Obacunone itattenwa l-fibrożi tal-fwied b'effetti anti-ossidanti li jtejbu tal-GPx-4 u l-inibizzjoni tal-EMT

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Astratt:Obacunone, limonin triterpenoid estratt minn Phellodendronchinense Schneid jew Dic-tamnus dasycarpusb Turcz plant, iqajjem varjetà ta 'effetti farmakoloġiċi bħal dawk anti-infjammatorji, anti-neoplastiċi, anti-ossidazzjoni, u anti-pulmun-fibrosis. Madankollu, l-effett anti-fibrotiku ta 'oba-cone u l-mekkaniżmu sottostanti dettaljat fil-fibrożi tal-fwied għadu mhux ċar. Il-fibrożi tal-fwied hija marda debilitanti li thedded is-saħħa tal-bniedem. It-trasformazzjoni tal-fattur tat-tkabbir (TGF)-/P-Smad huwa mogħdija ewlenija ta 'fibrożi li tidher bi trasformazzjonijiet epiteljali-mesenkimali (EMT) u depożizzjonijiet ta' kollaġen, akkumpanjati minn radikali eċċessivi ħielsa mill-ossiġnu. Nrf-2 jaġixxi bħala regolatur anti-ossidant ewlieni li jmexxi l-espressjonijiet ta 'diversi ġeni relatati mal-antiossidanti. Glutathione peroxidase-4(GPx{-4)huwa membru tal-familja tal-glutathione peroxidase li jinibixxi direttament l-ossidazzjoni tal-fosfolipidi biex itaffi l-istress ossidattiv. Fl-istudju preżenti, għandna l-għan li nesploraw ir-rwol tas-sinsla fil-mudell tal-fibrożi tal-fwied tal-ġrieden indott minn tetrachloride tal-karbonju (CCl4) u f'ċelloli stellati epatiċi (linja taċ-ċelluli LX2) sfidati b'TGF- . Obacunone wera effetti ta 'titjib qawwi fuq il-fibrożi tal-fwied kemm f'LX2 attivat kif ukoll f'tessuti tal-fwied tal-ġrieden b'livelli mnaqqsa ta' -SMA, collagen1, u vimentin. Obacunone soppressa wkoll b'mod notevoli s-sinjali TGF-/P-Smad u l-proċess EMT. Sadanittant, obacunone eżerċita effett qawwi kontra l-ossidazzjoni billi naqqas il-livelli ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) fiż-żewġ mudelli. L-effett antiossidant tas-sinsla kien attribwit għall-attivazzjoni ta' GPx-4 u Nrf-2. Barra minn hekk, l-effett terapewtiku tas-sinsla fuq iċ-ċelluli LX2 tneħħa b'mod sinifikanti in vitro flimkien ma 'GPx-4 antagonist RSL3, b'mod parallel mal-livelli elevati mill-ġdid ta' ROS.puritani vitamina ċGħalhekk, aħna nuru li s-sinsla tad-dahar hija kapaċi attenwa l-fibrożi tal-fwied permezz tat-titjib tas-sinjal GPx-4 u l-inibizzjoni tal-mogħdija TGF-/P-Smad u l-proċess EMT.

Kliem ewlieni:sinsla;fibrożi tal-fwied; EMT;ċelluli stellati tal-fwied; GPx-4;TGF- ;stress ossidattiv

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

1. Introduzzjoni

L-epatite kronika hija ġeneralment ikkawżata minn epatite tal-virus, steatosis mhux alkoħolika, epatite alkoħolika, u epatite awtoimmuni. Korriment persistenti tal-fwied jista 'jispiċċa f'fibrożi tal-fwied, jew saħansitra kanċer tal-fwied, li affettwa b'mod fatali s-saħħa tal-bniedem [1]. Il-fibrożi tal-fwied hija tip ta 'rispons mhux fejqan tal-feriti taħt il-fatturi ta' korriment kontinwu kkaratterizzat mill-akkumulazzjoni esaġerata ta 'matriċi extraċellulari (ECM) u formazzjoni ta' ċikatriċi [2]. Iċ-ċelloli stellati tal-fwied (HSCs) huma ġeneralment fi stat ta 'mistrieħ taħt kundizzjonijiet normali, saru attivati ​​b'mod aberranti taħt ħsara kronika tal-fwied u dehru bi proliferazzjoni għolja u tnixxijiet ta' ECM [3], indikati bħala myofibroblasts [4]. Il-fehim tal-mekkaniżmu tal-attivazzjoni tal-HSC huwa ta 'valur kbir għall-iżvilupp ta' terapewtiċi ġodda għat-trattament tal-fibrożi epatika.

Fattur ta' tkabbir ta' trasformazzjoni (TGF- ) jippromwovi reazzjonijiet infjammatorji billi jistimula l-espressjoni ta' Interleukin-1 (IL-1) u Interleukin-6(IL{-6) fil-monoċiti [5]. Barra minn hekk, jinduċi metastasi tal-kanċer permezz tat-trasformazzjoni epiteljali-mesenkimali (EMT) u l-ħarba immuni tat-tumur [6-8]. L-EMT tirreferi għal proċess fiżjoloġiku dinamiku fejn iċ-ċelloli epiteljali jitilfu l-polarità tagħhom u jittrasformaw f'ċelloli mesenkimali bħal fibroblasts u myofibroblasts, u b'hekk iwasslu għall-iżvilupp ta 'fibrożi [9]. L-okkorrenza ta 'EMT hija dejjem assoċjata mar-regolazzjoni 'l isfel ta' E-cadherin u l-upregulation ta 'markaturi ta' ċelluli mesenchymali, bħal N-cadherin u bebbux[10]. L-attivazzjoni ta' TGF- -smad hija waħda mill-mogħdijiet intraċellulari ewlenin fl-EMT kif ukoll fil-formazzjoni ta' myofibroblast [11].

L-istress ossidattiv huwa meqjus bħala waħda mill-kawżi primarji tal-fibrożi bil-produzzjoni żejda ta 'speċi reattivi ta' ossiġnu (ROS)[12]. Il-livell għoli ta 'ROS jikkawża ħsara strutturali lill-bijomolekuli, bħall-proteini, il-lipidi, u d-DNA, li eventwalment iwassal għal korriment taċ-ċelluli u l-promozzjoni tal-fibrożi [13]. Taħt stress ossidattiv, id-dimer ta' Nrf-2-Żomm-1 huwa dissoċjat, fattur respiratorju nukleari-2(Nrf{-2) jiġi ttrasportat fin-nukleu, u kkaġunat l-espressjoni ta' diversi enżimi antiossidanti billi jorbtu ma 'l-elementi ta' rispons antiossidant (ARE) inaqqsu l-livelli ta 'ROS[14]. Glutathione peroxidase-4 (GPx-4) ​​taġixxi bħala proteina antiossidant b'attività glutathione peroxidase, li hija prinċipalment responsabbli għall-inibizzjoni tal-ossidazzjoni tal-fosfolipidi u l-produzzjoni ta 'ROS fil-proċess tal-ferroptosi [15].sistancheStudji fuq il-ġrieden urew li l-fibrożi hija aggravata wara t-telf ta' jew Nrf-2 jew GPx-4 [16,17].

Cistanche jista 'anti-aging

Bħalissa, hemm diversi mediċini disponibbli għat-trattament tal-fibrożi tal-fwied, inklużi dawk bil-proprjetajiet ta 'anti-infjammazzjoni [18], antiossidanti [19], u agonist ta' riċetturi attivati ​​mill-proliferaturi tal-peroxisome (PPAR) [20]. Fi studju reċenti, Prof Yu sab li pazjenti b'ċirrożi tal-fwied għandhom livelli ogħla ta 'ossidazzjoni tal-lipidi meta mqabbla mal-kontrolli b'saħħithom f'kampjuni kliniċi [21]. Diversi mediċini antiossidanti bħal resveratrol[19] u aċidu ursoliku |13]urew effetti tajbin fuq il-fibrożi. Din l-evidenza tissuġġerixxi b'mod kumulattiv li l-anti-ossidazzjoni hija strateġija promettenti għat-trattament ta 'anti-fibrosis.

Pirfenidone (PFD) huwa mediċina piridina għall-fibrożi pulmonari idjopatika (IPF), filwaqt li jimmanifesta wkoll effett terapewtiku tajjeb fuq il-fibrożi tal-fwied fi studji multipli [22,23]. Għalhekk, PFD jintgħażel bħala mediċina ta 'kontroll pożittiv f'dan l-istudju. Obacunone(Oba) huwa kompost limonoid naturali estratt minn pjanti rutaceous bħal Phellodendri u Dictamnus-dasycarpus [24], li għandhom diversi proprjetajiet bijoloġiċi bħal anti-infjammazzjoni |25, antiossidazzjoni [26], u dawk kontra t-tumur [27]. Rapporti reċenti wrew li Oba huwa agonist Nrf-2 qawwi, li ttaffi b'mod effettiv il-fibrożi tal-pulmun permezz ta' induzzjoni CCL4 u ħsara ossidattiva liċ-ċelloli MDA-MB-231 ikkawżati minn H, O2. Aktar importanti minn hekk, Oba mhuwiex tossiku għall-ġrieden [28]. Madankollu, ma huma rrappurtati l-ebda rapporti dwar l-effett ta' Oba fil-fibrożi tal-fwied, speċjalment fuq GPx-4 li jimmedja l-ossidazzjoni kontra l-fosfolipidi, sinjali TGF- -Smad, u l-proċess EMT. Hawnhekk, għandna l-intenzjoni li nesploraw l-effetti ta 'Oba fuq il-fibrożi tal-fwied u niddefinixxu l-mekkaniżmi molekulari sottostanti.

2. Riżultati

2.1. Oba Inibit TGF- -Lx Indott-2 Attivazzjoni

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Interessanti, bil-konċentrazzjoni miżjuda ta 'Oba, l-effett ta' inibizzjoni a-SMA ma żdiedx b'mod sinifikanti (Figura 1B).x'inhu cistancheGħalhekk, għażilna konċentrazzjoni ta '20 μM għall-esperiment li ġej, b'PFDserving bħala l-kontroll pożittiv. Oba inibixxi b'mod effettiv il-livelli ta 'proteina ta' -SMA, kollaġen -1, vimentin, u fattur tat-tkabbir tat-tessut konnettiv (CTGF) (Figura 1C), f'aHSCs[3,4]. Barra minn hekk, Oba naqqas il-livelli ta 'espressjoni ta' mRNA ta '-SMA, kollaġen -1, u vimentin (Figura 1D). Ir-riżultati tal-immunofluworexxenza vverifikaw aktar li s-sinjali pożittivi tat-tbajja ta '-SMA kienu ovvjament imnaqqsa minn Oba (relattivament għal dak fil-grupp TGF-, peress li l-għadd taċ-ċelluli ħomor mnaqqas wara t-trattament b'Oba) f'Lx -2 (Figura 1E). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li Oba jeżerċita effett tajjeb ta' inibizzjoni fuq l-attivazzjoni ta' Lx-2.

2.2.Oba Inibit Sinjali TGF-/Smad, Proċess EMT, u Effett Anti-Infjammatorju Eżerċitat

Biex tiddefinixxi l-mekkaniżmi molekulari sottostanti l-effetti kontra l-fibrożi ta 'hawn fuq, ġew osservati l-livelli ta' espressjoni tal-proteini ta 'TGF-Receptor, P-Smad, u -SMA, li kienu inibiti b'mod sinifikanti minn Oba f'aHSCs (Figura 2A). Barra minn hekk, il-proteina livelli ta 'espressjoni ta' N-cadherin u bebbux tnaqqsu, filwaqt li l-livell ta 'espressjoni ta' proteina ta 'E-cadherin ġie promoss (Figura 2B), li jindika li l-mogħdija EMT kienet imblukkata wkoll [3]. Barra minn hekk, sibna li Oba indotta livell imnaqqas ta 'IL-6(Figura 2C).Cistanche kontra t-tixjiħBiex nevalwaw aktar l-effett ta 'Oba fuq l-infjammazzjoni, l-ewwel stimolajna ċ-ċelloli HepG-2 (tip ta' linja taċ-ċelluli tal-karċinoma epatoċellulari tal-bniedem) b'20 nmol CCl4, segwit mit-trattament b'20 uM Oba. Dawn ir-riżultati wrew li Oba jista' jnaqqas il-livelli ta' espressjoni ta' mRNA u proteina ta' IL-6 f'HepG stimulat minn CCl{4-(Figura 2D). B'mod ġenerali, oba wera diversi effetti kontra l-fibrożi billi jinibixxi sinjali TGF-/Smad, u proċess EMT, kif ukoll anti-infjammatorji.

2.3. L-Effetti ta' Kontra l-Fibrożi ta' Oba Kienu Dipendenti fuq il-Kapaċità Mtejba ta' Antiossidanti billi Attivaw GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 μM, il-vijabbiltà taċ-ċelluli ta 'Lx-2 naqset b'mod sinifikanti; għalhekk, intgħażlet 0.75-μM RLS biex tintervjeni fl-espressjoni ta' GPx-4.Ir-riżultati tal-Western blot wrew li meta RSL3 ġie miżjud f'aHSCs, l-espressjoni tal-proteina GPx-4 tnaqqset u il-markaturi profibrotiċi inklużi -SMA u vimentin kienu kollha maqluba b'mod sinifikanti, li jindika l-importanza ta 'GPx -4 fil-medjazzjoni tal-effetti kontra l-fibrożi ta' Oba (Figura 3D). Sadanittant, Oba ovvjament naqqas il-livell ROS ta 'aHSCs minn detectors fluworexxenti ROS, u dan l-effett kien apparentement imblukkat minn RSL3 (Figura).Din id-dejta indikat li l-livell aktar baxx ta' fosfolipidi ROS medjat minn GPx-4 kien l-anti-fibrosis prinċipali. sinjal ta’ Oba.

2.4. Oba Attenwa CCl4-Fibrożi tal-Fwied tal-Ġurdien Indotta

CCl4-fibrożi tal-fwied indotta hija waħda mill-mudelli tal-ġrieden l-aktar użati komunement biex tistudja l-fibrożi tal-fwied [3]. Fil-livell istoloġiku, Oba ttaffi b'mod sinifikanti l-patoloġija tal-fwied, evidenzjata mid-depożizzjonijiet tal-kollaġen imtejba indikati bit-tbajja 'Masson u t-tbajja' kontra l-SMA. (Figura 4A-D). Imbagħad, il-livelli tas-serum ta 'alanine transaminase(ALT)/aspartate transaminase (AST) ġew determinati biex jittestjaw il-livelli ta' ħsara tal-fwied, meta mqabbla mal-ġrieden CCL4, il-grupp Oba b'doża baxxa u l-grupp PFD naqqsu b'mod sinifikanti l-livelli ALT (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba Tejbet l-Espressjoni ta' GPx-4, Naqqas l-Infjammazzjoni, Espressjonijiet ta' Proteini Relatati mal-EMT, u Naqqas il-Livelli ta' Ossidazzjoni tal-Lipidi f'CCl4-Fibrożi tal-fwied Indotta

Kif muri fil-Figura 5A, Oba inibixxi l-espressjonijiet tal-proteini ta 'IL-6 u l-okkorrenza ta' EMT fil-fwied fibrotiku tal-ġrieden b'livelli mnaqqsa ta 'bebbuxu u N-cadherin iżda livelli ogħla ta' E-cadherin. Barra minn hekk, l-espressjonijiet tal-proteini ta 'Nrf-2 u GPx-4 ovvjament żdiedu wara trattament b'dożi medji u għoljin ta' Oba (Figura 5B).cistanche benefíciosIr-riżultati tat-Tbajja Immunoistokimika (IHC) wrew li meta mqabbla mal-grupp mudell, in-numri ta 'ċelluli pożittivi GPx-4 (kannella) fil-gruppi ta' Oba b'doża għolja u medja żdiedu b'mod sinifikanti (Figura 5C, E). Wara ttestjajna l-livelli ta 'stress ossidattiv fil-fwied tal-ġrieden u sibna li, meta mqabbla mal-kontroll, l-intensità tal-fluworexxenza ROS tal-grupp mudell kienet apparentement ogħla. Min-naħa l-oħra, il-livell ta 'ROS naqas b'mod sinifikanti wara t-trattament b'Oba (Figura 5D, F).

3. Diskussjoni

Il-fibrożi hija marda intima fid-dinja. Tkun xi tkun l-etjoloġija, inkluża l-infezzjoni tal-virus, l-epatite alkoħolika jew mhux alkoħolika, u r-risponsi awtoimmuni, kollha jispiċċaw b'fibrożi minħabba ħsara kronika fil-fwied [1]. L-attivazzjoni ta 'HSCs hija l-avveniment ċentrali sottostanti fibrożi tal-fwied. L-HSCs huma attivati ​​bi produzzjonijiet aberranti ta 'varjetà ta' fatturi fibroġeniċi u depożizzjonijiet ECM [2,3]. Is-sinjalar ta' attivazzjoni Smad kanoniku relatat TGF- -, il-proċess EMT kif ukoll l-infjammazzjoni kronika relatata mal-IL-6- huma rrappurtati li huma involuti fil-proċessi ta' hawn fuq [3,4]. Sabiex nevalwaw l-effetti kontra l-fibrożi ta 'Oba fuq il-fibrożi tal-fwied, l-ewwelnett qed niffokaw fuq id-definizzjoni tal-effetti tiegħu fuq l-attivazzjoni ta' Lx-2 indotta minn TGF- , u mbagħad nivverifikaw l-effetti tiegħu in-vivo kontra l-fibrożi billi nużaw CCl4-indotta mudell tal-ġrieden tal-fibrożi tal-fwied fl-aħħar.

Oba huwa kompost limonoid naturali [24] u l-effetti bijoloġiċi tiegħu jinkludu prinċipalment funzjonijiet anti-infjammatorji [25], antiossidanti [26], u anti-tumur [27]. Riċentement, instab li Oba huwa agonist Nrf-2 qawwi u effettiv u jeżerċita effetti kontra l-fibrożi pulmonari fil-ġrieden [28]. Madankollu, l-evidenza għadha nieqsa mill-effetti tagħha kontra l-fibrożi tal-fwied u l-mekkaniżmi molekulari relatati. Hawnhekk, espressjonijiet żejda ta '-SMA, collagen 1, u CTGF kienu kollha inibiti minn Oba f'mudelli Lx-2 stimulati b'TGF- . Is-sinjalar EMT mtejjeb huwa wkoll effettivament mrażżan minn Oba.

Ġie kkonfermat li l-istress ossidattiv huwa kontributur importanti għall-fibrożi [12]. Speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) huwa terminu umbrella għall-molekuli jew jonji ossidizzati b'attività bijoloġika u produzzjonijiet żejda ta' diversi ROS fl-epatoċiti jistgħu jwasslu għall-mewt tiegħu u jqanqlu fibrożi tal-fwied [13]. Għall-kuntrarju, l-HSCs ta 'mistrieħ huma attivati ​​wara korriment taċ-ċelluli tal-fwied u ROS eċċessiv jamplifika aktar attivazzjoni tal-HSCs u jispiċċa b'fibrożi tal-fwied [12]. Għalhekk, it-tnaqqis tal-istress ossidattiv esaġerat isir trattament effettiv għall-fibrożi.

Nrf-2 huwa regolatur kritiku tal-istress anti-ossidattiv, in-Nrf fosforilat attivat-2 jiġi traslokat fin-nukleu biex imexxi r-regolazzjoni 'l fuq tal-proteini antiossidanti downstream, GST, HO1[15]. Ħafna attivaturi kimiċi naturali ta 'Nrf2 huma rrappurtati li għandhom l-effetti kontra l-fibrożi, bħal tert-butylhydroquinone u curcumin. Fost il-proteini anti-ossidanti kollha, il-glutathione peroxidase-4(GPx-4) huwa membru tal-familja tal-glutathione peroxidase (GPx{1-8) u jiffaċilita l-bilanċ redox billi jnaqqas il-glutathione [ 30-32]. Huwa ppruvat li l-espressjonijiet ogħla ta 'glutathione peroxidase-7 inibixxu l-mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku billi naqqsu l-produzzjoni ta' ROS [33]. GPx-4 naqqas il-perossidu tal-fosfolipidi fuq il-membrana tal-lipidi biex jipproteġi ċ-ċelloli mill-ħsara ossidattivaJ15]. Kazuya Tsubouchi et al. sabet li l-espressjoni ta' GPx-4 titnaqqas fit-tessuti tal-fibrożi tal-pulmun tal-ġurdien indotti minn bleomycin, u l-fibrożi hija aktar severa meta l-ġene GPx-4 jiġi knocked out. Barra minn hekk, il-perossidazzjoni tal-lipidi u l-passaġġ TGF-/P-Smad huma mtejba b'mod sinifikanti fil-fibroblast tal-pulmun meta l-ġene GPx-4 ikun eżawrit [17]. Riċentement, aktar evidenza appoġġat li ROS derivati ​​mill-fosfolipidi huma involuti f'mewt taċ-ċelluli speċjali, imsejħa ferroptosis. L-inibitur GPx-4, RSL3, huwa applikat ukoll bħala l-induttur tal-ferroptosi [21,34].

Fl-esperimenti tagħna, sibna li Oba eżerċita l-kapaċità antiossidant billi rregola Nrf-2 u GPx-4 u rregola 'l isfel Nox-2. Notevolment, l-effett kontra l-fibrożi ta' Oba ddgħajjef b'mod sinifikanti, meta l-ġene GPx-4 ġie inibit minn RSL3, l-inibitur GPx-4. B'mod konsistenti, il-livell imnaqqas ta 'ROS permezz ta' trattament Oba kien imdawwal ukoll. Dawn l-osservazzjonijiet in vitro appoġġjaw ħafna li ROS anti-fosfolipidi medjati minn GPx-4-kienu kritiċi għall-effetti protettivi ta' Oba.

Sabiex jiġu vvalidati r-riżultati ta 'hawn fuq tat-trattament kontra l-fibrożi ta' Oba fiċ-ċelloli LX2, ġiet eżaminata wkoll fibrożi tal-fwied tal-ġrieden indotta minn CCl4-. CCl4 huwa tip ta 'velenu epatotropiku, degradazzjoni medjata ta' enzima mikrosomali P450 prodotta radikali ħielsa reattivi ħafna biex jeqirdu l-integrità tal-membrana taċ-ċellula, min-naħa tagħhom, li jikkawżaw serje ta 'disfunzjoni tal-fwied u korriment, eventwalment tevolvi f'fibrożi tal-fwied [35]. Fl-esperiment tagħna, Oba wera effetti kurattivi tajbin fuq fibrożi tal-fwied indotta minn CCl. Huwa ttaffi l-ħsara fil-fwied b'livell aktar baxx ta 'AST, iż-żona tal-qatet tal-fibra tal-kollaġen saret iżgħar, u l-espressjonijiet tal-proteini ta' a-SMA, CTGF, Collagen-1, bebbux, N-cadherin, u IL{{10} }} kienu kollha mnaqqsa. Filwaqt li s-sinjalar anti-ossidant, l-espressjonijiet tal-proteini ta 'Nrf-2, u GPx{-4 kienu kollha elevati wkoll, il-livelli ogħla ta' ROS naqsu. Dawn ir-riżultati kkonfermaw aktar l-effetti in vitro kontra l-fibrożi minn Oba u s-sinjalar relatat, speċjalment l-inibizzjoni tal-EMT u l-effetti anti-ossidanti minn Nrf-2 u GPx-4.

Fil-qosor, aħna kkonkludejna li Oba ttaffi l-attivazzjoni tal-HSCs indotta minn TGF- -u CCl4-indotta fibrożi epatika permezz ta 'varjetà ta' mekkaniżmi. L-ewwelnett, Oba inibixxi l-passaġġ klassiku ta' TGF-/Smad, EMT, u produzzjoni ta' IL-6. It-tieni nett, wera kapaċità antiossidant eċċellenti billi saħħaħ l-espressjonijiet ta 'Nrf-2 u GPx-4. ROS anti-fosfolipidi medjati minn GPx-4ew qed jikkontribwixxu prinċipalment għall-effetti tiegħu kontra l-fibrożi. Għalhekk, Oba jista 'jservi bħala regent kimiku kandidat għall-prevenzjoni u t-trattament tal-fibrożi.

Oba wera xi effett ta' fejqan fuq il-fibrożi tal-fwied indotta minn CCl4-fil-ġrieden C57. Oba jista' jirregola 'l isfel l-espressjoni tal-bijomarkaturi tal-proteini tal-fibrożi, bħal: -SMA, CTGF, eċċ. Sadanittant, Oba naqqas l-espressjoni tal-proteini ta' I-6, E-cadherin, eċċ. Kien interessanti li Mid-Oba juri sinjali ta 'riżultati aħjar fuq Oba baxx u Oba għoli f'termini ta' espressjoni relattiva ta 'dawn il-proteini, għalkemm, mhuwiex statistikament sinifikanti. Madankollu, indika li l-aħjar dożaġġ jista 'jkun fattur kritiku f'dan il-proċess, u aħna se nesploraw dan il-fenomenu fl-esperiment li jmiss. Barra minn hekk, sibna li ROS aktar baxxi u grad ta 'fibrożi tal-fwied b'espressjonijiet li jirregolaw 'il fuq ta' Nrf-2 u GPx-4. Għalhekk, aħna nemmnu li Oba jista’ jtaffi l-fibrożi tal-fwied billi jirregola n-Nrf-2 u l-GPx-4. Madankollu, PFD jista' jkollu azzjoni terapewtika aħjar minn Oba kemm in vivo kif ukoll vitro. Madankollu, Oba kien aħjar minn PFD fuq effett anti-ossidant, huwa li jwassal biex tiżdied il-possibbiltà li tinstab mediċina ġdida għal effett anti-fwied-fibrogenic min-naħa anti-ossidant, u tagħmel ftit kontribut għas-saħħa tal-bniedem.

4. Materjali u Metodi

4.1. Kimiċi u Reaġenti

Oba (nru.B20553, purità akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija) u RSL3 (nru. S81241, purità akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija) inxtraw minn YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Ċina) u maħlula f'dimethyl sulfoxide (DMSO) (nru.R21950; YUANYE) għal konċentrazzjoni ta '72.64 mg/mL u 6mmol, rispettivament. Wara l-isterilizzazzjoni tal-filtru, is-soluzzjoni riżultanti ġiet ippreservata fi -20 grad C. Is-soluzzjoni ġiet miżjuda mal-medju tal-kultura biex tinkiseb konċentrazzjoni finali ta' DMSO ta'<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Kulturi taċ-Ċelloli u Disinn Sperimentali

Il-linja taċ-ċelluli stellate tal-fwied uman Lx-2 u l-linja taċ-ċelluli tal-kanċer tal-fwied uman Hepg-2 (kollha miġbura mid-Dipartiment tal-Farmaċija, ir-Raba' Università Medika Militari, iċ-Ċina) ġew ikkultivati ​​fil-Medju tal-Ajkla Modifikat ta' Dulbecco ( DMEM) supplimentati b'10 fil-mija serum bovin fetali u 1 fil-mija peniċillina (Thermo Fisher Scientific) u streptomycin (Thermo Fisher Scientific), u mbagħad miżmuma f'37C f'atmosfera umidifikata ta '5 fil-mija CO2 u 95 fil-mija arja. Biex jiġi evalwat l-effett ta' Oba fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli Lx-2, Lx-2 ġie mdawwar b'1 × 10* ċelluli/bir fi pjanċa 96-bir u inkubat għal 24 siegħa qabel iż-żieda ta' Oba. Imbagħad, Lx-2 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' Oba (10,20, 40,80, u 160 wM u kkultivati ​​għal 24,48, jew 72 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ittestjata mis-CCK8. Biex tiġi evalwata l- effett ta' Oba fuq l-attivazzjoni ta' Lx-2, Lx-2 ġie kkultivat minn qabel b'mezz ħieles minn serum għal 12-il siegħa, segwit minn stimulazzjoni b'TGF- (10ng/mL, 24 h) u trattament b'Oba jew PFD. Biex jiġi evalwat l-effett ta 'Oba fuq l-infjammazzjoni, Hepg-2 ġie stimulat minn CCl4 (20 nm, 8 h) u ttrattat b'20 μM Oba. Fl-aħħar tal-kultura, iċ-ċelloli nġabru u ġew soġġetti għal Western blotting u analiżi qPCR f'ħin reali.

4.3. Annimali u Disinn Sperimentali

Ġrieden maskili C57 li jiżnu 20± 0.5 g (Iċ-Ċentru tal-Annimali tal-Laboratorju tar-Raba’ Università Medika Militari) kienu miżmuma taħt kundizzjonijiet xierqa ta’ temperatura ta’ 25 grad ± 2 gradi u ċiklu ta’ dawl/dlam 12-h b’ aċċess liberu għall-ilma u l-ikel. Kull esperiment f'dan l-istudju sar skont il-protokolli approvati mir-Raba 'Kumitat Militari tal-Università Medika dwar il-Kura tal-Annimali. Il-ġrieden c57 tqassmu b'mod każwali f'6 gruppi (n=6 f'kull grupp) kif ġej: i) grupp ta' kontroll fint, i) grupp mudell, ii) grupp b'Oba għoli (CCl4 flimkien ma' 6mg/kg Oba), io ) grupp ta 'Oba medju (CCl4 flimkien ma' 3 mg/kg Oba）, ø）grupp ta 'Oba baxx (CCl4 flimkien ma' 1.5 mg/kg Oba), u vi） grupp PFD (CCl4＋ PFD). Il-grupp mudell ġie ttrattat b'CCl4 (30) fil-mija CCl4/żejt taż-żebbuġa,5 mL/kg injezzjoni intraperitoneali) tliet darbiet fil-ġimgħa għal perjodu ta’ 6-ġimgħa biex jinduċi fibrożi tal-fwied Il-gruppi l-oħra ġew mitmugħa b’dożi differenti ta’ Oba jew PFD u volumi ugwali ta’ infezzjoni intraperitoneali CCil4 għal perjodu ta' 6-ġimgħa. Volum ugwali ta' żejt taż-żebbuġa minflok CCl4 ġie amministrat lil C57 permezz ta' ipas a sham control. Kull esperiment f'dan l-artikolu sar skont il-protokolli approvati mir-Raba' Kumitat Militari tal-Università Medika dwar l-Annimali Kura.

4.4.Western Blotting

Fwied C57 jew ċelluli kkultivati ​​ġew omoġenizzati jew lysed fil-buffer RIPA bl-użu tal-apparat tal-lapping tat-tessuti jew il-brix taċ-ċelluli (Servizz, KZ-2). Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet imkejla bl-użu tal-Kit tal-Assaġġ tal-Proteina BCA. Il-lisat ġie ċentrifugat (4 gradi, 12,000 rpm, 5 min), u s-supernatant inġabar. Il-passi operattivi ġew segwiti kif irrappurtat qabel [14]. Il-kampjuni ġew skennjati taħt sistema ta 'Immaġini u Analiżi Chemiluminexxenti (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Analiżi qPCR f'ħin reali

Fwied C57 jew ċelluli kkultivati ​​ġew omoġenizzati jew lisati f'reaġent Trizol bl-għajnuna tal-apparat tal-lapping tat-tessuti biex jiġi estratt l-RNA totali. L-RNA totali ġie traskritt b'lura f'cDNA bl-użu tal-RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit. -actin intuża għal referenza interna. RT-qPCR sar fuq is-Sistema qPCR 7500 Real-time (Bijosistemi Applikati) bir-reaġenti SYBR Premix Ex Taq. Il-primers tal-ġeni umani użati kienu elenkati fit-Tabella 1.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules