Lamivudine Ittejjeb it-Tnaqqis Konjittiv fil-ġrieden SAMP8: Integrazzjoni in Vivo tal-Evalwazzjoni Farmakoloġika U l-Farmakoloġija tan-Netwerk

Astratt

Inibituri tar-reverse transcriptase bħal lamivudine (3TC) għandhom rwoli importantikontra t-tixjiħ, iżda l-effetti tagħhom fuqmard newrodeġenerattiv ikkawżat mit-tixjiħmhumiex ċari, speċjalment dwar il-funzjonijiet tal-sistema nervuża bħall-konjizzjoni. F'dan l-istudju, amministrajna 3TC lil ġrieden suxxettibbli 8 (SAMP8) aċċelerati għas-senescence permezz ta 'perfużjoni gastrika (100 mg/kg) għal 4 ġimgħat. Ir-riżultati tagħna wrew li 3TC tejbet b'mod sinifikanti l-status ta' tixjiħ tal-ġrieden SAMP8, speċjalment it-tnaqqis tal-kapaċità konjittiva evalwata mit-test tal-labirint tal-ilma Morris. Biex tkompli tinvestiga l-mekkaniżmi molekulari ta 'it-titjib tal-istatus tax-xjuħijata 'ġrieden SAMP8 minn 3TC, il-qPCR, u metodi ta' tbajja tat-tessuti ntużaw biex jiġu studjati t-tessuti tal-moħħ (jiġifieri, hippocampus u kortiċi) tal-ġrieden, filwaqt li l-analiżi tal-farmakoloġija tan-netwerk ġiet applikata biex tinvestiga l-miri potenzjali ta '3TC. Ir-riżultati wrew li l-livelli tal-mRNA tal-ġeni relatati mal-element imxerred fit-tul-1, ir-rispons tal-interferon tat-tip 1, il-fenotip tas-sekrezzjoni assoċjat mas-senescence, uIl-marda ta' Alzheimerfil-hippocampus u l-kortiċi tal-ġrieden SAMP8 żdiedu minħabbaSenescence, iżda din it-tendenza ġiet maqluba parzjalment minn 3TC. Riżultati ta 'studji istoloġiċi wrew li 3TC naqqas il-mewt tan-newroni tal-hippocampal, filwaqt li r-riżultati tal-analiżi tal-farmakoloġija tan-netwerk indikaw li 3TC jista' jeżerċita l-influwenza tiegħu permezz ta 'mogħdijiet multipli, inkluż is-sinjalar tal-estroġenu u l-mogħdijiet ta' sinjalazzjoni tal-interazzjoni ligand-riċettur PI3K/Akt u newroattivi, li vverifikajna permezz ta’ esperimenti in vitro. Dawn is-sejbiet jipprovdu evidenza għall-potenzjal terapewtiku ta '3TC fit-trattament ta' mard newrodeġenerattiv.

KLIEM EWLENINtixjiħ, ħila konjittiva, lamivudine, lelement imxerred-1, mard newrodeġenerattiv

Ħwawar Ċiniżi Cistanche Effett FuqInibituri tar-reverse transcriptase Fuq Anti-aging

1|INTRODUZZJONI

Sal-lum, tixjiħ u mard newrodeġenerattiv, bħalmard ta' Alzheimer (AD) jew Parkinson'smarbuta mat-tixjiħ, qed dejjem jiżdiedu minħabba bidliet demografiċi globali.1,2 it-tnaqqis konjittiv jirrappreżenta xkiel serju biex tinkiseb ħajja twila u b'saħħitha. Għal għexieren ta' snin, kien hemm sforzi konsiderevoli ddedikati għat-tfittxija għal mediċini li jistgħu jintużaw biex jittrattaw id-deġenerazzjoni konjittiva mat-tixjiħ.3 F'dawn l-aħħar snin, l-element imxerred fit-tul-1 (L1) kiseb attenzjoni dejjem akbar bħala ġdid potenzjali. mira għall-istudju tas-senescence.4 L-L1 jappartjeni għall-familja l-aktar abbundanti ta' retrotransposons ripetuti terminali mhux twal b'~500,000 kopja, li jinkludu ~17 fil-mija tal-ġenoma uman. Il-ġene L1 jinkludi operon b'żewġ frejms ta' qari miftuħa (ORF1 u ORF2), li t-tnejn huma meħtieġa għar-retrotraspożizzjoni. lamivudine (2'-3'-deoxy-3'-thiocytidine, 3TC).8

L1 attiv jista' jissintetizza cDNA barra l-kromatina u mbagħad jerġa' jdaħħalha fil-ġenoma katalizzat minn ORF1p, fl-aħħar mill-aħħar ibiddel l-espressjoni ta' ġeni oħra u jirriżulta f'mard assoċjat ma' instabbiltà ġenomika.9,10 L-ospitant ġeneralment jinibixxi l-attività trasponibbli ta 'L1 permezz ta' serje. ta’ regolamenti, bħall-modifika epiġenetika u r-regolamentazzjoni tal-fattur li jillimita l-ospitanti.11,12 It-traspożizzjoni ta’ L1 ġeneralment isseħħ biss jew fiċ-ċelloli tal-mikrobi jew tal-kanċer, filwaqt li studji reċenti wrew li L1 huwa wkoll attiv ħafna fis-sistema nervuża ċentrali jew fiċ-ċelloli li qed jixjieħu, għalkemm il-mekkaniżmi newrali sottostanti ta 'L1 mhumiex ċari.13 Studji wrew li fatturi (eż., TREX1, RB1 u FOXA1) relatati mal-mekkaniżmu ta' monitoraġġ ta 'L1 mhumiex funzjonali fis-senescence taċ-ċelluli, li jirriżultaw fl-attivazzjoni ta' L1. TREX1 huwa 3' exonuclease li jiddegrada DNAs invadenti barranin u t-telf tiegħu ġie assoċjat ma 'l-akkumulazzjoni ta' L1 cDNA ċitoplasmika.14 RB1 intwera li jorbot ma 'elementi ripetittivi, inklużi elementi L1, u jippromwovi l-eterokromatinizzazzjoni tagħhom.15 U FOXA1 huwa regolata 'l fuq f'ċelloli senescent13 u marbuta mar-reġjun ċentrali ta' L1 5' UTR. L1 attivat jattiva aktar ir-rispons tal-interferon tat-tip I (IFN-I), li jinduċi infjammazzjoni permezz ta' cDNA traskrizzjoni inversa u jżomm il-fenotip ta' sekrezzjoni assoċjat mas-senescence (SASP). Għalhekk, bħala fattur importanti fl-infjammazzjoni asettika kkawżata mit-tixjiħ, L1 huwa meqjus bħala mira importanti għat-trattament ta 'mard relatat mat-tixjiħ. Fil-ġrieden anzjani ttrattati bi 3TC, l-akkumulazzjoni ta 'fatturi infjammatorji hija mtejba billi tinibixxi t-traskrizzjoni extraċellulari ta' L1 f'tessuti muskolari u oħrajn.16 Sal-lum, l-istudji tal-effetti ta 'inibituri ta' reverse transcriptase fuq il-funzjonijiet tas-sistema nervuża huma skars. Riċentement, eluf ta 'varjanti ta' cDNA ġenomika (gencDNA) instabu fl-imħuħ ta 'pazjenti mejta b'AD, li jirriżultaw mill-inserzjoni mill-ġdid ta' varjanti karatteristiċi ta 'splicing ta' RNA fil-ġenoma.17 Dan il-fenomenu huwa meqjus bħala kawża importanti ta 'AD. Il-fatturi li jikkawżaw il-ġenerazzjoni ta 'gencDNAs jinkludu traskrizzjoni, qerda tad-DNA, reverse transcriptase u tixjiħ.

Studji wrew li l-proċess ta’ formazzjoni ta’ gencDNA huwa mblukkat bl-użu ta’ inibituri ta’ reverse transcriptase tan-nukleosidi f’linji taċ-ċelluli tal-ovarji tal-ħamster Ċiniż (CHO) b’attivitajiet ta’ reverse transcriptase endoġeniċi. għal żmien twil rarament żviluppat AD.20 Għalhekk, aħna nispekulaw li 3TC, bħala inibitur tar-reverse transcriptase, jista 'jkun mediċina potenzjali għat-trattament ta' indeboliment konjittiv u mard newrodeġenerattiv ikkawżat mit-tixjiħ. Intwera li l-ġrieden suxxettibbli għas-senescence 8 (SAMP8), bħala mudell għall-istudju tat-tixjiħ tal-bniedem u l-mard relatat mal-età, juru ħafna karatteristiċi magħrufa li jseħħu fl-istadji bikrija tal-mard newrodeġenerattiv, bħal żieda fl-istress ossidattiv, newroinfjammazzjoni u konjittivi. tnaqqis.21 F'dan l-istudju, għalhekk, il-ġrieden SAMP8 intgħażlu bħala mudell ideali ta 'annimali għal mard newrodeġenerattiv ikkawżat mit-tixjiħ. Aħna ffukajna fuq l-effetti konjittivi ta '3TC fuq ġrieden li qed jixjieħu prematuri u l-mogħdijiet molekulari assoċjati mat-tixjiħ, billi pprovdew evidenza għar-rwol ta' inibituri tar-reverse transcriptase fit-trattament ta 'mard newrodeġenerattiv minħabba x-xjuħija. Aħna applikajna aktar il-metodu tal-farmakoloġija tan-netwerk biex inbassru l-miri tat-3TC, nibnu netwerks u tanalizza l-funzjonijiet u l-mogħdijiet bijoloġiċi relatati ma '3TC.

2|TAQSIMA SPERIMENTALI 2.1 |

Annimali Il-ġrieden maskili SAMP8 ta' 44-ġimgħat u kognati normali tas-senescence-accelerated mouse-R1 (SAMR1) ipprovduti mill-Università ta' Tianjin tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża ntużaw wara perjodu ta' akklimatizzazzjoni ta' 1-ġimgħa. Il-protokoll sperimentali tal-annimali ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Isptar Provinċjali ta 'Shandong u sar ibbażat fuq il-Gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa (NIH) għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju. Il-ġrieden inżammu f'gaġeġ awtoklavi u ngħataw ikel u ilma sterili. Il-piżijiet tal-ġisem tal-ġrieden ġew irreġistrati kuljum. A flow chart ta 'l-esperimenti mwettqa f'dan l-istudju hija mogħtija fil-Figura 1A. Mat-tlestija ta 'l-esperimenti, il-ġrieden ġew ewtanizzati permezz ta' inalazzjoni ta 'diethyl ether.

2.2|Preparazzjoni u trattament ta '3TC

Id-drogi kienu ppreparati friski fil-jum ta 'kull esperiment. It-3TC mixtri minn MCE (Shanghai, iċ-Ċina) ġie maħlul f'DMSO għal konċentrazzjoni finali ta '2 mmol/L. Is-soluzzjoni stokk imbagħad ġiet dilwita għall-konċentrazzjoni tax-xogħol bl-użu ta 'ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni finali ta' DMSO inqas minn 0.1 fil-mija. Ġew stabbiliti tliet gruppi ta 'ġrieden: grupp ta' kontroll ittrattat b'soluzzjoni ta 'vettura (ilma tax-xorb), grupp tat-test ittrattat bi 3TC, u l-grupp SAMR1 li rċieva vettura użata bħala grupp ta' kontroll ieħor għat-tixjiħ. Il-grupp tat-test irċieva oralment 3TC f'doża ta '100 mg/kg kuljum. Il-ġrieden kollha ġew mitmugħa b'amministrazzjoni intragastrika għal 4 ġimgħat (Figura 1B).

FIGURA 1 Disinn sperimentali u l-effetti ta '3TC fuq it-titjib ta' telf ta 'piż relattiv minħabba punteġġi ta' gradazzjoni ta 'tixjiħ u senescence. (A) Tabella tal-fluss tal-esperimenti farmakoloġiċi biex tistudja l-effett ta '3TC fuq il-kapaċità konjittiva tal-ġrieden SAMP8. (B) Preżentazzjoni skematika tal-iskeda tal-esperiment tal-annimali. (C) Il-fluss tax-xogħol kunċettwali għat-tbassir tal-interazzjonijiet tal-mediċina-mira bl-użu ta 'Pharmmapper li juri, mix-xellug għal-lemin, l-istruttura molekulari ta' 3TC, id-dijagramma strutturali 3D ta '3TC u l-mudell farmakoforu previst b'3TC li jorbtu mar-riċettur tal-estroġenu bl-ogħla normalizzazzjoni punteġġi tajbin. (D) Il-mudell tat-tkabbir tal-piż tal-ġisem f'kull grupp ta 'ġrieden. (E) Bidliet fil-punteġġi tal-gradazzjoni qabel u wara t-trattament ta '3TC. SAMR1 plus Vettura: 44-ġrieden SAMR1 ta' ġimgħa ttrattati bil-vettura għal 4 ġimgħat. SAMP8 plus Vettura: 44-ġrieden SAMP8 ta' ġimgħa ttrattati bil-vettura għal 4 ġimgħat. SAMP8 flimkien ma' 3TC: 44-ġrieden SAMP8 ta' ġimgħa ttrattati bi 3TC għal 4 ġimgħat. It-test t tal-istudent: *p < 0.05, **p < 0.01 u ***p < 0.001. ns: l-ebda sinifikat statistiku. L-asterisks suwed jirrappreżentaw paragun mal-grupp tal-vetturi SAMR1 plus. Asterisks ħomor jirrappreżentaw paragun mal-grupp ta 'vetturi SAMP8 plus. Il-linja blu timmarka l-grupp SAMP8 flimkien ma '3TC fl-età ta' 44 u 48 ġimgħa.

2.3|Sistema ta' punteġġ ta' gradazzjoni

Il-grad ta’ senescenza fil-ġrieden ġie evalwat permezz ta’ sistema ta’ punteġġ ta’ gradazzjoni deskritta qabel.22 Kull kategorija ta’ punteġġi fiha ħames livelli, li jvarjaw minn 0 sa 4 bl-ogħla punteġġ tal-grad li jindika l-ogħla grad tas-senescenza tal-annimal . Il-punteġġi għal kull kategorija ġew evalwati separatament minn erba 'esperimentaturi b'esperjenza li kienu blinded għall-kundizzjonijiet tat-trattament (Tabella Supplimentari S1).

.2.4|Test tal-labirint tal-ilma Morris

Studji tal-labirint tal-ilma Morris saru skont il-protokoll ta’ Morris, inkluż esperiment ta’ navigazzjoni tal-orjentazzjoni u provi ta’ sonda.23 Il-labirint tal-ilma kien ġabra ċirkolari (120 ċm fid-dijametru mgħammra bi pjattaforma ta’ 10 ċm fid-dijametru) u mimlija bl-ilma f’25. ± 1 grad. Il-ġrieden ġew imħarrġa biex isibu l-pjattaforma taħt il-wiċċ tal-ilma fi żmien minuta. Jekk il-ġurdien ma sabx il-pjattaforma fi żmien 60 s, kien iggwidat lejn il-pjattaforma u tħalla jibqa 'hemm għal 20 s. Kull wieħed mill-ġrieden kien imħarreġ ħames darbiet kuljum b'kull wieħed separat minn xulxin bi 15-il minuta. F'kull prova, il-pożizzjoni tal-bidu kienet differenti, f'ordni psewdo-random. Fis-sitt jum tat-test, il-pjattaforma tneħħiet u l-annimal daħal fil-labirint tal-ilma minn punt oppost għall-kwadrant tal-labirint fejn il-pjattaforma kienet tkun waqt it-taħriġ u tħalla jesplora l-labirint għal 60 s. Il-mogħdija tal-għawm u l-ammont ta 'ħin li l-ġrieden qattgħu jfittxu l-labirint ġew irreġistrati mill-kamera tal-vidjo u analizzati bl-użu ta' EthoVision XT (Noldus Software). Kull grupp kien jikkonsisti minn minimu ta’ tmien annimali.

2.5|Estrazzjoni ta' RNA u PCR kwantitattiv

L-RNA totali ġie estratt mit-tessuti tal-hippocampal u kortikali tal-ġrieden wara t-trattamenti bl-użu tar-Reaġent TRIzol (Invitrogen) skont il-protokoll tal-manifattur. Kull kampjun ta 'RNA (1 ug) ġie traskritt b'mod invers biex jiġġenera cDNA bl-użu ta' cDNA Reverse Transcription Kit (Takara) u mbagħad amplifikat b'PCR bl-użu tat-TaKaRa Taq Kit (Takara). Settijiet tal-primer huma deskritti fit-Tabella Supplimentari S2.

2.6|Preparazzjoni tat-tessuti

L-annimali ġew anestetizzati bl-etere tad-dietil, u l-imħuħ tagħhom inġabru wara perfużjoni transkardjali b'melħ imbuffer bil-fosfat (PBS) u soluzzjoni ta 'paraformaldehyde ta' 4 fil-mija. It-tessuti tal-moħħ tneħħew u ġew iffissati f'paraformaldehyde għal aktar minn jumejn. L-imħuħ fissi kienu inkorporati fil-paraffin bit-tessut tal-hippocampal sezzjoni bi ħxuna ta '5 μm.

2.7|Tbajja ta' ematossilin u eosina (H & E).

Il-morfoloġija tal-moħħ ġiet analizzata bl-użu ta 'metodi ta' tbajja ta' ematossilin u eosina (H & E). Is-sezzjonijiet tal-paraffin tat-tessuti tal-hippocampal ġew dewaxed u deidratati b'gradjent ta 'alkoħol ta' serje ta 'konċentrazzjonijiet. It-tbajja 'HE saret bl-użu ta' kit ta 'tbajja' H & E (Solarbio) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Wara li ġew mgħaddsa fl-etanol u l-xylene, is-sezzjonijiet ġew immuntati bir-reżina u osservati taħt mikroskopju tad-dawl (Olympus).

2.8|Tbajja Nissl

Il-metodu tat-tbajja 'Nissl (Biyuntian) intuża biex jikxef il-ħsara newronali fuq is-sezzjonijiet tat-tessuti tal-hippocampal. Is-sezzjonijiet ġew inkubati b'tebgħa Nissl għal 30 min u maħsula b'95 fil-mija etanol. Iċ-ċelloli mtebbgħin ġew magħduda u fotografati taħt mikroskopju tad-dawl (Olympus). Iċ-ċelloli ġew magħduda fuq tliet oqsma magħżula b'mod każwali li ma jikkoinċidux f'kull slide tat-tessut tal-hippocampal bl-indiċi tas-sopravivenza definit bħala n-numru ta 'newroni superstiti/numru totali ta' newroni.

2.9|Tbajja 'TUNEL

Sezzjonijiet ta 'tessuti tal-hippocampal ġew inkubati b'soluzzjoni ta' proteinase K għal 15-il minuta segwit minn inkubazzjoni b'taħlita ta 'reazzjoni TUNEL (Beyotime). Wara li nħaslu tliet darbiet bil-PBS, is-sezzjonijiet ġew immuntati b'soluzzjoni ta 'immuntar li kien fih iż-żebgħa nukleari DAPI u osservati bl-użu ta' mikroskopju fluworexxenti konvenzjonali jew mikroskopju fluworexxenti tal-laser konfokali.

2.10|Kostruzzjoni ta' database ta' mira ta' 3TC

Id-database tal-mira ta' 3TC inbniet ibbażata fuq żewġ databases. L-ewwel, il-miri potenzjali ta '3TC ġew identifikati bl-użu tal-mappa tal-ġeni farmakodinamika inversa bbażata fuq id-database Pharmmapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Il-komponenti kimiċi kollha ġew ikkonvertiti għall-format ta '.mol2 minn Chembiodraw u mtella' fid-database Pharmmapper (Figura 1C). Molekuli b'Punteġġ ta' Qbil Normalizzat akbar minn 4.0 ġew identifikati bħala miri potenzjali ta' 3TC. It-tieni, id-database ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) intużat għall-mistoqsijiet dwar l-attivitajiet bijoloġiċi ta' miri jew komposti. Proteini vverifikati bħala derivati ​​minn Homo sapiens ġew identifikati bħala l-miri potenzjali ta '3TC.

2.11|Analiżi tal-interazzjoni tal-proteini fil-mira u l-kostruzzjoni tan-netwerk

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 ġew magħżula fl-issettjar iddisinjat wara li ġew eliminati d-duplikati.

Biex jiġu investigati b'mod komprensiv il-mekkaniżmi molekulari ta '3TC, in-netwerks PPI ġew mibnija bl-użu tas-softwer Cytoscape verżjoni 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). Twettqet analiżi tal-grad tan-nodi bil-Centiscape 2.2 (http:// apps.cytoscape.org/apps/centiscape) biex jiġu skrinjati l-ġeni tal-hub fin-netwerks bil-valur taċ-ċentralità tal-qrubija, il-valur taċ-ċentralità bejn il-qalb u l-valur taċ-ċentralità tal-grad issettjat għal {{6 }}.2, 450 u 50, rispettivament.

2.12|L-arrikkiment u l-iskrinjar tal-mogħdijiet tas-sinjalar għal 3TC

Twettqet analiżi ta 'arrikkiment tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) bi proċessi bijoloġiċi, komponenti ċellulari u funzjonijiet molekulari ta' miri potenzjali għal annotazzjoni tal-funzjoni bijoloġika bbażata fuq database tal-bijoinformatika DAVID (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). Il-mogħdijiet metaboliċi KEGG ġew annotati bbażati fuq id-databases tal-Enċiklopedija ta’ Kjoto tal-Ġeni u l-Ġenomi (KEGG) bl-użu tas-Server ta’ Annotazzjoni Awtomatika KEGG onlajn (http://www.genome.jp/ kegg/)

2.13|L-irbit tat-3TC mal-miri mbassra

Il-fajls tal-istruttura SDF tal-kompost 3TC inkisbu mill-websajt Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Il-fajl SDF ġie trasformat f'fajl PDB minn softwer OpenBabel2.3.2, u l-proteini tar-riċetturi ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) u EGFR (PDBID:6S9C) inkisbu mid-database tal-Protein Data Bank (www.wwpdb). .org). Is-softwer PYMOL2.3.4 intuża biex jitneħħa l-ilma u l-ligandi mill-proteini tar-riċetturi. L-istudju tad-docking sar bl-użu tal-AutoDock Vina (1.1.2), li huwa softwer ta 'docking molekulari ta' sors miftuħ żviluppat minn Scripps. Intuża softwer tal-għodda biex jimmodifika l-erba 'proteini tar-riċettur, u l-kmand tal-Kaxxa tal-Grid taħt il-programm tal-Grid intuża biex tiftaħ l-għodda tal-Għażla tal-Grid biex tanalizza kull proteina tar-riċettur. L-ispazjar tal-kannizzata kien issettjat għal 1, u ċ-ċentru tal-but ġie stabbilit bħala ċ-ċentru tas-sit tal-irbit.

2.14|Kultura taċ-ċelluli u trattament

Il-linji taċ-ċelluli newronali tal-hippocampal tal-ġurdien HT22 inxtraw mill-Kumpanija ta 'Shanghai Cell Biotechnology. Iċ-ċelloli HT22 ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS). Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi 6-pjanċi ta' bir ġurnata qabel it-trattamenti sperimentali. Is-senescence taċ-ċelloli ġiet indotta minn formaldehyde (FA), mixtrija minn Sigma-Aldrich, kif deskritt qabel.24 ċelluli HT22 ġew maqsuma fi tliet gruppi, inkluż il-grupp FA trattat bi 30 µmol/L FA għal 24 siegħa, l-FA/3TC grupp ittrattat kemm bi 30 µmol/L FA kif ukoll 50 µmol/L 3TC, u l-grupp ta’ kontroll ikkultivat mingħajr la FA jew 3TC.

2.15|Immunofluworexxenza u mikroskopija

Il-medju tneħħa, u ċ-ċelloli ġew iffissati bl-użu ta 'soluzzjoni ta' paraformaldehyde ta '2 fil-mija għal siegħa f'temperatura tal-kamra. L-esperiment ta’ immunofluworexxenza sar kif deskritt qabel.25 L-antikorpi użati f’dan l-istudju kienu jinkludu l-antikorp anti LINE-1 ORF1p (1:1000; Sigma-Aldrich) b’antikorp sekondarju Alexa Fluor 594 (1:1000; Invitrogen) . Iċ-ċelloli ġew inkubati b'DAPI (dilwizzjoni 1:500; Thermo Fisher Scientific) għal minuta 1 biex ittikketta n-nuklei. Wara li l-aġent ta 'immuntar tat-tifi kontra l-fluworexxenza ġie miżjud, iċ-ċelloli ġew osservati bl-użu ta' mikroskopju konfokali (Nikon). 2.16|Analiżi Western blot

L-espressjonijiet ta 'EGFR, p-AKT1 (Akt1 Attiv: fosforilati f'S473) u ADRB2 ġew imkejla permezz ta' analiżi Western blot. Proteina totali nġabret miċ-ċelloli wara diversi trattamenti. Western blot sar kif deskritt qabel.26 L-antikorpi użati f'dan l-istudju kienu jinkludu antikorp anti-EGFR (1:500; Sigma-Aldrich), antikorp anti-pAKT1 (1:1000; Sigma-Aldrich) u antikorp anti-ADRB2 (1:200; Sigma-Aldrich) b'antikorp sekondarju kontra l-fenek (1:1,000; Invitrogen). Wara l-ħasil, il-blots ġew żviluppati bis-sistema ta 'skoperta ECL Western blotting (Amersham, Aylesbury, UK).

2.17|Analiżi tad-dejta u statistika

Kull esperiment ġie ripetut mill-inqas tliet darbiet u kkunsidrat validu bil-provi juru riżultati simili. Ir-riżultati ġew ippreżentati bħala l-medja ± devjazzjoni standard (SD). Id-differenza sinifikanti kienet determinata jew mit-test t ta' Student b'p < 0.05.

Staqsi għal aktar:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: flimkien ma' 86 15292862950