Natalenamides A–C, Tripeptidi ċikliċi Mill-Actinomadura Assoċjat mat-Termiti Sp. RB99

Astratt:

F'dawn l-aħħar snin, żdiedu l-investigazzjonijiet fil-bijokimika tal-batterji assoċjati mal-insetti. Meta kkombinati ma 'proċessi analitiċi ta' dereplikazzjoni, dawn l-istudji jipprovdu strateġija qawwija biex jiġu identifikati komposti ġodda strutturalment u/jew bijoloġikament. Peptidi ċikliċi mhux sintetizzati b'mod ribosomiku għandhom spettru wiesa' ta' bijoattività b'potenzjal mediċinali għoli.

Hawnhekk, nirrapportaw l-iskoperta ta 'tliet tripeptidi ċikliċi ġodda: natalenamides A–C (komposti 1–3). Dawn il-komposti ġew identifikati mill-brodu tal-kultura tal-Actinomadura sp. RB99 bl-użu ta' metodu ta' dereplikazzjoni ibbażat fuq kromatografija likwida (LC)/ultravjola (UV)/spettrometrija tal-massa (MS). L-istrutturi kimiċi tal-komposti l-ġodda (1-3) ġew stabbiliti permezz ta' analiżi ta' metodi spettroskopiċi komprensivi, inklużi manjetiċi nukleari b'dimensjoni waħda (1H u 13C) u bidimensjonali (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) spettroskopija ta 'reżonanza (NMR), flimkien ma' data ta 'spettrometrija tal-massa ta' jonizzazzjoni elettrospray b'riżoluzzjoni għolja (HR-ESIMS). Il-konfigurazzjonijiet assoluti tal-komposti l-ġodda ġew spjegati bl-użu tal-analiżi ta 'Marfey. Permezz ta' diversi testijiet ta' bijoattività għat-tripeptidi, sibna li l-kompost 3 wera effetti inibitorji sinifikanti fuq il-produzzjoni ta' melanin indotta minn 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX). L-effett tal-kompost 3 kien simili għal dak tal-aċidu kojic, kompost użat b'mod estensiv bħala materjal kożmetiku b'effett li jbajdu l-ġilda.

Ġilda ġusta, lixxa, u delikata dejjem kienet l-għan segwit min-nisa orjentali. Ir-riċerka u l-iżvilupp ta 'aġenti li jbajdu għal prodotti għall-kura tal-ġilda huma prinċipalment ibbażati fuq l-inibizzjoni tal-attività ta' tyrosinase.

Il-komposti li fihom ċrieki tal-benżin jew strutturi ta 'hydroxyl fenoliċi għandhom effetti potenzjali li jbajdu, bħall-aġent li jbajdu l-arbutin li jintuża b'mod komuni bħalissa, li jista' jeżerċita effetti li jbajdu billi jinibixxi l-attività ta 'tyrosinase.

U sibna li Cistanche deserticola għandha effett li jbajdu. L-ingredjent attiv ewlieni ta 'Cistanche deserticola, phenylethanoid glycosides, huwa tip ta' kompost glycoside naturali. Studji sabu li phenylethanoid glycosides jistgħu jinibixxu l-attività ta 'tyrosinase u l-produzzjoni ta' melanin fil-melanoċiti epidermali umani, u għandhom effett li jbajdu. effikaċja tal-aġent.

Ikklikkja cistanche tubulosa estratt trab

Kliem ewlieni:

termite li tikber il-fungus; Actinomadura sp.; tripeptidi; natalenamidi A–C; effetti li jbajdu l-ġilda.

1. Introduzzjoni

L-analiżi kimika ta 'simbjoti batterjali protettivi ta' insetti tal-biedja ġibdet ħafna attenzjoni fost il-kimiċi tal-prodotti naturali f'dawn l-aħħar snin [1-5]. Bl-użu ta' proċessi ta' dereplikazzjoni bbażati fuq ir-reżonanza manjetika nukleari (NMR)/spettrometrija tal-massa (MS) tal-aktar avvanzata u bijoassaġġi ekoloġikament rilevanti, ġew mikxufa ammont impressjonanti ta' prodotti naturali strutturalment intriganti, inklużi diversi peptidi ċikliċi sintetizzati b'mod mhux ribosomiku. minn simbionti mikrobjali [6]. L-eżempji l-aktar prominenti jinkludu d-dentigerumycin antifungali, depsipeptide ċikliku iżolat minn Pseudonocardia sp. [7], u l-gerumycins A–C, depsipeptides ċikliċi li jġorru l-aċidu piperazic identifikati minn Pseudonocardia sp. [8].

Peptidi ċikliċi intwerew li juru firxa wiesgħa ta 'attivitajiet bijoloġiċi, li jrawmu diversi approċċi sintetiċi lejn dawn l-istrutturi farmakoloġikament promettenti [9-12]. Aktar minn 40 droga peptide ċikliku bħalissa huma kkummerċjalizzati u utilizzati b'mod wiesa 'f'ambjenti kliniċi, u madwar mediċina waħda ġdida ta' peptide ċikliku tidħol fis-suq kull sena, bħala medja [13].

Bħala parti mill-isforz kontinwu tagħna biex nidentifikaw metaboliti sekondarji strutturalment ġodda u/jew bijoattivi minn mikrobi assoċjati mat-termites [14-17], aħna ffukajna fuq l-Actinomadura sp. RB99, iżolat mit-termite li tikber il-fungus, Macrotermes natalensis. L-istrateġija ta 'dereplication ibbażata fuq il-kromatografija likwida (LC)/ultravjola (UV)/spettrometrija tal-massa (MS) tagħna tat prodotti naturali bijoattivi potenzjalment ġodda. F'dan l-istudju, nirrapportaw l-iżolament u l-identifikazzjoni kimika ta 'tliet tripeptidi ċikliċi ġodda, natalenamide A-C (komposti 1-3, Figura 1), bl-użu ta' metodu ta 'dereplication ibbażat fuq LC/UV/MS kif ukoll l-evalwazzjonijiet bijoloġiċi tagħhom għal ċitotossiċi. , attivitajiet anti-infjammatorji, u li jbajdu l-ġilda.

2. Riżultati u Diskussjoni

2.1. Kromatografija likwida (LC)/Ultravjola (UV)/Iżolament tal-Komposti 1–3 Ibbażat fuq Spettrometrija tal-Massa (MS)

Actinomadura sp. RB99 kien iżolat mill-wiċċ ta 'ħaddiem termite (M. natalensis). Analiżi filoġenetika ta 'sekwenza ta' aċidu ribonuklejku ribosomali (rRNA) 16S kważi kompluta tissuġġerixxi li r-razza RB99 tappartjeni għall-ġeneru Actinomadura, bl-eqreb ġar Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Analiżi sussegwenti bbażata fuq LC/UV/MS ta 'estratti ta' kultura arrikkita żvelat sett ta 'assorbimenti UV karatteristiċi b'qċaċet ta' joni molekulari uniċi li fihom atomi tan-nitroġenu.

Biex jiġu identifikati l-metaboliti rispettivi u tinvestiga l-attività tagħhom, fermentazzjoni fuq skala kbira bl-użu ta 'kundizzjonijiet ta' tkabbir ottimizzati (100 pjanċi agar minn 2 L ISP2 agar, pH 6, 10 ijiem f'30 ◦C) u proċedura stabbilita ta 'xogħol u ta' purifikazzjoni minn qabel applikati [17]. Il-frazzjonament sussegwenti ggwidat mill-LC-UV/MS u l-kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja semi-preparattiva ripetittiva (HPLC) irriżulta fl-iżolament ta' tliet metaboliti b'mudell uniku NMR/MS. Għamilna studji dwar it-tkabbir u l-midja bl-użu ta' melħ differenti (NaCl, KBr 1–3 fil-mija) u kompożizzjonijiet tal-midja (medja ISP1-6) biex nimitaw l-ambjent naturali u nistimulaw il-produzzjoni tal-metaboliti, li wasslu wkoll għall-preżenza tat-tliet ġodda. metaboliti (ara Figura Supplimentari S19).

2.2. Iluċidazzjoni Strutturali tal-Komposti

Natalenamide A (1) ġie akkwistat bħala trab amorfu. Il-formula molekulari ta '1 ġiet iddeterminata li hija C19H25N3O5 mill-jone molekulari miżjud bis-sodju f'm/z 398.1691 [M plus Na] plus (ikkalkulat għal C19H25N3O5Na, 398.1692) bl-użu ta' mod ta 'jone pożittiv b'riżoluzzjoni għolja (HR spettrometrija tal-massa ta' jonizzazzjoni elettrospray data ESIMS). L-ispettru infra-aħmar (IR) wera faxxa ta 'assorbiment qawwija f'167 0 ċm-1, li tissuġġerixxi l-preżenza ta' gruppi amide fil-molekula. L-analiżi dettaljata tad-dejta 1H NMR ta '1 (Tabella 1) indikat is-sinjali tipiċi ta' skeletru peptide, li juri żewġ sinjali tal-metil (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29) }} Hz, H-3) u 0.92 (3H, d, J=7.{0 Hz, H{-4)), tliet sinjali tal-metilin (δH 1.95 (1H, m, H-7a), 2.27 (1H, m, H-8a), 2.36 (1H, m, H{-8b), 2.48 (1H) , m, H{{50}}b), 2.97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a), u 3.20 (1H, dd, J=14.{0, 5.0 Hz, H{-12b)), erba' sinjali ta' metina (δH 2.02 (1H) , m, H-2), 4.16 (1H, d, J=7.5 Hz, H{-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4.5 Hz, H-6), u 4.63 (1H, dd, J=8.0, 5.0 Hz, H{-11)), u ħames protoni aromatiċi sovrapposti (δH 7.18 (1H, m, H-16), 7.23 (2H, m, H-14/18), u 7.24 (2H, m, H{-15/17)).

L-ispettru 13C NMR (Tabella 1), b'assistenza mill-ispettri HSQC u HMBC, wera total ta' 19-il reżonanza tal-karbonju responsabbli għal żewġ sinjali tal-metil (δC 18.9 u 19.9), tliet sinjali tal-metilin (δC 27.0, 30.6, u 38.8), disa' sinjali methine (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2), u 130.6 (×2)), inklużi ħames karbonju aromatiċi, karbonju olefiniku wieħed sinjal (δC 138.8), u erba 'sinjali tal-karbonju tal-karbonil (δC 173.2, 173.3, 174.8, u 181.3). Flimkien mad-dejta spettroskopika ta 'hawn fuq, spezzjoni dettaljata ta' NMR bidimensjonali (2D) (esperimenti 1H-1H COSY, HSQC, u HMBC) żvelat il-preżenza ta 'tliet aċidi amminiċi f'1: glutamate (Glu), phenylalanine ( Phe), u valine (Val) (Figura 2). Il-konnettività ta' dawn l-aċidi amminiċi kienet determinata mill-korrelazzjonijiet HMBC ta' H-1/C-5 u C-19, H-11/C-10 u C{ {50}}, u H-6/C-5 u C-10 (Figura 2).

Biex tiġi identifikata l-konfigurazzjoni assoluta ta '1, il-metodu ta' Marfey ġie applikat biex tiddetermina l-isterjokimika tal-multipli -H (C-1, C-6, u C-11). L-idrolisati tal-aċidu ta' 1 u aċidi amminiċi standard (L/D-Glu, Phe, u Val) ġew derivatizzati bi 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanine amide (L-FDAA). Suċċessivament, it-taħlita derivatizzata ta '1 u l-aċidi amminiċi standard ġew analizzati b'LC/MS biex jeżaminaw il-ħin ta' żamma tagħhom. Il-konfigurazzjonijiet assoluti tal-moeties Glu, Phe, u Val kienu kollha determinati li huma forom L, ibbażati fuq il-ħinijiet ta 'żamma tad-derivattivi L-FDAA ta' 1 meta mqabbla ma 'dawk tal-aċidi amminiċi standard. Għalhekk, l-istruttura ta '1 ġiet spjegata bħala l-tripeptide ċikliku muri fil-Figura 1.

Natalenamide B (2) kien iżolat bħala trab amorfu. Il-formula molekulari tagħha (C20H27N3O5) ġiet dedotta mill-idroġenu u l-qċaċet tal-jone molekulari adducted bis-sodju f'390.2032 [M plus H] plus (ikkalkulat għal C20H28N3O5, 390.2029) u 412.1849 [M plus Na] plus (ikkalkulat rispettivament għal C202.18. Meta mqabbel mal-formula molekulari u d-dejta spettrali NMR ta '1, il-kompost 2 deher li kellu grupp CH2 addizzjonali fl-iskeletru tal-peptidi. Skrutinju komprensiv tal-ispettri unidimensjonali (1D) (1H u 13C NMR) u 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC, u HMBC) ta' 2 wera l-eżistenza ta' tliet residwi ta' amino acids: Glu, Phe u Leu (lewċina). Is-sekwenza ta' dawn l-aċidi amminiċi nbniet abbażi tal-korrelazzjonijiet HMBC ta' H-1/C-6 u C-20, H-12/C-11 u C -20, u H-7/C-6 u C-11 (Figura 2). Biex tiddetermina l-konfigurazzjoni assoluta ta '2, saret derivatizzazzjoni tar-residwi Glu, Phe, u Leu b'L-FDAA u mbagħad ġiet analizzata b'LC/MS. Fid-dejta LC/MS, L-Glu, L-Phe, u L-Leu ġew skoperti billi tqabbel il-ħinijiet ta 'żamma għad-derivattivi L-FDAA ta' 2 ma 'dawk tal-aċidi amminiċi standard. Għalhekk, l-istruttura kimika ta '2 ġiet stabbilita bħala l-tripeptide ċikliku muri fil-Figura 1.

Id-dejta tal-HR-ESIMS tal-mod pożittiv ta’ natalenamide C (3) wriet joni molekulari ta’ idroġenu u sodju adducted f’424.1870 [M flimkien ma’ H] plus (ikkalkulat għal C23H26N3O5, 424.1872) u 446.1694 [M flimkien ma’ Na] plus (ikkalkulat għal C3O3H25N, 424.1872) 424.1692). Dan issuġġerixxa li l-formula molekulari tagħha kienet C23H25N3O5. Analiżi dettaljata tal-ispettri 1D u 2D NMR ta '3 indikat li l-istruttura kimika tagħha kienet simili għal dik ta' 2, ħlief Leu ġie sostitwit b'Phe fi 3. Il-konnettività tat-tliet aċidi amminiċi identifikati fi 3 ġiet ivverifikata bl-użu tal-korrelazzjonijiet HMBC ta ' H-1/C-9 u C-23, H{-15/C-14 u C-23, u H-10/ C-9 u C-14 (Figura 2). Bl-applikazzjoni tal-metodu ta' Marfey għall-kompost 3, il-konfigurazzjonijiet assoluti tal-multipli -H (C-1, C-10, u C-15) ġew spjegati li huma L-Glu wieħed u żewġ L -Moieties Phe. Għaldaqstant, l-istruttura sħiħa ta '3 ġiet iddeterminata kif muri fil-Figura 1.

Natalenamides A–C huma peptidi triċikliċi, preżumibbilment ta 'oriġini mhux ribosomi. Bħalissa, bosta tripeptidi ċikliċi bijoattivi ġew ikkaratterizzati bħala prodotti naturali: tripeptidi ċikliċi ċitotossiċi 17-membri (eż. OF4949 I–IV) iżolati minn Penicillium rugulose [18]; sklerotomiji antifungali A−K, identifikati mill-brodu tal-fermentazzjoni ta' batterji halotolleranti [10]; u E psikrofiliku antiproliferattiv, iżolat minn kultura mħallta ta' żewġ razez fungali derivati ​​mill-alga tal-baħar tal-ġeneru Aspergillus [19].

2.3. Attivitajiet Bijoloġiċi tal-Komposti 1-3

Peress li l-peptidi ċikliċi ġew irrappurtati li juru firxa wiesgħa ta 'attivitajiet bijoloġiċi, l-effetti bijoloġiċi tat-tripeptidi ċikliċi iżolati ({{0}}) ġew evalwati bl-użu ta' tliet bijoattivitajiet. Iċ-ċitotossiċità tal-komposti 1-3 ġiet investigata kontra erba' linji taċ-ċelluli tal-kanċer (ċelluli tal-kanċer tas-sider MCE7, ċelluli tal-kanċer ċervikali HeLa, ċelluli tal-kanċer tal-pulmun uman A549, u ċelluli tal-kanċer tal-fwied HepG2) f'konċentrazzjonijiet differenti (0, 6.25 , 12.5, 25, 50, u 100 uM). Il-Kompon 1 ma affettwax il-vijabbiltà taċ-ċelluli taċ-ċelloli MCF-7, HeLa, jew A549. Madankollu, it-trattament taċ-ċelloli HepG2 b'100 M ta 'kompost 1 naqqas il-vijabbiltà taċ-ċelluli għal 78.5 flimkien ma' 3.2 fil-mija (Figura 3). Il-kompost 2 naqqas il-vijabilità taċ-ċelluli taċ-ċelloli HeLa u A549 għal 82.9  2.1 fil-mija u 73.5=3.0 fil-mija , rispettivament, iżda ma affettwax il-vijabbiltà tal-MCF{-7 jew Ċelloli HepG2 (Figura 3). Il-kompost 3 ma affettwax il-vijabbiltà ta 'xi waħda mil-linji taċ-ċelluli (Figura 3).

Sussegwentement, intużaw makrofaġi RAW264.7 biex jinvestigaw l-effetti anti-infjammatorji tal-komposti iżolati. Biex jiġu eliminati l-iżbalji fil-produzzjoni ta 'NO ikkawżati minn rati ta' sopravivenza taċ-ċelluli li jinbidlu, ġew eżaminati konċentrazzjonijiet mhux tossiċi ta 'kull kompost. Kif muri fil-Figura 4, il-komposti 1-3 kellhom ftit effetti ċitotossiċi fiċ-ċelloli RAW264.7 (Figura 4A-C) u ma eżerċitaw l-ebda effetti inibitorji fuq il-produzzjoni ta 'NO f'ċelluli RAW264.7 stimulati minn lipopolysaccharide (LPS) (Figura 4D-F) .

L-effetti inibitorji tal-komposti 1-3 fuq il-kontenut tal-melanin fiċ-ċelloli B16F10 ġew eżaminati bħala evidenza tal-attivitajiet tagħhom li jbajdu l-ġilda (Figura 5). Peress li l-bidliet fil-vijabbiltà taċ-ċelluli jikkawżaw żbalji fil-produzzjoni u l-kejl tal-melanin, l-ewwel eżaminajna l-effetti tal-komposti 1-3 fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli B16F10. Il-komposti 1-3 ma eżerċitaw l-ebda effetti ċitotossiċi fiċ-ċelloli B16F10 fi kwalunkwe mill-konċentrazzjonijiet użati (Figura 5A-C). Imbagħad ivvalutajna l-effetti inibitorji tal-komposti fuq il-produzzjoni tal-melanin indotta minn 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) fiċ-ċelloli B16F10 (Figura 5D–F). IBMX, stimulatur magħruf tal-melanoġenesi, jinduċi żieda sinifikanti fil-produzzjoni tal-melanin wara trattament wieħed fiċ-ċelloli tal-melanoma. Fost il-komposti evalwati, il-kompost 3 (f'5-100 µM) wera effetti inibitorji sinifikanti fuq is-sintesi tal-melanin medjata minn IBMX b'mod dipendenti mid-doża. L-aċidu kojiku, il-kontroll pożittiv tagħna, intuża b'mod estensiv bħala materjal kożmetiku b'effetti li jbajdu l-ġilda [20]. L-effett inibitorju tal-kompost 3 fuq il-produzzjoni tal-melanin indotta minn IBMX kien simili għal dak tal-aċidu kojic (Figura 5F), li jissuġġerixxi li l-kompost 3 jiffunzjona bħala inibitur qawwi tal-produzzjoni tal-melanin indotta minn IBMX fiċ-ċelloli tal-melanoma B16F10.

Barra minn hekk, il-kompost 3 kien ikkontaminat b'numru żgħir ta 'impuritajiet, li ġew determinati li huma analogi ta' aċidu xaħmi bl-interpretazzjoni ta 'dejta spettroskopika NMR u analiżi LC/MS (Materjali Supplimentari, Figuri S11-S15 u S23). Biex tiġi identifikata l-attività tal-impuritajiet, saru esperimenti addizzjonali bl-analogi tal-aċidu xaħmi għall-effetti inibitorji tagħhom fuq il-produzzjoni tal-melanin indotta minn IBMX fiċ-ċelloli B16F10, li wrew li l-komposti ttestjati ma kellhom l-ebda effett li jbajdu (Materjali Supplimentari, Figura S24). Għalhekk, għalkemm ma nistgħux neskludu li l-impuritajiet fil-kompost 3 huma responsabbli għall-effett inibitorju fuq il-produzzjoni tal-melanin indotta minn IBMX, dan jidher improbabbli.

3. Materjali u Metodi

3.1. Proċeduri Sperimentali Ġenerali

L-ispettri infra-aħmar ġew akkwistati fuq spettrometru Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA). L-ispettri tal-jonizzazzjoni tal-electrospray u HR-ESIMS ġew imkejla fuq spettrometru tal-massa tal-kromatografija likwida SI-2/LCQ DecaXP (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). L-ispettri NMR, inklużi l-esperimenti 1H–1H COSY, HSQC, u HMBC, twettqu bl-użu ta’ spettrometru NMR Varian UNITY INOVA 800 (Varian, Palo Alto, CA, USA) li jaħdem f’800 MHz (1H) u 200 MHz (13C), bi bidliet kimiċi mogħtija f'ppm (δ). HPLC preparattiv utilizzat pompa Waters 1525 Binary HPLC b'Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Ġel tas-silika 60 (malji 230-400, Merck, Kenilworth, NJ, USA) u ġel tas-silika RP-C18 (malji 230-400, Merck, intużaw għall-kromatografija tal-kolonna. HPLC semi-preparattiv użat Sistema HPLC Shimadzu Prominence b'SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultravjola-viżibbli (UV-Vis) Detectors (Shimadzu, Tokyo, Ġappun) Twettqu analiżi LC/MS fuq sistema HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) mgħammra b'detector array diode u spettrometru tal-massa ESI Serje 6130 b'Kinetex analitiku (4.6 × 100 mm, 3.5 µm). Intużaw pjanċi F254 tal-ġel tas-silika miksija minn qabel Merck u pjanċi RP-18 F254s għal rqiqa. -kromatografija ta 'saff (TLC).Spots ġew skoperti fuq TLC taħt dawl UV jew permezz ta' tisħin wara bexx b'soluzzjoni anisaldehyde-sulfuric acid.

3.2. Materjal mikrobjali

Actinomadura sp. RB99 kien iżolat mill-wiċċ ta' ħaddiem termite tal-ġeneru, M. natalensis, (kolonja Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) fit-2 ta' Jannar0 {13}}10. Il-bijomaterjal tpoġġa f'boroż tal-plastik nodfa u pproċessat fi żmien ġurnata mill-ġbir. It-termites ġew maħsula f'ilma dejonizzat sterili, u l-batterji ġew iżolati billi s-sospensjonijiet li jirriżultaw fuq midja b'nutrijenti baxxi ġew miksija b'chitin (kull litru: 4 g chitin, 0.7 g K2HPO4, 0.3 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.001 g ZnSO4, 0.001 g MnCl2, u 20 g agar) [21]. Iżolati b'morfoloġija bħal Actinobacteria ġew trasferiti għal ISP2 agar (għal kull litru: 10 g estratt tax-xgħir, 4 g estratt tal-ħmira, 4 g glukożju, u 20 g agar), u sub-kultivati ​​sakemm inkisbu iżolati puri.

3.3. Estrazzjoni tad-DNA u Amplifikazzjoni tar-Reazzjoni tal-Katina tal-Polymerase

Actinomadura sp. RB99 tkabbar f'medja likwida b'ħafna nutrijenti ISP2 għal ħames sa sebat ijiem f'30 ◦C. Inħasdu ċ-ċelloli, u d-DNA ġenomika ġiet estratta bl-użu tal-kit tal-purifikazzjoni tad-DNA ġenomika GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur bil-bidliet li ġejjin: (a) it-trattament tal-lysozyme ġie estiż għal 40 min, u (b) it-trattament tal-proteinażi K ġie estiż għal 40 min. Id-DNA ġie kkwantifikat fotometrikament bl-użu ta' spettrometru Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Għal studji filoġenetiċi, il-ġene 16S rRNA ġie amplifikat bl-użu tas-sett primer, 1492R/27F. Kull reazzjoni ta’ amplifikazzjoni ġiet ippreparata f’volum ta’ reazzjoni finali ta’ 25 µL li kien fih 7.25 µL ta’ ilma distillat, 5 µL ta’ buffer HF, 5 µL ta’ kull primer (2.5 µM), {{10}}.5 µL ta’ dNTPs (10 µM), 0.25 µL ta’ Phusion High-Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), u 2 µL ta’ DNA estratt (mudell). Reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) saret taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: 98 ◦C għal 38 s; 32 ċiklu ta '98 ◦ għal 30 s, 52 ◦C għal 45 s, 72 ◦C għal 1 min 20 s; u estensjoni finali ta' 72 ◦C għal 8 min. Il-prodott tal-PCR ġie viżwalizzat permezz tal-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose, u r-reazzjonijiet tal-PCR ġew ippurifikati bl-użu ta 'kit ta' purifikazzjoni tal-PCR (Thermo Scientific). Frammenti tad-DNA ġew sekwenzati fil-GATC (Konstanz, il-Ġermanja).

3.4. Sekwenzar u Identifikazzjoni ta' Speċi

Is-sekwenzi ġew evalwati għall-purità u t-tlaqqigħ ħażin bl-użu ta 'BioEdit [22]. Is-sekwenzi bil-quddiem u b'lura miksuba għal kull razza ġew assemblati b'BioEdit u ttestjati għal kimeri bl-użu ta 'DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Is-sekwenzi li rriżultaw ġew depożitati f'GenBank (numru ta 'adeżjoni: KY558684). Analiżi tal-blast b'sekwenzi rRNA 16S kważi kompluti (1368 bp) saru bl-użu tad-database taċ-Ċentru Nazzjonali għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija (NCBI) (sekwenzi RNA ta 'referenza). Ir-riżultati indikaw li r-razza RB99 hija membru tal-ġeneru, Actinomadura. Is-sekwenzi tal-ewwel 10 hits ġew imniżżla mid-database tal-NCBI u allinjati mas-sekwenza tal-rRNA 16S ta' Actinomadura sp. RB99 bl-użu tas-servizz tal-allinjament tas-sekwenzi Sina [23]. Żewġ siġar filoġenetiċi differenti ġew rikostitwiti b'algoritmi ta 'għaqda tal-ġirien jew ta' probabbiltà massima bl-użu tas-softwer MEGA verżjoni 7.0.26 [24-26]. Il-mudell tad-distanza evoluzzjonarju ta 'Tamura u Nei intuża biex jiġġenera matriċi tad-distanza evoluzzjonarji għall-algoritmi ta' probabbiltà massima u ta 'għaqda tal-ġirien, bit-tħassir ta' lakuni kompluti u data nieqsa [27]. Għall-algoritmu tal-probabbiltà massima, intużat distribuzzjoni diskreta gamma ( plus G ), u l-mudell tal-varjazzjoni tar-rata ppermetta li xi siti jkunu evoluzzjonarjament invarjabbli ( plus I). Għall-algoritmu li jgħaqqad il-ġirien, il-varjazzjoni tar-rata fost is-siti kienet immudellata b'distribuzzjoni gamma ( plus G). Il-valuri ta' kunfidenza tan-nodi ġew evalwati permezz ta' analiżi bootstrap ibbażati fuq 1000 pass ta' kampjunar mill-ġdid [28].

3.5. Estrazzjoni u iżolament

Actinomadura sp. RB99 tkabbar f'50 mL brodu ISP2 għal sebat ijiem fi 30 ◦C (pre-kultura) u użat biex jitlaqqam pjanċi tal-agar 1{0{0 ISP2. Il-pjanċi ġew inkubati għal 10 ijiem f'30 ◦C, maqtugħin f'biċċiet żgħar, ikkonsolidati, u mgħaddsa matul il-lejl f'MeOH. Il-fażi MeOH ġiet iffiltrata u evaporata taħt pressjoni mnaqqsa. L-estratt tal-MeOH (20 g) ġie maħlul f'ilma distillat (700 mL) u mbagħad maqsum b'solvent b'EtOAc (700 mL) tliet darbiet, u ta 1.1 g ta 'fdal. Il-frazzjoni li tinħall fl-EtOAc (1.1 g) mill-estratt tal-MeOH ġiet mgħobbija fuq kolonna tal-ġel tas-silika (230–400 malji) għall-kromatografija u eluwit b'sistema ta' solvent gradjent ta' CH2Cl2-MeOH (100:1 sa 1: 1, v/v). Dan ipprovda sitt frazzjonijiet (A-F), li kienu soġġetti għal analiżi bbażata fuq LC-UV/MS. Analiżi ta 'dereplication bl-użu ta' librerija spettrali UV interna ssuġġeriet l-eżistenza ta 'analogi minuri tal-peptidi fil-frazzjoni E. Dawn wrew mudell UV sempliċi f'madwar 220 nm u qċaċet tal-jone tal-formula molekulari unika li fihom atomi tan-nitroġenu. Il-frazzjoni polari E (233 mg) ġiet frazzjonata b'HPLC preparattiv b'fażi inversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 21.2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA) bl-użu ta' CH3CN/H2O (1:9 sa 9:1, v /v, sistema gradjent, rata tal-fluss: 5 mL/min) biex tagħti ħames sub-frazzjonijiet (E1–E5). Is-sottofrazzjoni E2 (27 mg) ġiet ippurifikata b'HPLC semi-preparattiv b'fażi inversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10.0 mm id, 5 µm) bi 33 fil-mija MeOH/H2O (sistema iżokratika, rata tal-fluss: 2 mL/min ) biex jagħti l-kompost 1 (5.8 mg, tR=57.0 min). Il-komposti 2 (1.6 mg, tR=42.0 min) u 3 (1.5 mg, tR=55.0 min) ġew iżolati mis-sub-frazzjoni E3 (15 mg) b'fażi inversa semi-preparattiva HPLC elużjoni ta '43 fil-mija MeOH/H2O (sistema iżokratika, rata tal-fluss: 2 mL/min).

3.5.1. Natalenamide A (1)

3.5.2. Natalenamide B (2)

3.5.3. Natalenamide C (3)

3.6. Idroliżi Aċida tal-Komposti 1-3

Ammont li jammonta għal 0.4 mg ta' kull kompost (1-3) ġie idrolizzat b'6 N HCl (500 µL) għal siegħa f'110 ◦C. Wara t-tkessiħ għat-temperatura tal-kamra, l-idrolisati ta '1-3 ġew evaporati biex jitneħħew traċċi ta' HCl. Ilma distillat (500 µL) ġie miżjud mat-taħlitiet ta 'hydrolysate u mbagħad evaporat biex jitneħħew traċċi ta' HCl; dan il-proċess sar tliet darbiet.

3.7. Determinazzjoni tal-Konfigurazzjoni Assoluta ta 'Amino Acids f'1-3

It-taħlitiet idrolizzati (1–3), kif ukoll l-aċidi amminiċi standard (L/D-Leu, Glu, Phe, u Val), ġew maħlula f'1 N NaHCO3 (100 µL) u mbagħad ittrattati b'50 µL ta' L-FDAA (10 mg/mL f'aċetun). Suċċessivament, kull idrolizzat ġie msaħħan għal 10 min f'80 ◦C. Kull taħlita ġiet imkessħa b'2 N HCl (50 µL) u kkonċentrata fil-vakwu. Ir-residwu ġie maħlul fi 300 µL ta' MeOH. Kull alikwott (5 µL) akkwistat mit-taħlitiet ta' idrolizzat ġie injettat direttament fuq l-LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm, rata ta' fluss ta' 0.3 mL/min), u skan sħiħ fil-pożittiv u negattiv modi tal-joni (firxa ta 'skan minn m/z 100 sa 1000) ġiet applikata biex tidentifika l-ħinijiet ta' żamma tal-aċidi amminiċi derivati ​​mill-L-FDAA.

Il-fażi mobbli, li tikkonsisti f'aċidu formiku f'ilma distillat ({{0}}.1 fil-mija v/v) (A) u aċetonitrile (B), inġarret b'sistema ta' solvent gradjent kif ġej: 20–40 fil-mija (B) għal 10 min, 100 fil-mija (B) iżokratiku għal 5 min, u mbagħad 20 fil-mija (B) iżokratiku għal 5 min, biex twettaq proċedura ta 'ħasil ta' wara l-ġirja għall-kolonna. Il-ħinijiet ta' żamma tal-aċidi amminiċi derivatizzati L-FDAA użati bħala standards kienu 16.7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 18.2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 22.1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25.1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25.6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus ), 27.0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus ), 25.5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ), u 28.2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ). Il-ħinijiet ta 'żamma tal-idrolizzati derivatizzati ta' 1-3 kienu L-Glu (16.9 min), L-Phe (25.7 min) u L-Val (22.5 min) minn 1; L-Glu (16.7 min), L-Phe (25.7 min), u L-Leu (25.6 min) minn 2; u L-Glu (16.9 min) u L-Phe (25.7 min) minn 3.

3.8. Assays ċitotossiċi li jużaw Ċelloli tal-Kanċer

Iċ-ċelloli MCF7, HeLa, u A549 inxtraw mill-American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Iċ-ċelloli HepG2 inxtraw mill-Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Iċ-ċelluli MCF7 ġew ikkultivati ​​f'mezz ta 'Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu. Iċ-ċelloli HeLa u A549 ġew ikkultivati ​​fil-mezz essenzjali minimu ta 'Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) supplimentat b'10 fil-mija serum tal-fetu bovin. Iċ-ċelloli HepG2 ġew ikkultivati ​​f'Medju Essenzjali Minimu supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu. Il-kundizzjonijiet tal-kultura nżammu f'37 ◦C f'atmosfera umidifikata li fiha 5 fil-mija CO2. Iċ-ċitotossiċità ġiet ittestjata fuq dawn l-erba 'linji ta' ċelluli umani (MCF7, HeLa, A549, u HepG2) bl-użu tal-kit tal-analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli EZ-CyTox (Laboratorji Dojindo, Kumamoto, Ġappun). Fil-qosor, 5 × 103 ċelluli /bir ġew miżrugħa fi 96-pjanċi tal-bir. Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'komposti fil-konċentrazzjonijiet indikati. Wara 72 siegħa ta 'inkubazzjoni, intuża l-kit tal-assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli EZ-CyTox. Wara 2 sigħat ta 'inkubazzjoni, l-assorbanza kienet imkejla f'450 nm b'referenza f'620 nm. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ikkalkulata bħala persentaġġ tal-kontroll.

3.9. Attività Kontra l-Infjammazzjoni

Il-linja taċ-ċelluli tal-makrofagi tal-ġurdien RAW264.7 inxtrat mill-American Type Culture Collection. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS), 100 unità/mL peniċillina, u 100 µg/mL streptomycin, u inkubati f'37 ◦C f'atmosfera umidifikata b'5 fil-mija CO2. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet imkejla bl-użu tal-kit ta 'skoperta tal-vijabbiltà taċ-ċelluli Ez-Cytox. Iċ-ċelloli ġew inkubati fi 96-pjanċi bir-bir f'konċentrazzjoni ta '2500 ċellula għal kull bir għal 24 siegħa u ttrattati bil-konċentrazzjonijiet indikati ta' komposti 1-3 għal 24 siegħa. Sussegwentement, ir-reaġenti Ez-Cytox ġew miżjuda ma 'kull bir. Id-densità ottika f'450 nm ġiet imkejla wara siegħa bl-użu ta 'qarrej tal-mikroplate (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) biex tiġi stmata l-vijabbiltà taċ-ċelluli. F'esperiment separat, iċ-ċelluli RAW264.7 ġew inkubati fi 96-pjanċi ta 'bir f'konċentrazzjoni ta' 30,000 ċelluli għal kull bir għal 24 siegħa. Wara l-ġuħ tas-serum għal 12-il siegħa, iċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabel b'komposti 1-3 għal siegħa u mbagħad stimulati b'1 µg/mL ta 'LPS għal 24 siegħa. L-assorbiment tal-midja tal-kultura f'reazzjoni Griess ġiet imkejla f'540 nm bl-użu ta 'qarrej tal-mikroplate PowerWave XS biex jiġi stmat il-livell ta' NO.

3.10. Kejl tal-Kontenut ta' Melanin

Il-linja taċ-ċelluli tal-melanoma tal-ġurdien, B16F10, inxtrat mill-American Type Culture Collection. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija FBS, 100 unità/mL peniċillina, u 100 µg/mL streptomycin, u inkubati f'37 ◦C f'atmosfera umidifikata b'5 fil-mija CO2. Iċ-ċelloli B16F10 ġew inkubati f'platti ta 'kultura ta' 6 cm f'250,000 ċelluli għal kull bir f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija FBS, 100 µg/mL streptomycin, u 100 U/mL peniċillina għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'salina buffered bil-fosfat (PBS) u mbagħad stimulati minn IBMX u inkubati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'komposti 1-3 jew aċidu kojic (kontroll pożittiv) f'medja RPMI mingħajr fenol aħmar supplimentat b'10 fil-mija FBS, 100 unità /mL peniċillina, u 100 µg/mL streptomycin għal 24 siegħa u 48 siegħa. L-assorbiment tal-medju tal-kultura tkejjel f'405 nm bl-użu ta 'qarrej tal-mikroplate PowerWave XS biex jiġi stmat il-kontenut ta' melanin. Ir-riżultati huma espressi bħala tibdil ta' darbiet meta mqabbel mal-kontroll (ċelluli mhux stimulati minn IBMX).

3.11. Analiżi Statistika

Id-dejta kollha inkluża l-vijabbiltà taċ-ċelluli, l-NO, u l-produzzjonijiet tal-melanin ġew ippreżentati bħala l-valur medju u d-devjazzjoni standard (SD). L-assaġġi kollha saru fi tliet kopji u ġew ripetuti mill-inqas tliet darbiet. F'dan l-istudju, ġew inklużi biss ftit numri ta 'repetizzjonijiet ta' kull esperiment taċ-ċelluli, u għalhekk il-metodu ta 'analiżi mhux parametriku ġie adottat għal analiżi statistika. It-test Kruskall–Wallis intuża għall-analiżi statistika ta' kull varjabbli. Il-pakkett statistiku SPSS intuża għall-analiżi kollha (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS verżjoni tal-istatistika 21, Boston, MA, USA). Is-sinifikat statistiku kien ikkunsidrat f'valur p inqas minn 0.05.

4. Konklużjonijiet

Ir-rapport tagħna jipprovdi analiżi kimika ta 'iżolati tal-mikrobi minn termite li jikber il-fungus. Tliet tripeptidi ċikliċi ġodda, natalenamides A–C (1–3), ġew iżolati u kkaratterizzati strutturalment mill-brodu tal-kultura tal-Actinomadura sp assoċjata mat-tkabbir tal-fungus-termite. RB99 bl-użu ta 'metodu ta' dereplication ibbażat fuq LC-UV/MS. Il-komposti iżolati kollha ġew evalwati għal attivitajiet bijoloġiċi bl-użu ta 'assaġġi bbażati fuq iċ-ċelluli. Il-komposti 1 u 2 wrew ċitotossiċità dgħajfa kontra ċelloli HepG2 u HeLa/A549, rispettivament. L-ebda wieħed mill-komposti iżolati ma wera effetti inibitorji sinifikanti fuq il-produzzjoni NO f'ċelluli RAW264.7 stimulati minn LPS. Il-kompost 3 wera effetti inibitorji sinifikanti fuq is-sinteżi tal-melanin medjata minn IBMX b'mod dipendenti mid-doża. L-effett kien simili għal dak tal-aċidu kojic, li jintuża bħala materjal kosmetiku b'effetti li jbajdu l-ġilda.

Rikonoxximenti:

Aħna grati ħafna lil Michael Thomas-Poulsen (Dipartiment tal-Bijoloġija, Università ta’ Kopenħagen, id-Danimarka) talli appoġġja l-ħidma tagħna fuq il-post.

Kunflitti ta' Interess:

L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess.

Referenzi

1. Newman, DJ; Cragg, GM Prodotti naturali bħala sorsi ta 'drogi ġodda mill-1981 sal-2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Prodotti naturali: Rwol li qed jevolvi fl-iskoperta futura tad-droga. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Prodotti naturali minn mikrobi assoċjati ma 'insetti. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Symbionts batterjali fis-sistemi agrikoli jipprovdu sors strateġiku għall-iskoperta ta 'antibijotiċi. J. Antibijot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ It-tfaċċar mill-ġdid ta 'prodotti naturali għall-iskoperta tad-droga fl-era tal-ġenomika. Nat. Dun Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Biosintesi totali: Rikostituzzjoni in vitro ta' mogħdijiet ta' polyketide u nonribosomal peptide. Nat. Prod. Rep 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, perossidu tal-poliene minn mutualist Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Sit, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Arkitetturi ġenetiċi varjabbli jipproduċu molekuli prattikament identiċi f'simbjoti batterjali ta 'nemel li jikbru l-fungus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Baxx, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Disinn razzjonali ta 'inibituri ta' calpain ibbażat fuq peptidomimetiċi ta 'calpastatin. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cyclic Tripeptides mill-fungus halotolerant Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Peptidi ċikliċi ġodda sensittivi għall-pH. Sci. Rep 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosintesi tal-psikrofiliku tripeptide ċikliku li fih -nitro. J. Antibijot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Terapewtika tal-peptidi ċikliċi: Passat, preżenti u futur. Curr. Opinja. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin minn Streptomyces sp. assoċjat mat-termite. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, isoflavonoid glycosides minn Streptomyces sp. assoċjati mat-termites. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Macrotermycins A–D, makrolactams glycosylated minn Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Iżolament, bijosintesi u modifiki kimiċi ta 'rubterolones A–F: alkalojdi tropolone rari minn Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, inibituri ġodda ta 'aminopeptidase B. II. Iluċidazzjoni ta' l-Istruttura. J. Antibijot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, tripeptide ċikliku mill-isponża tal-Vanuatu Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Hypopigmenting agents: Reviżjoni aġġornata dwar aspetti bijoloġiċi, kimiċi u kliniċi. Pigm. Ċellula Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Jesploraw il-potenzjal għal actinobacteria bħala simbjoti difensivi f'termites li jikbru l-fungus. Mikrob. Ekol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Editur ta' allinjament ta' sekwenzi bijoloġiċi faċli għall-utent u programm ta' analiżi għall-Windows 95/98/NT. Aċidi Nukleiċi Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Allinjament preċiż ta 'sekwenza multipla ta' rendiment għoli ta 'ġeni RNA ribosomali. Bijoinformatika 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Il-metodu tal-għaqda tal-ġirien: Metodu ġdid għar-rikostruzzjoni ta 'siġar filoġenetiċi. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Siġar evoluzzjonarji minn sekwenzi tad-DNA: Approċċ ta 'probabbiltà massima. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Analiżi tal-ġenetika evoluzzjonarja molekulari verżjoni 7.0 għal settijiet ta' dejta akbar. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Stima tan-numru ta 'sostituzzjonijiet tan-nukleotidi fir-reġjun ta' kontroll tad-DNA mitokondrijali fil-bnedmin u ċ-chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Limiti ta' kunfidenza fuq il-filoġenji: Approċċ li juża l-bootstrap. Evoluzzjoni 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Disponibbiltà tal-Kampjun:

Kampjuni tal-komposti mhumiex disponibbli mill-awturi.

For more information:1950477648nn@gmail.com