L-Estratt tal-Werqa taż-Żebbuġ (OLE) Indeboliment It-Traffikar tal-Akwaporin-2 Indott minn Vasopressin Permezz tal-Attivazzjoni tar-Riċettur li Jħoss il-Kalċju

Kuntatt:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressin(AVP) iżid il-permeabilità tal-ilma fil-renalikanal tal-ġbir permezz tar-regolamentazzjoni tat-traffikar tal-akkwaporin-2 (AQP2). Diversi disturbi, inkluż pressjoni għolja u sekrezzjoni mhux xierqa ta 'ormon antidijuretiku (SIADH), huma assoċjati ma' anormalitajiet fl-omeostażi tal-ilma. Intwera li ċerti fitokomposti huma ta 'benefiċċju għas-saħħa tal-bniedem. Hawnhekk, l-effetti tal-Olive Leaf Extract (OLE) ġew evalwati bl-użu ta 'mudelli in vitro u in vivo. Studji konfokali wrew li OLE jipprevjeni t-traslokazzjoni AQP2 indotta mill-vasopressin għall-membrana tal-plażma fiċ-ċelloli MCD4 u l-far.kliewi. L-inkubazzjoni b'OLE tnaqqas iż-żieda dipendenti fuq l-AVP tal-koeffiċjent tal-permeabilità tal-ilma osmotiku (Pf).Biex jiġu spjegati l-effettituri possibbli tal-OLE, ġie evalwat kalċju intraċellulari.OLE iżid il-kalċju intraċellulari permezz tal-attivazzjoni tar-Riċettur Sensing tal-Kalċju (CaSR).NPS2143 , inibitur selettiv ta 'CaSR, abolixxa l-effett inibitorju ta' OLE fuq il-permeabilità ta 'l-ilma dipendenti fuq AVP. Esperimenti in vivo wrew li t-trattament b'OLE iżid l-espressjoni tal-mRNA CaSR u jnaqqas l-mRNA tal-AQP2 flimkien ma 'żieda tal-AQP2-miRNA mmirata-137. Flimkien, dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-OLE jantagonizza l-azzjoni tal-vasopressin permezz ta 'stimulazzjoni tal-CaSR li jindika li dan l-estratt jista' jkun ta 'benefiċċju biex attenwa disturbi kkaratterizzati minn sinjalar anormali ta' CaSR u li jaffettwa r-riassorbiment tal-ilma renali.

Il-weraq tas-siġar taż-żebbuġ intużaw ħafna bħala rimedji tradizzjonali biex tfejjaq diversi mard, speċjalment fil-pajjiżi tal-Mediterran. Il-weraq huma komunement ikkunsmati fid-dieta tal-bniedem bħala estratt jew trab biex jippreparaw infużjonijiet jew tè tal-ħxejjex. L-analiżi tal-karatterizzazzjoni kimika wriet li l-weraq tas-siġar taż-żebbuġ fihom diversi komposti bijoattivi li jistgħu jeżerċitaw effetti ta 'benefiċċju f'ċerti morbożitajiet bħal sindromu metaboliku, dislipidemija, u pressjoni għolja. Bosta polifenoli bħal oleuropein, hydroxytyrosol, u tyrosol instabu arrikkit f'estratt tal-weraq taż-żebbuġa ħadra (OLE)5, u huma magħrufa li huma involuti fil-prevenzjoni ta 'ċertu mard ikkaratterizzat minn stress ossidattiv. Għalhekk, f'dawn l-aħħar ftit snin, l-interess fl-investigazzjoni tal-effetti ta 'benefiċċju potenzjali tal-estratt tal-weraq taż-żebbuġ qed jiżdied fost ix-xjenzati f'oqsma differenti ta' riċerka. L-OIE wriet effett antiproliferattiv sinifikanti fiċ-ċelluli tal-mesoteljoma malinna billi tbiddel id-dinamika tal-kalċju intraċellulari, possibbilment immirat lejn T- tip Ca2 plus kanali. Interessanti, OLE instab li jeżerċita effetti kontra l-pressjoni għolja fuq pressjoni għolja ġenetika fil-firien b'pressjoni għolja spontanja (SHR), relatati mat-titjib tal-funzjoni vaskulari*. Riassorbiment eċċessiv ta 'ilma għandu rwol importanti fil-patoġenesi ta' żieda fil-pressjoni tad-demm. F'pazjenti bi pressjoni għolja, ittrattati b'estratt tal-weraq taż-żebbuġ, instab tnaqqis sinifikanti ta 'diversi fatturi infjammatorji assoċjati ma' tnaqqis fil-pressjoni tad-demm. Barra minn hekk, iż-żamma eċċessiva tal-ilma tikkaratterizza diversi disturbi bħal ċirrożi tal-fwied, insuffiċjenza tal-qalb, u sekrezzjoni mhux xierqa tal-ormon antidijuretiku (SIADH). L-omeostażi tal-ilma tal-ġisem hija kkontrollata sewwa mill-ormon antidijuretiku vasopressin (AVP) li jiġi rilaxxat taħt il-kundizzjoni deidrata. AVP jorbot ir-riċettur V2R konness tiegħu lokalizzat fil-membrana basolaterali ta 'renaliċelluli prinċipali b'hekk jattivaw il-mogħdija tas-sinjali cAMP li tirriżulta fit-traslokazzjoni tal-vesikoli li jġorru akkwaporin-2(AQP2) minn pool intraċellulari għall-membrana tal-plażma apikali fejn iseħħ assorbiment mill-ġdid tal-ilma. F'livell molekulari, diversi fatturi jistgħu jimmodulaw il-bilanċ tal-ilma tal-kliewi, Livell elevat ta 'kalċju luminali irregola t-traffikar AOP2 għal żmien qasir dipendenti fuq il-vasopressin permezz tal-attivazzjoni tar-riċettur li jħoss il-kalċju (CaSR)1,12. Min-naħa l-oħra, l-attivazzjoni tal-CaSR f'ċelluli epiteljali tubulari prossimali tal-kliewi immortalizzati b'mod kondizzjonali, iżolati mill-awrina tal-bniedem, induċiet żieda sinifikanti fil-kalċju ċitosoliku u naqqset b'mod sinifikanti ż-żieda fil-cAMP suscitat minn forskolin (FK), attivatur dirett ta 'adenylate cvclase3 Barra minn hekk , fiċ-ċelluli MCD4 tal-kanal tal-ġbir tal-kliewi, li jesprimu b'mod stabbli l-kanal tal-ilma AOP2, l-istimulazzjoni tal-CaSR attenwat iż-żieda dipendenti fuq cAMP fil-fosforilazzjoni AQP2 f'serine 256 li hija avveniment pivotali fil-kaskata tat-trasduzzjoni tas-sinjal attivata minn vasopressin u li eventwalment żiedet il-permeabilità tal-ilma4 ,15 Barra minn hekk, fikliewiflieli mill-kliewi tal-ġrieden medulla ta 'ġewwa, l-attivazzjoni tal-CaSR bl-NPS-R568 kalċimimetiku kkawża żieda sinifikanti fl-AQP2-miRNA fil-mira-137, li tikkonferma interazzjoni stretta bejn il-mogħdija tas-sinjal CaSR u AQP{ {4}}permeabilità tal-ilma dipendenti.17.Fl-istudju preżenti, l-effetti tal-estratt tal-weraq taż-żebbuġ, miksub mill-kultivar Coratina lokali, ġew evalwati fuq il-funzjoni AQP2 indotta minn vasopressin fiċ-ċelluli MCD4 tal-kanal tal-ġbir tal-kliewi li jesprimu b'mod stabbli AOP2 u f'dDAVP firien ittrattati injettati bl-estratt. Aħna nipprovdu evidenza li t-trattament b'OLE jikkontrobatti r-rispons tal-vasopressin fiċ-ċelloli renali, li jista' jispjega parzjalment l-effett dijuretiku tiegħu. Interessanti, dan l-effett jidher li huwa relatat mal-attivazzjoni indotta mill-OLE tal-CaSR, riċettur magħruf li għandu interazzjoni negattiva mar-riċettur tal-vasopressin2.

Tgħallem aktar effetti ta' cistanche fuq il-kliewi

Riżultati

Effetti ta 'OLE fuq il-funzjoni AQP2 indotta minn vasopressin fiċ-ċelloli MCD4. Biex tinvestiga l-involviment possibbli ta' OLE fuq il-funzjoni AQP2 dipendenti fuq il-vasopressin,renaliċelluli MCD4 tal-kanal tal-ġbir, li jesprimu b'mod stabbli r-riċettur tal-vasopressin 2(V2R) u AQP2 uman, intużaw bħala mudell sperimentali18. Studji kon-fokali (Fig. 1A) żvelat li, meta mqabbla ma 'ċelluli ttrattati dDAVP, li fihom it-tbajja' AQP2 lokalizzata mal-membrana tal-plażma apikali, it-trattament b'OLE impedixxa l-lokalizzazzjoni tal-membrana ta' AOP2 indotta minn stimulazzjoni b'dDAVP. B'mod konsistenti ma 'dawn l-osservazzjonijiet, it-trattament OLE imfixkel iż-żieda indotta mid-dDAVP tar-rispons osmotiku temporali (indikat bħala 1/t f'Fig.1B)(OLE/dDAVP=88.70±1.86 fil-mija, n=292 ċelluli vs dDAVP=206.8±5.49 fil-mija ,n=186 ċelluli;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="">ċelluli vs OLE/dDAVP=88.70±1.86 fil-mija ,n=292 ċelluli;p<0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Effetti ta' OLE fil-kliewi tal-firien injettati b'OLE.

Biex jiġu investigati aktar l-azzjonijiet ta 'OLE, saru studji in vivo. Speċifikament, il-firien ġew injettati b'OLE (250 mg/kg/jum) darba kuljum għal tlett ijiem. Alternattivament, il-firien ġew kotrattati b'OLE, għal 3 ijiem, u dDAVP, għal 30 min. Evalwazzjoni ta 'CaSR mRNA li kien iżolat mill-kanal tal-ġbir tal-kliewi tal-firien u pproċessat għal PCR f'ħin reali (Fig.6) kixfet żieda sinifikanti fl-mRNA CaSR f'OLE(OLE=1.87±0.29, n{{{ 10}} firien vs CTR=1.02±0.17, n=5 firien; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="" the="">kliewi, Twettqu analiżi tal-western blotting, u studji confocal (Fig.9).Fi firien injettati OLE/dDAVP, il-fosforilazzjoni ta 'AQP2 f'serine 256 tnaqqset b'mod sinifikanti meta mqabbla ma' tessuti renali ta 'annimali ttrattati dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 firien vs dDAVP{=2.16±0.25,n{=5 firien;<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskussjoni

Il-kalċju huwa messaġġier intraċellulari importanti li jimmodula għadd kbir ta 'funzjonijiet ċellulari2. Is-sinjalar anormali tal-kalċju jista 'jwassal għal diversi mard inkluż insuffiċjenza tal-qalb, kanċer, u pressjoni għolja23. Kontroll speċifiku tal-espressjoni u l-attività tal-proteini li jikkontrollaw sinjali multipli tal-kalċju intraċellulari ġie ppruvat ta 'suċċess biex jiffaċċja bosta disturbi u għalhekk huwa attraenti għall-iżvilupp tad-droga. Dan l-istudju jipprovdi għarfien ġdid dwar il-mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' OLE billi juri l-kapaċità tiegħu li jimmodula s-sinjalar tal-kalċju intraċellulari permezz tal-istimulazzjoni tal-CaSR li hija involuta fl-irfinar tat-traffikar u l-espressjoni AQP2 indotti minn vasopressin. Taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi, AQP2 għandu rwol importanti fil-kontroll tal-omeostasi tal-ilma tal-ġisem25. L-istimulazzjoni tal-makkinarju intraċellulari, li twassal għal lokalizzazzjoni ta 'AQP2 fil-membrana tal-plażma apikali, tirriżulta f'ritenzjoni anormali ta' ilma u iponatremja konsegwenti bħal fis-sindromu ta 'sekrezzjoni mhux xierqa ta' ormon antidijuretiku (SIADH), ċirrożi tal-fwied, u insuffiċjenza tal-qalb konġestiva-.F'ġurdien mudell ta 'SIADH, assoċjat ma' mard tal-kliewi poliċistiku 1 haploinsufficiency, il-livell bażali ta 'kalċju intraċellulari kien imnaqqas b'mod sinifikanti meta mqabbel mal-livell imkejjel fil-kanali tal-ġbir tal-ġrieden tat-tip selvaġġ. Kalċju intraċellulari baxx irregola l-attività ta 'ċerti enzimi inkluża l-fosfatażi tal-proteina PP2A li tirriżulta fir-regolazzjoni 'l fuq tal-fosforilazzjoni AOP2 f'serine 2561. B'kuntrast. l-attivazzjoni tal-CaSR bl-NPS-R568 kalċimimetiku żiedet il-konċentrazzjoni tal-kalċju intraċellulari u naqqas il-livell ta 'cAMP f'ċelluli defiċjenti PKD1. B'mod importanti, il-kalċju ċitosoliku jista' jirregola l-adenylated cyclase3 inibibbli mill-kalċju u b'hekk jirfina l-livell intraċellulari ta 'cAMP.Fiċ-ċelloli MCD4, tabilħaqq, l-istimulazzjoni tal-CaSR b'NPS-R568 naqset AQP2-pS256 permezz tal-inibizzjoni tal-adenylate cyclase4.F'dan l-istudju, it-trattament b'OLE ipprevjeni ż-żieda dipendenti fuq il-vasopressin tal-cAMP u AOP2-pS256, possibbilment sekondarja għal żieda fil-konċentrazzjoni tal-kalċju intraċellulari. Ta' min jinnota, l-espożizzjoni għal sors estern ta' cAMP bl-użu ta' 8-Br-cAMP permeabbli, ikkontrobattat b'mod sinifikanti l-effett inibitorju ta' OLE fuq il-mogħdija V2R.

Livell elevat ta' kalċju ċitosoliku jista' jwassal għal mewt taċ-ċelluli u apoptożi. Madankollu, żieda sostnuta fil-kalċju intraċellulari minn 250 nM għal aktar minn 60{0 nM ippromwoviet sopravivenza newronali4.Fiċ-ċelloli MCD4, trattament b'OLE f'0.1 mg/ml ma jurix effett ċitotossiku. F'din il-konċentrazzjoni, OLE (0.1 mg/ml) żied ftit il-livell tal-kalċju intraċellulari. L-immaġini tal-kalċju wrew li l-istimulazzjoni akuta b'OLE ikkawżat żieda temporanja tal-kalċju intraċellulari permezz tal-attivazzjoni tal-CaSR li titneħħa meta ċ-ċelloli ġew preinkubati bl-antagonist selettiv tal-CaSR NPS2143, F'ċelluli tat-tubuli prossimali renali, attivazzjoni allosterika tal-CaSR b'I-ornithine naqqas il-produzzjoni ta 'ROS u b'hekk irregola l-istress ossidattiv mitokondrijali li kkawża l-apoptożi taċ-ċelluli356. Barra minn hekk, l-istudju preċedenti tagħna wera li l-espressjoni tal-varjanti tal-qligħ tal-funzjoni tal-CaSR naqqset ir-rilaxx ta 'ROS u S-glutathionylation ta' AQP237. L-inkubazzjoni b'OLE naqqset il-ġenerazzjoni ROS fiċ-ċelloli MCD435 li turi l-kapaċità antiossidant tagħha. Madankollu, bħalissa mhuwiex ċar jekk OLE jaffettwax l-AOP2-S-glutathionylation. Bosta studji wrew li OLE jew oleuropein, li huwa l-kostitwent ewlieni ta 'OLE, jista' jkollhom rwoli protettivi billi jinibixxu l-imwiet taċ-ċelluli,39 Madankollu, effetti dipendenti fuq id-doża ġew deskritti fil-firien li jirċievu OLE. Risposti ta' benefiċċju nkisbu f'dożi ta' 250 u 500 mg/kg. B'kuntrast, f'konċentrazzjonijiet ogħla, it-trattament b'OLE jista' jkollu effetti ta 'ħsara possibilment minħabba l-azzjonijiet pro-ossidanti ta' bosta fitokomposti. F'dan l-istudju, il-firien ġew injettati b'OLE f'doża ta' 250 mg/kg għal tlett ijiem li juru regolazzjoni 'l fuq ta' CaSR. Il-livell ta' espressjoni tal-CaSR jiżdied b'ċerti komposti li jaġixxu bħala attivaturi allosteriċi tar-riċettur,. Il-kalċimimetiċi, tabilħaqq, naqqsu l-kalċifikazzjonijiet vaskulari billi żiedu l-bijosintesi tal-CaSR fiċ-ċelloli tal-muskoli lixxi vaskulari umani0. F'dan il-konkors, ma tistax tiġi eskluża l-possibbiltà li ċerti komposti fl-OLE jistgħu jiffunzjonaw bħala modulaturi allosteriċi tal-CaSR. Min-naħa l-oħra, stimulazzjoni bil-vasopressin tista' twassal għal rilaxx ta' IL-6 li jista' jikkontribwixxi biex jiżdied il-livell ta' espressjoni tal-CaSR42.

Fil-kliewi, l-istimulazzjoni tas-sinjalar tal-CaSR hija assoċjata ma 'tnaqqis fl-espressjoni AQP2 possibilment permezz tal-ġenerazzjoni miR-137. Il-miRNAs huma modulaturi ta' wara t-traskrizzjoni. Ġew deskritti wkoll diversi miRNAs dipendenti fuq il-vasopressin li jimmiraw għall-espressjoni AQP243. It-trasfezzjoni b'miR-32 u miR-137 naqqset b'mod sinifikanti l-livell ta' espressjoni ta' AOP2 fiċ-ċelloli mpkCCDc14. Interessanti, OLE jista' jnaqqas sinjali infjammatorji u jeżerċita effetti protettivi billi jimmodula l-livell ta' espressjoni ta' diversi miRNAs". B'mod partikolari, fiċ-ċelloli tal-glioblastoma multiforme, OLE ippromwova l-espressjoni ta' miRNA differenti inkluż miR-13745 li huwa involut fir-regolazzjoni 'l isfel ta' il-mogħdija ta' sinjalazzjoni Akt/mTOR 46. Ta' min jinnota, it-trattament b'oleuropein jipprevjeni s-sinjalar ta' Akt/mTOR permezz tal-attivazzjoni ta' CAMK u AMPK indotti mill-kalċju". B'mod konsistenti ma 'dawn is-sejbiet, l-inkubazzjoni b'OLE żżid il-kalċju ċitosoliku, tnaqqas l-attività tal-PKA, u tnaqqas id-daqs taċ-ċisti f'mudell ta' kultura ta 'ċelluli 3D48. Flimkien dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-OLE jista 'jkun utli fit-trattament ta' disturbi kkaratterizzati minn disregolazzjoni tad-dinamika tal-kalċju intraċellulari relatata mar-regolazzjoni baxxa tas-sinjalar CaSR.

L-estratt tal-weraq taż-żebbuġa jikkonsisti f'diversi komponenti bijoattivi, inklużi polifenoli, fibri, u minerali49. Bħalissa, mhuwiex ċar jekk kompost wieħed jew kombinazzjoni sinerġika ta 'phytocompounds f'OLE jistgħux ikunu ta' benefiċċju fil-modulazzjoni tar-risponsi intraċellulari. L-estratt użat f'dan l-istudju ġie applikat bħala addittiv ta' l-ikel possibbli u għalhekk huwa importanti li jiġi definit l-impatt fiżjoloġiku ta' l-estratt innifsu meta wieħed iqis li diversi fenoli, inkluż hydroxytyrosol, jistgħu jiġu ffiltrati mill-kliewi u rkuprati fl-awrina50. Studji ulterjuri se jipprovdu l-effikaċja ta 'komponenti speċifiċi li jistgħu jirregolaw b'mod attiv is-sinjalar tal-kalċju intraċellulari permezz tal-CaSR. Biex nikkonkludu, dan l-istudju jipprovdi evidenza li OLE jista 'jitqies bħala aġġuvant potenzjali ġdid utli biex itaffu disturbi kkaratterizzati minn tnaqqis fl-espressjoni ta' CaSR kif ukoll sinjal u jaffettwa l-permeabilità tal-ilma renali.

materjali u metodi

Kimiċi u antikorpi.Il-kimiċi u l-antibijotiċi kollha nxtraw minn Merck (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja). Calcein-AM, Fura-2-AM, midja tal-kultura taċ-ċelluli, serum tal-fetu bovin (FBS), u Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates inxtraw minn Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Aquaporin{ {2}}(AQP2) ġiet skoperta bl-użu ta' antikorpi speċifiċi (C-tail Ab) imqajma kontra peptide sintetiku li jikkorrispondi għall-aħħar 15-il aċidu amminiku C-terminal ta' AQP2 uman!. L-antikorpi AQP2-pS256 ġew ġentilment mogħtija minn Prof Peter Deen. Antikorpi sekondarji akkoppjati mal-perossidażi tal-mogħoż kontra l-fenek inkisbu minn Merck (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja). Antikorp sekondarju tal-mogħoż-kontra l-fenek akkoppjat ma' Alexa-488 inxtara mingħand Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Produzzjoni ta 'estratt b'ħafna fenoliċi u karatterizzazzjoni kimika.Il-produzzjoni ta 'estratt b'ħafna fenoliċi mill-weraq taż-żebbuġ twettqet kif irrappurtat f'Ranieri et al.35. Wara tħin bi blender (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), ġie miżjud ilma ddH2O (proporzjon 1/20, w/y) u mbagħad suġġett għal ultrasound (CEIA, Viciomaggio, Italja) tliet darbiet , għal 30 min f'35±5 grad kull darba. Fl-aħħarnett, l-estratti ġew iffiltrati minn karta tal-filtru, lajofilizzati, u maħżuna fi -20 grad C. L-estratti miksuba ġew iffiltrati b'filtri tan-najlon ta '0.45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) u użati għall-karatterizzazzjoni kimika. Il-kontenut totali ta 'fenol, l-attività antiossidanti, u l-identifikazzjoni ta' komposti fenoliċi singoli twettqu skond Difonzo et al..L-OLE wera kontenut ta 'polifenoli, iddeterminat minn Folin-Ciocalteu, ugwali għal 195 mg. Ekwivalenti ta' aċidu galliku (GAE) u attività antiossidanti, determinata minn ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonjumeld) , li jammontaw għal 750 μmol TE (ekwivalenti Trolox) g!.

Kultura taċ-ċelluli u trattamenti.Ċelluli MCD4 tal-kanal tal-ġbir kortikali tal-ġurdien, li jesprimu b'mod stabbli AQP2 uman u l-V2R-Rluc kimeriku intużaw bħala mudell sperimentali18. Iċ-ċelloli tkabbru f'taħlita 1:1 ta' medium Eagle modifikat Dalbec-cos u F-12 supplimentat b'5 fil-mija (y/y) serum tal-fetu bovin. 1 fil-mija (y/y) L-glutamina u 1 fil-mija penicillin/streptomycin, 5 μM dexamethasone,400 ug/ml G418 (għal reżistenza AQP2) u 1 ug/ml puromycin (għal reżistenza V2R-Rluc) , f'atmosfera umidifikata ta '5 fil-mija CO, f'37 grad. Iċ-ċelloli MCD4 tħallew taħt kondizzjoni bażali (CTR) jew ittrattati fit-tul b'OLE f'0.1 mg/ml O/N, dDAVP f'100 nM għal 30 min, jew kotrattati b'OLE u dDAVP jew NPS2143 f'l μM O/N .B'mod alternattiv, iċ-ċelloli ġew esposti għal 8-Br-cAMP f'500 μM għal 45 min, Twettqu esperimenti għal żmien qasir b'OLE f'1 mg/ml għal 5 min u NPS2143 f'10 μM għal 15 min. Twettqu esperimenti 3-5 ħinijiet indipendenti bl-użu ta' ċelloli minn passaġġi differenti.

Mudell tal-annimali u trattamenti.Il-proċeduri kollha twettqu bi qbil mal-Linji Gwida Nazzjonali Daniżi għall-kura u l-immaniġġjar ta 'annimali esperimentali u l-linji gwida ppubblikati tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, Il-protokolli ġew approvati mill-Istitut tal-Mediċina Klinika. Università ta' Aarhus, skont il-liċenzji għall-użu ta' annimali sperimentali maħruġa mill-Ministeru tal-ġustizzja Daniż (Nru ta' approvazzjoni 2015-15-0201-00658). Saru studji fuq firien irġiel adulti Wistar b'piż tal-bidu ta' 200-225 g. L-annimali nżammu fuq dieta standard tal-gerriema (Altromin, Lage, il-Ġermanja) u kellhom aċċess liberu għall-ilma tal-vit. Matul l-esperimenti, il-firien kienu miżmuma fi gruppi ta 'tnejn għal kull gaġġa, b'ċiklu ta' dawl-dlam ta '12:12 h, temperatura ta' 21±2 grad C, u umdità ta '55±2 fil-mija.

Ħames firien ġew ittrattati b'injezzjoni taħt il-ġilda ta '1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danimarka) f'200 ul salina/annimal, u ħames firien ittrattati bil-vettura servew bħala kontrolli. Wara 30 min, il-firien inqatlu, u l-kliewi ġew ipproċessati kif deskritt hawn taħt.

Ċelloli u lisati IMCD.Iċ-ċelloli tkabbru fuq dixxijiet ta' {{0}}mm u ġew sospiżi mill-ġdid f'buffer li kien fih 220 mM mannitol, 70 mM sukrożju, 0.5 M EGTA pH 8.0 ,0.5 M EDTA pH 8.0,1 M Tris-HCl pH 7.4 fil-

preżenza ta' proteases (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptin, u 2 mg/ml pepstatin A) u phosphatases (10 mM NaF u 1 mM sodium orthovanadate) inibituri. Sezzjonijiet alternattivi tal-kliewi ta' madwar 0.5 mm ġew ippreparati u ekwilibrati għal 10 min f'buffer li kien fih 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukożju, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2,1.8 mM u Mg. 1.8 mM KH2PO4 (pH7.4). Papilla renali ġew ikkapuljati b'imqass fl-istess buffer fil-preżenza ta 'proteases (1 mM PMSF, 2 mg / mlleupeptin, u 2mg / mlpepstatin A) u phosphatases (10 mM NaF u 1 mM sodju orthovanadate) inibituri.Wara l-sonika-zzjoni (60 kHz għal 5 s),lysates ġew ċentrifugati fi 12,000xg għal 10 min.Is-supernatanti ġew miġbura u użati għal studji immunoblotting'8.

Mikroskopija konfokali.Twettqu studji konfokali kif deskritt qabel1. Fil-qosor, iċ-ċelloli tkabbru fuq inserzjonijiet tal-PET tal-kultura taċ-ċelluli u ttrattati kif deskritt hawn fuq. Alternattivament, sezzjonijiet tal-kliewi miksuba mill-kontroll, OLE, dDAVP, u OLE b'firien ittrattati dDAVP ġew soġġetti għal esperimenti ta 'immunofluworexxenza kif deskritt qabel. L-immaġini nkisbu b'mikroskopju fluworexxenti konfokali tal-iskannjar bil-lejżer Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, l-Isvizzera).

Elettroforesi tal-ġel u immunoblotting. Proteini ġew isseparati fuq 12 fil-mija ġels tal-polyacrylamide mingħajr tebgħa (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) taħt kundizzjonijiet ta 'tnaqqis kif deskritt qabel=5,52. Fil-qosor, meded ta 'proteini ġew trasferiti fuq membrani Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) u immunoblotted bl-użu ta' antikorpi anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) u anti-AQP2-pS256. Sinjali immunoreattivi nkisbu bl-użu ta 'Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates b'Sistema Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).Il-meded ġew normalizzati għal proteina totali bl-użu ta' teknoloġija mingħajr tbajja (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) .Analiżi tad-densitometrija saret bl-użu ta 'ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) u analizzata bl-użu ta' GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Assaġġ tal-permeabilità tal-ilma.Il-permeabilità osmotika tal-ilma ġiet imkejla kif deskritt qabel43. Fil-qosor, ċelluli MCD4 tkabbru fuq coverslips tal-ħġieġ ta' 40-mm. Wara t-trattamenti, iċ-ċelloli ġew mgħobbija b'10 μM Calcein-AM permeabbli mill-membrana għal 45 min f'37 grad, 5 fil-mija CO, f'DMEM/F -12. Coverslips ġew immuntati f'kamra tal-perfużjoni (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Il-kejl sar permezz ta' mikroskopju TE2000-S invertit (mikroskopju Nikon Eclipse, Tokyo, Ġappun) mgħammar għal kejl ta' fluworexxenza b'ċellula waħda. u analiżi tal-immaġini. Il-kampjuni mgħobbija bil-Calcein-AM kienu eċċitati f'490 nm. Kejl tal-fluworexxenza, wara soluzzjonijiet iżosmotiċi (140 mM NaCl.5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl.,10 mM Hepes sulfonic acid,5 mM Glucose,pH7.4) jew iperosmotiku (soluzzjoni iżosmotika miżjuda b'135 mM Mannitol) . twettqu bl-użu tas-softwer Metafluor (Apparat Molekulari, Teknoloġiji Analitiċi MDS, Toronto, Kanada). Id-dejta tal-fluworexxenza tal-kors tal-ħin wara t-tixrid taċ-ċelluli b'soluzzjonijiet iso-u iperosmotiċi ġew irreġistrati. Il-kors tal-ħin tat-tnaqqis taċ-ċellula tkejjel bħala l-kostanti tal-ħin (Ki, espress bħala 1/r, sek), parametru korrelatat mal-permeabilità tal-ilma, miksub billi twaħħal data b'funzjoni esponenzjali analizzata bl-użu ta' GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, USA).

Kejl tat-trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza.Biex tevalwa l-bidliet intraċellulari tal-cAMP, ġiet applikata t-teknoloġija tat-trasferiment tal-enerġija tar-reżonanza tal-fluworexxenza (FRET). Għal esperimenti FRET, iċ-ċelluli ġew trasfettati bi plasmid li jikkodifika s-sensor H96 li fih il-motif ta 'kunsens li torbot cAMP ta' EPAC1 inkorporat bejn il-proteina fluworexxenti cyan (CFP) u cp173Venus-Venus kif muri qabel32.33.54. Il-plasmid li jikkodifika s-sonda H96 kien rigal minn Dr.K. Jalink. Il-viżwalizzazzjoni taċ-ċelloli li jesprimu ECFP u/jew EYFP u s-sejbien ta' FRET saru permezz ta' mikroskopju TE2000-S invertit (mikroskopju Nikon Eclipse, Tokyo, Ġappun). Kull immaġini ġiet ikkoreġuta u analizzata kif muri qabel55.

Kejl tal-kalċju intraċellulari. Twettqu kejl tal-kalċju intraċellulari kif muri qabel56. Fil-qosor, iċ-ċelloli MCD4 ġew mgħobbija b'4 μM Fura-2 AM għal 15-il minuta f'37 grad f'DMEM/F-12. Is-soluzzjoni ta 'Ringer intużat biex tħaffef iċ-ċelloli matul l-esperiment li fih 140 mM NaCl, 5 mM KCl 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM Glukosju, 1.8 mM CaCl, pH 7.4. Fil-kejl tal-fluworexxenza, il-coverslips b'ċelluli mgħobbija żżejjed ġew immuntati f'kamra tal-perfużjoni (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA). Il-kejl twettaq bl-użu ta 'mikroskopju TE2000-S invertit (mikroskopju Nikon Eclipse, Tokyo. Ġappun), Il-proporzjon tal-intensitajiet tal-fluworexxenza f'340 u 380 nm ġie plottjat u kkalkulat bħala l-bidla fil-fluworexxenza. B'mod partikolari, l-istimulazzjoni b'OLE (1 mg/ml) jew NPS2143 (10 μM) ġiet imqabbla fl-istess tip ta' ċellula ma' dawk miksuba wara stimulazzjoni b'doża massima tal-agonist medjat mill-kalċju ATP (100 μM) li ntuża bħala kontroll intern (100 fil-mija).

Il-livell ta 'kalċju intraċellulari kien imkejjel fi stat fiss u kkalibrat kif deskritt minn Grynkiewicz57. OLE u NPS2143 intużaw għal żmien twil f'0.1 mg/ml u l uM, rispettivament, u kull kampjun ġie kkalibrat biż-żieda ta' 5 μM ionomycin fil-preżenza ta' 1 mM EGTA (Rm.) segwit minn 5 μM ionomycin f'5 mM CaCl, (RMA).

Analiżi PCR f'ħin reali ta 'AQP2 u CaSR mRNA fil-firien ta' kontroll u ttrattati.Twettqu esperimenti PCR f'ħin reali biex titkejjel l-espressjoni relattiva ta 'mRNA fil-kanal tal-ġbir tal-medulla ta' ġewwa (IMCD) iżolat mill-papilli tal-kliewi tal-firien tal-kontroll u ttrattati. Flieli tal-kliewi ta' madwar 0.5 mm saru u ekwilibrati għal 10 min f'buffer li kien fih 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukosju, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2,1.8 mM MgSO4, u 1.8 mM KH2PO4 (pH 7.4). Il-papilla renali ġiet iżolata taħt stereomikroskopju. Kampjuni minn firien ta 'kontroll u ttrattati mbagħad ġew ikkapuljati b'imqass direttament fi Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). It-traskrizzjoni inversa saret fuq 2.5 ugs ta' RNA totali bl-użu ta 'SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), skond is-suġġerimenti tal-manifattur (25C għal 10 min;42C għal 60 min;85C għal 5 min). L-amplifikazzjoni tal-PCR f'ħin reali twettqet bl-użu ta' TagMan Fast Advanced Master Mix ma' testijiet CaSR, AOP2, u GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) f'StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ), l-issettjar tal-kundizzjonijiet taċ-ċikli termali kif speċifikat mill-manifattur (95 grad C għal 20 s;40 ċiklu alternattivament f'95·C għal 1 s u 60 grad C għal 20 s). Ir-riżultati ġew espressi bħala 2- valuri(kwantifikazzjoni relattiva) b'△ACt=(Ct mira-Ct GAPDH) ittrattat-(Ct mira-Ct GAPDH)Sham1.

Evalwazzjoni tal-miRNA-137 fil-firien ta' kontroll u ttrattati.Il-kontenut ta' miRNA{{0}} fil-kanal tal-ġbir tal-medulla ta' ġewwa tal-firien tal-kontroll u ttrattat ġie evalwat bl-użu ta' TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), li ppermetta notifika sensittiva ħafna u speċifika ta 'miRNA maturi bl-użu ta' PCR kwantitattiv. Flieli tal-kliewi ta' madwar 0.5 mm saru u ekwilibrati għal 10 min f'buffer li kien fih 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukożju, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.8 mM MgSO4M, u 1.8 mM MgSO4M. KH2PO4(pH7.4).Il-papilla renali kienet iżolata taħt stereomikroskopju. Kampjuni minn firien ta 'kontroll u ttrattati mbagħad ġew ikkapuljati b'imqass direttament fi Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) biex jiġi estratt l-RNA totali. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Katalog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA） intuża biex tinkiseb sinteżi ta 'cDNA, skond il-protokoll ipprovdut mill-manifattur (reazzjoni ta' denb Poly(A); reazzjoni ta 'ligazzjoni; reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa; reazzjoni miR-Amp). L-RNA sintetiku (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) b'59-fosforu ġie sintetizzat minn Thermo Fisher Scientific u użat biex iwettaq kurva ta' kalibrazzjoni biex jinterpola l-valuri tal-kampjuni tal-miRNA u biex tinkiseb evalwazzjoni preċiża (f'nanogrammi) tal-kontenut ta' miR-137 f' kampjuni16, billi tuża GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Analiżi statistika.Il-valuri kollha huma rrappurtati bħala mezzi±SEM Analiżi statistika saret b'ANOVA one-way segwita minn test ta' paraguni multipli Newman-Keuls b'*p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Dikjarazzjonijiet, approvazzjoni etika, u kunsens għall-parteċipazzjoni.Twettqu studji fuq l-annimali bi qbil mal-Linji Gwida Nazzjonali Daniżi għall-kura u l-immaniġġjar ta 'annimali esperimentali u l-linji gwida ppubblikati tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa. Il-kumitat tal-etika għall-kura tal-annimali tal-Istitut tal-Mediċina Klinika, l-Università ta 'Aarhus approva l-protokolli ta' studju, skont il-liċenzji għall-użu ta 'annimali sperimentali maħruġa mill-Ministeru tal-Ġustizzja Daniż (Nru ta' approvazzjoni 2015-15-0201-00658). L-awturi jikkonfermaw li l-metodi kollha twettqu skont il-linji gwida u r-regolamenti rilevanti. Barra minn hekk, l-awturi jikkonfermaw li l-istudju sar f'konformità mal-linji gwida ARRIVE.

Referenzi

1. El, SN & Karakaya, S. Siġra taż-żebbuġ (Olea europaea) tħalli effetti ta 'benefiċċju potenzjali fuq is-saħħa tal-bniedem. Nutr. Apk 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Effetti tal-estratt tal-weraq taż-żebbuġ fuq rispons metaboliku, funzjonijiet tal-fwied u tal-kliewi u bijomarkaturi infjammatorji f'pazjenti bi pressjoni għolja. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Polifenoli taż-żebbuġa, u s-sindromu metaboliku. Molekuli

4. Cherif, S. et al. Prova klinika ta 'estratt ta' Olea titrat fit-trattament ta 'pressjoni għolja arterjali essenzjali. J. Pharm. Belg. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Estratti ħodor minn kultivari taż-żebbuġ cortina weraq karatterizzazzjoni antiossidanti u attività bijoloġika. J. Funct. Ikel 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Possibbiltajiet ġodda għall-valorizzazzjoni tal-prodotti sekondarji taż-żejt taż-żebbuġa. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. L-estratt tal-weraq taż-żebbuġ arrikkit bl-oleuropein jaffettwa d-dinamika tal-kalċju u jfixkel il-vijabbiltà taċ-ċelloli malinni tal-mesoteljoma. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Effetti kontra l-pressjoni għolja ta 'estratt tal-weraq taż-żebbuġ arrikkit bl-oleuropein fil-firien b'pressjoni għolja spontanjament. Funzjoni tal-Ikel 7, 584–593.

9. Hall, JE Disfunzjoni renali, aktar milli disfunzjoni vaskulari mhux renali. Medja pressjoni għolja kkaġunata mill-melħ. Ċirkolazzjoni 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin u r-regolamentazzjoni tal-akkwaporin-2. Clin. Exp. Nephrol. 17, 751–764.

11. Procino, G. et al. Il-kalċju extraċellulari jantagonizza t-traffikar tal-akwaporin 2 indott minn forskolin fil-ġbir taċ-ċelloli tal-kanal. Kidney Int. 66, 2245–2255.

12. Riccardi, D. & Valenti, G. Lokalizzazzjoni u funzjoni tar-riċettur tal-kalċju tal-kliewi li jħoss. Reviżjonijiet tan-natura. Nefroloġija 12, 414–425.

13. Di Mise, A. et al. Ċelluli epiteljali tubulari prossimali umani immortalizzati kondizzjonalment iżolati mill-awrina ta 'suġġett b'saħħtu jesprimu riċettur funzjonali li jħoss il-kalċju. Em. J. Physiol. Physiol renali. 308, F1200-1206.