Benefiċċji newroprotettivi tal-eżerċizzju u l-mitoq fuq il-funzjoni tal-memorja, id-dinamika mitokondrijali, l-istress ossidattiv, u n-newroinfjammazzjoni fil-firien tat-tixjiħ Indotti mid-D-Galactose Parti 2

2.6. Preparazzjoni tat-Tessut

Wara li tlestew 8 ġimgħat ta 'TE u testijiet tal-imġieba tal-memorja, il-firien kollha ġew ewtanizzati permezz ta' inalazzjoni tas-CO2, u t-tessuti tal-moħħ inħasdu minn 7 annimali f'kull grupp ta 'trattament.

It-test tal-imġieba tal-memorja huwa għodda effettiva għall-evalwazzjoni tal-memorja. Bil-pressjoni soċjali u tax-xogħol dejjem tiżdied, il-memorja tan-nies qed issir dejjem aktar importanti. Għalhekk, it-teħid ta 'test tal-imġieba tal-memorja jista' jgħinna nifhmu l-livell tal-memorja tagħna u nieħdu miżuri effettivi biex intejbu u nżommu l-memorja tagħna skont ir-riżultati tat-test.

Speċifikament, it-testijiet tal-imġieba tal-memorja jistgħu jevalwaw il-kapaċità tan-nies li jirċievu, jipproċessaw, jaħżnu u jirkupraw l-informazzjoni. Permezz ta 'ttestjar ta' tipi differenti ta 'informazzjoni bħal lingwa, numri, stampi, eċċ., il-memorja tan-nies tista' tiġi ttestjata bis-sħiħ. Ir-riżultati tat-test se jipprovdu punteġġi varji biex jgħinuna nifhmu d-dgħufijiet u s-saħħiet tagħna, u kif insaħħu l-memorja tagħna.

Fil-prattika, ħafna testijiet tal-imġieba tal-memorja jipprovdu wkoll pariri u suġġerimenti professjonali. Pereżempju, irqad tajjeb, dieta bilanċjata, eżerċizzju xieraq, u eżerċizzji regolari tal-moħħ huma kollha ta 'benefiċċju għat-titjib tal-memorja tan-nies. Permezz ta 'dawn il-metodi, nistgħu ntejbu l-ħin tagħna ta' żamma tal-memorja, il-kapaċità ta 'riproduzzjoni tal-memorja, u aspetti oħra, biex naddattaw aħjar għall-ħajja ta' kuljum jew għall-ħtiġijiet tax-xogħol.

Fil-qosor, test tal-imġieba tal-memorja huwa utli ħafna biex wieħed jifhem, jevalwa u jtejjeb il-memorja tiegħu. Għandna wkoll nadottaw metodi xierqa biex insaħħu l-memorja tagħna skont is-sitwazzjoni attwali tagħna, biex nibqgħu pedament sod għal ħajja aktar sodisfaċenti u għanja. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche jista' jtejjeb il-memorja b'mod sinifikanti minħabba li Cistanche huwa materjal mediċinali tradizzjonali Ċiniż b'ħafna effetti uniċi, li wieħed minnhom huwa li jtejjeb il-memorja. L-effett ta 'Cistanche ġej mid-diversi ingredjenti attivi li fih, inkluż aċidu tanniku, polysaccharides, flavonoid glycosides, eċċ Dawn l-ingredjenti jistgħu jippromwovu s-saħħa tal-moħħ b'diversi modi.

Ikklikkja Know Short-term Memory kif ittejjeb

Wara li sseparat il-kortiċi ċerebrali u l-ippokampus, it-tessut tal-moħħ kien iffriżat f'nitroġenu likwidu u maħżun f'-80 ◦C sal-analiżi. Il-5 annimali li jifdal intużaw għall-analiżi tal-immunoistokimika (IHC).

Wara li fetaħ il-kavità toraċika, 50 mM phosphate-buffered saline (PBS) għadda mill-ventrikul tax-xellug għal 10 min, u mbagħad l-annimal ġie mxerred b'4% paraformaldehyde (PFA) f'100 mM PBS.

Wara l-iffissar tal-perfużjoni, il-moħħ ġie maħsud, imqiegħed f'4% PFA, u ffissat għal 4 sigħat f'4 ◦C. It-tessut tal-moħħ fiss ġie mgħaddas f'soluzzjoni ta '30% sukrożju għal jumejn u mbagħad maqtugħ f'biċċiet ta' ħxuna ta '40 µm bl-użu ta' kriostat ( Leica Microsystems, Nussloch, il-Ġermanja).

2.7. Iżolament tal-mitokondrija

Biex tiżola l-mitokondrija, użajna Mitochondria Extraction Kit (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Għal kull 100 mg ta 'tessut tal-hippocampal, ġie miżjud 1 mL ta' buffer omoġenizzat.

Wara l-omoġenizzazzjoni, it-tessut ġie ċentrifugat f'900 × g għal 10 min f'4 ◦C, u s-supernatant ġie miġbur u ċentrifugat għal darb'oħra f'15, 000 × g għal 30 min f'4 ◦C.

Meta tieħu l-frazzjoni ċitosolika ċentrifugata, iċ-ċitosol ġie separat, u l-pellet li kien fadal tħallat sewwa f'1 mLof sospensjoni buffer, qabel iċ-ċentrifugazzjoni f'15, 000 × g għal 10 min f'4 ◦C.

Is-supernatant tneħħa, u ġie miżjud 1 mL ieħor ta' buffer ta' sospensjoni qabel ma ħallat sewwa u jerġa' jiġi ċentrifugat f'15,000× g għal 10 min f'4 ◦C.

Is-supernatant tneħħa, u l-pellet li kien fadal ġie maħlul f'1 mL ta' buffer tal-liżi mitokondrijali kompluta għal 30 min f'4 ◦C. L-estratt mitokondrijali mbagħad ġie ċentrifugat f'15,000x g għal 5 min f'4◦C, u s-supernatant (frazzjoni mitokondrijali) inġabar.

2.8. Punent Blotting
Il-proteina totali miksuba mill-iżolament mitokondrijali ġiet ikkwantifikata bl-użu tal-metodu Bradford. Ammont ugwali ta 'proteini mitokondrijali (30 µg kull korsija) ġie mgħobbi fuq elettroforesi tal-ġel tas-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) (8% jew 12%).

Wara l-elettroforeżi, il-proteini ġew trasferiti f'membrana Polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA).

L-imblukkar sar għal siegħa f'temperatura tal-kamra bl-użu ta '1 × Tris-buffered saline li fih soluzzjoni ta' Tween-20 (TBS-T) b'5% BSA, u mbagħad il-membrana ġiet irreaġita b'antikorpi primarji matul il-lejl f'4 ◦C.

Intużaw l-antikorpi primarji li ġejjin: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalase, u -actin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, dilwizzjoni:1 :1000); u TNF- (Abcam, Cambridge, UK, dilwizzjoni: 1:1000).

Il-membrani mbagħad ġew maħsula b'buffer tal-ħasil (PBS bi 0.1% Tween 20), u wara ġew inkubati b'antikorpi sekondarji tal-mogħoż kontra l-fenek konjugati mal-perossidasi taż-żwiemel (HRP) forp22 phox, gp91 phox, u TNF. - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, dilwizzjoni: 1:5000).

Intużaw antikorpi sekondarji tal-mogħoż kontra l-ġurdien HRPkonjugati għal Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, catalase, u -actin (Santa Cruz Biotechnology, dilwizzjoni: 1:5000).

Il-livelli ta 'espressjoni tal-proteini ġew skoperti bl-użu tas-sistema ta' skoperta ECL Western blotting (Santa Cruz Biotechnology). Id-densitajiet tal-meded tal-proteini żviluppati ġew analizzati bl-użu tas-sistema tal-immaġini tal-ġel ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.9. Immunoistokimika (IHC)
Għall-analiżi IHC, il-metodu free-floating intuża għat-tessut magħżul f'kull grupp ta 'trattament. Wara li ħasel it-tessut 3 × għal 10 min kull wieħed f'0.01 M PBS, it-tessut ġie inkubat f'80 ◦C għal 60 min f'tazza li fiha 0.01 M ċitrat tas-sodju, segwit minn imblukkar f'10% serum normali tal-ħmar (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).

Il-kampjun tat-tessut imbagħad ġie reazzjoni b'antikorpi primarji anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, dilwizzjoni: 1:500) u proteina aċiduża fibrillari anti-Glial (GFAP) (Abcam, dilwizzjoni: 1:500) għal 12 h f'4 ◦C. L-għada, it-tessut inħasel 3 × għal 5 minuti kull wieħed f'0.01 M PBS u mbagħad irreaġixxa b'antikorp sekondarju tal-mogħoż kontra l-ġurdien konjugat bl-HRP (Santa Cruz Biotechnology, dilwizzjoni: 1:5000) f'temperatura tal-kamra għal 2 sigħat.

Fl-aħħarnett, it-tessut ġie inkubat f'temperatura tal-kamra bl-użu ta 'soluzzjoni ta' kit Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), u r-riżultati ġew viżwalizzati bl-użu tad-DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories).

Kull porzjon tat-tessut ġie mmuntat fuq slide bl-użu ta 'mezz ta' immuntar (Vector Laboratories) u spezzjonat permezz ta 'mikroskopju tad-dawl (Leica Microsystems).

2.10. Analiżi Statistiċi

Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta' SPSS għall-Windows Verżjoni 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Il-valuri kollha huma espressi bħala l-medja ± SEM. Is-sinifikat statistiku kien determinat permezz ta' ANOVA one-way. Testijiet post hoc Bonferroni ntużaw għal paraguni multipli. Id-differenzi ġew ikkunsidrati statistikament sinifikanti f'p < 0.05.

3. Riżultati

3.1. Effetti ta' Eżerċizzju Treadmill u MitoQ fuq l-Espressjoni ta' Proteini Relatati mad-Dinamika Mitokondrijali fl-Ippokampus tal-Firien li Tixjiħ Indotti minn D-Gal

Aħna vverifikajna li TE u MitoQ affettwaw fatturi relatati mal-fużjoni mitokondrijali (Mfn1, Mfn2, Opa1) u fatturi relatati mal-fissjoni (Drp1, Fis1) fl-ippokampus tal-firien li qed jixjieħu (Figura 1).

Il-livelli ta' espressjoni ta' fatturi relatati mal-fużjoni mitokondrijali kienu differenti b'mod sinifikanti bejn il-gruppi ta' trattament (Mfn1, F4, 34=134.750, p <0.001; Mfn2, F4,34=80. 816, p < 0.001;Opa1, F4,34=51.456, p=0.001).

Il-livelli ta' espressjoni ta' fatturi relatati mal-fissjoni mitokondrijali kienu wkoll differenti b'mod sinifikanti bejn il-gruppi ta' trattament (Drp1, F4,34=53.448, p <0.001; Fis1,F4,34=116 .313, p < 0.001). Ir-riżultati tat-test post hoc huma murija fil-Figura 1.

Meta mqabbel mal-grupp Y-CON, l-espressjoni ta 'fatturi relatati mal-fużjoni mitokondrijali naqset fil-grupp D-CON u wriet xejriet dejjem jiżdiedu fil-gruppi D-TE, D-MI, u D-COMBI.

Min-naħa l-oħra, l-espressjoni tal-fattur Drp1 relatat mal-fissjoni mitokondrijali żdiedet fil-grupp D-CON meta mqabbel mal-grupp Y-CON. Filwaqt li s-sinjali tal-fissjoni mitokondrijali naqsu bi trattament kombinat ma 'TE, it-trattament MitoQ waħdu ma wassalx għal bidla sinifikanti.

Il-fattur ieħor relatat mal-fissjoni mitokondrijali, Fis1, wera l-istess xejriet ta' tnaqqis bħal Drp1 iżda naqas ukoll bit-trattament MitoQ waħdu.

Figura 1. Effett ta 'eżerċizzju ta' treadmill u mitoquinone (MitoQ) fuq l-espressjoni ta 'proteini relatati mad-dinamika mitokondrijali fl-ippocampus ta' firien li qed jixjieħu indotti D-galactose (D-gal). (A) Blots rappreżentattivi tal-Punent ta 'fużjoni mitokondrijali u proteini relatati mal-fissjoni. (B-F) Analiżi densitometrika tal-meded Western blot normalizzati għal -Actin. Id-dejta murija fil-Western blot huma mezzi minn seba' imħuħ tal-firien.

-Actin kien ittestjat bħala kontroll intern. Bonferroni post hoc testwas użat wara ANOVA. Il-valuri huma mezzi ± SEM.

a Tindika differenza statistika mill-grupp tal-grupp ta' kontroll żgħażagħ (Y-CON). b Tindika differenza statistika mill-grupp tal-grupp D-galactose (D-CON). c Tindika differenza statistika mill-grupp ta' eżerċizzju ta' D-galactose flimkien ma' treadmill (D-TE).

d Tindika differenza statistika mill-grupp D-galactose flimkien ma' MitoQ (D-MI) (p < 0.05). D-COMBI; D-galactose flimkien ma' TE u grupp MitoQ.

3.2. Effetti ta 'Eżerċizzju Treadmill u MitoQ fuq l-Espressjoni ta' Subunitajiet NADPH Oxidase fil-Cortex Ċerebrali u Hippokampus ta 'Firien Tixjiħ Indotti minn D-Gal

Aħna osservajna differenzi sinifikanti bejn il-gruppi ta 'trattament fl-immunoreattività ta' p22 phox fil-kortiċi ċerebrali u l-ippokampus tal-firien li qed jixjieħu (Figura 2) (CA3,F4,24=18.786, p <0.{{11 }}01; kortiċi, F4,24=12.662, p < 0.001).

Fil-kortiċi, il-gruppi D-CON wera żieda fl-immunoreattività ta 'p22 phox meta mqabbel mal-grupp Y-CON, li naqas b'mod sinifikanti fil-gruppi D-TE, D-MI, u D-COMBI.

F'CA3, żieda fl-immunoreattività ta 'p22 phox naqset fil-gruppi D-TE u D-COMBI meta mqabbla ma' D-CON. Il-livelli ta' espressjoni tal-proteini tas-subunitajiet NOX p22 phox, gp91 phox, u p47phox kienu differenti b'mod sinifikanti bejn il-gruppi (p22 phox, F4,{{10}}.513, p <0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p < 0.001; p47 phox, 34=69.249, p < 0.001).

Ir-riżultati tal-post hoctest wrew żieda sinifikanti fil-livelli tas-subunità NOX fid-D-CON meta mqabbla mal-Y-CON. Madankollu, il-livelli tas-subunità NOX kienu aktar baxxi fil-gruppi kollha ta 'intervent meta mqabbla mal-grupp D-CON.

B'mod partikolari, l-espressjoni ta 'p22 phox u gq91 phox naqset b'mod sinifikanti fid-D-TE meta mqabbla mal-grupp D-MI. Dawn is-sejbiet jimplikaw li l-eżerċizzju u MitoQ individwalment jipprevjenu stress ossidattiv ikkawżat mit-tixjiħ fil-moħħ, iżda l-kombinazzjoni tagħhom ma tirriżulta fl-ebda effett addizzjonali.

Figura 2. Effetti ta 'eżerċizzju ta' treadmill u MitoQ fuq l-espressjoni ta 'subunitajiet NADPH oxidase fil-kortiċi ċerebrali u hippocampus ta' firien li qed jixjieħu indotti minn D-gal. (A1) Fotomikrografi li juru l-immunoreattività ta 'NAPDH p22 phox fil-kortiċi ċerebrali u l-ippokampus ta' agingrats indotti minn D-gal f'kull grupp. Rettangoli suwed f'A1 jindikaw il-porzjon tal-immaġini kif muri f-i up-t. (A2, A3) Kwantifikazzjoni tad-densità ottika tat-tbajja 'NADPH p22 phox fil-kortiċi ċerebrali u l-ippokampus.

Bonferroni post hoc test wara ANOVA. Il-valuri huma ppreżentati bħala mezzi ± SEM.(n=5 annimali). (a–e u k–o) Skala=100 µm, (f–j u p–t) Skala=50 µm. (B) Immaġini Rappreżentanti Western blot għal subunitajiet NADPH oxidase fil-hippocampus.

(C – E) Kwantifikazzjoni ta 'subunitajiet NADPH oxidase fl-ippokampus. Id-dejta murija fil-Western blot kienet mezzi minn seba' imħuħ tal-firien. -Actin kien ittestjat bħala kontroll intern. Test post hoc Bonferroni intuża wara ANOVA. Il-valuri huma mezzi ± SEM.

a Tindika differenza statistika mill-grupp Y-CON. b Tindika differenza statistika mill-grupp D-CON. c Tindika differenza statistika mill-grupp D-TE.(p <0.05).

3.3. Effett tal-Eżerċizzju Treadmill u MitoQ fuq l-Espressjoni GFAP fil-Cortex Ċerebrali u l-Hippocampal Dentate Gyrus tal-firien li qed jixjieħu Indotti minn D-Gal

Aħna osservajna differenzi sinifikanti bejn il-gruppi ta 'trattament fl-immunoreattività tal-GFAP fil-kortiċi ċerebrali u l-ġirnu dentat tal-hippocampal (DG) ta' firien li qed jixjieħu (Figura 3) (Cortex, F4, 24=13.524, p <0.001 ; DG, F4,24=30.364).

Ir-riżultati tat-test post hoc wrew li t-trattament D-gal żied b'mod sinifikanti l-immunoreattività tal-GFAP kemm fil-kortiċi kif ukoll f'DG.

Meta mqabbel mal-grupp D-CON, il-livelli ta 'GFAP fil-kortiċi naqsu fil-gruppi kollha ta' intervent, u l-livelli ta 'GFAP f'DG naqsu fil-gruppi D-TE u D-COMBI, filwaqt li l-grupp D-MI wera differenzi fl-immunoreattività tal-GFAP biss. fir-reġjun tal-kortiċi.

Għalhekk, għalkemm it-trattament TE jew MitoQ naqqas newroinflammation indotta minn D-gal fil-kortiċi, l-intervent TE biss ipproduċa effetti pożittivi fid-DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com