PARTI 1: L-Estratti ta' Cistanche Itejbu In-Newrotossiċità Indotta mill-Perossidu ta' l-Idroġenu f'Mudelli Ċellulari ta' Neuroblastoma Mutant Ġodda ta' DJ-1-trasfettat

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com

1. INTRODUZZJONI

Il-mard newrodeġenerattiv ewlieni jinkludiAlzheimermard, il-marda ta 'Parkinson (PD), il-marda ta' Huntington, u oħrajn. Fost dawn id-disturbi, ir-rata ta’ inċidenza ta’ PD(marda ta' Parkinson) hija t-tieni fid-dinja u tilħaq 1 fil-mija –2 fil-mija fin-nies ta’ aktar minn 60 sena (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Bħala l-karatteristika newroloġika ewlenija tal-PD, in-newroni dopaminerġiċi fis-substantia nigra pars compacta huma deġenerattivi progressivi (Glizer & MacDonald, 2016), li hija akkumpanjata mid-dehra ta 'inklużjonijiet ta' ‐synuclein imsejħa korpi Lewy (Zhang, An, Zhang, & Pu). , 2010). Fil-patoġenesi tal-PD, rogħda tal-mistrieħ, riġidità, bradikinesja, u anormalitajiet posturali qed jiġu djanjostikati bħala s-sintomi ewlenin tal-PD fil-klinika. Għalkemm il-mekkaniżmi deġenerattivi progressivi eżatti tan-newroni dopaminerġiċi ma jistgħux jinftiehmu, jew kawżi ambjentali li jinkludu espożizzjoni għal insettiċidi, aġenti newrotossiċi, u metalli tqal, jew kawżi ġenetiċi bħal mutazzjonijiet ta' Parkin (Kitada et al., 1998), ‐synuclein (Polymeropoulos et al., 1998). al., 1997), u DJ‐1 (Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003), huma maħsuba li jwasslu għall-okkorrenza tal-PD. Sal-lum, in-numru ta 'mutazzjonijiet missense, mutazzjonijiet frameshift, u tħassir ta' frammenti kbar ikkawżati minn mutazzjonijiet tal-ġene DJ‐1 jaqbeż l-10 (Andres‐Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). Fi ħdan il-proteina DJ‐1, is-sostituzzjoni ta' Leucine166Proline (L166P) tispikka bħala importanti. Barra minn hekk, intwera wkoll li l-istress ossidattiv iseħħ fil-PD (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) u huwa involut fil-patoġenesi tiegħu (Hague et al., 2003).

Il-ġene DJ-1 li fih tmien esoni mqassma fuq 24 kb, jillokalizza fuq il-kromożoma 1p36 fil-bnedmin (Bonifati et al., 2003), u jikkodifika proteina kkonservata ħafna li fiha 189 aċidu amminiku. Il-proteina kienet tappartjeni għall-familja ThiJ/PfpI, teżisti f'forma homodimer. Iċ-ċelloli gliali fi ħdan il-kortiċi u substantia nigra u striatum huma l-prinċipali misjuba f'żoni tal-proteina DJ‐1 (Olzmann et al., 2007). F'dawn iċ-ċelloli, DJ‐1 għandu r-rwoli li ġejjin, bħal onkogene (Nagakubo et al., 1997), regolamentazzjoni traskrizzjoni (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi‐ Niki, Taira, Iguchi‐Ariga, & Agria, 2003). ), stress antiossidant (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), chaperone (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006), u protease (Abou‐Sleiman, Healy, Quinn, Lees, & Wood, 2003).

Trattament għal mard newrodeġenerattiv: estratt ta' cistanche

Cistanchehija mediċina tradizzjonali Ċiniża u ġiet prinċipalment użata biex tikkura mard androloġija fl-etajiet. L-ingredjenti attivi ewlenin ta 'Cistanchehuma phenyl glycosides inklużi 34 kompost, bħal acteoside, echinacoside, eċċ. L-effetti farmakoloġiċi ta 'Estratti ta' Cistanchejinkludu t-titjib tal-funzjoni sesswali, kontra t-tixjiħ, żieda fil-kapaċità tat-tagħlim u l-memorja, newroprotezzjoni, immunomodulazzjoni, kontra l-għeja, antiiskemika, u protezzjoni tal-fwied (Tu et al., 2011). L-aċidu caffeic huwa wieħed mill-metaboliti ewlenin ta 'Cistanche (Yan, 2018).

Il-mudelli ċellulari komunement użati ta 'PD jinkludu ċelluli PC12 indotti mill-jone 1-methyl-4-phenyl pyridinium (Abou-Sleiman et al., 2003) u ċelluli newroblastoma indotti minn perossidu idroġenu (H2O2) (SH-SY5Y) (Zhang et al. ., 2009). Madankollu, il-karatteristiċi patoloġiċi tipiċi tal-PD mhumiex preżenti f'dawn il-mudelli. Biex niżviluppaw mudell ċellulari ta’ PD aktar fiżjoloġikament rilevanti, f’dan l-istudju waqqafna ċelluli SH-SY5Y indotti minn H2O2 u C106S DJ-1-trasfettati SH-SY5Y, u investigajna l-effetti ta’Estratti ta' Cistancheu komposti bijoattivi ewlenin, inklużi acteoside, echinacoside, caffeic acid, uCistanche glycosides totalifuq dawn iż-żewġ mudelli, għall-ewwel darba.

Cistanche estratt mard anti-newrodeġenerattiv

2. MATERJAL U METODI

2.1|Plażmidi, drogi, kimiċi, u ċelloli

FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 plasmidi, u antikorpi poliklonali anti-DJ-1 ġew ġentilment fornuti minn Dr Hiroyoshi Ariga, l-Iskola tal-Gradwati tax-Xjenzi Farmaċewtiċi, l-Università ta 'Hokkaido. Il-mezz essenzjali minimu deidrat (MEM) u l-mezz F-12 inxtraw mingħand Gibco. Lipofectin kien minn Invitrogen. FastDigest Xho I u FastDigest EcoR I kienu minn Fermentas. Il-kit tal-preparazzjoni tal-plasmid mingħajr endotossini kien mill-bijoteknoloġija. Il-linja taċ-ċelluli SH-SY5Y kienet mill-Bank taċ-Ċelloli tal-Akkademja Ċiniża tax-Xjenzi Mediċi. Il-kit tar-reaġent tal-assaġġ tal-proteina BCA kien minn Pierce. Il-membrani tal-PVDF kienu minn Millipore. L-antikorp poliklonali anti-FLAG kien minn GeneTex.Estratti ta' Cistanche, inklużi acteoside, echinacoside, caffeic acid, u Cistanche totali glycosides, ġew fornuti mid-Dipartiment tal-Mediċini Naturali, l-Iskola tax-Xjenzi Farmaċewtiċi, l-Università ta 'Peking.

2.2|Plasmidi amplifikazzjoni, estrazzjoni, u purifikazzjoni

Wara li kkultivaw ċelluli Escherichia coli JM109 f'mezz likwidu LB sa OD600=0.5, ċelluli kompetenti ġew ippreparati bl-użu tal-metodu tal-klorur tal-kalċju. L-E. coli kompetenti mbagħad ġew trasformati b'DNA tal-plasmid bl-użu tal-metodu ta 'xokk tas-sħana, u wara t-trasformanti ġew ikkultivati ​​fuq pjanċi LB li kien fihom ampicillin għal 16-24 siegħa f'temperatura ta' 37 grad. Kolonja monoklonali trasformata b'suċċess imbagħad ġiet magħżula u kkultivata f'mezz likwidu LB li fih 50 ug/mL ampicillin għal 12-il siegħa addizzjonali f'37 grad. Il-plażmidi ġew estratti u ppurifikati bl-użu ta' kit ta' preparazzjoni ta' plasmidi mingħajr endotossini skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

2.3|Identifikazzjoni tal-plażmidi

Plasmidi estratti ġew soġġetti għal diġestjoni enżimatika, wara li l-plażmidi u frammenti diġeriti ġew eżaminati bl-użu ta 'elettroforesi ta' ġel agarose 1 fil-mija. Il-ġel li jirriżulta kien imtebba f'soluzzjoni EB għal 20-25 min f'temperatura tal-kamra u fotografat.

2.4|Trasfezzjoni tal-plażmidi f'ċelloli SH-SY5Y

Id-DNA tal-plasmid purifikat ġie trasfettat f'ċelloli SH-SY5Y kkultivati ​​f'medium MEM/F-12 li kien fih 10 fil-mija serum tal-fetu tal-bovini. Iċ-ċelluli trasfettati mbagħad ġew magħżula f'mezz li fih 400 ug/mL G418, wara li ntuża 200 ug/mL G418 biex tinżamm il-linja taċ-ċelluli trasfettata b'mod stabbli.

2.5|Identifikazzjoni ta' ċelluli trasfettati permezz ta' Western blot

Iċ-ċelloli SH-SY5Y trasfettati ġew lysed fil-buffer RIPA. Wara ċ-ċentrifugazzjoni tal-lisat, il-konċentrazzjoni totali tal-proteina fis-supernatant ġiet iddeterminata bl-użu ta 'kit ta' reaġent tal-analiżi tal-proteina BCA. Ammonti ugwali ta 'estratt ta' proteina mbagħad ġew soġġetti għal elettroforeżi ta 'ġel SDS-polyacrylamide ta' 12.5 fil-mija u trasferiti fuq membrana PVDF. Il-membrana PVDF ġiet imblukkata b'5 fil-mija ħalib xott bla xaħam f'soluzzjoni TBST u pproċessata għal immunodetection. Anti-FLAG u anti-DJ-1 intużaw bħala antikorpi primarji, u IgG konjugat bl-HRP kien l-antikorp sekondarju. Ġiet applikata sistema mtejba ta 'skoperta ta' kimiluminixxenza biex tiskopri l-proteini fil-mira.

2.6|Identifikazzjoni immunoċitokimika ta' ċelluli trasfettati

Iċ-ċelloli SH-SY5Y trasfettati ġew iffissati b'soluzzjoni ta '4 fil-mija ta' paraformaldehyde, permeabilizzati b'soluzzjoni ta '0.3 fil-mija Triton X-100, u mblukkati b'10 fil-mija serum tal-mogħoż. Iċ-ċelloli mblukkati mbagħad ġew inkubati l-ewwel b'antikorp poliklonali anti-FLAG u anti-DJ-1, u mbagħad b'antikorp sekondarju tal-mogħoż kontra l-fenek konjugat FITC. In-nuklei taċ-ċelluli kienu mtebbgħin b'Hoechst 33342, u ċ-ċelloli ġew viżwalizzati taħt mikroskopju fluworexxenti maqlub (IX-71, Olympus).

2.7| Assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli

Ċelloli SH-SY5Y mhux trasfettati u trasfettati ġew ibbanjati f'96-estratti, inklużi acteoside, echinacoside, caffeic acid, u Cistanche totali glycosides (kollha 10, 20, u 40 ug/mL, rispettivament), ġew miżjuda u l- ċelluli ġew inkubati għal 6 sigħat qabel it-trattament b'0.2 mM H2O2 għal siegħa addizzjonali. Il-medium twarrab, u l-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ttestjata bl-użu ta 'MTT kif deskritt hawn fuq.

2.8|Effetti ta 'estratti ta' Cistanche fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli

estratti, inklużi acteoside, echinacoside, caffeic acid, u Cistanche totali glycosides (kollha 10, 20, u 40 ug/mL, rispettivament), ġew miżjuda u ċ-ċelloli ġew inkubati għal 6 sigħat qabel it-trattament b'0.2 mM H2O2 għal siegħa addizzjonali. Il-medium twarrab, u l-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ttestjata bl-użu ta 'MTT kif deskritt hawn fuq.

2.9|Analiżi statistika

Id-dejta hija espressa bħala l-medja ± SD ta' tliet esperimenti indipendenti. Id-differenzi bejn il-gruppi ġew analizzati bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda u l-metodu LSD bis-softwer SPSS 22.0. Valuri ta' p < 0.05="" tqiesu="">

Cistancheħwawar

3|RIŻULTATI

3.1|Il-plażmidi ġew trasformati u purifikati b'suċċess. Wara espressjoni separata f'E. coli JM109, il-plażmidi ġew estratti u eżaminati bl-użu ta 'elettroforeżi ta' ġel agarose 1 fil-mija wara diġestjoni b'enzima ta 'restrizzjoni (Figura 1). Il-plażmidi ta '6.2-kb ġew imqassma fi frammenti ta' DNA lineari ta '5.4- u 0.8-kb, li kkonfermaw li l-plażmidi L166P u C106S DJ-1 kienu t-tnejn espressi b'suċċess u purifikati.

3.2|Identifikazzjoni ta' ċelluli trasfettati permezz ta' Western blotting. Kif muri fil-Figura 2, skoprejna bands FLAG-L166P DJ-1 u FLAG-C106S DJ-1 f'madwar 70 kDa. Il-livelli għoljin ta 'proteina b'tikketta FLAG fiċ-ċelloli SH-SY5Y trasfettati jindikaw li l-mutanti L166P u C106S DJ-1 kienu espressi b'mod qawwi fit-trasfettanti rispettivi tagħhom.

3.3|Identifikazzjoni immunoċitokimika ta' ċelluli trasfettati. Juri s-sinjali fluworexxenti qawwija minn ċelluli SH-SY5Y trasfettati wara inkubazzjoni b'antikorpi anti-DJ-1 jew anti-FLAG. Dan jikkonferma l-livelli għoljin ta 'L166P u C106S DJ‐1 espressi fit-trasfettanti.

3.4|Iċ-ċelloli trasfettati kienu aktar sensittivi għal H2O2 minn ċelloli mhux trasfettati. Wara inkubazzjoni għal siegħa fil-preżenza ta' konċentrazzjonijiet gradati ta' H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} }.5, u 1 mM, rispettivament), il-vijabbiltajiet taċ-ċelloli SH-SY5Y trasfettati b'L166P jew C106S DJ-1 tnaqqsu b'mod dipendenti fuq id-doża meta mqabbla ma' ċelloli mhux trasfettati

3.5|L-estratti ta' Cistanche inibixxu tnaqqis indott minn H2O2 Il-vijabbiltà taċ-ċelluli SH-SY5Y inibita b'mod dipendenti fuq id-doża permezz ta' kura biEstratti ta' Cistanche, inklużi acteoside, echinacoside, caffeic acid, u Cistanche totali glycosides (kollha 10, 20, u 40 ug / mL, rispettivament).

Cistanche