Parti 5: L-immappjar tal-Interazzjoni Epiġenomika U Traskriptomika Waqt il-Formazzjoni tal-Memorja U t-Tifkira fl-Ensem tal-Engram Hippocampal

ali.ma@wecistanche.com

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 6

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 5

Dejta Estiża Fig. 2: DARs stabbli huma prinċipalment arrikkit għal marki li jtejbu

(a) Fluss tax-xogħol għad-dissezzjoni taċ-ċitometrija tal-fluss tal-popolazzjonijiet newronali differenti mill-ippokampus, matulmemorjaformazzjoni u rkupru. Plottijiet FACS rappreżentattivi li juru l-espressjoni tal-popolazzjoni kollha (pannell tax-xellug). Saret aktar għażla fuq nuklei singoli u NeuN plus /DAPI plus popolazzjoni (panel tan-nofs). Fl-aħħar, l-għażla saret fuq is-sotto-popolazzjoni gated; GFP plus (aġġustat għal ~ 2.5 fil-mija miċ-ċelloli kollha), ARC plus /GFP plus (~0.15 fil-mija miċ-ċelloli kollha), u nuklei ġew magħżula għal tubi Eppendorf ta '1.5 ml miksija b'200ul ta' 1 fil-mija PBS.

Ikklikkja biexTrab tal-estratt ta 'Cistanche itejjeb il-memorja

(b) Dijagramma Venn (xellug) u tabella (lemin), juru l-koinċidenza bejn id-DARs identifikati fil-paraguni differenti f'pari matulmemorjaformazzjoni u recall.

(c) Twettqet analiżi statistika bbażata fuq kampjunar mill-ġdid biex tiddetermina jekk l-arrikkimenti tal-istati tal-kromatina fuq l-emissjonijiet tal-ChromHMM (osservati) humiex statistikament sinifikanti. L-arrikkiment mistenni ġie kkalkulat billi wettqu 10,000 settijiet randomised ta' sovrapposizzjonijiet (permutazzjonijiet) bejn 'siti kollha aċċessibbli' u 'siti kollha ta' modifiki tal-histone (jiġifieri l-emissjonijiet kollha)' loci u ppreżentati bħala istogramma f' il-figura. Daqs tal-kampjun ta 'kull sett randomised ġie determinat mid-daqs ta' DARs minn kull stat. Il-medja u d-devjazzjoni standard tal-kampjun ġiet ikkalkulata (Tabella Supplimentari 3). In-numru ta' sovrapożizzjonijiet osservati bejn id-DARs u kull emissjoni ġie kkalkulat u ppreżentat bħala linji. z-score kien ikkalkulat bħala mhux maħdum; Z=(valuri osservati (X) – medja tal-kampjun (μ))/(devjazzjoni standard tal-kampjun (σ)). z-score Basal vs Kmieni; SE 10.5, WE 6.9. Stabbli; SE 16.9, WE 12.7, kollha p < 0.0001,="" z-score="" kmieni="" vs="" tard;="" sp="" 91.7,="" wp="" 38.7.="" tard="" vs="" riattivat;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" kollha=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) Il-pie chart turi l-perċentwal ta 'stati ta' enhancer differenti, għar-reġjuni stabbli kollha. Il-koinċidenza ta 'kull reġjun stabbli twettqet b'dejta H3K4me1 u H3K27ac ChIP-seq ippubblikata qabel, miksuba 1h wara FS21. L-istati li jsaħħu ġew ikklassifikati bħala 'ipprajmata' - jikkoinċidu ma' reġjuni mmarkati b'H3K4me1 biss, 'attivi' - b'H3K4me1/ H3K27ac jew 'moħbi' - l-ebda sovrappożizzjoni.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5kb minn TSS). Id-daqs taċ-ċirku jindika l-persentaġġ ta' arrikkiment (1-50 fil-mija). Il-kulur jindika –log (valur P).

Dejta Estiża Fig. 3: Priming koordinat tal-istat epiġenetiku matulmemorjakodifikazzjoni u

(a) Il-proprjetajiet tal-interazzjonijiet misjuba f'Chicago f'kull fażi (Bażali, Attivat - kmieni, Attivat - tard, u Riattivat). Settings default u limitu ta 'punteġġ ta' 5 intużaw f'sejħa ta 'interazzjoni sinifikanti, imwettqa b'mod konġunt fuq ir-repliki kollha.

(b) Pie chart tirrappreżenta l-perċentwal tal-interazzjonijiet kollha misjuba f'Chicago li huma demarkati jew minn H3K27ac/H3K4me1 (67.5 fil-mija tal-marki li jtejbu), H3K4me3/H3K9ac (46.2 fil-mija tal-promoturi tal-marka), jew minn H3K27me3 (1.1 fil-mija tal-marki repressivi).

(c) Immaġini tal-brawżer tal-epigenoma WashU, li tinkludi ~ reġjun ta '500 Kb madwar il-ġeni Eif4e2. L-arki juru aġenti sinifikanti komuni (rettangolu aħmar) u uniċi (vleġġjati) li jinteraġixxu ma 'promoturi (rettangolu blu).

(d) Eżempji ta' interazzjonijiet imsejħa minn Chicago. Plots li juru l-għadd kollu tal-qari minn bait-other-end (enhancer), fi żmien 500–70{0 kb (upstream u downstream) tal-Grink3 u promoturi Wwc2. Interazzjonijiet sinifikanti misjuba minn Chicago (punteġġ akbar minn jew ugwali għal 5) huma murija bl-aħmar, u interazzjonijiet taħt il-limitu (3 Inqas minn jew ugwali għal punteġġ < 5)="" huma="" murija="" bil-blu.="" linji="" griżi="" juru="" għadd="" mistenni="" u="" linji="" dashed="" il-limitu="" ta="" 'fuq="" tal-intervalli="" ta'="" kunfidenza="" ta="" '95="" fil-mija.="" (e)="" analiżi="" ta'="" arrikkiment="" ta'="" koinċidenza="" bejn="" sustanzi="" li="" jsaħħu="" u="" dars="" li="" jinteraġixxu,="" bl-użu="" ta'="" proċedura="" ta'="" permutazzjoni="" fuq="" 10,000="" settijiet="" randomised="" ta'="" siti="" aċċessibbli.="" l-istogramma="" tippreżenta="" distribuzzjoni="" ta'="" kampjuni="" każwali="" ta'="" siti="" aċċessibbli="" għal="" kull="" kundizzjoni="" (bażali="" vs="" attivat="" -="" kmieni,="" attivat="" -="" kmieni="" vs="" attivat="" -="" tard,="" attivat="" -="" tard="" vs.="" riattivat,="" stabbli).="" in-numru="" ta="" 'loċi="" sovrapposti="" huwa="" ppreżentat="" f'linji="" kkuluriti="" minn="" newroni="" bażali,="" attivati="" ​​-="" kmieni,="" attivati="" ​​-="" tard="" u="" riattivati.="" dars="" ta'="" bas="" vs="" attivat="" -early="" (punteġġ="" z;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 10.9).="" dars="" ta'="" attivat="" -early="" vs="" attivat="" -tard="" (z-score;="" -0.1,="" -0.8,="" -2.4,="" -3.2).="" dars="" ta="" 'attivat="" -tard="" vs="" riattivat="" (0.4,="" 1.8,="" 0.4,="" -0.2).="" dars="" ta="" 'stabbli="" (punteġġ="" z;="" 1.7,="" 2.0,="" 6.5,="">

Dejta Estiża Fig. 4: Bidliet fil-kromatina li jseħħu matul il-fażi bikrija tippermetti

(a) Analiżi ta' koinċidenza bejn l-ismijiet tal-ġeni mill-analiżi differenzjali bil-pari u data ppubblikata qabel ta' i) ċelluli tal-granuli DG attivati ​​1 siegħa wara espożizzjoni ġdida32 ii) 24 siegħa wara FS20 u iii) wara stimulazzjoni fit-tul (6h) ta 'kortikali kkultivati ​​ġurdien newroni b'KCl33. L-analiżi twettqet mill-pakkett GeneOverlap R.

(b) Qari eżonika (aħmar) u introniku (blu) ġew ikkwantifikati separatament fil-kundizzjonijiet kollha u mqabbla ma 'attività traskrizzjoni kif imkejla minn DEseq2. Qari kienu normalizzati (RPKM) u l-bidliet log2FC huma ppreżentati għal kull stat. plot tal-vjolin jindika l-medja,

firxa interkwartili, u l-minimu u massimu, ANOVA one-way (parametriku, mhux paired), Basal vs Kmieni; F (5, 248)=389.9. Kmieni vs Tard; F (5, 2374)=2183. Tard vs Riattivat. F (5, 1357) {{10}}.5, Ps kollha < 0.0001.="" il-paraguni="" multipli="" ta’="" bonferroni.="" ns="mhux" sinifikanti,="" ***p=""><>

(c) Il-proporzjonijiet Exon/Intron ġew imkejla f'kull cluster fil-kundizzjonijiet kollha (skala Log2FC). plott tal-vjolin jindika l-medja, il-firxa interkwartili u l-ANOVA minima u massima, one-way (parametrika, mhux imqabbla), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Analiżi ta' sovrapożizzjoni bejn DARs u DEGs matul differentimemorjafażijiet. Id-DARs fuq ir-reġjuni Intergenic u introns ġew immappjati mal-ġeni rispettivi tagħhom bil-mapep tal-interazzjoni pc-HiC. Analiżi ta 'koinċidenza twettqet mill-pakkett GeneOverlap R. Il-valur P (numri) u l-odds ratio (kulur) mit-test eżatt ta' Fisher huma ppreżentati fil-mappa tas-sħana. ns – mhux sinifikanti.

(e) Korrelazzjoni ta' Pearson bejn il-valuri log2FC ta'DARs u log2FC DEGs li ġew annotati għal dak ir-reġjun (ir-reġjuni interġeniċi ġew immappjati permezz tas-sett tad-dejta pc-HiC). Bidliet fl-aċċessibbiltà tal-kromatina tqabblu ma' qari eżonika parsed (linja ħamra), qari introniċi (linji blu), u bidliet traskrizzjonijiet totali (kemm qari intrronic kif ukoll exonic) kif imkejla minn Desq2 (linja griża). Il-valuri r u p kollha huma rrappurtati fit-tabella supplimentari 9.

Dejta Estiża Fig. 5: Bidliet traskrizzjonali fin-newroni attivati-tard korrelatati ogħla

(a) Qari eżonika (aħmar) u intronika (blu) ġew ikkwantifikati separatament fil-kundizzjonijiet kollha għal kull wieħed mill-clusters identifikati f'Fig 5B. Qari kienu normalizzati (RPKM) u l-bidliet log2FC huma ppreżentati għal kull cluster.

(b) Il-proporzjonijiet exon/intron ġew imkejla f'kull cluster fil-kundizzjonijiet kollha. Plott tal-vjolin jindika l-medja, il-medda interkwartili u l-minimu u massimu, n=3 kampjuni bijoloġikament indipendenti ANOVA f'direzzjoni waħda (parametrika, mhux imqabbda), Dw – Raggruppament tard; F (3, 968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Estiża Data Fig. 6: Distinti temporalment traskrizzjoni programmi huma qed sinkronizzat biex

b'mod dipendenti fil-preżenza ta' tamoxifen. Fil-pannell tal-lemin, immaġini rappreżentattivi tal-IHC tad-DĠ. Aħdar – AAV-eYFP, Aħmar – Ark endoġenu. Il-bar tal-iskala tirrappreżenta 50 μm.

(b) Valutazzjoni tal-morfoloġija tal-ispina matul differentimemorjafażijiet. Il-pannell tal-lemin juri eYFP wieħed flimkien ma 'xaft dendritiku b'tipi differenti ta' xewka (Stubby, Thin, Mushroom, Enlarged faqqiegħ). Il-bar tal-iskala tirrappreżenta 5 μm. boxplot jindika l-medja, il-firxa interkwartili u l-minimu u massimu, Attivat - kmieni: n=4 ġrieden /5 sezzjoni għal kull annimal, Attivat -tard: n=4 ġrieden /4 sezzjoni għal kull annimal, Riattivat: n=4 ġrieden /2 sezzjoni għal kull annimal. ANOVA f'direzzjoni waħda (parametrika, mhux paired), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Irqiq; F (2, 36)=35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) Immaġini IHC rappreżentattivi u kwantifikazzjoni tal-livelli ta' proteina ta' żewġ membri tal-familja EIF; (xellug) Eif2a u (lemin) Eif3e. Il-bar tal-iskala tirrappreżenta 10 μm. Id-dejta għax-xaft dendritiku hija ppreżentata bħala proporzjon bejn in-numru u t-tul (μM). n=4 ġrieden /5 sezzjoni għal kull annimal, boxplot jindika l-medja, il-firxa interkwartili u l-ANOVA minima u massima, one-way (parametrika, mhux paired) bit-test ta 'paraguni multipli ta' Bonferroni, ns - mhux sinifikanti, Eif2a Shaft; F (2, 20)=4.484, P{=0.0246. Soma; F (2, 21)=19.58, P < 0.0001.="" (attivat="" -bikrija="" vs.="" attivat="" -tard="" *p="0.0142," attivat="" -kmieni="" vs.="" riattivat="" *p="">< 0.0001,="" attivat="" -tard="" vs.="" riattivat="" *p="0.0303)." eif3e="" xaft;="" f="" (2,="" 14)="1.983," p="0.1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (attivat="" -bikri="" vs.="" riattivat="" *p="0.0057," attivat="" -tard="" vs.="" riattivat="" *p="" {{="">

(d) Pie chart tippreżenta l-perċentwal ta 'spina tal-faqqiegħ imkabbra (Dh Greater minn jew ugwali għal 3Dn) u spines tal-faqqiegħ minn newroni Attivati ​​-tard u Riattivati.

(e) Immaġini rappreżentattivi (pannell tax-xellug) u kwantifikazzjoni (pannell tal-lemin) tal-livelli tal-mRNA Gria1, matul fażijiet differenti ta 'memorja. Id-dejta hija ppreżentata bħala proporzjon bejn diversi puncta u t-tul tax-xaft dendritiku. Il-bar tal-iskala tirrappreżenta 10 μm. N=4 ġrieden /5 sezzjoni għal kull annimal, boxplot jindika l-medja, il-firxa interkwartili u l-minimu u massimu, Shaft; ANOVA f'direzzjoni waħda (parametrika, mhux imqabbda) F (2, 15)=10.41, P=0.0015. Test tal-paraguni multipli ta' Bonferroni, **P=0.0011. pannell t'isfel - Soma; ANOVA f'direzzjoni waħda F (2, 12)=0.13, P=0.88.

Dejta Estiża Fig. 7: Interazzjonijiet ma 'tisħiħ kombinatorji distinti jwasslu għal direzzjonali

(a) Id-dijagrammi Venn juru l-perċentwal ta’ koinċidenza bejn l-aċċessibbiltà tal-kromatina (DARs) madwar kullmemorjafażijiet (BAS vs. Attivat -bikrija, ċirku tal-grilja aħdar ċar; Attivat -bikri vs. Attivat -tard, ċirku tal-grilja aħdar skur; Attivat -tard vs. Riattivat, ċirku tal-grilja oranġjo) u bidliet traskrizzjonali totali mill-clusters kollha identifikati (Dw – tard, Up –tard, Stabbli, Riattivazzjoni, ċirku tal-grilja blu). DARs interġeniċi u introni ġew immappjati mal-ġeni rispettivi tagħhom bil-mapep tal-interazzjoni pc-HiC. Il-perċentwal ta' koinċidenza ġie kkalkulat mid-DEG identifikati kollha fir-raggruppamenti (n=1095).

(b) Analiżi ta' sovrapożizzjoni bejn DARs (pairwise) u DEGs minn kull cluster. DARs interġeniċi u introni ġew immappjati mal-ġeni rispettivi tagħhom bil-mapep tal-interazzjoni pc-HiC.

Analiżi ta 'koinċidenza twettqet mill-pakkett GeneOverlap R. Il-valuri P u l-valuri Jaccard (kulur) mit-test eżatt ta' Fisher huma ppreżentati fuq il-mappa tas-sħana (xellug). Il-perċentwal ta' sovrapożizzjoni ġie kkalkulat mid-DEGs identifikati kollha fir-raggruppamenti (lemin).

(c) Immaġini rappreżentattiva tal-kromatina u bidliet traskrizzjonijiet tal-locus Gabrb3 mill-cluster Dw-tard. Filwaqt li l-interazzjonijiet tal-istat bikri kienu bejn il-promotur u dawk li jsaħħu b'attivaturi tat-traskrizzjoni (Ap1), l-interazzjonijiet tal-istat tard kienu ma ' repressuri tat-traskrizzjoni (Slug). Il-binarji ta' fuq tal-browser tal-ġenoma tal-IGV (vjola - Bażali, aħdar ċar - Attivat - kmieni, aħdar skur - Attivat - tard u oranġjo - Riattivat) jippreżentaw bidliet traskrizzjonijiet (ncRNA-seq), binarji tan-nofs juru dinamika tal-aċċessibbiltà tal-kromatin (ATAC-seq) fuq il- promotur (rettangolu aħmar) u enhancers (rettangolu griż). Interazzjonijiet sinifikanti promotur-enhancer huma rappreżentati bħala arki (binarji tal-browser WashU). Motivi preżenti tal-binarji t'isfel li ġew identifikati permezz ta 'għodod HOMER (Slug, Ap1, u Rest).

(d) Plottijiet ta' aggregazzjoni għal motivi individwali. Il-valuri ta 'arrikkiment (motivi għal kull bp / għal kull quċċata) ta' sitt motivi magħżula (żewġ repressuri, żewġ attivaturi, u żewġ bivalenti) ġew ivvalutati madwar iċ-ċentru tal-qċaċet (-/ flimkien ma '4000bp) minn kull cluster.

Dejta Estiża Fig. 8: Mudell propost tal-aċċessibbiltà tal-kromatina, interazzjoni promotur-enhancer, u dinamika traskrizzjoni tan-newroni tal-engram tal-memorja tal-hippocampal

reġjuni, li jħaddnu motivi attivaturi tat-traskrizzjoni. Din ir-riprogrammazzjoni tal-promotur-enhancer tirriżulta f'żieda fl-espressjoni tal-ġeni li preżumibbilment tippermetti l-istabbilizzazzjoni tal-memorja. Recall - newroni engram riattivati ​​użaw subsett ta 'interazzjonijiet promotur-enhancer ipprajmata, li hija assoċjata ma' bidliet traskrizzjoni involuti fit-trasport tal-mRNA għal kompartimenti sinaptiċi u traduzzjoni tal-proteini. Fattur tat-traskrizzjoni – TF, E(1–3) – li jsaħħu differenti li jinteraġixxu mal-istess promotur, Aħmar - repressuri tat-traskrizzjoni, Blu - attivaturi tat-traskrizzjoni.

Materjal Supplimentari

Irreferi għall-verżjoni tal-Web fuq PubMed Central għal materjal supplimentari.

Rikonoxximenti

Nirringrazzjaw lil E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin, u l-membri tal-L.HT Lab għal diskussjoni u suġġerimenti utli. Nirringrazzjaw lill-maniġers tal-laboratorju Y. Zhou, E. McNamara għall-manutenzjoni tal-kolonji tal-ġrieden. Nirringrazzjaw lil P. Autissier (Whitehead Institute) għall-għajnuna mal-FACS. Finanzjament: Dawn ix-xogħlijiet kienu appoġġjati minn għotjiet NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, Cure Alzheimer's Fund CIRCUITS Renee and The Robert A consortium. Fondazzjoni Familja Belfer lil LH.T. This work was also supported in part by NIH grants R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 to MK and LH.T, and R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01HG008155, U24HG009446 to MKVD is supported by an AARF-19-618751 grant from Alzheimer's Association . L-HSM huwa appoġġjat minn Burroughs Wellcome Fund u l-fellowship postdottorat UNCF-Merck. C. A hija appoġġjata mill-Fondazzjoni JPB. RMR huwa appoġġjat mill-għotja NIH T32 5T32HD09806. Il-kit tal-preparazzjoni tal-libreriji Hi-C ġie riċevut bħala rigal ġeneruż minn DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Nirringrazzjaw lit-tim ta' Dovetail għal diskussjoni u suġġerimenti utli.