Cistanche Glyside Rg1 ittejjeb il-fibrożi tal-fwied indotta mit-tixjiħ billi jinibixxi l-inflammasome NOX4/NLRP3 fil-ġrieden SAMP8
May 29, 2023
Astratt.Tixjiħspiss ikun akkumpanjat minnkorriment tal-fwiedufibrożi, eventwalment iwassal għal tnaqqis filfunzjoni tal-fwied. Madankollu, il-mekkaniżmu takorriment tal-fwied ikkawżat mit-tixjiħufibrożigħadu mhux mifhum bis-sħiħ, sa fejn nafu, u bħalissa m'hemm l-ebda għażliet ta 'trattament effettivi disponibbli għat-tixjiħ tal-fwied. Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) ġie rrappurtat li jeżerċita effetti qawwija kontra t-tixjiħ minħabba l-attività anti-ossidanti u anti-infjammatorja qawwija tiegħu. L-istudju preżenti kellu l-għan li jinvestiga l-effett protettiv u l-mekkaniżmu ta 'azzjoni sottostanti ta' Rg1 inkorriment tal-fwied ikkawżat mit-tixjiħufibrożifisenescence-aċċellerataġrieden suxxettibbli għall-ġurdien 8 (SAMP8) ittrattati għal 9 ġimgħat.
Ir-riżultati istopatoloġiċi wrew li l-arranġament tal-epatoċiti kien diżordinat, seħħet deġenerazzjoni bħal vakuole fil-maġġoranza taċ-ċelloli, u l-kollaġen IV u TGF- Livelli ta 'espressjoni 1, li ġew skoperti permezz ta' immunoistokimika, kienu wkoll regolati b'mod sinifikanti fil-grupp SAMP8. It-trattament Rg1 tjieb b'mod notevolikorriment tal-fwied ikkawżat mit-tixjiħ u fibrożi, u rregola b'mod sinifikanti l-livelli ta' espressjoni tal-kollaġen IV u TGF- 1. Barra minn hekk, it-tbajja 'dihydro ethylene u r-riżultati tal-western blotting wrew li t-trattament Rg1 naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' speċi reattivi ta 'ossiġnu (ROS) u IL-1 , u rregola inqas il-livelli ta' espressjoni ta' NADPH oxidase 4 (NOX4), p47phox, p22phox, phosphorylated-NF-κB, caspase-1, proteina speck-like assoċjata mal-apoptosi li fiha dominju ta 'reklutaġġ ta' caspase C-terminal u d-dominju tal-pyrin tal-familja NLR li fih inflammasome 3 (NLRP3), li kienu rregolati b'mod sinifikanti fit-tessuti tal-fwied ta 'ġrieden SAMP8 anzjani. Bħala konklużjoni, is-sejbiet ta 'l-istudju preżenti jissuġġerixxu li Rg1 jista' jnaqqaskorriment tal-fwied ikkawżat mit-tixjiħ u fibrożibilli tnaqqas l-istress ossidattiv ROS medjat minn NOX4 u tinibixxi l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3.
Introduzzjoni
Il-fibrożi tal-fwied hija proċess dinamiku assoċjat mad-depożizzjoni u r-riassorbiment kontinwu tal-matriċi extraċellulari, prinċipalment il-collagen fibrillari (3), li ħafna drabi huwa l-ewwel pass f'distorsjoni arkitettonika u disfunzjoni li tipprevjeni l-funzjonament normali tal-fwied (4). Jekk ma tiġix ittrattata, il-fibrożi tal-fwied tista 'twassal għal ċirrożi avvanzata tal-fwied u epatoma (4). L-evidenza akkumulata ssuġġeriet li s-suxxettibilità għall-fibrożi tal-fwied u l-epatite tiżdied b'mod sinifikanti bl-età (5). Għalhekk, jibqa' ta' importanza kbira li jiġu studjati t-tixjiħ tal-fwied u l-mekkaniżmi sottostanti assoċjati biex jiġu pprovduti strateġiji ġodda biex tiġi evitata l-fibrożi tal-fwied relatata mat-tixjiħ.7
riċettur ta' rikonoxximent ta' caspase-1 u proteina speck-like assoċjata mal-apoptosi li fiha dominju ta' reklutaġġ ta' caspase C-terminal (ASC). Skont is-sejba ta’ studji preċedenti, l-NLRP3 inflammasome, tip ta’ inflammasome espress kullimkien f’bosta tessuti, inkluż il-fwied, ġie skopert li huwa involut fl-evoluzzjoni tal-fibrożi tal-fwied u l-progressjoni ta’ ħsara fil-fwied u mard tal-fwied relatat mal-età ( 20-22). Meta jiġi attivat minn diversi irritanti, bħal ATP u kristalli tal-kolesterol, kif ukoll patoġeni batterjali, virali u fungali (23,24), l-inflammasome NLRP3 jirrispondi għall-infjammazzjoni billi jippromwovi l-maturazzjoni ta 'serje ta' ċitokini proinfjammatorji, bħal IL-1 u IL-18 (25). Barra minn hekk, ġie rrappurtat li l-akkumulazzjoni eċċessiva ta 'ROS attivat l-inflammasome NLRP3 fil-fwied matul il-proċess tat-tixjiħ, li eventwalment wassal għal mard tal-fwied assoċjat mat-tixjiħ (26).
materjali u metodi
Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 fil-mija; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) darba kuljum għal 9 ġimgħat. Il-gruppi SAMP8 u SAMR1 ġew ittrattati b'ilma distillat għal 9 ġimgħat. Wara 9 ġimgħat ta 'trattament, sitt ġrieden f'kull grupp ġew sagrifikati permezz ta' dislokazzjoni ċervikali. Il-fwied inħasdu u nħażnu f'temperatura ta' -80˚C għal użu sussegwenti f'esperimenti ta' western blotting, jew imqiegħda
tome (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) f'-20˚C. Is-sezzjonijiet ġew maħsula bil-PBS u inkubati b'5 mg/l soluzzjoni Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) f'temperatura tal-kamra għal 5 min. Imbagħad, is-sezzjonijiet ġew issiġillati b'aġent tat-tifi kontra l-fluworexxenza (Beyotime Institute of Biotechnology) u viżwalizzati bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti (Olympus IX72; Olympus Corporation; ingrandiment, x400). Is-softwer Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) intuża biex jikxef id-densità medja ta 'fluworexxenza ħamra minn tliet oqsma ta' vista magħżula b'mod każwali f'kull taqsima biex tindika l-produzzjoni ROS.
Eżami patoloġiku tat-tessut tal-fwied.
Il-bidliet morfoloġiċi fil-fwied ġew eżaminati bl-użu ta 'H&E, aċidu-Schiff perjodiku (PAS), u tekniki ta' tbajja trikromju ta 'Masson. It-tbajja 'H&E hija l-aktar metodu komuni biex jiġu osservati bidliet patoloġiċi fit-tessuti (38). Fil-qosor, kampjuni tal-fwied ġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde għal 24-48 siegħa, deidrati u inkorporati fil-paraffin, imbagħad maqtugħin f'sezzjonijiet ħoxnin ta '5-µm. Sezzjonijiet tal-fwied (n=4) ġew deparaffinizzati fi xylene u reidratati f'serje ta 'alkoħol gradat (etanol anidru, 85 fil-mija etanol, 75 fil-mija etanol), imbagħad imtebba' b'ematossilin għal 3 min u eosin għal 30 sek. Dawn il-passi kollha twettqu f'temperatura ambjentali. Is-sezzjonijiet ġew issiġillati b'reżina newtrali u osservati bl-użu ta 'mikroskopju tad-dawl (Olympus IX72; Olympus Corporation; ingrandiment, x200).
Tbajja immunoistokimika.
Is-sezzjonijiet inkorporati fil-paraffin (n=4) ġew deparaffinizzati u idratati mill-ġdid, skont il-metodu deskritt għat-tbajja 'H&E. Imbagħad, is-sezzjonijiet ġew inkubati bi 3 fil-mija H2O2 għal 10 minuti f'37˚C biex jimblokka l-attività tal-perossidasi endoġena qabel ma ġew mgħaddsa f'buffer taċ-ċitrat tas-sodju jagħli għal 7 minuti f'forn microwave għall-irkupru tal-antiġen. It-taqsimiet sussegwentement ġew inkubati b'10 fil-mija serum tal-mogħoż (cat. nru. C0265; Beyotime Institute of Biotechnology) f'37˚C għal 30 min biex jimblokka t-twaħħil mhux speċifiku. It-taqsimiet imbagħad ġew inkubati bl-antikorpi primarji li ġejjin f'4˚C matul il-lejl: Anti-collagen poliklonali tal-fenek IV (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; nru tal-kat. BS1072), fenek poliklonali anti-NLRP3 (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nru BS90949) u fenek poliklonali anti-TGF-1 (1:100; Abcam; kat. nru ab92486).
Western blotting.
Proteina totali ġiet estratta mit-tessuti tal-fwied (n{{0}}) bl-użu ta' buffer ta' liżi RIPA (nru tal-kat P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) u magna awtomatika tat-tħin rapidu tal-kampjun (Jinxing Industrial Development Co., Ltd .) f'65 Hz għal 60 sek f'4˚C. Il-proteina totali ġiet ikkwantifikata permezz ta' kit ta' analiżi tal-proteini BCA u l-proteini (20 µg) ġew separati permezz ta' 8-15 fil-mija SDS/PAGE. Il-proteini separati ġew sussegwentement trasferiti fuq membrani PVDF (MilliporeSigma) u mblukkati b'5 fil-mija ħalib xkumat f'TBS-0.05 fil-mija Tween-20 (TBST) buffer għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-membrani mbagħad ġew inkubati bl-antikorpi primarji li ġejjin matul il-lejl f'4˚C: Anti-NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nr. BS90949), anti-ASC (1:1) ,000; BIOSS; Cat. Nru. bs-67412-R), anti-caspase-1(1:1,{000; Abcam; Cat. Nru. ab1872), anti-IL-1 (1:500; Abcam;cat. nru. ab9722), anti-NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology,Inc.; kat. nru. BS60435), anti-p47phox (1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; Cat. Nru BS4852), anti-p22phox (1:1,000;Bioworld Biotechnology, Inc.; Cat. Nru. BS60290), anti-NF-κB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;
Wara l-inkubazzjoni primarja tal-antikorpi, il-membrani ġew maħsula b'TBST tliet darbiet (10 min kull darba) u inkubati b'IgG kontra l-fenek tal-mogħoż konjugat bl-HRP (1:10,000; Affinity Biosciences; cat. nru S. 0001) u antikorpi sekondarji tal-mogħoż kontra l-ġurdien IgG (1:10,000 Affinity Biosciences; cat. nru S0002) għal siegħa f'temperatura ambjentali. Il-meded tal-proteini ġew viżwalizzati bl-użu ta 'kit ECL (Bio‑Rad Laboratories, Inc.) u Bioshine Chemi Imaging System (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology). Id-densità ottika ta 'kull medda kienet semi-kwantifikata bl-użu ta' softwer ImageJ 1.53a (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa) u normalizzata għall-espressjoni GAPDH.
Analiżi statistika.
Id-dejta kollha hija ppreżentata bħala l-medja ± SD ta' Akbar minn jew ugwali għal 3 esperimenti indipendenti. GraphPad Prism 8.0 Software (GraphPad Software, Inc.) intuża biex isiru l-analiżi statistiċi. Twettqet ANOVA f'direzzjoni waħda segwita mit-test post hoc ta' Tukey biex tqabbel id-differenzi bejn il-gruppi. P< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Riżultati
tesplora jekk Rg1 ittaffix il-fibrożi tal-fwied relatata mat-tixjiħ, id-depożizzjoni tal-kollaġen ġiet imkejla fit-tessuti tal-fwied bl-użu tat-tebgħa ta 'Masson. Ir-riżultati wrew li ż-żoni pożittivi blu żdiedu b'mod sinifikanti fit-tessuti tal-fwied tal-grupp SAMP8 meta mqabbla mal-grupp SAMR1 (Fig. 2A u B). Madankollu, meta mqabbel mal-grupp tal-mudell SAMP8, il-livelli ta 'depożizzjoni ta' kollaġen tnaqqsu b'mod sinifikanti fil-gruppi ta 'trattament tempol, apocynin u Rg1 (5 u 10 mg / kg) (Fig. 2A u B). Barra minn hekk, il-livelli ta 'espressjoni tal-kollaġen IV u TGF-1 ġew imkejla fit-tessuti tal-fwied bl-użu ta' tbajja immunoistokimika.
Ir-riżultati tal-kollaġen IV tbajja wrew li collagen IV kien espress f'livelli baxxi fit-tessuti tal-fwied fil-grupp SAMR1 (Fig. 3A u C). Madankollu, meta mqabbel mal-grupp SAMR1,
It-trattament Rg1 inaqqas il-produzzjoni ta 'ROS u l-espressjoni ta' NOX4 fil-fwied tal-ġrieden SAMP8. ROS huwa fattur importanti fl-iżvilupp tal-fifibrożi epatika (41). Fl-istudju preżenti, intużat sonda ROS, DHE, biex tiskopri l-livell ta 'produzzjoni ta' ROS fit-tessuti tal-fwied. Ir-riżultati wrew li kien hemm livelli baxxi ta 'produzzjoni ta' ROS fit-tessuti tal-fwied tal-grupp SAMR1. Madankollu, meta mqabbla mal-grupp SAMR1, il-livelli ta 'produzzjoni ROS żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp SAMP8 (Fig. 4A u B), filwaqt li meta mqabbla mal-grupp SAMP8, tempol, apocynin u Rg1 (5 u 10 mg / kg) trattament b'mod sinifikanti naqqas il-livelli ta 'produzzjoni ta' ROS fit-tessuti tal-fwied (Fig. 4A u B). Biex jiġi kkonfermat l-effett ta 'NOX4 fuq l-akkumulazzjoni ta' ROS matul ix-xjuħija, ġew analizzati l-livelli ta 'espressjoni ta' proteini relatati ma 'NOX4. Ir-riżultati wrew li, meta mqabbla mal-grupp SAMR1, il-livelli ta 'espressjoni ta' NOX4, p22phox u p47phox fit-tessuti tal-fwied kienu regolati b'mod sinifikanti fil-grupp SAMP8 (Fig. 5A-D).
Madankollu, meta mqabbel mal-grupp SAMP8, it-trattament tempol, apocynin u Rg1 (5 u 10 mg / kg) irregola b'mod sinifikanti l-livelli ta 'espressjoni ta' NOX4, p22phox u p47phox fit-tessuti tal-fwied matul it-tixjiħ (Fig. 5A-D). Din id-dejta ssuġġeriet li t-trattament b'Rg1 jista' jtejjeb il-ħsara mill-istress ossidattiv ikkawżat minn ROS fit-tessuti tal-fwied billi jinibixxi NOX4 waqt it-tixjiħ fil-ġrieden.
