Parti 2: Effett Anti-fibrotiku Ta 6-Bromo-indirubin-3 ′ -oxime ({6-BIO) Permezz tar-Regolament tal-Proteina Attivatur-1 (AP-1) U Fatturi ta' Traskrizzjoni ta' Proteina ta' Speċifiċità-1 (SP{-1) fiċ-Ċelloli tal-Kliewi

Għall-Parti 1, ikklikkjahawn.

3.3. 6-BIO ttaffi l-markaturi tal-fibrożi u l-mogħdijiet tas-sinjalar assoċjati mal-fibrożi fiċ-ċelluli tat-tubuli prossimali (HK-2) u tal-fibroblasti interstizjali (NRK49F)

Sussegwentement, aħna kkonfermajna l-effett ta' 6-BIO fuq ċelluli tubulari prossimali u ċelluli fibroblasti interstizjali. Aħna osservajna tnaqqis dipendenti fuq il-konċentrazzjoni u l-ħin tal-espressjoni tal-mRNA GSK3 minn 6-BIO fiċ-ċelloli HK{-2 u NRK49F (Fig. S2A u B), u l-espressjoni ta 'ECM u proteini relatati mal-EMT involuti fikliewiċellulafibrożitnaqqset ukoll (Fig. S2E). Barra minn hekk, espressjoni mtejba ta 'GSK3, fuq espożizzjoni TGF ta' dawn iċ-ċelluli, naqset ukoll bi trattament 6-BIO (Fig. S2C u D). Fig. 3 turi l-espressjoni tal-proteina takliewifibrożimarkaturi fiċ-ċelloli HK-2 u NRK49F ittrattati b'TGF . Kif muri f'Fig. 3A, l-espressjoni tal-proteini PAI-1 u CTGF żdiedet b'mod sinifikanti b'reazzjoni għal trattament b'5 u 10 ng/mL TGF fiċ-ċelloli HK-2 u NRK49F, rispettivament. Madankollu, l-espressjoni tagħhom naqset b'mod notevoli wara t-trattament bi 6-BIO (Fig. 3B).SMADu l-mogħdijiet tas-sinjalar tal-MAPK kienu regolati 'l fuq permezz ta' trattament ta 'TGF, li kien imreġġa' lura bit-trattament 6-BIO (Fig. 4). Sussegwentement, investigajna l-espressjoni ta' fatturi ta' traskrizzjoni AP-1 u SP-1 involuti fis-sinjalar medjat minn TGF fiċ-ċelloli HK-2 u NRK49F. Fig. 4D turi li ż-żieda medjata minn TGF f'PC-JUN u PC-FOS tnaqqset b'reazzjoni għat-trattament b'6-BIO u inibitur JNK SP600125 u fuq trasfezzjoni C-JUN dominanti negattiva. Fig. 4E turi l-bidla fl-intensità tal-proteina relattiva għall-kontroll. Barra minn hekk, żieda medjata minn TGF fil-livell SP-1 kienet attenwata b'mod sinifikanti b'reazzjoni għat-trattament b'6-BIO u SP-1 siRNA (Fig. 4F). Fig. 4G turi l-bidla fl-intensità tal-proteina relattiva għall-kontroll. Dawn ir-riżultati ssuġġerew li TGF /SMADu s-sinjalar MAPK kif ukoll fatturi ta' traskrizzjoni, AP-1, u SP-1, huma regolati minn 6-BIO.

3.4. 6-BIO ttaffi l-espressjoni nukleari tal-proteini PC-JUN, PC-FOS, u SP-1 fiċ-ċelloli fibroblasti tubulari u interstizjali prossimali

Fig. 5A u B juru l-lokalizzazzjoni ta 'PAI-1 u CTGF b'PC-JUN, PC-FOS, u SP-1. Tbajja ħamra ta' PC-JUN, PC-FOS, u SP-1 indikaw l-espressjoni żejda tagħhom fin-nukleu wara t-trattament ta' TGF; bl-istess mod, it-tbajja' ħadra ta' PAI-1 u CTGF indikaw l-espressjoni żejda tagħhom fiċ-ċitosol. Madankollu, il-livelli ta' espressjoni ta' PC-JUN, PC-FOS, u SP-1 tnaqqsu bit-trattament 6-BIO. Dawn ir-riżultati ssuġġerew li 6-BIO taffettwa direttament AP-1 u SP{-1, il-fatturi ta' traskrizzjoni li jirregolaw l-espressjoni ta' PAI-1 u CTGF.

3.5. 6-BIO attenwa l-attività promotur PAI-1, CTGF, AP-1, u SP-1 fiċ-ċelluli fibroblasti tubulari u interstizjali prossimali

Sussegwentement, investigajna jekk 6-BIO jinibixxix l-attivitajiet promoturi tal-ġeni PAI-1, CTGF, AP-1, u SP-1. L-attività promotur ta' PAI-1 u CTGF żdiedet b'reazzjoni għal TGF iżda tnaqqset bit-trattament 6-BIO (Fig. 6A u B). Barra minn hekk, it-tnaqqis kien notevoli meta ċ-ċelloli ġew ittrattati b'6-BIO waħdu milli fil-preżenza ta' TGF . AP-1 u SP-1 jorbtu mal-promoturi ta' PAI-1 u CTGF. Fig. 6C u 6D juru l-attività tal-promotur ta' AP-1 u SP-1. L-attività ta' AP-1 u SP-1 luciferase żdiedet bit-trattament ta' TGF u naqset b'6-BIO b'mod dipendenti fuq id-doża. Fig. 6E turi l-espressjoni tal-fattur ta 'traskrizzjoni fl-estratti ta' proteina nukleari. Għalhekk, aħna kkonfermajna li l-espressjoni nukleari ta 'PC-JUN, PC-FOS, u SP-1 żdiedet b'reazzjoni għat-trattament ta' TGF u ġiet mrażżna bi trattament 6-BIO. Fig. 6F turi l-bidla fl-intensità tal-proteina relattiva għall-kontroll. Barra minn hekk, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li 6-BIO jaġixxi fuq is-sit tal-irbit tal-fattur ta' traskrizzjoni tal-promotur biex idgħajjef it-twaħħil ta' AP-1 u SP-1. Aħna għamilna assay in vitro tal-irbit tal-promotur fil-preżenza ta' 6-BIO biex nikkonfermaw l-istess. L-irbit ta 'proteini nukleari u PC-JUN, PC-FOS, u SP-1 iddgħajjef biż-żieda ta' 6-BIO b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Fig. 3 supplimentari). Dawn ir-riżultati jindikaw li 6-BIO jinibixxi l-attivitajiet ta' promotur PAI-1 u CTGF kif ukoll il-funzjonijiet AP{-1 u SP-1; għalhekk, jista’ jkollu potenzjal terapewtiku fikliewifibrożi.

4. Diskussjoni

Bl-użu tal-mudell tal-far ta 'UUO u TGF-trattatkliewitubuli prossimali derivati ​​u linji taċ-ċelluli fibroblasti interstizjali, aħna wrejna li t-trattament 6-BIO jista' jnaqqaskliewiħsara. Il-mudell UUO huwa mudell ta 'annimali rappreżentattiv ta' nefropatija ostruttiva li hija kkaratterizzata minn tubulointerstizjali progressiva.fibrożi[43]. Analiżi istopatoloġika ta'kliewitessuti miksuba mill-mudell UUO wrew li l-akkumulazzjoni tal-ECM u l-atrofija tubulari fl-ispazju interstizjali ġew restawrati bit-trattament 6-BIO. Barra minn hekk, bl-użu ta 'TGF-trattatkliewiċelluli fibroblasti interstizjali derivati ​​mit-tubuli prossimali, urejna li t-trattament 6-BIO jista' jnaqqaskliewiħsara. Fil-mudell UUO u ċelluli HK-2 u NRK49F ittrattati b'TGF, 6-BIO inibixxa l-espressjoni ta'kliewifibrożimarkaturi kif ukoll MAPK uSMADmogħdijiet tas-sinjalar. Barra minn hekk, it-trattament 6-BIO naqqas l-espressjoni ta' proteini PC-JUN, PC-FOS, u SP-1 indotti minn UUO u TGF , kif ukoll l-espressjoni nukleari u l-attività promotur ta' AP{{6 }} u SP-1 f'ċelluli HK-2 u NRK49F ittrattati TGF- -. L-inibizzjoni tal-fatturi ta' traskrizzjoni AP{-1 u SP-1 permezz ta' trattament 6-BIO kienet assoċjata mal-inibizzjoni tal-akkumulazzjoni tal-ECM li twassal għal aggravament ta'kliewifibrożi. Dan jinkiseb billi jrażżnu MAPK uSMADmogħdijiet ta' sinjalazzjoni li jwasslu għal tnaqqis fl-espressjoni ta' PAI-1 u CTGF. Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li 6-BIO jista' jkun aġent terapewtiku potenzjali kontrakliewimard, kif ukoll għall-prevenzjonikliewiħsara kkawżata minn UUO u TGF .

Ikklikkja għal Cistanche organika għall-mard tal-kliewi

Id-derivattiv ta' indirubin permeabbli miċ-ċelluli semisintetiċi 6-BIO jappartjeni għal familja bis-indol u jseħħ b'mod naturali f'molluski u pjanti gastropodi li jittieklu [12]. Indirubin fih rabta idroġenu intramolekulari bejn ir-rabta doppja 2-C O u l-grupp N1-H u bond idroġenu intermolekulari ieħor bejn il-molekuli. 6-BIO għandha struttura modifikata kimikament li fiha l-6-pożizzjoni hija sostitwita b'Br biex tegħleb l-iżvantaġġ ta' proprjetajiet farmakokinetiċi ħżiena minħabba s-solubilità baxxa ta' indirubin fl-ilma [44]. Ħafna indirubins, minħabba rbit kompetittiv ma 'ATP, jaġixxu bħala inibituri doppji ta' cyclin-dependent kinase (CDK) u glycogen synthase kinase{{10}} (GSK{-3), li juru aktar minn {{ 12}}selettività darbiet fuq CDK5 [12]. Barra minn hekk, 6-BIO juri inibizzjoni selettiva b'mod notevoli ta' GSK-3 b'valur IC50 ta' 0.005 μM [12]. Skont rapporti minn diversi gruppi, 6-BIO jinibixxi kompletament il-proliferazzjoni taċ-ċelluli MCF-7 u jimblokka l-migrazzjoni b'madwar 75 fil-mija f'konċentrazzjoni ta' 10 μM, u jinibixxi l-fosforilazzjoni ta' PDK1. Dan wera li 6-BIO ġie mdaħħal fil-but ta 'l-irbit ta' PDK1 biex jifforma tliet bonds ta 'l-idroġenu b'residwi fir-reġjun taċ-ċappetta, u l-but ta' l-irbit faċilment akkomoda l-atomi Br addizzjonali f'6-BIO [45]. B'dawn il-karatteristiċi, 6-BIO qed tiġi studjata bħala mediċina ġdida biex tirregola proċessi ċellulari bħal infjammazzjoni relatata mat-tixjiħ, stress ossidattiv, sopravivenza taċ-ċelluli, proliferazzjoni, u apoptożi fil-kanċer, dijabete, u mard deġenerattiv [46,47 ]. Madankollu, studji dwar ir-regolamentazzjoni tal-ġeni u l-mekkaniżmi molekulari relatati malkliewiċellulafibrożihuma skarsi. Għalhekk, fittxejna li ninvestigaw jekk 6-BIO attenwatxkliewifibrożibilli jinibixxi r-regolamentazzjoni tal-ġeni PAI-1 u CTGF fikliewiċelluli, u b'hekk titnaqqas l-akkumulazzjoni tal-ECM.

Diversi studji użaw il-mudell UUO biex jirrappurtaw korrelazzjoni bejn l-akkumulazzjoni tal-ECM u kronikakliewimard ikkawżat minn tubulari interstizjalifibrożi[43]. Barra minn hekk, PAI-1 u CTGF espressi żżejjed huma rrappurtati assoċjati ma' akkumulazzjoni għolja ta' ECM matul il-progressjoni ta' kroniku.kliewimard. Għalhekk, l-identifikazzjoni ta' molekula terapewtika li tinibixxi s-sinjalar u t-traskrizzjoni ta' ġeni assoċjati ma' akkumulazzjoni mtejba ta' ECM hija importanti biex tinibixxi b'mod effettiv.kliewifibrożi. Għalhekk, f'dan l-istudju, aħna evalwajna 6-BIO, wieħed mill-inibituri tal-glycogen synthase kinase 3 (GSK-3), f'kliewifibrożi.

Studjajna l-effett tal-proteini PAI-1 u CTGF fuqkliewiċellulafibrożiu kkonfermaw li l-espressjoni tagħhom kienet regolata minn fatturi ta' traskrizzjoni komuni, AP-1, u SP-1. Il-fattur ta' traskrizzjoni, AP-1, huwa eterodimeru magħmul minn proteini li jappartjenu għall-JUN (C-JUN, JUNB, u JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1, u Fra{ {6}}), ATF (fattur ta' traskrizzjoni ta' attivazzjoni), u familja JDP (JUN dimerization protein) [48]. Jirregola diversi proċessi ċellulari bħall-proliferazzjoni taċ-ċelluli, il-mewt,

divrenzjar, u vaskularizzazzjoni. Studju preċedenti rrapporta li l-attività AP-1 tiżdied fil-fwied u fil-pulmuni bl-attivazzjoni tal-kollaġen tat-tip VI u fibroblasti [49,50]. Iż-żewġ komponenti ewlenin ta 'AP-1, C-JUN, u C-FOS jirrispondu għal varjetà ta' stimuli, bħal ċitokini, fatturi ta 'tkabbir, u stress [51]. Aħna osservajna żieda fil-fosforilazzjoni ta 'C-JUN u C-FOS f'mudell ta' far UUO u ċelluli HK -2 u NRK49F ittrattati b'TGF (Figuri 2D u 4D). C-JUN u C-FOS jiffurmaw eterodimeri u jingħaqdu mas-sit ta' rbit AP-1 fid-DNA, u b'hekk jaġixxu bħala fatturi ta' traskrizzjoni biex jirregolaw l-espressjoni ta' ġeni oħra. Barra minn hekk, il-fosforilazzjoni ta 'ERK1/2 u JNK jattiva C-FOS u C-JUN, rispettivament. Fl-istudju tagħna, il-fosforilazzjoni ta 'ERK1/2 u JNK, kif ukoll C-JUN u C-FOS fin-nukleu żdiedet b'mod notevoli b'reazzjoni għat-trattament b'TGF. Madankollu, it-trattament 6-BIO biddel dawn l-effetti b'mod sinifikanti. L-istudju tagħna wera li 6-BIO inibixxi b'mod effiċjenti l-fosforilazzjoni ta' ERK1/2 u JNK u naqqas l-attività tal-fattur ta' traskrizzjoni AP-1, u b'hekk inibixxi l-fosforilazzjoni ta' C-JUN u C-FOS li huma downstream tiegħu. effetturi. SP-1 inibizzjoni fl-astroċiti tal-fwied teżerċita ananti-fibrotikueffett [52]. Studju ieħor wera li l-SP-1 kellu rwol importanti fifibrożi[52,53]. Għalhekk, aħna evalwajna jekk 6-BIO tistax tinibixxi l-fattur ta' traskrizzjoni SP-1. Aħna osservajna li l-espressjoni tal-proteina SP-1 żdiedet b'rispons għat-trattament TGF kif ukoll fil-mudell UUO, filwaqt li naqset wara t-trattament 6-BIO. Barra minn hekk, l-espressjoni nukleari ta' SP-1 indotta minn TGF ġiet mrażżna bit-trattament 6-BIO. Bħala riżultat, l-attivitajiet ta' promotur ta' PAI-1 u CTGF, li għandhom siti ta' rbit AP{-1 u SP{-1, tnaqqsu wkoll bit-trattament b'6-BIO (Fig. 6 ). Għalhekk, dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li t-tnaqqis fl-attività tal-promotur tal-PAI-1 u CTGF bi 6-trattament BIO naqqas l-espressjoni tal-proteini PAI{-1 u CTGF, u naqas l-akkumulazzjoni tal-ECM, u b'hekk tnaqqaskliewiċellulafibrożi.

5. Konklużjoni

6-Trattament BIO naqas PAI-1 u espressjoni CTGF fil-mudell UUO u TGF ittrattatkliewiċelloli. Barra minn hekk, 6-BIO inibixxi l-attivazzjoni indotta minn TGF taSMADu s-sinjalar MAPK, filwaqt li jinibixxi wkoll l-attivitajiet ta' AP-1 u SP-1, tnejn mid-diversi fatturi ta' traskrizzjoni li jorbtu mal-promoturi tal-ġeni PAI-1 u CTGF. L-inibizzjoni ta' AP-1 u SP-1 tidher li hija waħda mill-mekkaniżmi ewlenin li bihom 6-BIO jinibixxikliewifibrożi. Għalhekk, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li 6-BIO jista 'jkun aġent terapewtiku potenzjali kontrakliewimard.

Dikjarazzjoni tal-kontribuzzjoni tal-awtur CRedit

Jung Sun Park: Kunċettwalizzazzjoni, Metodoloġija, Kurazzjoni tad-Data, Kitba − preparazzjoni ta' abbozz oriġinali, Kitba − reviżjoni u editjar, Viżwalizzazzjoni, Akkwist ta' finanzjament. F'Ae Jung: Kurazzjoni tad-dejta, Kitba − reviżjoni u editjar. Hong Sang Choi: Kurazzjoni tad-dejta, Kitba - reviżjoni u editjar. Dong-Hyun Kim: Metodoloġija, Kurazzjoni tad-Data. Hoon In Choi: Metodoloġija, Kurazzjoni tad-Data. Eun Hui Bae: Kitba − reviżjoni u editjar, Superviżjoni. Seong Kwon Ma: Kitba - reviżjoni u editjar,

6. Referenzi

Is-sors huwa minn Jung Sun Park et, al fuq Bijomediċina u Farmakoterapija 145 (2022) 112402