Profil tal-Metabolomika Ibbażat fuq NMR Għall-Kenniet Radikali u l-Proprjetajiet Kontra l-Aging Parti 2

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

2.5. Klassifikazzjoni ta' Estratti tal-Ħwawar mill-Analiżi tal-Komponent Prinċipali

Il-varjazzjoni tal-metabolit bejn il-weraq tal-ħxejjex ittestjati ġiet analizzata aktar bl-użu ta 'analiżi tad-dejta multivarjata (MVDA). L-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA), metodu ta 'rikonoxximent tal-mudell, hija MVDA mhux sorveljata li tagħti fehim ewlieni tal-assoċjazzjoni bejn il-kampjuni. Il-plots tal-punteġġ tal-PCA wrew is-separazzjoni tal-ħxejjex fi gruppi, filwaqt li l-plots tat-tagħbija enfasizzaw il-metaboliti li jipprovdu s-separazzjoni [85,86]. Il-mudell PCA wera saħħa tajba (R2X=0.997) u prevedibbiltà għolja (Q2=0.993) fejn il-varjazzjoni bejn R2X (cum) u Q2 (cum) kienet inqas minn 0 .3, u b'hekk jindika li kull wieħed mill-estratti tal-ħxejjex b'mod ugwali u indaqs ikkontribwixxa għas-separazzjoni tal-grupp osservata. Din l-osservazzjoni kienet konformi ma' Wheelock et al. [87].

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Il-plott tal-punteġġ tal-analiżi tal-komponent prinċipali wera li l-ħxejjex magħżula kienu separati f'żewġ gruppi mingħajr ebda fattur ta' barra notevoli kif muri fil-Figura 4A. Il-komponent prinċipali (PC)1 wera l-akbar varjazzjoni tal-kampjun, imbagħad segwit minn PC2. PC1 u PC2 ikkontribwew għall-perċentwal ta 'varjanza f'29.7 fil-mija u 24.9 fil-mija, rispettivament. Għalhekk, varjanza totali ta 'madwar 54.6 fil-mija kienet deskritta minn dawn il-PCs. Ir-riżultati mill-plot tal-kolonna tat-tagħbija wrew il-metaboliti responsabbli għas-separazzjoni tal-ħxejjex fin-naħa pożittiva ta 'PC1(V.negundo u C.longa) u n-naħa negattiva ta' PC1 (P. minus, P. indica, O.javanica u C. caudatus) (Figura 4B).

Dejta mill-plot tal-kolonna tat-tagħbija ta 'PC1 skopriet li l-komposti fenoliċi, prinċipalment il-grupp flavonoid u l-aċidi fenoliċi, kienu responsabbli għas-separazzjoni tal-ħxejjex aromatiċi magħżula. Quercetin (1), quercetin-3-O-rhamnoside (2), quercetin-3-O-glucoside (3), quercetin-3-O-glucuronide (4), quercetin-3- O-arabinofuranoside (5), rutin (6), derivattivi mvricetin (7), catechin (8), epicatechin (9), isorhamnetin (10), astragalin (11), aċidu chlorogenic (12), aċidu galliku (13), aċidu cumariku (14), aċidu askorbiku (15), aċidu formiku (21), aċidu fumariku (22), 3-methylxanthine (26) u apigenin (28) kontenuti kienu l-aktar ogħla f'P. minus, P. indica , C. caudatus u O.javanica peress li kienu jinsabu fin-naħa negattiva tal-plott. B'kuntrast, V.negundo u C.longa kienu differenzjati mill-ħxejjex l-oħra bil-preżenza ta 'serotonin (27) u D-limonene (29) fl-estratti tagħhom.

2.6. Korrelazzjoni bejn il-Bijoazzjonijiet u l-Metaboliti bl-Użu ta' Analiżi Parzjali tal-Anqas kwadri (PLS)

Sabiex tinftiehem l-assoċjazzjoni bejn il-bijoattività mkejla u l-metaboliti misjuba fil-ħwawar ittestjati, PLS, bħala metodoloġija MVDA sorveljata, ġie implimentat biex jikkorrelata d-dejta tal-varjabbli indipendenti (bidla kimika NMR tal-metaboliti) mad-dejta tal-varjabbli dipendenti, li kienu l-inibizzjoni tal-analiżi DPPH, ABTS u ORAC, kif ukoll attivitajiet anti-elastase u anti-collagenase. Din il-metodoloġija ġiet applikata minħabba li PLS għandu kisba kbira sabiex jgħaqqad il-bijoattivitajiet ittestjati mal-metaboliti, u għalhekk jista 'jipprovdi mudell għat-tbassir [88]. Permezz tal-analiżi PLS, tista 'tiġi stabbilita r-relazzjoni bejn bijoattivitajiet bħal attivitajiet ta' scavenging radikali u proprjetajiet kontra t-tixjiħ b'metaboliti fil-kampjuni. Għalhekk, metaboliti li kienu responsabbli bħala markaturi bijoattivi jistgħu mbagħad jiġu ssuġġeriti.

Il-biplot huwa taħlita ta 'punteġġi u plottijiet tat-tagħbija li jirriżultaw mill-analiżi PLS, kif irrappurtat minn Mediani et al. [80]. Biplot parzjali ta 'l-inqas kwadri għall-attività ta' scavenging radikali (Figura 5A) u proprjetajiet kontra t-tixjiħ (Figura 5B) wera li l-kampjuni kollha kienu separati sew u miġbura mingħajr valuri notevoli. Il-PC1 issepara l-weraq ta 'P. minus, C.caudatus, u P. indica minn V. negundo, O.jaoanica, u C.longa. Ibbażat fuq l-attivitajiet ta ' scavenging radikali u l-proprjetajiet kontra t-tixjiħ ta 'biplots, il-mudell ippreżenta valuri tajba ta' fitness (R'Y) ta '{{10}}.988 u 0.966, rispettivament. Sadanittant, il-prevedibbiltà (Q4) għall-attivitajiet ta ' scavenging radikali u proprjetajiet anti-aging kienu fuq 0.984 u 0.951, rispettivament.

Kif muri mill-PLS biplot ta 'attivitajiet ta' scavenging radikali (Figura 5A), il-bijoattivitajiet (DPPH, ABTS, u ORACassay) kienu diretti lejn in-naħa pożittiva tal-biplot, li kienet l-aktar żoni attivi u l-eqreb għal P.minus, P. indica u C.caudatus. B'kuntrast, V. negundo, O.javanica, u C. longa kienu diretti lejn in-naħat negattivi tal-biplot, li kienu kkunsidrati bħala l-inqas żoni attivi u kienu aktar 'il bogħod mill-assaġġi DPPH, ABTS, u ORAC, u wrew korrelazzjoni negattiva b'bijoattivitajiet. F'din is-sitwazzjoni, P. mimus, P. indica, u C.caudatus inġabru apparti mill-inqas ħxejjex aromatiċi attivi, li jindikaw li dawn il-ħxejjex aromatiċi wrew effett ta' tneħħija radikali aktar qawwija, u b'hekk jissuġġerixxu li dawn l-estratti tal-ħxejjex setgħu kien fihom livelli ogħla ta' fenoliċi. komposti. Fost it-tliet ħxejjex aromatiċi l-aktar attivi, P. minus instab li kien korrelatat b'mod aktar qawwi mal-assaġġ DPPH u ABTS, segwit mill-assaġġ ORAC.

Din is-sejba kienet taqbel mar-riżultati in vitro ta' attivitajiet ta' scavenging radikali li kienu twettqu. Ir-riżultati wrew li P. minus wera effett qawwi ta 'tneħħija tar-radikali ħielsa meta mqabbel mal-ħxejjex l-oħra. Ir-riżultati għalhekk żvelaw li P. minus hija l-aktar herb attiva għall-eradikatur ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv. Metaboliti sekondarji sinifikanti li kkontribwew għall-attività ta' tneħħija radikali ta' P. minus ġew identifikati bħala quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, catechin, isorhamnetin, astragalin, u apigenin.oteflavonojdiDawn il-metaboliti kollha kienu jinsabu eqreb lejn il-P. minus u wkoll għall-assaġġi ta 'scavenging radikali DPPHand ABTS. Studju preċedenti minn Mediani et al.[80] skopra wkoll li kampjun imnixxef bil-friża ta 'pjanti wera ammont ogħla ta' -glucose, -glucose, catechin, u aċidu chlorogenic, li setgħu kkontribwew għall-kapaċità qawwija ta 'scavenging DPPH radikali tal-ħaxix. Madankollu, l-effett ta 'scavenging radikali għoli ta' P.minus jista 'jkun ikkontribwit ukoll mill-metaboliti mhux identifikati fl-estratt.

Instabu wkoll sejbiet simili għall-proprjetajiet kontra t-tixjiħ. Il-Figura 5B tippreżenta l-biplot miksub mill-PLS ta 'proprjetajiet kontra t-tixjiħ. Il-bijoattivitajiet (attivitajiet anti-elastase u anti-collagenase) kienu proġettati fuq in-naħa pożittiva tal-biplot, li kienet l-aktar żona attiva u kienet eqreb lejn P.minus, P. indica, u C.caudatus. B'kuntrast, V.negundo, O.javanica, u C.longa kienu diretti lejn in-naħa negattiva tal-biplot, li kienet meqjusa bħala l-inqas żona attiva u kienet aktar 'il bogħod mill-attivitajiet anti-elastase u anti-collagenase. Dan wera korrelazzjoni negattiva jew aktar dgħajfa mal-bijoattivitajiet. F'din is-sitwazzjoni, P.mimus, P.indica, u C. caudatus kienu miġbura apparti mill-inqas ħxejjex aromatiċi attivi, li jindikaw li dawn l-estratti tal-ħxejjex urew inibizzjoni akbar ta 'elastasi u collagenase. Fost it-tliet ħxejjex aromatiċi l-aktar attivi, P. minus għal darb'oħra nstab li kellu korrelazzjoni qawwija ma 'dawn il-proprjetajiet kontra t-tixjiħ meta mqabbel mal-ħxejjex l-oħra.

Din is-sejba kienet taqbel mar-riżultati in vitro ta' proprjetajiet kontra t-tixjiħ li kienu saru qabel. Ir-riżultati wrew li P.minus kien l-iktar ħaxix attiv biex jinibixxi l-enzimi elastase u collagenase. Metaboliti sekondarji sinifikanti li kkontribwew għall-proprjetajiet kontra t-tixjiħ ta 'P. minus ġew identifikati bħala quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, derivattivi ta' myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin, u apigenin. Metaboliti oħra bħal -glucose, -glucose, aċidu fumariku, u aċidu xaħmi jistgħu wkoll ikunu responsabbli għall-bijoattivitajiet. Dawn il-metaboliti kollha kienu jinsabu eqreb lejn P. minus u lejn l-attivitajiet anti-elastase u anti-collagenase.

Cistanche jista 'anti-aging

Id-diskriminazzjoni ta 'dawn il-ħxejjex aromatiċi magħżula kienet taqbel mal-kampjuni ta' attività ta 'kenis radikali għolja speċjalment. nieqes, P.India andC.caudatus, li kienu mistennija li jiġu diskriminati mill-oħrajn minħabba l-konċentrazzjoni għolja tagħhom ta 'metaboliti sekondarji, speċjalment flavonoids, Il-preżenza ta' dawn il-komposti fenoliċi hija wkoll maħsuba li tikkontribwixxi għall-attivitajiet inibitorji elastase u collagenase akbar ta ' dawn il-ħwawar [67-79,89-92].

Il-kontribut ta' komposti bijoattivi ta' estratti tal-pjanti lejn il-ħila ta' tneħħija tar-radikali ħielsa u l-attività kontra t-tixjiħ ġie dokumentat minn diversi studji [66,72,75,79,92-101]. Barra minn hekk, metaboliti bħal flavonoids (quercetin, kaempferol, myricetin, epicatechin, u catechin) u fenoli oħra bħal resveratrol u procyanidin B2, ġew ippruvati li jinibixxu b'mod sinifikanti elastase u collagenase [69-71,79].

Fl-istudju preżenti, is-sinjali tal-metaboliti għal importanza varjabbli fil-valuri tal-projezzjoni (VIP) ġew identifikati u riveduti biex jinkisbu l-aktar metaboliti sinifikanti li kienu korrelatati mal-bijoattivitajiet ittestjati. Dan sar biex tiżdied l-integrità tar-riżultati ppreżentati hawn, li eżaminaw il-potenzjal diskriminattiv tal-metaboliti identifikati.puritani vitamina ċGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}.5 tqieset bħala sinifikanti għad-diskriminazzjoni [102]. F'dan l-istudju, il-metaboliti kollha li jikkontribwixxu għall-attivitajiet ta 'scavenging radikali u l-proprjetajiet kontra t-tixjiħ jistgħu jiġu kklassifikati bħala metaboliti diskriminatorji sinifikanti peress li l-valuri VIP tagħhom kienu ogħla minn 1.0 (Tabella 2). Iż-żewġ mudell PLSbiplots ġie vvalidat bl-użu ta '100 permutazzjoni każwali, biex tikkonferma l-validità (R2) u l-abbiltajiet ta' tbassir (Q2) tal-mudell oriġinali b'diversi mudelli, komparattiv mat-tajjeb ta 'tajbin. L-R2 wera li l-idoneità tal-mudell kienet sinifikanti u spjega l-grad tal-varjabbli Y fil-mudell, filwaqt li Q2 offra l-kwalità ta 'tbassir tal-mudell simili għal dak irrappurtat minn Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Ir-riżultati wrew li l-interċettazzjonijiet kollha tal-assi Y ta 'R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheIl-valuri ta' interċettazzjoni R2 u Q2 kienu fil-medda ta' 0.0367-0.0872 u-0.444 sa -0.492, rispettivament, li jissuġġerixxu li ż-żewġ mudelli PLS kienu validi u ma wrewx saħħa żejda. Għalhekk, dawn iż-żewġ mudelli PLS jistgħu jiġu kkategorizzati bħala mudelli ta 'prestazzjoni tajba u dawn is-sejbiet żiedu l-affidabbiltà tal-mudelli.

2.7. Kwantifikazzjoni Relattiva ta' Metaboliti Sekondarji

Il-kwantifikazzjoni relattiva ta 'xi wħud mill-metaboliti sekondarji li kienu ġew identifikati mill-ħwawar magħżula hija murija fil-Figura 6. Dawn il-metaboliti nstabu l-aktar ogħla fl-aktar ħwawar attivi bħal P. minus, kienu jinsabu fuq in-naħa pożittiva tal-biplots, u kienu eqreb lejn kważi l-bijoattivitajiet kollha ttestjati.x'inhu cistancheDawn ir-riżultati wrew li metaboliti sekondarji speċjalment mill-grupp flavonoid ta 'komposti li huma preżenti f'ammonti għoljin f'P. minus setgħu kkontribwew għall-eradicator tar-radikali ħielsa u l-proprjetajiet anti-aging ta' din il-ħaxix?

Meta tqabbel mal-istrutturi differenti tal-flavonojdi li setgħu kkontribwew għall-effettività tagħhom, ġie nnutat li l-mudell tal-idrossilazzjoni fiċ-ċirku B jista 'jkun wieħed mill-fatturi importanti għall-effett ta' inibizzjoni tal-metaboliti fuq l-attività tal-enzimi li qed tixjieħ[80] . Sim et al.[104] wrew ukoll li kemm fil-livell tal-proteina kif ukoll tal-mRNA, l-effett inibitorju ta 'dawn il-flavonoids sar qawwi b'numru dejjem jikber ta' gruppi fil-B-ring, u eżaminaw l-assoċjazzjoni struttura-attività ta 'xi flavonoids fuq MMP-1 espressjoni tal-ġeni f'fibroblasti dermali umani UV-Airradiated.

3. Materjali u Metodi

3.1. Kimiċi u Reaġenti

Metanol dewterat-d4(CH3OH-d4), KH2PO4 mhux dewterat, ossidu tad-dewterju tas-sodju (NaOD), melħ tas-sodju trimethyl silyl propionic acid-d4 (TSP), etanol, u metanol ġew forniti minn Merck Millipore International (Darmstadt, il-Ġermanja). Quercetin, buffer tal-fosfat, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),2,2-azinobis({3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)[ABTS ], Trolox, persulfat tal-potassju, 2,2'-azobis(2-amidinopropane)[AAPH, epigallocatechin gallate (EGCG),buffer HEPES, enżimi elastase, N-metossi succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide u ossidu tad-dewterju (D2O) ġew fornuti minn Sigma(Aldrich, il-Ġermanja).

3.2. Materjal tal-Pjanti u Teħid ta' Kampjuni

Weraq frisk ta 'O.jacanica, P. minus, u C.longa inġabru minn Felda Sungai Koyan Satu, Raub, u Pahang. Weraq V.negundo nkisbu mill-Istitut tal-Bijoxjenza, Universiti Putra Malasja. Weraq frisk ta 'P. indica inġabar fil-Park tal-Agrikoltura tal-Università, Universiti Putra Malaysia, u weraq friski ta' weraq ta 'C. caudatus inġabru fl-Istitut Agrikolu, Serdang, Selangor. Tqiegħed kampjun vawċer ta 'dawn il-ħxejjex aromatiċi fl-erbarju, Istitut tal-Bijoxjenza, Universiti Putra Malaysia, u kull kampjun ġie vvalidat mill-botaniku.Cistanche kontra t-tixjiħIl-weraq kollha nħasdu b'mod konsistenti filgħodu, fi ġranet xemxija biex tiġi żgurata l-affidabilità tal-kontenut tal-metaboliti. Il-plott fil-għalqa miftuħa għal kull ħwawar kienet separata f'sitt partijiet u kull kampjun inġabar minn kull segment bħala sitt repliki.

3.3.Preparazzjoni tal-Kampjun

Ladarba maħsuda, il-weraq frisk ġew maħsula taħt ilma tal-vit ġieri biex jitneħħew ir-residwi kollha, imnixxfa b'karta fina tal-laboratorju, u ffriżati istantanjament b'nitroġenu likwidu biex iwaqqfu r-reazzjonijiet enżimatiċi kollha u ppreservati l-metaboliti qabel il-lijofilizzazzjoni. Il-kampjuni mbagħad ġew imnixxfa fi freeze dryer LABCONCO (Kansas City, MO, USA) sakemm il-piż konsistenti u l-kontenut ta 'umdità laħqu taħt l-10 fil-mija. Il-kampjuni kollha mnixxfa ġew mitħunin bl-użu ta 'blender tal-laboratorju għal trab fin u mgħarbel bl-użu ta' għarbiel tat-test tal-laboratorju (ENDECOTTS LTD.London, England) ta 'daqs 300 um biex jinkiseb id-daqs uniformi. Il-kampjuni tat-trab ġew ippakkjati bil-vakwu f'ippakkjar tal-aluminju biex jipproteġuhom mill-espożizzjoni għad-dawl u l-umdità u maħżuna fi grad-80 qabel l-analiżi.

3.4. Estrazzjoni

Il-proċedura ta 'estrazzjoni deskritta minn Mediani et al. [105] ġiet segwita b'xi modifiki. Fil-qosor, 10 g ta 'kull kampjun trab ġew mgħaddsa f'100 mL 60 fil-mija etanol fi flixkun koniku ambra u ivvibrati għal siegħa bl-użu ta' sonikatur tal-banju ultrasoniku (WiseClean, mudell WUC-D10H, Seoul, Korea) taħt temperatura kkontrollata (taħt 40 grad) . Il-kampjuni ġew iffiltrati minn karta tal-filtru Whatman Nru.1 u l-fdalijiet ġew estratti mill-ġdid darbtejn u ffiltrati wara li tlestiet l-ewwel estrazzjoni. L-estratti mbagħad ġew miġbura flimkien u kkonċentrati bl-użu ta' evaporatur li jdur taħt vakwu f'40 grad. Is-sustanzi viskużi derivati ​​mbagħad ġew imnixxfa bil-friża bl-użu ta 'freeze dryer LABCONCO biex tiġi żgurata l-eliminazzjoni komprensiva tal-ilma u maħżuna fi grad-80 sa aktar użu. Fl-aħħar nett, l-estratti mhux raffinati mnixxfa ġew dilwiti għall-konċentrazzjonijiet meħtieġa għall-investigazzjonijiet kollha mwettqa.

3.5. DPPH Attività Radical Scavenging

L-attività ta ' scavenging radikali tal-kampjuni ġiet iddeterminata billi ssegwi t-teknika żviluppata minn Kong et al.[106], li ġiet żviluppata minn metodu modifikat ta' Brand-Williams et al. [107]b'modifika żgħira. Fil-qosor, estratti ta' kampjuni ta' 50uL f'metanol f'konċentrazzjonijiet differenti (0 sa 500 ug/mL) ġew miżjuda b'soluzzjoni ta' 195uL ippreparata friska0.2mMmethanolic2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) u maħżuna. Il-kampjuni kollha tat-test ġew ippreparati fi pjanċa ta' 96 well. Il-proċess ta 'decolourizing ġie rreġistrat f'515 nm bl-użu ta' spettrofotometru (Biotek EL 800 microplate reader, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) wara 60 min inkubazzjoni fid-dlam u mqabbla ma 'kontroll pożittiv u kampjuni vojta. Il-perċentwal ta 'attività ta' scavenging radikali tkejjel skont l-ekwazzjoni li ġejja:

fejn A kontroll huwa l-assorbiment tal-kontroll mingħajr estratti tal-pjanti u Sempliċi huwa l-assorbiment tal-estratti tal-pjanti.

L-estratti tal-pjanti jew il-konċentrazzjonijiet ta 'kontroll pożittiv li qaxxru 50 fil-mija ta' radikali ħielsa stabbli DPPH ġew ikkalkulati bħala l-ICs bl-użu tal-graff lineari tal-perċentwali ta 'attività ta' scavenging radikali kontra

estratti tal-pjanti/konċentrazzjonijiet ta' kontroll pożittiv. ICso aktar baxx indikat attività antiossidant ogħla. L-esperimenti kollha twettqu f'sitt repliki bi Trolox u quercetin bħala kontrolli pożittivi.

3.6.ABTS Radical Scavenging Assay

Għall-assaġġ ta' scavenging radikali ABTS, l-analiżi saret wara l-proċedura deskritta minn Arnao et al.[108] b'xi emendi. Is-soluzzjonijiet tal-istokk ippreparati kienu 7 mM ABTS flimkien ma 'soluzzjoni u 2.45 mM soluzzjoni ta' persulfate tal-potassju. Sabiex titħejja s-soluzzjoni tax-xogħol, iż-żewġ soluzzjonijiet tal-istokk tħalltu fl-istess kwantitajiet u tħallew jirreaġixxu fid-dlam għal 16-il siegħa f'temperatura tal-kamra. Imbagħad, is-soluzzjoni tax-xogħol ġiet dilwita b'ilma distillat biex takkwista assorbiment ta' 0.700±0.005 unitajiet f'734 nm bl-użu ta' spettrofotometru (UV-1650PC spettrofotometru, Shimadzu, Kyoto, Ġappun) u magħruf bħala ABTS plus soluzzjoni. Is-soluzzjoni ABTS plus kienet ippreparata friska għal kull assaġġ. Din is-soluzzjoni ABTS plus (900 μL) tħalliet tirreaġixxi ma '100 μL ta' estratti tal-ħxejjex għal 2 min. L-assorbanza mbagħad inqrat f'734 nm bl-użu tal-ispettrofotometru. Il-kurva standard li tinkludi 3.1 ug/mL sa u 50 ug/mL Trolox ġiet żviluppata, u r-riżultati ġew espressi bħala mg Trolox Ekwivalenti Antiossidant Kapaċità/g kampjun (mg TEAC/g kampjun).

3.7. ORAC Radical Scavenging Assay

Assaġġ ORAC biex titkejjel l-effikaċja ta 'scavenging radical peroxyl ġie implimentat kif iddikjarat minn Huang et al. [109] bl-użu tal-qarrej tal-fluworexxenza tal-mikroplate FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Ortenberg, il-Ġermanja). Kull estratt tal-ħaxix u Trolox (standard) ġew ippreparati f'soluzzjoni buffer tal-fosfat ta '75 mM (PBS) pH 7.4. F'96-mikroplate sewda sew, total ta' 150 μL fluworexxeina (10 nM maħlul f'PBS) ġie miżjud segwit minn 25 μL ta' Trolox, estratti tal-pjanti, jew PBS bħala vojt. Dawn is-soluzzjonijiet ġew pipettati fi bjar tripplikati. Il-mikroplate ġiet inkubata għal 15-il minuta f'37 grad u mgħottija b'għatu. Il-fluworexxenza kienet imkejla b'tul ta 'mewġ ta' eċċitazzjoni f'458 nm u wavelength ta 'emissjoni f'520 nm. Is-sinjal fl-isfond ġie ddeterminat billi jittieħed il-kejl kull 90 s.

Wara dan, 2,2'-azobis(2-amidinopropane)(AAPH,240 mM f'PBS) ippreparat friska ġie introdott minn injetturi abbord. It-tħassir tal-fluworexxenza mbagħad ittieħed sa 90 min bl-użu tal-istess wavelengths ta 'eċċitazzjoni u emissjoni. L-evalwazzjoni saret għaż-żoni taħt il-kurva għall-kampjuni (fluworexxenza kontra l-ħin) nieqes iż-żona taħt il-kurva għall-vojt u mqabbla ma 'kurva standard （25-400 μM Trolox）. Il-valuri ORAC relatati mat-Trolox ġew ikkalkulati bl-użu tal-ekwazzjoni kif ġej:

3.8.Assaġġ ta 'Inibizzjoni ta' Elastase

L-attività inibitorja tal-elastasi ġiet iddeterminata skont it-teknika deskritta minn Krause et al.[110], b'modifiki minuri minn Ndlovu et al. [75]. Il-bjar tal-kampjun kien fihom 25 μL 0.1 M HEPES buffer (pH7.5), 25 μL estratt tal-ħaxix (100 ug/mL), u 25 μL enzima elastase (1 ug/mL). Il-bjar vojta kien fihom biss 75 μL buffer HEPES u l-bjar ta 'kontroll negattiv kien fihom 50 μL buffer HEPES u 25 μL enzima elastase. Il-bjar ta 'kontroll pożittiv kien fihom 25 μL buffer HEPES, 25 μL N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro (10 ug/mL), u 25μL ta' enzima elastase. Il-bjar tal-kontroll tas-solvent kien fihom 25 μL buffer HEPES, 25 μL ta '10 fil-mija metanol, u 25 μL enzima elastase. Kontrolli vojta għall-estratt tal-ħxejjex (għall-kontrolli tal-kulur ta 'kull estratt ittestjat) kien fihom 150 μL buffer HEPES u 25 uL tal-estratt tal-ħxejjex. Il-pjanċa tal-mikro-bir imbagħad ġiet inkubata għal 20 min f'temperatura tal-kamra. Wara dan, ġie miżjud sottostrat 100μL (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide, 1 mM). Imbagħad il-pjanċi ġew inkubati għal 40 minuta addizzjonali f'25 grad. Wara l-inkubazzjoni, l-assorbiment inqrat bl-użu ta 'spettrofotometru (Biotek EL800microplate reader) f'405 nm. L-inibizzjoni perċentwali tal-estratti tal-ħxejjex ġiet ikkalkulata bl-użu tal-ekwazzjoni kif ġej:

fejn A kontroll huwa l-assorbiment ta 'buffer b'elastasi u solvent u Atest huwa l-assorbiment ta' buffer, elastase, u estratt tal-ħxejjex jew N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. Assaġġ ta' Inibizzjoni ta' Collagenase

L-attività ta 'inibizzjoni tal-collagenase twettqet skond il-metodu ta' Van-Wart u Steinbrink [111] (1981) b'modifiki minn Madrone et al. [92]. It-test ġie implimentat f'50 mM buffer TES (pH7.4 b'0.36 mM CaCl2). L-enzima Collagenase minn Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) ġiet ippreparata fil-konċentrazzjoni ta' 0.8 unitajiet/mL (imdewweb f'soluzzjoni buffer stock TES). Is-sottostrat sintetiku N-[3-({2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) ġie ppreparat f'konċentrazzjoni ta '2 mM f'soluzzjoni buffer stock TES. Il-volum totali ta' 150 μL għat-taħlita ta' reazzjoni finali kien fih 46.3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA (konċentrazzjoni finali FALGPA 0.8 mM), 18.7 μL enzima collagenase (0.1 unitajiet/mL, konċentrazzjoni finali ta' ħxejjex aromatiċi u estratti 2（5 μL) 100 ug/mL）. Estratti tal-ħxejjex u enzimi fil-buffer TES ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal 15-il minuta qabel ma żżid is-sottostrat biex tibda r-reazzjoni kimika. Twettqu kontrolli negattivi b'buffer TES. Wara li żiedet is-sottostrat, l-assorbenza nqrat immedjatament f'340 nm bl-użu ta' spettrofotometru (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) fi pjanċi mikrotiter ta' 96 bir u kontinwament imkejla għal ieħor 20 min. Kontroll pożittiv sar bl-użu ta 'epigallocatechin gallate(EGCG) f'12.5ug/mL. L-inibizzjoni perċentwali tal-kampjuni ġiet ikkalkulata bl-użu tal-ekwazzjoni kif ġej:

fejn A kontroll huwa l-assorbiment tal-buffer TES u Atest huwa l-assorbiment tal-buffer TES, enżima collagenase, u estratt tal-pjanti jew FALGPA.

3.10. Profiling tal-Metaboliti Bl-Użu ta' 'Kejl H-NMR

Il-profil tal-metabolit bl-użu ta 'H-NMR ta' ħxejjex aromatiċi magħżula twettaq ibbażat fuq il-protokoll deskritt minn Kim et al. [47] b'modifiki żgħar. Estratti ta 'ħxejjex mhux raffinati (25mg) ġew trasferiti f'tubu mikroċentrifugu mL. Taħlita ta' methanol-d4 u KHPO4 buffer f'Dao (pH 6.0) li fiha 0.1 fil-mija melħ tas-sodju tal-aċidu trimetil silipropioniku (TSP) ġiet miżjuda mal-kampjuni tal-ħxejjex aromatiċi b'volum totali ta' { {10}}.7mL fi proporzjon (1:1). It-tubi tal-mikroċentrifuga li fihom estratti tal-ħxejjex ġew imbagħad vortexed għal 1 min f'temperatura tal-kamra segwit minn ultrasonikazzjoni għal 15 min. Imbagħad, it-taħlita ġiet ċentrifugata għal 10 min f'5678g biex tissepara s-supernatant minn kwalunkwe materjali li ma jistgħux jissolvew. Sussegwentement, 0.6mL supernatant ċar ġie inkorporat f'tubi NMR u soġġett għal analiżi 'H-NMR. L-analiżi ta ''H-NMR twettqet permezz ta' spettrometru Varian INOVA NMR ta' 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) li ħadem fi frekwenza ta '499.887 MHz u spettri ġew irreġistrati f'26 grad. Kull spettru wieħed kien jinkludi 64 skan bi 3.53 min ta 'ħin ta' akkwist u wisa 'ta' 20 ppm. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta 'softwer Chenomx (v.6.2) (Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Kanada) biex twettaq korrezzjoni ta' fażi u linja bażi b'setting konsistenti. L-analiżi tad-dejta multivarjata saret bl-użu tas-softwer SIMCA (verżjoni 13.0, Umetrics, Umea, l-Isvezja). 3.11. Bucketing ta' 'H-NMR Spectra

Buketingof H-NMR spettri ġew implimentati bl-użu Chenomxsoftware (v.6.2, Edmonton, AB, Kanada). L-ispettri kollha ġew imqassma minn0.5-10.0 pprn reġjun bl-istess parametri. Il-parametri inkludew wisa 'spettrali ta' §0.04 li kiseb total ta '245 reġjun integrat għal kull spettru NMR. Il-bidla kimika għall-ilma u metanol-d residwu f'δ4.70-4.90 u δ3.27-3.35 rispettivament ġew eliminati. Id-dejta uniformi binn imbagħad ġiet soġġetta għal analiżi tad-dejta multivarjata (MVDA).

3.12. Kwantifikazzjoni Relattiva ta' Metaboliti

Il-metaboliti identifikati ġew eżaminati għall-kwantifikazzjoni relattiva tagħhom li ġiet ikkalkolata abbażi tal-erja medja tal-quċċata tas-sinjali wara l-binning tal-ispettri LH-NMR.

3.13. Analiżi Statistika

Ir-riżultati kollha ta 'sitt repliki ġew espressi bħala l-medja ± devjazzjoni standard. Għall-kejl ta 'attivitajiet ta' scavenging radikali, inibizzjoni ta 'attivitajiet elastase u collagenase, u kwantifikazzjoni relattiva ta' metaboliti, saru analiżi statistiċi bl-użu ta 'Minitab 16 (Verżjoni 16, Minitab Inc., State College, PA, USA). Analiżi ta 'varjanza (ANOVA) ġew applikati biex jeżaminaw id-differenzi sinifikanti bejn il-mezzi b'p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. Konklużjonijiet

L-applikazzjoni ta 'analiżi H-NMR flimkien ma' MVDA kienet ta 'suċċess fl-investigazzjoni tal-varjazzjoni fil-metaboliti tal-ħxejjex aromatiċi magħżula. Il-plott tal-punteġġ tal-PCA wera separazzjoni distinta tal-ħxejjex aromatiċi skont ir-raggruppamenti tagħhom. Dan l-istudju wera li P. minus kellu l-ogħla effett ta 'scavenging radikali permezz ta' testijiet DPPH u ABTS u esebit l-ogħla attivitajiet kontra t-tixjiħ. Iż-żewġ biplots tal-analiżi PLS ivvalidaw aktar dan ir-riżultat, peress li nstabet assoċjazzjoni qawwija bejn il-metaboliti identifikati f'P. minus u l-bijoattivitajiet ittestjati. Il-metaboliti attivi maħsuba li jikkontribwixxu għall-attivitajiet ta ' scavenging radikali u l-proprjetajiet kontra t-tixjiħ ta ' P.minus inkludew quercetin, quercetin -3-O-rhamnoside, derivattivi myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin, u apigenin. Għalhekk, jista 'jiġi preżunt li dawn il-metaboliti kienu responsabbli għall-effett qawwi ta' scavenging radikali u proprjetajiet anti-aging għolja ta 'P. minus. Dawn il-metaboliti kienu prinċipalment mill-grupp tal-flavonoids, b'mod partikolari l-flavonols. Għalhekk, jista 'jiġi ssuġġerit li l-metaboliti minn P. minus jistgħu jkunu eradikatur ta' radikali ħielsa promettenti u inibitur ta 'enzimi li qed jixjieħu li jistgħu jintużaw biex jittardjaw is-sintomi tat-tixjiħ u għat-trattament ta' mard kroniku assoċjat mat-tixjiħ. Dawn is-sejbiet se jgħinu biex tiġi stabbilita l-qawwa ta 'P. minus bħala sors naturali potenzjali ta' aġenti kontra t-tixjiħ u bħala eradikatur tar-radikali ħielsa naturali.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Molekuli 2019, 24, 3208; doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules