KLRG1 jimmarka s-sottosettijiet taċ-ċelluli T CD4 li jinfiltraw it-tumur assoċjati mal-progressjoni tat-tumur u r-rispons għall-immunoterapija

Astratt

Il-metodi attwali għall-iskoperta tal-bijomarkaturi u l-identifikazzjoni tal-mira fl-immuno-onkoloġija jiddependu fuq snapshots statiċi tal-immunità tat-tumur. Biex nikkaratterizzaw bir-reqqa n-natura temporali tar-risponsi immuni kontra t-tumur, żviluppajna 34-panel ta' ċitometrija tal-fluss spettrali tal-parametri u wettaqna analiżi ta' rendiment għoli f'kuntesti kritiċi.

Aħna influwenzajna żewġ mudelli prekliniċi distinti li jirrikapitulaw l-immunoediting tal-kanċer (NPKC1) u r-rispons tal-imblokk tal-punt ta 'kontroll immuni (ICB) (MC38), rispettivament, u pprofilajna tessuti rilevanti multipli fi u madwar punti ewlenin ta' inflessjoni ta 'sorveljanza immuni u ħarba u/jew rispons ICB.

Il-miri jirreferu għal bijomolekuli importanti fiċ-ċelloli, bħal proteini, enzimi u riċetturi. Ir-rikonoxximent fil-mira huwa l-użu ta 'metodi kimiċi u bijoloġiċi biex jiġu identifikati l-proprjetajiet u l-funzjonijiet speċifiċi ta' dawn il-bijomolekuli għall-applikazzjoni fit-trattament tal-mard u l-iżvilupp tad-droga.

L-immunità tirreferi għall-kapaċità tal-ġisem li jirreżisti l-invażjoni ta 'patoġeni barranin u t-tkabbir ta' ċelloli anormali endoġeni. Il-qalba tas-sistema immunitarja hija ċ-ċelloli u l-molekuli immuni, li għandhom konnessjonijiet u interazzjonijiet mill-qrib mal-miri tagħhom.

Fit-trattament tal-mard u l-iżvilupp tad-droga, ir-relazzjoni bejn l-identifikazzjoni tal-mira u l-immunità hija importanti ħafna. Pereżempju, il-mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' ħafna mediċini huwa permezz ta 'rikonoxximent tal-mira, li jimmira proteini speċifiċi, enzimi, riċetturi, u molekuli oħra, li jaffettwaw il-funzjonijiet tagħhom, u jirregolaw it-trasduzzjoni tas-sinjali, biex jinkisbu effetti terapewtiċi. Iċ-ċelloli u l-molekuli fis-sistema immuni jistgħu jkunu wkoll miri tad-drogi. Pereżempju, mediċini kontra l-kanċer jiksbu effetti terapewtiċi billi jaffettwaw ir-rispons immuni taċ-ċelloli tal-kanċer u jirregolaw l-apoptosi u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli.

Għalhekk, fl-iżvilupp tad-droga u t-trattament kliniku, konsiderazzjoni komprensiva ta 'identifikazzjoni tal-mira u fatturi ta' immunità tista 'twassal għal żvilupp ta' droga aktar effettiv u effett terapewtiku mtejjeb. Minn dan il-lat, jeħtieġ li ntejbu l-immunità. Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità. Cistanche hija rikka f'varjetà ta 'sustanzi antiossidanti, bħal vitamina Ċ, vitamina Ċ, karotenojdi, eċċ Dawn l-ingredjenti jistgħu jneħħu r-radikali ħielsa, inaqqsu l-istress ossidattiv, u jtejbu l-immunità. reżistenza tas-sistema.

Ikklikkja cistanche tubulosa estratt trab

L-analiżi tad-dejta mmexxija mit-tagħlim tal-magni wriet mudell ta 'espressjoni KLRG1 li identifika b'mod uniku popolazzjonijiet ta' ċelluli CD4 T intratumorali li jassoċjaw b'mod kostituttiv mal-piż tat-tumur fil-mudelli tat-tumur, u jintilfu f'tumuri li għaddejjin minn rigressjoni b'rispons għal ICB. Bl-istess mod, Helios-KLRG1 flimkien ma 'subsett ta' ċelluli T regolatorji li jinfiltraw it-tumur (Tregs) kien assoċjat mal-progressjoni tat-tumur mill-ekwilibriju immuni biex jaħrab u ntilef ukoll f'tumuri li jirrispondu għal ICB.

Studji ta 'validazzjoni kkonfermaw firem KLRG1 fiċ-ċelluli T CD4 li jinfiltraw it-tumur tal-bniedem assoċjati mal-progressjoni tal-marda fil-kanċer tal-kliewi. Dawn is-sejbiet jinnominaw popolazzjonijiet ta 'ċelluli T KLRG1 flimkien ma' CD4 bħala sottogruppi għal aktar investigazzjoni fl-immunità tal-kanċer u juru l-utilità tal-profiling tal-fluss spettrali lonġitudinali bħala magna ta 'bijomarkatur dinamiku u/jew skoperta fil-mira.

Introduzzjoni

L-immunoterapija issa hija pilastru tat-trattament tal-kanċer. Madankollu, ir-reazzjonijiet għall-biċċa l-kbira tal-aġenti immunoterapewtiċi jibqgħu rari, ristretti għal numru limitat ta 'tipi ta' tumuri, u diffiċli biex jiġu mbassra (1). It-titjib tar-rati ta 'rispons u l-iżvilupp ta' bijomarkaturi li jbassru r-rispons huma għanijiet ċentrali tal-qasam tal-immunoloġija tat-tumur, iżda dan għadu ta 'sfida.

Għadd ta' interazzjonijiet multi-ċellulari kumplessi jistgħu jirregolaw ir-riżultat ta' rispons immuni kontra t-tumur fi kwalunkwe pazjent partikolari. Għalhekk, huwa komuni li bijomarkaturi singoli - jew modulazzjoni terapewtika ta 'mogħdijiet singulari - għandhom tendenza li jkollhom utilità f'xi wħud, iżda mhux fil-biċċa l-kbira tal-pazjenti tal-kanċer.

Pereżempju, hemm tliet bijomarkaturi relatati mal-immunità bħalissa f'użu kliniku mifrux; (i) piż mutazzjonali tat-tumur (TMB), kif imkejjel direttament jew dedott permezz tal-preżenza ta' mutazzjonijiet diżattivanti fil-makkinarju tat-tiswija tad-DNA(2-4), (ii) espressjoni ta' PD-L1 permezz ta' immunoistokimika (IHC)(5), u (iii) immunità pre-eżistenti kif imkejla bil-preżenza ta 'ċelluli T CD8 ġewwa u madwar tumuri, imsejħa l-Immunoscore (6).

Filwaqt li kull wieħed huwa assoċjat b'mod sinifikanti mar-rispons għall-immunoterapija f'ċerti kuntesti, is-sensittività u l-ispeċifiċità ta 'dawn il-prevedituri jibqgħu sub-ottimali (7). Dawn l-approċċi unimodali x'aktarx jonqsu milli jaqbdu bis-sħiħ il-mekkaniżmi kumplessi sottostanti l-immunità antitumorali, inkluża n-natura dinamika ta 'reazzjonijiet bħal dawn li jseħħu fit-tessuti u maż-żmien.

Bħala tali, l-applikazzjoni ta 'approċċi ta' profiling immuni ta 'ċellula waħda multiplexed ħafna għall-iskoperta tal-bijomarkaturi u l-iskoperta tal-mira b'mod trans-tessut u lonġitudinali tista' tipprovdi fenotipi immuni sfumati b'utilità tbassir u translazzjonali akbar.

Għal dan il-għan, żviluppajna 34-panel ta’ ċitometrija tal-fluss spettrali tal-parametri u pipeline ta’ analiżi tad-dejta ta’ dimensjoni għolja biex jinterrogaw fenotipi immuni fil-livell tal-proteini assoċjati ma’ fażijiet differenti taċ-ċiklu tal-immunoeditjar tal-kanċer, inkluż il-ħarba immuni u t-tkabbir tat-tumur, u punt ta’ kontroll immuni imblokk (ICB) fuq mudelli prekliniċi.

Aħna pprofilaw il-mudelli MC38 ittrattati bl-NPK-C1 u bl-ICB, analizzajna tessuti multipli (tumur, nodi limfatiċi li jbattu kontra li ma jbattux, u demm) fuq u madwar punti ewlenin ta 'inflessjoni fil-progressjoni tat-tumur. Dan iffaċilita l-karatterizzazzjoni profonda tad-dinamika sottostanti rigressjoni tat-tumur naturali u indotta mill-ICB, transizzjoni għal ekwilibriju immuni, u transizzjoni sussegwenti mill-ekwilibriju għal ħarba mhux ikkontrollata tat-tumur. Studji ta' validazzjoni f'settijiet ta' data ta' ċellula waħda umana tal-kanċer tal-kliewi kkonfermaw ir-rilevanza tat-traduzzjoni ta' dawn is-sejbiet.

Materjali u metodi

Ġrieden. Ġrieden C57BL/6J maskili u femminili (5-6 ġimgħat) inxtraw mill-Laboratorju Jackson (Bar Harbor, ME). Il-ġrieden kellhom 6-8 ġimgħat fil-ħin tal-użu. L-annimali kollha kienu miżmuma f'konformità stretta mar-regolamenti tal-NIH u l-Assoċjazzjoni Amerikana tal-Kura tal-Annimali tal-Laboratorju. L-esperimenti u l-proċeduri kollha għal dan l-istudju ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali taċ-Ċentru Mediku tal-Università ta 'Columbia (IACUC).

Linji taċ-Ċelloli. Il-linja taċ-ċelluli NPK-C1 (oriġinarjament LM7304) ġiet ipprovduta minn Dr Cory AbateShen fl-Università ta 'Columbia. Ara r-referenzi preċedenti għal aktar dettall(8,9). Iċ-ċelloli NPK-C1 inżammu f'R10, li jikkonsisti f'medja RPMI (Corning; Corning, NY) supplimentata b'10 fil-mija FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL peniċillina, u 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD). Iċ-ċelloli tal-karċinoma tal-kolon MC38 inxtraw minn Kerafast u kkultivati ​​f'D10 li jikkonsisti f'DMEM (Corning; Corning, NY) supplimentat b'10 fil-mija FBS, 100 U/mL penicillin, u 100 mg/mL streptomycin (Gibco; Gaithersburg, MD).

Sfida tat-Turi u Injezzjonijiet ta' Terapija. Iċ-ċelluli NPK-C1 f'konfluwenza ta' 70-90 fil-mija jew ċelluli MC38 f'konfluwenza ta' 50-75 fil-mija ġew maħsuda ma' 0.{05 fil-mija trypsin (Gibco, Gaithersburg, MD), maħsula bi PBS, magħdud, u sospiż mill-ġdid f'10x106 ċelluli/mL f'PBS kiesaħ bis-silġ. F'jum 0, ġrieden ta' 6-8 ġimgħa ġew impjantati fuq il-ġenb tal-lemin b'ċelluli 1x106 NPK-C1 jew MC38. Il-kejl tat-tumur kien irreġistrat f'dimensjonijiet X, Y, u Z (l-akbar dijametru, l-iżgħar dijametru, u l-akbar għoli, rispettivament) kull 2-3 jiem permezz ta' kalibru diġitali u l-volum tat-tumur ġie kkalkulat bil-multiplikazzjoni ta' X*Y*Z. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) jew Antikorp isotip Rat IgG2a (Bio X Cell; Lebanon, NH) ġie dilwit f'PBS sterili u amministrat b'injezzjoni intraperitoneali (IP) f'200 ug/ mL għal kull ġurdien fil-ġranet 3, 6, 9, u 12-il impjantazzjoni wara l-MC38.

Ħsad tat-Tessuti. Wara l-ewtanasja tal-ġrieden, ~200 ul demm ġie iżolat permezz ta' titqib kardijaku bl-użu ta' labra tas-siringa miksija b'0.2 fil-mija eparina (StemCell Technologies; Vancouver, BC) u tqiegħed fuq is-silġ f'tubi li fihom 10 ul 0.5M EDTA (Corning; Corning, NY). Lymph nodes ingwinali li jbattu t-tumur u li ma jqattgħux it-tumur ġew imqassma u mqiegħda fi 48-pjanċi tal-bir li kien fihom 150 ul R10 media fuq is-silġ.

Tumuri ġew maħsuda, massed, u sa 50 mg tumur kien imqatta 'u mqiegħda fil-midja X-Vivo 15 (Lonza; Basel, l-Isvizzera) f'tubi Eppendorf ta' 5mL fuq is-silġ. DNase (40 ul ta’ soluzzjoni ta’ 20 mg/mL; Roche; Basel, l-Isvizzera) u Collagenase D (125 ul ta’ soluzzjoni ta’ 40 mg/mL; Roche; Basel, l-Isvizzera) ġew miżjuda mal-kampjuni tat-tumur qabel l-inkubazzjoni fuq shaker f’37o C għal 30 minuta. Ir-reazzjonijiet tad-diġest ġew mitfija permezz ta 'vortexing (30 sekonda) u żżid midja R10 ta' 5mL. Id-diġestjoni tat-tumur ġew iffiltrati permezz ta 'filtri ta' 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) u pelleted. Kampjuni tad-demm ġew RBC lysed b'żewġ inkubazzjonijiet suċċessivi ta' 2-minuti f'2mL buffer ACK (Quality Biological; Gaithersburg, MD) u tkessiħ f'R10 qabel it-tqattigħ. Il-lymph nodes ġew fiżikament diżaggregati bi planġer ta' siringa ta' 1mL fil-48-plakka tal-bir, imbagħad is-sospensjonijiet ġew iffiltrati minn 40-um filtri. Il-kampjuni kollha tpoġġew fi pjanċi tal-bir 96-U-qiegħ għat-tbajja'.

Ċitometrija tal-Fluss. Il-kampjuni ġew maħsula bil-PBS. Ċelloli mejta kienu mtebbgħin permezz ta 'sospensjoni mill-ġdid f'100 ul PBS flimkien ma' żebgħa Blu Live/Dead Fixable (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Dan u l-passi ulterjuri kollha ta 'tbajja' jew fissazzjoni saru għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra fuq plate shaker, protett mid-dawl. Il-kampjuni ġew maħsula 2x b'PBS, imbagħad ġew sospiżi mill-ġdid f'FACS (PBS flimkien ma '3 fil-mija FBS flimkien ma' 1mM EDTA flimkien ma '10mM HEPES) supplimentati b'TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) u TruStain Monocyte Blocker (1:20); BioLegend; San Diego, CA) u mqiegħda fuq is-silġ.

L-antikorpi tal-wiċċ ġew ippreparati f'dilwizzjonijiet ottimali (ara Tabella Supplimentari S1) f'FACS supplimentat b'buffer Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), imbagħad ġew miżjuda mal-kampjuni f'soluzzjoni ta 'imblukkar. Wara t-tbajja ', il-kampjuni ġew maħsula 2x bil-buffer FACS u ffissati f'100 ul ta' buffer FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit (eBioscience; San Diego, CA). Il-kampjuni ġew maħsula darbtejn b'1X Permeabilization buffer (1X PW) u mbagħad imtebba 'f'1X PW flimkien ma' antikorpi intraċellulari. Il-kampjuni ġew imbagħad maħsula darbtejn f'1X PW imbagħad iffissati f'100 ul ta' buffer FluoroFix (BioLegend: San Diego, CA), maħsula darbtejn b'FACS, imbagħad sospiżi mill-ġdid f'200 ul FACS u ssiġillati fil-pjanċi ta' 96 bir għall-akkwist l-għada fuq Cytek Aurora 5-ċitometru bil-lejżer.

Kampjuni ta' splenoċiti mtebbgħin fl-istess ħin ġew utilizzati għal kontrolli ta' tebgħa waħda. Analiżi u Statistika. Twettqu esperimenti ta 'profil lonġitudinali darba kull wieħed għal mudelli MC38 u NPK-C1. Total ta' n=10-25 ġrieden għal kull punt ta' ħin ġew evalwati. Id-dejta taċ-ċitometrija tal-fluss ġiet analizzata f'FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), u l-algoritmi tal-plugin ta 'dimensjoni għolja UMAP u FlowSOM ġew imniżżla minn FlowJo Exchange. Sa 30k CD45 ħajjin flimkien ma 'ċelluli li jinfiltraw it-tumur u sa 15k CD45 ħajjin flimkien ma' ċelluli tad-demm jew derivati ​​minn LN għal kull kampjun ġew magħquda għal analiżi dimensjonali għolja.

It-tnaqqis tad-dimensjonalità u l-clustering kollha saru f'FlowJo. Analiżi statistiċi saru fi GraphPad Prism v9.3.1. Pearson Korrelazzjoni ntużat biex tiġġenera koeffiċjenti ta 'korrelazzjoni, u t-testijiet T ta' Student mhux imqabbla mal-korrezzjoni ta 'Welch intużaw biex iqabblu l-frekwenzi tal-cluster bejn il-gruppi. Metodi analitiċi b'ċellula waħda huma deskritti qabel (10,11).

Ir-regulon KLRG1 ġie estratt mill-konsensus metaVIPER KLRG1 regulon minn Obradovic, et al(11). Biex nikkalkulaw il-firma ta 'regulon KLRG1, aħna noqogħdu mudell ta' rigressjoni tal-foresti każwali b'ġeni regulons bħala karatteristiċi u KLRG1 bħala mira, imbagħad ikkalkula punteġġi ta 'importanza ta' Gini ta 'ġeni regulon biex jiddeterminaw l-impatt tagħhom fuq l-espressjoni KLRG1. Il-punteġġ ta 'regulon KLRG1 ta' kull ċellula ngħatat mis-somma peżata ta 'miżuri ta' espressjoni tal-ġeni kollha ta 'regulon fiċ-ċellula b'punteġġi ta' importanza bħala piżijiet.

For more information:1950477648nn@gmail.com