjali medja ta' 25 mmHg. L-ossiġenu (100 fil-mija) ġie fornut lill-ossiġenatur (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, il-Ġermanja) b'rata ta 'fluss fissa ta' 0.1 L/min.
Perfużjoni tal-magna normotermika.Il-kliewi ġew riperfużi bl-użu ta' setup NMP ex vivo għal 4 sigħat li kien deskritt qabel. Fl-istudju tagħna, żieda fid-dożi tametforminajew salina ġew miżjuda bl-użu ta 'pompa ta' infużjoni. Fil-qosor, wara l-HMP, l-arterja tal-kliewi kienet kannulata u mlaħalħa. L-ureter ġie kkanulat għall-ġbir ta 'l-awrina. Wara, il-kliewi ġiet miżuna, u ttieħdet bijopsija u maħżuna f'4 fil-mija ta' formaldehyde buffered għal aktar analiżi. Sussegwentement, il-kliewi tqiegħdu f'ċirkwit NMP ikkontrollat bi pressjoni ex vivo. NMP sar b'500 mL lewkoċiti eżawriti, (BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Ġermanja) awtologu, ossiġenat (karboġenu, fluss 0.5L/min) demm għal 4 sigħat fi pressjoni arterjali medja ta' 80 mmHg. Komposti oħra miżjuda mal-fluwidu tal-perfużjoni huma pprovduti fit-Tabella S1. Fil-grupp sperimentali,metforminamaħlul fis-soluzzjoni tal-laktat ta' Ringer (20 mg/mL; Baxter, Utrecht, l-Olanda) ġie infuż bl-użu ta' pompa tal-infużjoni kkontrollata minn softwer magħmul apposta li fih setgħu jiġu definiti profili tal-infużjoni (Alaris; CareFusion, Rolle, l-Isvizzera). Kull 30 minuta waqt NMP , il-veloċità tal-infużjoni żdiedet skont skeda speċifikata minn qabel (Tabella S2). Din l-iskeda kienet ibbażata fuq dejta farmakokinetika umana li tindika limetforminait-tneħħija tal-krejatinina hija erba’ darbiet ogħla mit-tneħħija tal-krejatinina.19 Fil-grupp ta’ kontroll, il-kliewi kienu mxerrda mingħajr iż-żieda ta’metformina. Għal kull esperiment, il-fluss ġie rreġistrat bl-użu tas-sonda tal-fluss clampon (ME7PXL; Transonic Systems), li kienet imwaħħla mat-tubi qrib l-arterja renali. Din is-sonda tal-fluss ġiet ikkalibrata għat-tubi użati. Kull 15-il minuta matul NMP, l-awrina kienet miġbura u sostitwita b'volum korrispondenti ta 'soluzzjoni ta' lactate ta 'Ringer, li kien irreġistrat ukoll. It-temperatura tal-fluwidu tal-perfużjoni nżammet f'37 grad bl-użu ta 'heat exchanger integrat, imqabbad ma' banju ta 'l-ilma (Julabo). Ittieħdu kampjuni tad-demm u l-awrina wara 15 u 60 minuta u kull siegħa ta' wara għal analiżi bijokimiċi. Meta l-NMP kien lest, bijopsiji ttieħdu u maħżuna f'4 fil-mija buffered formaldehyde, jew snap-frozen u maħżuna fi grad-80 għal aktar analiżi.
ITEJBU SUPPLIMENT TA' CISTANCHE FUNZJONI TAL-KLIEI
Iż-żewġ studji
Analiżi bijokimiċi.Kampjuni ta' perfusat u awrina ġew ċentrifugati (1,300 g għal 10 minuti fil-mudell tal-far u 1,000 g għal 12-il minuta fil-mudell tal-ħnieżer, rispettivament, it-tnejn f'4 gradi ) u s-supernatant inħażen f'{{7} } grad . Lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (ASAT), u creatinine ġew determinati f'perfusate, u kreatinina fl-awrina, rispettivament, miċ-Ċentru tal-Laboratorju taċ-Ċentru Mediku tal-Università ta 'Groningen bl-użu ta' analiżi bijokimiċi standard. L-ammont ta 'proteina eliminata fl-awrina tal-firien tkejjel bl-użu ta' Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), filwaqt li l-konċentrazzjoni totali ta 'proteini fl-awrina tal-ħnieżer tkejjel bl-użu ta' analiżi bijokimiċi standard fiċ-Ċentru tal-Laboratorju.
Reazzjoni kwantitattiva fil-katina tal-polimerażi f'ħin reali.Realtime polymerase chain reaction (PCR) twettqet skond proċeduri standard fuq is-sistema Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR, kif deskritt qabel. kodifikazzjoni għal ET-1); endothelial nitric oxide synthase (eNOS); u fattur 2 bħal Krüppel (KLF{-2), attivazzjoni endoteljali (fattur Von Willebrand (wWF); molekula ta' adeżjoni taċ-ċelluli vaskulari 1 (VCAM) -1) u IL-6), u l-proteina ta' xokk tas-sħana 70(HSP-70) saret b'settijiet ta' primers elenkati fit-Tabella S3. Fil-qosor, RNA totali ġie estratt minn sezzjonijiet tal-kliewi bl-użu TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Is-cDNA miksub mill-firien intuża bħala referenza interna waqt il-PCR biex tiġi ttestjata l-effiċjenza tal-primer. L-espressjoni tal-ġeni ġiet normalizzata bil-medja tal-kontenut tal-mRNA -actin. Ir-riżultati ġew espressi bħala 2- △ACT, fejn il-valur CT jirrappreżenta d-differenza bejn il-valuri tal-limitu taċ-ċiklu.
Figura 2Parametri tal-perfużjoni u tal-funzjoni tal-kliewi evalwati waqt u wara perfużjoni tal-magni normotermika tal-kliewi tal-firien u tal-ħnieżer. It-tneħħija totali tal-krejatinina mill-kliewi tal-firien (a) u tal-ħnieżer (b). Produzzjoni totali tal-awrina (c, d) u proteina totali eliminata fl-awrina (e, f) tal-kliewi tal-firien u tal-ħnieżer, rispettivament. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± żball standard tal-medja. Gruppi fihom 5-7 kliewi. *P < 0.05="" u="" **p=""><>
Punteġġ morfoloġiku.Bijopsiji maħżuna f'4 fil-mija ta 'formaldehyde ġew inkorporati fil-paraffin u nqatgħu f'biċċiet ta' 4 μm. Coupes sussegwentement ġew imtebbgħin bl-aċidu perjodiku Schiff u skurjati fuq nekrożi taċ-ċelluli tubulari prossimali (li tvarja minn ħafifa għal severa: 1-5), edema (li tvarja minn ħafifa għal severa:1-4), u vakuolazzjoni taċ-ċelluli tubulari prossimali ( li jvarjaw minn ħafif għal sever: 1-4).21 Il-valutazzjoni istopatoloġika saret blinded minn żewġ riċerkaturi. Patologu kliniku indipendenti b'esperjenza estensiva fil-valutazzjoni ta' sinjali istopatoloġiċi ta' korriment wara perfużjoni bil-magni ta' organi tal-firien u tal-ħnieżer ivvalida l-punteġġi.
Kalkoli.Ir-reżistenza vaskulari intrarenali (IVR) ġiet ikkalkulata billi l-pressjoni arterjali medja tiġi diviża bil-fluss (espress f'mmHg/mL min). It-tneħħija tal-krejatinina ġiet ikkalkulata biex tiġi stmata r-rata ta' filtrazzjoni glomerulari bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:[kreatinina fl-awrina]* fluss tal-awrina/[kreatinina fil-perfusate].
Analiżi statistika.Id-dejta kollha hija espressa bħala l-medja ± żball standard tal-medja. Meta tqabbel żewġ gruppi f'punt ta 'żmien wieħed, id-differenzi ġew evalwati bl-użu tat-test t ta' Student mhux imqabbad. Id-differenzi għall-produzzjoni totali tal-awrina, il-punteġġi morfoloġiċi, u l-espressjoni tal-ġeni ġew ittestjati bl-użu tal-analiżi tal-varjanza. It-testijiet statistiċi kollha huma b'żewġ denbu u P Inqas minn jew ugwali għal 0.05 tqieset statistikament sinifikanti. L-Istatistika tal-SPSS verżjoni 23(IBM, Armonk, NY) intużat għall-analiżi kollha. L-erja taħt il-kurva (AUC) ġiet ikkalkulata skont ir-regola trapezojde, u ntużat biex tqarreb it-tneħħija totali tal-krejatinina, l-ammont totali ta 'proteina eliminata fl-awrina, u l-livelli totali ta' ASAT u LDH fil-perfusate.
Nota: Il-ċistanche tal-ħaxix mediċinali tradizzjonali Ċiniża (magħrufa wkoll bħala l-"ħaxix tad-dragun" u "ġinseng tad-deżert"), tikber biss fid-deżerti niexfa u sħan. Bħala waħda mid-disa 'ħwawar immortali, Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/desertliving cistanche/cistanche salsa) kontenut b'ingredjenti effettivi sinjuri bħal echinacoside, acteoside, glikosidi feniletanojdi totali, flavonoids, polysaccharides, eċċ. Dawn l-ingredjenti effettivi għamlu cistanche prezzjuż. ħaxix nutrittiv u materjal ta 'l-ikel għall-immunità tan-nies, organi interni, u ċelluli tal-moħħ u newroni, eċċ. L-istudji farmakoloġiċi moderni kkonfermaw l-effetti li ġejjin ta' cistanche (benefiċċji ta 'cistanche): itejbu l-immunità; ittejjeb il-funzjoni sesswali u l-funzjoni tal-kliewi; kontra l-għeja; kontra t-tixjiħ; ittejjeb il-memorja; kontra l-marda ta' Parkinson; marda ta' kontra l-Alzheimer; antiossidazzjoni; faċilità-stitikezza; anti-infjammatorji; jippromwovu t-tkabbir tal-għadam, jbajdu l-ġilda; jipproteġi l-fwied; eċċ.
