MiR-214 Ittejjeb il-Korriment Akut tal-Kliewi Ikkaġunat mis-Sepsis Permezz tal-Awtofaġija regolata minn PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Astratt. Studji preċedenti ssuġġerew li l-istress ossidattiv u l-awtofaġija jirriżultaw f'akutikorriment fil-kliewi (AKI) waqt sepsis u microRNA (miR)-214 jaqdi rwol vitali fil-protezzjoni tal-kliewisoġġetti għal stress ossidattiv. L-istudju preżenti kellu l-għan li jittestja jekk ir-rinoprotezzjoni ta 'miR-214 hijiex relatata mal-awtofaġija fis-sepsis. Ir-rwol tal-awtofaġija ġie investigat f'mudell tal-ġurdien ta 'ligazzjoni u titqib taċ-ċekali (CLP). Intużat reazzjoni tal-katina tal-polimerażi kwantitattiva ta' traskrizzjoni inversa (RT-qPCR) biex tanalizza l-espressjoni ta' miR-214. L-istruttura u l-funzjoni ta 'kliewimaħsuda mill-ġrieden ġew evalwati.Kilwalivelli ta 'awtofaġija ġew skoperti b'immunohistokimiċi, immunofluworexxenti u western blotting. Instab li miR-214 jista 'jtaffi l-AKI fil-ġrieden settiċi billi jinibixxi l-livell ta'kliewiawtofaġija. Barra minn hekk, miR-214 inibixxi l-awtofaġija billi sajlens l-espressjoni PTEN fil-kliewitessuti tal-ġrieden settiċi. Dawn is-sejbiet indikaw li miR-214 tejjeb l-AKI indott minn CLP billi naqqas l-istress ossidattiv u inibixxi l-awtofaġija permezz tar-regolamentazzjoni tal-mogħdija PTEN/AKT/mTOR.
Kliem ewlieni:microRNA-214, sepsis, ħsara akuta fil-kliewi, awtofaġija, renali
Introduzzjoni Akutakorriment fil-kliewi(AKI) hija waħda mill-aktar kumplikazzjonijiet komuni tas-sepsis u sseħħ f'40-50 fil-mija tal-pazjenti settiċi, b'rata ta 'mortalità ta' sa 60 fil-mija (1). Madankollu, il-patoġenesi tal-AKI indotta minn sepsis għadha mhux ċara. L-awtofaġija ġiet irrappurtata li sservi rwol ewlieni fl-AKI indotta minn sepsis u l-inibizzjoni tal-awtofaġija tirriżulta fl-iżvilupp ta 'AKI waqt is-sepsis (2,3). Studji preċedenti (4,5) ikkonfermaw li s-sepsis iqanqal awtofaġija f'organi multipli, inkluż il-kliewi(6) u proċessi awtofaġiċi huma involuti fit-tneħħija ta 'mitokondrija bil-ħsara u stress ossidattiv (7). Madankollu, awtofaġija eċċessiva tista 'tikkawża mewt taċ-ċelluli mhux mixtieqa u ta' ħsara (8). Għalhekk, livell moderat ta 'awtofaġija huwa ċ-ċavetta biex titnaqqas l-AKI indotta minn sepsis. Studji preċedenti rrappurtaw li miR-214 itejjeb l-AKI indott minn iskemija-riperfużjoni billi jinibixxi l-apoptożi (9) u miR-214 irażżan l-istress ossidattiv fin-nefropatija dijabetika permezz tal-mogħdija tas-sinjalar tal-ispeċi reattiva tal-ossiġnu (ROS)/AKT/mTOR (10). L-istudju preżenti sab li miR-214 jista' jnaqqas disfunzjoni mijokardijaka kkaġunata minn sepsis fil-ġrieden billi jinibixxi l-awtofaġija (11). Madankollu, jekk il-miR-214 jistax ittejjeb l-AKI indotta minn sepsis għad irid jiġi eluċidat. Fl-istudju preżenti, kien ipotizzat li miR-214 jnaqqas l-AKI indott minn CLP billi jnaqqas l-istress ossidattiv u jinibixxi l-awtofaġija permezz tar-regolamentazzjoni tal-mogħdija PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE SE TTEJJEB IL-MARD TAL-KLIEWA/KLIEWA
materjali u metodi
Annimali.Fl-istudju preżenti ntużaw total ta '100 ġrieden maskili Kunming (piż, 20.40±2.92 g; età, 6-8 ġimgħat) fornuti miċ-Ċentru tal-Annimali tal-Laboratorju Mediku tal-Università Medika ta' Hebei (Shijiazhuang, iċ-Ċina). Il-ġrieden kollha ġew akklimatizzati għal ċiklu ta’ dawl/dlam ta’ 12-il siegħa f’24˚C b’umdità ta’ 50 fil-mija u ngħataw aċċess liberu għall-ikel u l-ilma f’Ġimgħa akbar jew ugwali għal 1 qabel l-esperimenti. Il-proċeduri sperimentali kollha twettqu f'konformità stretta mal-linji gwida tal-Istitut Nazzjonali tas-Saħħa (Pubblikazzjoni NIH Nru 85-23, riveduta 1996) u approvazzjoni mill-Kumitati Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Isptar Ċentrali ta' Cangzhou (l-approvazzjoni Nru 2017-020- 01). Il-kirurġiji kollha saru taħt anestesija u sar kull sforz biex titnaqqas it-tbatija.
Ligazzjoni u titqib taċ-ċekali (CLP).CLP sar fuq ġrieden biex jinħoloq mudell sepsis murina, kif deskritt qabel (12). Wara anestetizzazzjoni permezz ta 'inalazzjoni ta' isoflurane (indotta fi 3 fil-mija u miżmuma fi 0.5 fil-mija), inċiżjoni tal-linja tan-nofs ta '1 ċm inqatgħet. Iċ-ċecum espost (distanza ta' 1 ċm mit-tarf) ġie mgħaqqad b'żewġ titqib bl-użu ta' labra ta' 23-gauge. Iċ-ċecum ħareġ bil-mod ammont żgħir ta 'ħmieġ u tpoġġa lura fil-pożizzjoni anatomika tiegħu. Il-ħajt addominali kien suturat f'saffi b'niżaga tal-ħarir 3‑0. Wara l-proċedura, 1 ml ta' 0.9 fil-mija salina ġie injettat taħt il-ġilda. Il-ġrieden ngħataw aċċess liberu għall-ilma biss. Il-ġrieden tal-mudell tal-fart ġew operati bl-istess mod bħall-mudell CLP mingħajr CLP.
Disinn sperimentali. Ġrieden (n=6 għal kirurġija sham u CLP) ġew assenjati b'mod każwali għal seba' gruppi: grupp ta 'sham, grupp CLP, adenovirus (Ad)-proteina fluworexxenti ħadra (GFP) flimkien ma' grupp CLP, Ad-miR-214 flimkien ma 'grupp CLP , anti-miR-214 flimkien mal-grupp CLP, inibitur PTEN flimkien mal-grupp CLP u Ad-miR-214 flimkien mal-inibitur PTEN flimkien mal-grupp CLP. Il-ġrieden tal-grupp Sham ġew esposti għall-istess proċedura iżda mingħajr ligazzjoni u titqib taċ-ċecum. Il-ġrieden fil-gruppi l-oħra rċevew ligazzjoni u perforazzjoni taċ-ċekali. Il-ġrieden kollha ġew anestetizzati malajr permezz ta 'inalazzjoni ta' isoflurane biex jiġbru demm, awrina ukliewikampjuni 24 siegħa wara l-aħħar trattament.
Ad-miR-214, anti-miR-214 jew Ad-GFP medjat minn adenovirustrasferiment tal-ġeni in vivo u injezzjoni ta 'inibitur PTEN. Ad-miR-214, anti-miR-214, jew Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) ingħata fil-kavità addominali tal-ġrieden 4 ijiem qabel CLP. Fil-qosor, il-ġrieden ġew anestetizzati permezz ta 'inalazzjoni ta' isoflurane. Kateter li kien fih 200 µl ta' adenovirus (2x1011 pfu, li jesprimi miR-214, anti-miR-214, jew Ad-GFP) ġie amministrat lil ġrieden normali permezz ta' injezzjoni intraperitoneali. L-inibitur PTEN (VO-OHpic, intraperitoneali, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ingħata lil ġrieden CLP li kienu rċevew anti-miR-214 permezz ta' injezzjoni intraperitoneali f'doża waħda ta' 10 µg/kg 30 min qabel l-għoti ta' adenovirus .
Valutazzjoni tal-funzjoni tal-kliewi. Inġabru kampjuni tad-demm mill-qalb tal-ġrieden, segwiti minn ċentrifugazzjoni (f'temperatura tal-kamra għal 15 min fi 3,000 xg) għall-ġbir tas-serum. Il-livelli tas-serum ta 'nitroġenu ta' l-urea fid-demm (BUN) u kreatinina tas-serum (Cr) ġew determinati bl-użu ta 'analizzatur awtomatiku Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA intuża biex janalizza l-livelli ta'korriment fil-kliewimolekula-1 (KIM-1; cat. nru. RKM100; R&D Systems,Inc.) u lipokalin assoċjat ma' newtrophil gelatinase (NGAL; cat. nr. DY3508; R&D Systems, Inc.) f'kampjuni ta' l-awrina.
Assaġġ għaċ-ċitokini tal-infjammazzjoni tas-serum.Serum TNF- (cat. nru. H052) u IL-6 (kat. nru. H007) ġew eżaminati bl-użu ta' kits ELISA kummerċjali (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.Kejl ta 'markers ta' stress ossidattiv. Il-kit tal-assaġġ korrispondenti (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, iċ-Ċina) intuża biex ikejjel il-livelli ta 'malondialdehyde (MDA) u tittestja l-attività ta' superoxide dismutase (SOD) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
Istoloġija u punteġġ ta 'korriment tubulari. Il-ġrieden kollha kienu suġġetti għalkliewiperfużjoni taħt anestesija 24 siegħa wara CLP. Il-kliewikampjuni ġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde għal 72 siegħa f'4˚C. Il-kampjuni tat-tessut imbagħad ġew deidrati f'serje gradata ta' soluzzjonijiet ta' etanol, inkorporati f'paraffin u maqtugħin f'sezzjonijiet ta' 4-µm. Sezzjonijiet (4 µm) inqatgħu bl-użu ta 'mikrotomu u s-sezzjonijiet tat-tessut ġew imtebba' b'ematossilin (5 min) u eosin (1 min) f'temperatura tal-kamra għal eżami istoloġiku. Il-pjastri ġew evalwati u kklassifikati permezz ta 'mikroskopju (BX51, Olympus Corporation).Renalitissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 fil-mija (13).
Mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni (TEM).Friskkliewiġew maħsula f'salina buffered fosfat, u maqtugħa f'kubi ta '1 mm u ffissati sekwenzjali f'2.5 fil-mija glutaraldehyde għal 24 siegħa f'4˚C. Is-sezzjonijiet ġew mgħaddsa f'1 fil-mija ta 'tetrossidu ta' l-osmju għal 2 sigħat f'4˚C, deidratati f'etanol gradat u inkorporati fl-epoxyresin. Fl-aħħarnett, is-sezzjonijiet ultrathin (60 nm) ġew doppji mtebbgħin b'uranyl acetate u ċomb citrate f'20˚C għal 60 min. L-osservazzjoni saret fuq mikroskopju elettroniku ta 'trasmissjoni (Tecnai; Hitachi, Ltd.) f'80 kV bl-użu ta' Film Microscopy Elettron 4489 (bażi ħoxna ESTAR; Kodak).
Immunoistokimika (IHC).Friskkliewiit-tessuti ġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde (għal 72 siegħa f'4˚C) u inkorporati fil-paraffin. Il-kampjuni tqattgħu f'sezzjonijiet ħxuna ta' 4 µm u ġew deparaffinizzati fi xylene. Wara li sezzjonijiet tat-tessuti ġew maħsula bil-PBS, ġew mgħollija f'10 mM citrate buffer (pH 6.0) għal 4 min għall-irkupru tal-antiġeni u mbagħad imblukkati b'10 fil-mija serum tal-mogħoż f'PBS f'temperatura tal-kamra għal siegħa. L-antikorp primarju (anti-LC3B; 1:400; cat. Nru. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) ġie miżjud skont l-istruzzjonijiet u inkubat f'4˚C għal 12-il siegħa. L-antikorp sekondarju (mogħoż antifenek HRP; 1:2,000; cat. nru BS13278; Bioworld Technology, Inc.) ġie miżjud u inkubat f'temperatura tal-kamra għal 10 min. DAB (100 µl) ġie miżjud u kontrotebba għal 5 min bit-tebgħa osservata taħt mikroskopju tad-dawl (Mudell CX31-P; Olympus Corporation). L-intensità tat-tebgħa pożittiva, li dehret kannella, ġiet iddeterminata bl-użu ta 'softwer ta' analiżi tal-immaġni Image‑Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Id-densità ottika integrali (IOD) ġiet ikkalkulata biex tirrappreżenta l-intensità. Il-valuri IOD żdiedu hekk kif żdiedet l-espressjoni tal-proteini.
Traskrizzjoni inversa-kwantitattiva(RT-q) PCR. RNA totali ġie estratt minntessut tal-kliewiwara l-induzzjoni tal-mudell bl-użu tar-reaġent TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Skont l-istruzzjonijiet tal-kit tat-traskrizzjoni inversa TaqMan (nru tal-kat N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNA ġie traskritt b'lura f'cDNA. Intużaw il-kundizzjonijiet termoċikliċi li ġejjin (miR-214): Denaturazzjoni inizjali f'95˚C għal 5 min; segwit minn 40 ċiklu ta' denaturazzjoni f'95˚C għal 30 sek, ittemprar f'60˚C għal 30 sek u titwil f'72˚C għal 30 sek. L-RT-qPCR twettqet bl-użu ta' Sistema ta' Rilevazzjoni ta' Sekwenza ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) u kit standard SYBR Green PCR (Toyobo Life Science). U6 intuża bħala l-kontroll intern għal miR-214. Is-sekwenzi tal-primer kienu kif ġej: miR-214, 'il quddiem, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' u lura, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, 'il quddiem, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' u lura, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Dawn l-esperimenti ġew replikati sitt darbiet. Ir-riżultati ġew analizzati bl-użu tal-metodu 2-ΔΔCq (14). Il-livelli ta' espressjoni ta' mRNA ta' LC3, p62, PTEN, AKT u mTOR ġew evalwati permezz ta' RT-qPCR. B'-actin bħala referenza interna ta 'dawn il-ġeni, it-2-ΔΔCq intuża biex titkejjel l-espressjoni relattiva tal-ġeni fil-mira. Is-sekwenzi tal-primer murija fit-Tabella I ġew sintetizzati minn Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blotting. Kilwait-tessut tħallat ma’ RIPA lysate (Beyotime Institute of Biotechnology) biex isir l-omoġenat u l-liżi twaqqaf meta ma kien osservat l-ebda tessut viżibbli. Il-kampjuni ġew ċentrifugati fi 13,000 xg għal 10 min f'-4˚C u s-supernatant ġie rkuprat għall-analiżi tal-western blot. Fil-qosor, il-konċentrazzjonijiet tal-proteini ġew determinati bl-użu tal-kit tal-analiżi tal-proteina mikro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Kampjuni tal-proteini (80 µg għal kull kampjun) ġew soġġetti għal separati billi tnaqqas 12 fil-mija elettroforesi tas-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel u mbagħad ittrasferiti fuq membrani ta' polyvinylidene difluoride f'4˚C matul il-lejl. Proteini separati ġew trasferiti għal membrani PVDF. Wara l-imblukkar f'5 fil-mija ħalib xkumat f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn, il-membrani ġew inkubati matul il-lejl (f'4˚C) b'antikorpi primarji. Intużaw l-antikorpi primarji li ġejjin (kollha Cell Signaling Technology, Inc.): Katina ħafifa 3B (1:1,000; cat. nru. 4412), p62 (1:1,000; qattus . Nru 4412), Anti-PTEN (1:1,000; Cat. Nru. 9188), anti-fosforilat (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; qattus . Nru 4060), anti-AKT (1:1,000; Cat. Nru. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1,000; Cat. Nru. . 5536), anti-mTOR (1:1,000; kat. nru. 2972) u ‑actin (1:2,000; kat. nru. 4970). Wara l-ħasil, il-membrani ġew inkubati (f'temperatura tal-kamra għal 2 sigħat) bl-antikorpi sekondarji kontra l-fenek konjugati bl-HRP (1:3,000; cat. nru. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Il-meded tal-proteini ġew skoperti b'Immobilon Western (MilliporeSigma) u analizzati bl-użu ta' softwer Total‑Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). L-espressjoni tal-proteina ġiet normalizzata għal ‑actin.
Analiżi statistika. Analiżi statistika saret bl-użu tal-GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Id-dejta kollha ġiet ippreżentata bħala mezzi ± devjazzjoni standard jew medjani (firxiet interkwartili) għal varjabbli kontinwi, skont id-distribuzzjonijiet tagħhom. Il-karatteristiċi u r-riżultati tal-linja bażi tqabblu bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda segwita mit-test posthoc ta' Tukey, jew it-test Kruskal-Wallis segwit mit-test ta' Dunn kif xieraq. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Riżultati
Punt ta' ħin 24 siegħa wara CLP. Studji preċedenti rrappurtaw (6,15,16) li l-analiżi bijokimika (jiġifieri, LC3 u p62) turi li l-fluss tal-awtofaġija huwa mrażżan bil-progressjoni tas-sepsis wara 6-8 sigħat ta 'CLP. Fl-istudju preżenti, in-numru ta 'autolysosomes fil-kliewital-ġrieden ittrattati b'CLP żdiedu fi żmien 24 siegħa wara l-operazzjoni. Barra minn hekk, l-analiżi ta 'markers ta'korriment fil-kliewiwera lifunzjoni renaliġarrbet l-aktar ħsara serja 24 siegħa wara CLP. Għalhekk, il-punt ta 'żmien 24 siegħa wara CLP ġie magħżul għall-esperimenti li ġejjin.
Effett regolatorju fuq miR-214 fit-tessuti tal-kliewi. L-analiżi RT-qPCR intużat biex tiskopri l-espressjoni ta 'miR-214 fi ġrieden ittrattati b'CLP. Instab li l-espressjoni miR-214 kienet kemmxejn upregulated fil-kliewitessuti wara kirurġija CLP 24 siegħa, meta mqabbla mal-grupp sham (1.47 darbiet, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">kliewitessut, meta mqabbel mal-grupp sham (it-tnejn P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE SE TTEJJEB INSUFFIRIMENT TAL-KLIEI/RENALI
Effett ta 'miR-214 fuq disfunzjoni renali fil-ġrieden settiċi.Ġrieden kollha ġew sagrifikati biex jiġbru demm, awrina ukliewikampjuni 24 siegħa wara l-kirurġija CLP. BUN u Cr huma indikaturi importanti tas-severità ta 'renaliindeboliment (17). Barra minn hekk, NGAL u KIM-1 ġew identifikati bħala bijomarkaturi speċifiċi ta'korriment fil-kliewiu l-espressjoni miżjuda tagħhom hija assoċjata ma 'bidurenalikorriment tubulari fl-AKI (17). Kif muri fil-Fig. 2A-D, il-livelli ta 'BUN, Cr, KIM-1 u NGAL żdiedu b'mod sinifikanti wara kirurġija CLP meta mqabbla mal-grupp sham. Madankollu, Ad-miR-214 naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' BUN, Cr, KIM-1 u NGAL meta mqabbel mal-grupp CLP (P kollha<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">funzjoni tal-kliewiparametri. Madankollu, wara trattament minn qabel bl-inibitur PTEN, l-effetti ta 'protezzjoni ta' Ad-miR-214 ġew imtejba. Ir-riżultati juru li miR-214 attenwa disfunzjoni tal-kliewi fil-ġrieden settiċi.
Effett ta 'miR-214 fuq infjammazzjoni renali u stress ossidattiv.Kif muri fil-Fig. 3A u B, CLP eleva b'mod sinifikanti l-livelli ta 'TNF- u IL-6, filwaqt li Ad-miR-214 naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' dawn il-markaturi. Meta mqabbel mal-
Effett ta 'miR-214 fuq l-awtofaġija renali fil-ġrieden settiċi.L-istudju preżenti eżamina l-bidliet fl-LC3 inkliewitessuti permezz ta’ tbajja’ IHC. Kif muri fil-Fig. 6, l-intensità LC3 ta 'tbajja' pożittiv żdiedet b'mod sinifikanti fil-grupp CLP meta mqabbla mal-grupp sham (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 jattiva l-mogħdija AKT/mTOR biex jinibixxiawtofaġija billi jnaqqas il-PTEN fit-tessuti tal-kliewi.L-effett tas-CLP fuq l-awtofaġija fikliewitessuti ġiet investigata billi ġew evalwati l-livelli ta’ LC3‑II/I u p62. Il-mogħdija tas-sinjalar PTEN/AKT/mTOR taqdi rwol importanti fl-awtofaġija (18). Biex jiġi investigat l-effett ta’ miR-214 fuq il-mogħdija PTEN-AKT/mTOR, il-livelli tal-proteini ta’ LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR u PTEN ġew analizzati permezz ta’ western blotting u RT- Analiżi qPCR. Kif muri fil-Fig. 7A-C, il-modifika f'dawn il-proteini sseħħ malajr, b'żieda fir-rata ta 'LC3-II/LC3-I, u tnaqqis fil-livelli ta' p62 (it-tnejn P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">kliewi tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Dawn ir-riżultati wrew li l-awtofaġija ġiet indotta minn CLP, u l-espressjoni żejda ta 'miR-214 tista' tinibixxiha parzjalment.
Kif muri fil-Fig. 7A u D-F, il-livell ta 'espressjoni ta' PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">kliewi tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li CLP jinduċikliewiawtofaġija tat-tessut billi jinibixxi l-mogħdija AKT/mTOR. Ad-miR-214 attiva l-mogħdija AKT/mTOR billi sajlens PTEN ġewwakliewitessuti. Madankollu, meta mqabbel mal-grupp CLP, anti-miR-214 ma inibixxix b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'mTOR. Għalhekk, RT-qPCR intuża aktar biex tiddetermina l-espressjoni ta 'mRNA ta' ġeni relatati mal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PTEN/AKT/mTOR. Skont ir-riżultati ta 'RT-qPCR (Fig. 8), meta mqabbla mal-grupp Sham, il-livelli tal-espressjoni tal-mRNA ta' p62, LC3 u PTEN żdiedu b'mod notevoli, filwaqt li l-espressjoni tal-mRNA ta 'AKT u mTOR naqset fil-grupp CLP. Meta mqabbel mal-grupp CLP, l-Ad‑miR‑214, PTEN
gruppi ta' inibitur u Ad-miR-214 flimkien ma' inibitur ta' PTEN urew tnaqqis fl-espressjoni ta' mRNA ta' LC3 u PTEN, iżda żieda fl-espressjoni ta' mRNA ta' p62, AKT u mTOR (P kollha<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Għalhekk, l-effett ta 'p62 fuq l-awtofaġija jista' jseħħ fil-livell tat-traskrizzjoni aktar milli fil-livell ta 'wara t-traskrizzjoni. Ir-riżultati attwali wrew li miR-214 irregola l-espressjoni ta' PTEN u attiva l-mogħdija tas-sinjalar AKT/mTOR.
Diskussjoni
L-istudju preżenti sab li l-awtofaġija eċċessiva kienet ta 'detriment għalfunzjoni renalifil-ġrieden settiċi. Studji preċedenti wrew li miR-214 huwa assoċjat ma 'żieda fil-proliferazzjoni, metastasi, invażjoni u jiffunzjona bħala onkoġenu għaċ-ċelloli u t-tessuti (19-22). Studji jirrappurtaw li miR-214 jaqdi rwol protettiv kontra l-AKI permezz ta 'apoptożi attenwanti, stress ossidattiv u fatturi infjammatorji downregulating (21,23). L-istudju preżenti eżamina aktar il-mekkaniżmi sottostanti l-effett protettiv ta 'miR-214 fuq AKI indotta minn sepsis billi jiffoka fuq l-involviment potenzjali ta' miR-214 fil-modulazzjoni tal-awtofaġija. Ir-riżultati wrew li l-istress ossidattiv seħħ fil-kliewiwara l-amministrazzjoni ta’ kirurġija CLP. Sadanittant, l-attivazzjoni tal-awtofaġija sseħħ fil-kliewi.LC3 II/I elevati u t-tnaqqis ta 'p62 fil-kliewikien osservat wara kura b’kirurġija CLP. Kif mistenni, l-espressjoni żejda ta 'miR-214 attenwat b'mod sinifikantikliewikorrimenti patoloġiċi ukliewidisfunzjoni kkawżata minn sepsis. Madankollu, l-inibizzjoni ta 'miR-214 wriet tendenza opposta għal rinoprotezzjoni. Barra minn hekk, l-effett ta 'protezzjoni ta' Ad-miR-214 ġie msaħħaħ mill-inibitur PTEN.
F'settikakliewi, infjammazzjoni eċċessiva hija akkumpanjata minn żidiet massivi fil-produzzjoni ta 'ROS u numru kbir ta' ROS iqajjem bidliet fl-istruttura mitokondrijali u tfixkel il-funzjoni mitokondrijali, li tikkawża li l-ġisem jidħol f'ċiklu vizzjuż li jaggravakliewiħsara (24,25). Għalhekk, l-istress ossidattiv jista 'jkun wieħed mill-mekkaniżmi patoloġiċi ewlenin ta' AKI indotta minn sepsis. L-istudju preżenti pprovda aktar evidenza li turi stress ossidattiv eċċessiv, li kien indikat minn żieda fil-produzzjoni ta 'MDA u attività mnaqqsa ta' SOD fil-kliewitessuti wara kirurġija CLP. Barra minn hekk, instab li l-espressjoni żejda ta’ miR-214 tista’ tipproteġi l-kliewikontra l-ħsara ossidattiva kkaġunata minn CLP, li hija involuta fl-inibizzjoni awtofaġika. Dan huwa konsistenti mal-istudji preċedenti li miR-214 jipproteġi diversi ċelloli u tessuti kontra stress ossidattiv (26,27).
L-awtofaġija sservi bħala 'xabla b'tarf doppju' fl-iżvilupp tas-sepsis: L-awtofaġija bażali tista 'teżerċita effetti protettivi billi tneħħi proteini ossidattivi tossiċi, iżda awtofaġija eċċessiva tista' twassal għal mewt ċellulari awtofaġika taħt stress sever, bħal eruzzjoni ROS (28,29) . Intwera li l-awtofaġija hija attivata inizjalment f'sepsis, segwita minn fażi sussegwenti ta 'disfunzjoni minħabba mewt taċ-ċelluli awtofaġiċi (30), li taggrava l-ħsara ossidattiva kkawżata mis-sepsis. Fl-istudju preżenti, l-inibitur PTEN jew l-espressjoni żejda ta 'miR-214 wera rinoprotezzjoni antiossidativa fil-ġrieden ittrattati b'CLP. Madankollu, l-inibizzjoni ta 'miR-214 wriet tendenza opposta għar-rinoprotezzjoni antiossidativa. Allura awtofaġija eċċessiva jew inadegwata tista 'tikkawżaħsara fil-kliewi; it-tnejn huma diżadattivi u eventwalment jipprovokaw il-mewt taċ-ċelluli. Għalhekk, iż-żamma ta 'livelli moderati ta' awtofaġija hija ċ-ċavetta biex titnaqqas il-ħsara ossidattiva f'kundizzjoni settika.
CISTANCHE SE TTEJB L-UĠIGĦ TAL-KLIEI/KLIEWA
L-evidenza akkumulata indikat li miR-214 jinibixxi l-awtofaġija f'diversi ċelloli u tessuti (31-33). Fl-istudju preżenti, l-espressjoni żejda ta 'miR-214 instabet li tinibixxi l-awtofaġija indotta minn CLP f'tessuti tal-kliewi,kif indikat mill-bidliet fil-markaturi tal-proteini, bħal LC3‑II/I u p62. Barra minn hekk, ir-riżultati wrew li l-espressjoni żejda ta 'miR-214 attenwat il-ħsara ossidattiva kkaġunata minn CLP billi inibixxi l-awtofaġija eċċessiva. L-istudju preżenti investiga wkoll il-mekkaniżmi molekulari li bihom jimmodula l-miR-214kliewiawtofaġija f'AKI indotta minn sepsis. PTEN/AKT/mTOR hija passaġġ importanti tas-sinjalar li jirregolakliewiawtofaġija (34,35) u li sservi rwol ewlieni f'AKI indotta minn sepsis, u PTEN huwa inibitur negattiv tal-mogħdija tas-sinjalar PI3K/AKT/mTOR. Studji preċedenti rrappurtaw li miR-214 jista' jirregola l-awtofaġija permezz tal-mogħdija tas-sinjalar PI3K/AKT/mTOR f'diversi mudelli (36-38). Ma et al (39) sabu li miR-214 jista' jirregola 'l isfel l-awtofaġija fil-kliewi dijabetiċi. Għalhekk, kien ipotizzat li l-effetti ta 'miR-214 fuq AKI indott minn CLP jistgħu jkunu involuti fir-regolamentazzjoni tal-mogħdija PTEN/AKT/mTOR. Notevolment, ir-riżultati tal-istudju preżenti wrew li l-kirurġija CLP elevat b'mod sinifikanti l-livelli ta 'PTEN iżda naqqset il-livelli ta' p-AKT u p-mTOR, li jindika li l-kirurġija CLP inattivat il-mogħdija AKT/mTOR. Barra minn hekk, l-espressjoni żejda ta 'miR-214 attivat il-mogħdija AKT/mTOR permezz tas-sajlenser ta' PTEN f'awtofaġija indotta minn CLP f'kliewitessuti. Madankollu, anti-miR-214 ma inibixxix b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'mTOR fl-analiżi tal-western blot. Għalhekk, RT-qPCR intuża aktar biex tiddetermina l-espressjoni ta 'mRNA ta' ġeni relatati mal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PTEN/AKT/mTOR. L-istudju preżenti identifika li miR-214 irregola l-espressjoni ta 'PTEN u attiva l-mogħdija ta' sinjalazzjoni AKT/mTOR biex jinibixxi l-awtofaġija. Madankollu, aktar studji eżawrjenti għandhom jitwettqu biex jinkisbu dettalji addizzjonali relatati mal-mekkaniżmu takliewiawtofaġija f'kundizzjoni settika.
Biex nikkonkludu, ir-riżultati tal-istudju preżenti ssuġġerew li miR-214 serva rwol protettiv kontra s-sepsis indottakorriment fil-kliewibilli tnaqqas l-istress ossidattiv u tinibixxi l-awtofaġija permezz tar-regolamentazzjoni tal-mogħdija PTEN/AKT/mTOR. Is-sejbiet preżenti ssuġġerew li miR-214 jista' jkun mira terapewtika potenzjali għal AKI indotta minn sepsis. Madankollu, l-istudju preżenti uża ġrieden ta '6-8 ġimgħat, għalhekk hija meħtieġa aktar riċerka dwar il-mekkaniżmu ta' miR-214 fil-ġrieden adulti.
