Evalwazzjoni In Vitro Ta 'Fotoreattività U Fototossiċità Ta' Antiossidanti Polifenoli Naturali

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.combiex tkun taf aktar.

Astratt:Il-polifenoli huma familja kbira ta 'komposti naturali użati ħafna fi prodotti kożmetiċi minħabba l-proprjetajiet ta' benefiċċju anti-ossidanti u anti-infjammatorji tagħhom u l-kapaċità tagħhom li jipprevjenu stress ossidattiv indott mir-radjazzjoni UV. Peress li dawn il-komposti jippreżentaw kromofori u huma applikati direttament fuq il-ġilda, jistgħu jirreaġixxu mad-dawl tax-xemx u jeżerċitaw effetti fototossiċi. L-informazzjoni xjentifika disponibbli dwar il-potenzjal fototossiku ta’ dawn il-komposti naturali hija skarsa, u għalhekk l-għan ta’ dan l-istudju kien li jevalwa l-fotoreattività u l-fototossiċità ta’ ħames fenoliċi.antiossidantib'użu dokumentat fi prodotti kożmetiċi. Assaġġ ROS standard ġie vvalidat u applikat għall-iskrin tal-fotoreattività tal-antiossidanti fenoliċi naturali aċidu caffeic, aċidu feruliku, aċidu p-cumariku, 3,4-aċidu dihydroxyphenylacetic (DOPAC), u rutin. Il-potenzjal ta' fototossiċità ġie ddeterminat bl-użu ta' linja taċ-ċelluli tal-keratinoċiti umani (HaCaT), ibbażata fuq it-test ta' fototossiċità 3T3 Neutral Red Uptake. Għalkemm kollhastudjat antiossidanti fenoliċiassorbita radjazzjoni UV/Vis fil-medda ta '290 sa 700 nm, DOPAC biss kien kapaċi jiġġenera ossiġnu singlet. Il-ġenerazzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattivi hija reazzjoni kimika fi stadju bikri bħala parti mill-mekkaniżmu ta 'fototossiċità. Madankollu, l-ebda wieħed mill-komposti studjati ma naqqas il-vijabbiltà tal-keratinoċiti wara l-irradjazzjoni, u dan wassal għall-konklużjoni li m'għandhomx potenzjal fototossiku. Id-dejta miksuba b'dan ix-xogħol tissuġġerixxi li dawn il-komposti huma sikuri meta inkorporati fi prodotti kożmetiċi.

Kliem ewlieni:sigurtà tar-ritratti; fotoreattività; fototossiċità; polifenoli;antiossidanti fenoliċi naturali; speċi ta' ossiġnu reattivi; keratinoċiti; kura tal-ġilda; prodotti kosmetiċi

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Introduzzjoni 

Il-polifenoli (PPs) jikkostitwixxu wieħed mill-aktar gruppi numerużi u mqassma b'mod wiesa 'ta' prodotti naturali fir-renju tal-pjanti. L-istruttura kimika tal-PPs hija kkaratterizzata mill-preżenza ta 'grupp idrossiliku fenoliku wieħed jew aktar, marbutin ma' sistema waħda jew aktar taċ-ċirku tal-benżin [1]. Il-polifenoli juru varjetà ta 'attivitajiet bijoloġiċi ta' benefiċċju fil-bnedmin, inklużi azzjoni antivirali, antibatterika, antikarċinoġenika, epatoprotettiva, anti-infjammatorja u antiossidanti [2-5].Bħala antiossidanti, Il-polifenoli jistgħu jipproteġu l-kostitwenti taċ-ċelluli kontra l-effetti ta 'ħsara ossidattivi ta' speċi reattivi ta 'ossiġnu (ROS), bħal ossiġnu singlet, superoxide, u radikali hydroxyl, li jillimitaw ir-riskju ta' diversi mard assoċjat ma 'stress ossidattiv [6,7]. Minħabba l-proprjetajiet kimiċi tagħhom, il-PPs huma kapaċi jneħħu r-ROS u l-jonji tal-metalli ta’ transizzjoni li jikkelaw, bħall-ħadid u r-ram, li ġibdu l-interess tal-industrija tal-kosmetiċi għall-użu tagħhom fil-formulazzjonijiet tal-kura tal-ġilda [8-10]. L-espożizzjoni għall-ultravjola (UV) hija waħda mill-fatturi ewlenin li jinduċu l-kanċer tal-ġilda, u ċ-ċelloli tal-ġilda jistgħu jiġu mħassra direttament mir-radjazzjoni UV jew indirettament minn produzzjoni żejda ta 'ROS medjata mill-UV [11]. Studji sperimentali u epidemjoloġiċi ssuġġerew li l-polifenoli jipproteġu l-ġilda mill-effetti avversi tar-radjazzjoni UV permezz ta 'mogħdijiet multipli [12]. Għalhekk, bosta komposti li jappartjenu għal din il-familja huma diġà użati bħala ingredjenti f'numru ta' prodotti kożmetiċi kummerċjali disponibbli fis-suq [13]. Żieda fit-talbiet tal-konsumaturi għall-kożmetiċi naturali ħeġġet lill-industrija tiżviluppa formulazzjonijiet li jużaw estratti naturali b'ingredjenti attivi, bħall-polifenoli, bħala soluzzjoni promettenti u effettiva għall-kura tal-ġilda [13]. Madankollu, il-kromofori preżenti fl-istruttura tal-polifenoli għandhom il-kapaċità li jassorbu r-radjazzjoni UV/Vis u jgħaddu minn reazzjonijiet kimiċi li jirriżultaw f'kaskata ta' avvenimenti li jistgħu jirriżultaw f'reazzjonijiet fototossiċi [14]. Il-fototossiċità hija definita bħala rispons tossiku li jirriżulta minn kimiċi fotoreattivi amministrati b'mod topiku jew sistemiku wara l-espożizzjoni tal-ġisem għad-dawl ambjentali [15]. Ingredjenti farmaċewtiċi attivi u eċċipjenti għal amministrazzjoni sistemika, formulazzjonijiet kliniċi għal applikazzjoni topika, garżi dermali, u oħrajn, għandhom potenzjal fototossiku u jistgħu jikkawżaw reazzjonijiet fototossiċi notevoli. Konsegwentement, l-aġenziji regolatorji, l-AID tal-Istati Uniti, l-EMA tal-UE u l-ICH, jipprovdu linji gwida dwar is-sikurezza tar-ritratti, billi jintroduċu metodi ta 'test u strateġiji ta' evalwazzjoni [15–17]. Il-valutazzjoni tas-sikurezza tal-prodotti kożmetiċi hija obbligatorja skont il-leġiżlazzjoni tal-Unjoni Ewropea [18]. L-evalwazzjoni tas-sikurezza meħtieġa tinkludi studji tossikoloġiċi rilevanti dwar l-ingredjenti kożmetiċi, inkluża valutazzjoni tat-tossiċità kkaġunata minn foto [18]. Peress li l-ittestjar fuq l-annimali ġie pprojbit għall-prodotti kożmetiċi, għadd ta’ testijiet ta’ sikurezza tar-ritratti in vitro ġew proposti matul l-aħħar snin, inkluża analiżi tal-ispettru UV, test ta’ fototossiċità 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU PT), u speċi reattiva tal-ossiġnu ( ROS) assaġġ [18-20]. L-assaġġ ROS kien iddisinjat għall-valutazzjoni tal-fotoreattività tad-drogi, li l-prinċipju tiegħu huwa l-monitoraġġ tar-reazzjonijiet fotokimiċi fis-sustanzi kimiċi tat-test esposti għal dawl tax-xemx simulat [19,20]. Permezz ta 'dawn ir-reazzjonijiet fotokimiċi ROS, bħal anjoni superossidu u ossiġnu singlet, jistgħu jiġu ġġenerati, u dawn il-proċessi fotokimiċi jistgħu jkunu trigger għal fototossiċità indotta mid-droga [19,20]. Livelli għoljin ta 'ROS jistgħu jikkawżaw ċitotossiċità permezz ta' ħsara tad-DNA, lipidi, u proteini minn stress ossidattiv.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlIl-metodoloġija in vitro 3T3 NRU-PT tuża l-linja taċ-ċelluli tal-fibroblasti tal-ġurdien Balb/c 3T3 u l-assorbiment aħmar newtrali bħala l-endpoint taċ-ċitotossiċità. Il-fototossiċità hija mbagħad iddeterminata bit-tnaqqis relattiv fil-vijabbiltà taċ-ċelloli esposti għall-kimika tat-test fil-preżenza u n-nuqqas ta' dawl li jissimula d-dawl tax-xemx. Studji rrappurtati fil-letteratura kkonkludew li dan it-test huwa sensittiv żżejjed, ibassar bi żball ir-riskji għas-sikurezza tar-ritratti tal-annimali u tal-bniedem, li jwassal għal numru għoli ta 'pożittivi foloz meta mqabbel ma' riżultati in vivo [21-23]. Meta wieħed iqis din il-limitazzjoni, ġiet proposta modifika tal-metodoloġija 3T3 NRU-PT mill-grupp tagħna bbażata fuq l-użu ta 'linja taċ-ċelluli tal-keratinoċiti umani (HaCaT) [24]. Peress li din il-metodoloġija tuża ċelloli tal-keratinoċiti umani, tirrappreżenta mudell aktar realistiku, peress li dawn huma l-aktar tip abbundanti ta 'ċelloli preżenti fis-saff estern tal-ġilda, fejn il-komposti topiċi huma applikati u esposti għar-radjazzjoni tad-dawl tax-xemx [24]. L-għan tal-istudju preżenti kien li jistma l-potenzjal tat-tossiċità foto-indotta tal-polifenoli naturali aċidu p-cumariku, aċidu caffeic, 3,4-aċidu dihydroxyphenylacetic (DOPAC), aċidu feruliku, u rutin (Figura 1), li diġà jintużaw bħala ingredjenti kożmetiċi jew qed jiġu kkunsidrati minħabba l-proprjetajiet kimiċi u antiossidanti interessanti tagħhom [25–27]. Assaġġ ROS ġie vvalidat u implimentat għall-valutazzjoni esploratorja tas-sikurezza tar-ritratti tal-komposti, u ċ-ċitotossiċità u l-fototossiċità tagħhom ġew ivvalutati aktar bl-użu ta 'linja taċ-ċelluli tal-keratinoċiti umani (HaCaT).

2. Riżultati u Diskussjoni 

Il-konsiderazzjoni inizjali għall-valutazzjoni tal-potenzjal fotoreattiv hija jekk kompost jassorbix fotoni fi kwalunkwe wavelength bejn 290 u 700 nm. Kompost li għandu koeffiċjent ta' estinzjoni molari (MEC) akbar minn 1000 L mol-1 cm-1 fi kwalunkwe wavelength bejn 290 u 700 nm jitqies li huwa fotoreattiv biżżejjed biex jirriżulta f'fototossiċità diretta [15]. L-ispettri ta' assorbiment ta' aċidi caffeic, p-coumaric, u ferulic, DOPAC, u rutin f'DMSO f'dawl UV viżibbli huma murija fil-Figura 2. Il-komposti kollha jassorbu fil-medda spettrali ta '200 sa 700 nm, b'wavelength massimu fi jew 'il fuq minn 290 nm u b'MEC tipikament akbar minn 4000 L mol−1 cm−1 (Tabella 1). Il-polifenoli huma komposti bijoloġiċi li fihom sistemi konjugati π bi gruppi idroksil fenoliċi. It-tranżizzjonijiet elettroniċi tal-orbitali molekulari tat-tip π huma responsabbli għall-ispettru UV viżibbli ta’ dan il-grupp ta’ komposti [28]

Il-komposti kollha ttestjati ppreżentaw MEC ogħla minn 1000 L mol-1 cm-1, li jfisser li kollha huma komposti fototossiċi possibbli ta 'min jistudja [15]. Qabel ma twettaq l-assaġġ ROS, is-simulatur solari ġie evalwat, u l-kundizzjonijiet sperimentali ġew ottimizzati biex jiġi żgurat li l-valuri mkejla tal-ossiġnu singlet (SO) u l-anjoni superossidu (SA) kienu qrib dawk imsemmija fil-letteratura [29]. L-ottimizzazzjoni tal-assaġġ tal-ġenerazzjoni ROS saret bl-użu ta 'kontrolli pożittivi u negattivi u sar studju ta' fattibilità bl-użu ta 'kimiċi ta' referenza. Taħt il-kundizzjonijiet sperimentali użati, is-sustanzi kollha ttestjati fl-istudju ta' fattibilità ssodisfaw il-kriterji ta' aċċettazzjoni li jagħtu valuri għal SO u SA fil-meded ta' valuri ammissibbli [29].

L-assaġġ ROS twettaq għall-komposti polifenoliċi, u l-kapaċità tas-sustanzi ttestjati li jiġġeneraw ROS, f'konċentrazzjoni ta '200 µM, tidher fit-Tabella 2. Tabella 2. Ir-riżultati nkisbu għall-komposti ttestjati bl-użu tal-assaġġ ROS.

Ir-riżultati miksuba juru li, bl-eċċezzjoni tad-DOPAC, il-komposti kollha, jistgħu jiġu kklassifikati bħala mhux fotoreattivi. Għalkemm dawn is-sustanzi wrew assorbiment tad-dawl UV-viżibbli u MEC ogħla minn 1000 L mol-1 cm-1 ma ġġenerawx ROS taħt il-kundizzjonijiet ittestjati, la speċi SO jew SA. B'mod sorprendenti, DOPAC kien kapaċi jinduċi l-ġenerazzjoni ta 'speċi SO u, għalhekk, ġie kklassifikat bħala fotoreattiv, minkejja li dan il-kompost kellu l-inqas valur MEC fil-medda UV-viżibbli fost il-komposti kollha studjati. Huma meħtieġa aktar studji biex jifhmu r-riżultati miksuba għad-DOPAC, li jista 'jkun importanti wkoll, fil-futur qarib, biex tiġi stabbilita korrelazzjoni bejn l-istruttura kimika ta' kompost u l-kapaċità tiegħu li jkun fotoreattiv. Iċ-ċitotossiċità tad-DMSO użata għall-evalwazzjoni tal-effetti fototossiċi, fil-preżenza u l-assenza ta 'irradjazzjoni, wara 1h ta' espożizzjoni ġiet evalwata. Għall-pjanċa mhux irradjata, DMSO ma werax differenza statistikament sinifikanti relattiva għall-kontrolli negattivi. Madankollu, għall-pjanċa irradjata, kien hemm differenza sinifikanti bejn il-1 fil-mija DMSO u l-kontroll tas-solvent relattiv għall-kontrolli negattivi (p <0.0001), li="" ġġustifikat="" l-użu="" ta="" 'kontroll="" tas-solvent="" fuq="" l-esperimenti="" kollha="" biex="" jiggarantixxi="" li="" d-differenzi="" fil-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="" ġew="" attribwiti="" biss="" lill-komposti="" taħt="" studju.="" biex="" tiġi="" żgurata="" l-fattibilità="" tal-assaġġ="" tal-fototossiċità="" bl-użu="" ta'="" linja="" taċ-ċelluli="" tal-keratinoċiti="" umani="" (hacat),="" 5-methoxy="" psoralen,="" chlorpromazine="" hydrochloride,="" u="" kinina="" ġew="" ittestjati="" bħala="" kontrolli="" pożittivi,="" u="" acetylsalicylic="" acid,="" hexachlorophene,="" u="" sodium="" lauryl="" sulfate="" bħala="" kontrolli="" negattivi="" [24].="" ir-riżultati="" miksuba="" mill-assaġġ="" tal-fototossiċità="" li="" jqabbel="" il-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="" taċ-ċelloli="" hacat,="" irradjati="" u="" mhux="" irradjati,="" fil-preżenza="" tal-komposti="" (poli)fenoliċi="" ttestjati="" huma="" murija="" fil-figura="" 3.="" il-firxiet="" tal-konċentrazzjonijiet="" tas-sustanzi="" kimiċi="" ttestjati="" fil-preżenza="" (irr="" plus="" )="" u="" n-nuqqas="" (irr-)="" tad-dawl="" ġew="" determinati="" f'esperimenti="" ta="" 'sejbien="" tal-firxa="" tad-doża,="" meta="" titqies="" il-konċentrazzjoni="" massima="" ta'="" 1000="" µm.="" serje="" ta'="" dilwizzjoni="" ġeometrika="" ġiet="" użata="" u="" aġġustata,="" meta="" meħtieġ,="" bħala="" funzjoni="" ta'="" konċentrazzjoni-rispons="" fil-preżenza="" u="" n-nuqqas="" ta'="" irradjazzjoni.="" fil-medda="" ta'="" konċentrazzjoni="" ittestjata="" (12.5;="" 31.25;="" 62.5;="" 125;="" 250;="" 500,="" u="" 1000="" µm)="" l-ebda="" waħda="" mis-sustanzi="" tat-test="" ma="" kkaġunat="" tnaqqis="" ta'="" 50="" fil-mija="" fil-vijabbiltà="" taċ-ċelluli,="" għalhekk,="" ma="" kienx="" possibbli="" li="" jiġu="" kkalkulati="" l-valuri="" ic50="" u="" pif="" korrispondenti.="" .="" għall-kuntrarju,="" kien="" possibbli="" li="" tiġi="" pperċepita="" żieda="" fil-vijabbiltà="" li="" tiddependi="" mid-doża="" għaċ-ċelloli="" irradjati="" fil-preżenza="" tas-sustanzi="" ttestjati,="" possibbilment="" minħabba="" l-effetti="" fotoprotettivi="" ta’="" dawn="" l-antiossidanti="" kontra="" l-ħsara="" ossidattiva="" indotta="" mir-radjazzjoni="" li="" twassal="" għal="" perċentwal="" ogħla.="" ta’="" ċelloli="" vijabbli="" meta="" mqabbla="" mal-kontroll="" (ċelloli="" irradjati="" mhux="" ittrattati).="" huwa="" deskritt="" fil-letteratura="" li="" r-radjazzjoni="" uv="" twassal="" għall-ġenerazzjoni="" ta="" 'ros,="" produzzjoni="" żejda="" ta'="" ossidu="" nitriku,="" u="" tnaqqis="" ta="" 'difiżi="" antiossidanti="" fil-keratinoċiti="" [30].="" għal="" dawn="" ir-raġunijiet,="" polifenoli="" b'kapaċità="" antiossidanti="" ġew="" studjati="" bħala="" aġenti="" fotoprotettivi.="" għalkemm="" ħafna="" studji="" ffukaw="" fuq="" il-kapaċità="" fotoprotettiva="" tal-polifenoli,="" ma="" studjawx="" il-potenzjal="" fototossiku="" tagħhom.="" studji="" preċedenti="" kkonfermaw="" l-abbiltà="" tal-aċidi="" caffeic,="" ferulic,="" u="" p-cumaric="" li="" jneħħu="" ros="" u="" speċi="" tan-nitroġenu="" reattiv="" (rns).="" barra="" minn="" hekk,="" il-protezzjoni="" kontra="" l-effetti="" ħżiena="" tar-radjazzjoni="" uv="" ġiet="" stabbilita="" wkoll="" in="" vivo="" jew="" ċelluli="" tal-ġilda="" għal="" dawn="" it-tliet="" komposti="" fenoliċi="" [31-34].="" din="" id-dejta="" tista’="" tispjega="" ż-żieda="" fil-perċentwal="" ta’="" ċelloli="" vijabbli="" meta="" jkunu="" esposti="" għall-irradjazzjoni="" fil-preżenza="" tal-komposti="" taħt="" studju.="" rutin,="" bħall-aċidi="" caffeic,="" ferulic,="" u="" p-cumaric="" ittestjat="" negattiv="" fl-assaġġ="" tal-ġenerazzjoni="" ros="" u="" ma="" kkaġunax="" fototossiċità="" fil-linja="" taċ-ċelluli="" hacat.="" hemm="" xi="" informazzjoni="" kontradittorja="" fil-letteratura="" dwar="" il-potenzjal="" fototossiku="" tar-rutin,="" għalhekk="" l-interess="" tar-riżultati="" miksuba.="" l-evalwazzjoni="" tal-potenzjal="" fototossiku="" bl-użu="" ta="" 'sistema="" ta'="" ċelluli="" keratinoċiti="" (hacat),="" uriet="" li="" r-rutina="" wriet="" fototossiċità="" [35].="" għall-kuntrarju,="" bl-użu="" ta’="" setup="" sperimentali="" li="" juża="" elettroforeżi="" kapillari="" b’detezzjoni="" elettrokimika="" u="" uv="" biex="" tiġi="" ttestjata="" l-fototossiċità="" ta’="" estratti="" u="" komponenti="" tal-pjanti="" f’termini="" ta’="" konsum="" ta’="" ossiġnu="" u="" ġenerazzjoni="" ta’="" speċi="" ta’="" ossiġnu="" reattivi="" fuq="" irradjazzjoni="" b’dawl="" viżibbli,="" kien="" possibbli="" li="" jiġi="" konkluż="" li="" r-rutina="" kienet="" mhux="" fototossiku="" [36],="" li="" kien="" taqbel="" mar-riżultati="" miksuba="" f'dan="" ix-xogħol="" fejn="" ir-rutina="" ma="" wrietx="" fotoreattività="" peress="" li="" ma="" ġġenerat="" la="" so="" jew="" sa="" fl-assaġġ="" tal-ġenerazzjoni="" ros.="" min-naħa="" l-oħra,="" f'dan="" ix-xogħol,="" intwera="" wkoll="" li="" r-rutina="" waħedha="" ma="" tippreżenta="" l-ebda="" potenzjal="" fototossiku="" fil-linja="" taċ-ċelluli="" hacat.="" dawn="" is-sejbiet="" kontradittorji="" jenfasizzaw="" l-importanza="" li="" jintużaw="" kundizzjonijiet="" ta="" 'ttestjar="" standardizzati="" u="" wkoll="" l-użu="" ta'="" sors="" tad-dawl="" xieraq="" sabiex="" jiġu="" evitati="" riżultati="" qarrieqa.="" interessanti,="" u="" minkejja="" x-xebh="" strutturali="" bejn="" dopac="" u="" l-pps="" l-oħra="" studjati,="" dopac="" ġġenera="" so="" fl-assaġġ="" tal-ġenerazzjoni="" ros,="" u="" ġie="" kklassifikat="" bħala="" fotoreattiv.="" madankollu,="" meta="" ttestjat="" fil-linja="" taċ-ċelluli="" hacat,="" dopac="" wera="" li="" ma="" kienx="" fototossiku.="" mir-riżultati="" miksuba,="" dopac="" jidher="" li="" huwa="" fotoreattiv="" iżda="" mhux="" fototossiku,="" għalhekk="" mhux="" mistenni="" li="" jseħħu="" reazzjonijiet="" fototossiċi="" wara="" l-applikazzjoni="" topika="" ta="" 'dan="">

3. Materjali u Metodi

3.1. Reaġenti

3,4-Aċidu Dihydroxyphenylacetic (DOPAC), aċidu kaffejku, aċidu trans-feruliku, aċidu p-kumariku, rutin, chlorpromazine hydrochloride, disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, sodium phosphate monobasic monohydrate, Aħmar newtrali (NR), u dimethyl sulfoxide (DMSO) inxtraw minn Sigma–Aldrich (Madrid, Spanja). Quinine hydrochloride, benzocaine, diclofenac, u erythromycin inxtraw minn Acofarma (Madrid, Spanja). Il-linja taċ-ċelluli tal-keratinoċiti umani immortalizzati (HaCaT) inkisbet minn Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, il-Ġermanja). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) b'4.5 g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES, u DMEM b'4.5 g/L D-glucose, L glutamine, 25 mM HEPES mingħajr l-ebda fenol aħmar, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), Fetal Bovine Serum (FBS), u trypsin EDTA nxtraw minn Gibco Life Technologies (Waltham, MA, USA). L-etanol ġie fornut minn Aga (Lisbona, il-Portugall). N, N-Dimethyl-4-nitroguanidine (RNO), imidazole, u Nitro Blue Tetrazolium (NBT) inxtraw minn Alfa Aesar (Kandel, il-Ġermanja).

3.2. Assorbiment Spettrali 

L-ispettru ta’ assorbiment ta’ kull kompost studjat ġie ddeterminat fil-medda ta’ 290 sa 700 nm, skont il-Linja Gwida tat-Test OECD 101, bl-użu ta’ spettrofotometru Jasco V650 UV/VIS [37]. Is-sustanzi ġew maħlula f'DMSO sabiex tinkiseb konċentrazzjoni finali ta' 10 µg/mL u l-ispettri ta' assorbiment ġew imkejla bl-użu ta' cuvettes tal-kwarz trasparenti UV (tul tal-passaġġ=10 mm). Kull spettru ġie kkoreġut għall-assorbiment tal-linja bażi speċifika għas-solvent. Koeffiċjenti ta 'estinzjoni molari (MEC) ġew ikkalkulati bl-użu tal-ogħla qċaċet ta' assorbiment minn 290 sa 700 nm [15].

3.3. Assaġġ ta' Speċi ta' Ossiġenu Reattiv (ROS). 

Ġie stabbilit il-protokoll tal-assaġġ ROS, u l-istudji ta 'validazzjoni twettqu skond il-proċedura deskritta fil-letteratura [19,29]. Soluzzjonijiet tal-ħażniet tas-sustanzi kollha ttestjati ġew ippreparati f'konċentrazzjoni ta '10 mM f'DMSO u użati fl-istess jum, protetti mid-dawl. Fil-qosor, il-ġenerazzjoni ta 'l-ossiġnu singlet (SO) ġiet skoperta permezz ta' kejl spettrofotometriku ta 'ibbliċjar ta' p-nitrosodimethylaniline (RNO) f'440 nm bl-użu ta 'imidazole bħala aċċettatur selettiv ta' ossiġnu singlet. Kampjuni, li kien fihom il-kimika ttestjata (200 µM), RNO (50 µM), u imidazole (50 µM) f'20 mM sodium phosphate buffer (PB, pH 7.4), tpoġġew f'tubu u mħallta ma 'vortex mixer u sonicated, protett mid-dawl, għal 10 min. It-taħlita ġiet trasferita f'ċellula ta 'prestazzjoni għolja tal-ħġieġ tal-kwarz Hellma u ċċekkjata għal preċipitazzjoni taħt mikroskopju qabel espożizzjoni għad-dawl. Imbagħad, il-kampjuni ġew irradjati bl-użu ta 'simulatur solari termostatiku Fitoclima S600PL (Aralab, Portugall), mgħammar bi tmien lampi UV-Vis Repti Glo (20 W), għal 90 min f'25 ◦C. Wara l-irradjazzjoni, l-assorbanza reġgħet inqrat f'440 nm. Ġenerazzjoni ta 'anjoni superossidu (SA) ġiet skoperta billi ġie osservat it-tnaqqis ta' nitroblue tetrazolium (NBT) għal monoformazan (NBT plus ), li l-formazzjoni tiegħu tista 'tiġi mmonitorjata spettrofotometrikament f'560 nm. Kampjuni li fihom il-komposti ttestjati (200 µM) u NBT (50 µM) f'20 mM NaPB ġew irradjati, u t-tnaqqis fl-NBT kien imkejjel biż-żieda fl-assorbenza f'560 nm bl-istess mod bħal għad-determinazzjoni ta 'SO. L-esperimenti saru fi tliet kopji. Peress li s-simulatur solari użat kien differenti mill-mudelli rakkomandati, kien meħtieġ li jiġu vvalidati l-kundizzjonijiet tal-irradjazzjoni. Twettaq analiżi ROS biex jiġi żgurat li l-kundizzjonijiet ta 'irradjazzjoni jissodisfaw il-kriterji rakkomandati bl-użu ta' kontrolli pożittivi (quinine) u negattivi (sulisobenzone) u komposti kimiċi ta 'referenza [29]. Skont ir-riżultat (medja ta 'determinazzjonijiet triplikati) mill-assaġġ ROS, il-komposti polifenoliċi ttestjati ġew ikklassifikati bħala sustanzi fotoreattivi meta tkejjel valur SO 25 jew aktar u/jew valur SA ta' 20 jew aktar; min-naħa tagħha, ġiet iddeterminata bħala sustanza mhux fotoreattiva meta ġew irreġistrati valuri ta' inqas minn 25 għal SO u inqas minn 20 għal SA [29].

3.4. Kultura taċ-Ċelloli 

Iċ-ċelloli HaCaT inżammu f'37 ◦C f'atmosfera umidifikata ta '95 fil-mija arja u 5 fil-mija CO2 fl-inkubatur f'DMEM b'10 fil-mija FBS u 1 fil-mija antibijotiċi. Bl-użu ta 'mikroskopju maqlub, ġiet osservata konfluwenza taċ-ċelluli u jekk iċ-ċelloli laħqu 70–80 fil-mija ta' konfluwenza, saret subkultura biex tiġi evitata l-mewt taċ-ċelluli. Għal dan il-għan, il-mezz tal-kultura ġie aspirat, u ċ-ċelloli ġew maħsula b'DPBS, ġew miżjuda 2 mL ta 'trypsin 0.25 fil-mija u inkubati għal 7 sa 8 min f'37 ◦C f'atmosfera ta' 5 fil-mija CO2. Wara li ċ-ċelloli jinqalgħu, ġie miżjud medju frisk biex jimblokka l-azzjoni tat-tripsina. Għall-għadd taċ-ċelluli, tpoġġiet 10 µL ta' sospensjoni taċ-ċelluli f'kamra Neubauer fejn ġew magħduda ċ-ċelloli. Is-sospensjoni taċ-ċelluli miksuba mbagħad ġiet suddiviża fi fliexken ġodda b'medju ta' kultura taċ-ċelluli frisk. Għall-iffriżar taċ-ċelluli, DMSO (5 fil-mija v/v) intuża bħala krijopreservattiv biex jipprevjeni l-formazzjoni ta 'kristalli matul il-fażi tal-ħażna. Sabiex jiġi ddeterminat iż-żmien meħtieġ għaċ-ċelloli biex jidduplikaw, 1 × 106 ċelluli ġew miżrugħa f'ħames fliexken ta '75 cm2 u inkubati għal 24 siegħa f'37 ◦C f'atmosfera ta' 5 fil-mija CO2 biex tintlaħaq aderenza sħiħa. Imbagħad, iċ-ċelloli ta 'kull flask ġew magħduda f'ħinijiet differenti. Ir-riżultati kienu mpinġija fi grafika li tirrappreżenta n-numru taċ-ċelluli kontra l-ħin, li minnu l-ħin ta 'l-irduppjar ġie kkalkulat bl-użu ta' analiżi ta 'rigressjoni lineari. Il-ħin ta' l-irduppjar ikkalkulat miksub kien 20.43 h, li huwa konsistenti mal-valuri rrappurtati fil-letteratura, u b'hekk jikkonferma li ċ-ċelloli użati kienu f'kundizzjonijiet ta 'tkabbir normali [38]. 3.5. Assaġġ tal-fototossiċità Għall-istudju tal-fototossiċità, ġie segwit protokoll preċedenti implimentat fil-laboratorju tagħna [24]. L-għoli tal-lampa Osram UVA/UVB (240V E27) ġie aġġustat sabiex irradja ċ-ċelloli b'doża ta' irradjazzjoni UVA ta' 1.7 mW/cm2 (radjometru Cosmedico, UVM-7), skont il-linja gwida tal-OECD [23] . Matul l-irradjazzjoni (10 min), il-pjanċi nżammu ġewwa reċipjent ta 'styrofoam li kien fih sistema ta' tkessiħ bl-ilma, u t-temperatura ġiet immonitorjata matul il-proċedura kollha. Fil-qosor, biex twettaq l-assaġġ ta 'assorbiment NR, ċelluli HaCaT ġew miżrugħa (2 × 104 ċelluli/bir) u inkubati f'37 ◦C f'atmosfera ta' 5 fil-mija CO2 għal 24 siegħa. Wara, il-medju tneħħa, ġew miżjuda konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanzi tat-test, u ċ-ċelloli ġew inkubati taħt l-istess kundizzjonijiet għal siegħa. Pjanċa waħda nżammet fid-dlam filwaqt li l-pjanċa l-oħra ġiet irradjata għal 10 min bit-temperatura miżmuma f'29-32 ◦C. Wara, il-medju taċ-ċelloli ġie sostitwit b'DMEM frisk mingħajr aħmar fenol u inkubat għal 18-22 siegħa. Wara dan il-perjodu ta 'inkubazzjoni, ċelluli miż-żewġ pjanċi ġew maħsula b'DPBS u DMEM komplut li kien fih 50 µg/mL NR ġie miżjud ma' kull bir u inkubati għal 3 sigħat. Wara l-inkubazzjoni ma 'NR, is-soluzzjoni NR tneħħiet, u soluzzjoni NR desorb (50 fil-mija etanol: 1 fil-mija aċidu aċetiku: 49 fil-mija ilma distillat) ġiet miżjuda biex jiġi estratt iż-żebgħa NR miċ-ċelloli. Għall-proċedura tal-qari, l-assorbanza kienet imkejla f'540 nm. F'kull pjanċa, ġew ittestjati kontrolli DMSO. Id-dejta dwar il-vijabbiltà taċ-ċelluli miksuba minn kull pjanċa ġiet espressa bħala l-proporzjon ta 'assorbiment ta' ċelloli ttrattati għal ċelloli ta 'kontroll tas-solvent u ntużat aktar biex jiġu stmati l-valuri IC50 bl-użu ta' analiżi ta 'rigressjoni lineari. Il-valur tal-Fattur tal-Irritazzjoni Fotografika (PIF) għal kull sustanza tat-test ġie kkalkulat bħala l-proporzjon bejn il-valur IC50 taċ-ċelloli irradjati (Irr plus ) kontra l-valur IC50 taċ-ċelloli mhux irradjati (Irr-). Skont il-linja gwida tal-OECD, indiċi PIF inqas minn 2 ibassar in-nuqqas ta’ effett fototossiku, indiċi PIF bejn 2 u 5 ibassar effett fototossiku probabbli, u PIF ogħla minn 5 ibassar effett fototossiku [23]. Il-komposti ttestjati ġew evalwati f'firxa ta 'konċentrazzjonijiet: 12.5; 31.25; 62.5; 125; 250; 500, u 1000 µM. 3.6. Analiżi Statistika Id-dejta kollha hija ppreżentata bħala medja ± devjazzjoni standard (SD) minn mill-inqas tliet esperimenti indipendenti mmexxija fi tliet kopji. Biex tikkonferma n-normalità u l-omoġeneità tal-varjanza, intuża t-test ta' normalità omnibus D'Agostino-Pearson, u wara, l-Analiżi One-way tal-varjanza (ANOVA), segwita mit-test post hoc ta' Dunnett (tqabbil ma' ċelloli ta' kontroll negattiv b'solvent), twettqet. Il-grafiċi ġew iġġenerati bis-softwer GraphPadPrism għall-Windows (verżjoni 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, USA).

4. Konklużjonijiet

F'dan l-istudju, analiżi ta' Speċi ta' Ossiġenu Reattiv (ROS) u analiżi ta' fototossiċità ta' 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU-PT) intużaw biex tiġi eżaminata l-imġieba ta' antiossidanti fenoliċi naturali meta ġew esposti għal radjazzjoni li timita d-dawl tax-xemx sabiex tiġi eżaminata l-fotoreattività u l-fototossiċità tagħhom. potenzjal. Ir-riżultati miksuba ppermettew il-konklużjoni li, għalkemm l-aċidi rutin u caffeic, p cumariku u feruliku jassorbu r-radjazzjoni tad-dawl UV viżibbli u jippreżentaw MEC ogħla minn 1000 L mol-1cm-1, huma kklassifikati bħala mhux fotoreattivi. Barra minn hekk, dawn il-komposti ma indoxxewx fototossiċità meta ttestjati bl-użu tal-linja taċ-ċelluli HaCaT. Id-dejta misjuba tissuġġerixxi lidawn l-antiossidantiwaħedhom mhumiex mistennija li jikkawżaw fototossiċità u għalhekk jistgħu jitqiesu sikuri għall-użu f'formulazzjonijiet kożmetiċi. Min-naħa l-oħra, kien possibbli li tiġi osservata żieda fil-vijabbiltà taċ-ċellula esposta għar-radjazzjoni meta fil-preżenza ta 'dawn l-antiossidanti tiżvela effett fotoprotettiv possibbli li jista' jkun interessanti li jiġi studjat biex isostni l-użu tagħhom bħala aġenti fotoprotettivi possibbli f'formulazzjonijiet kożmetiċi. Fil-każ ta' DOPAC, dan il-kompost wera li kien fotoreattiv, għalkemm ma ġiet osservata l-ebda fototossiċità fl-assaġġ ta' 3T3 Neutral Red Uptake. Madankollu, għandhom isiru aktar studji biex jifhmu l-mekkaniżmi wara l-fotoreattività DOPAC, biex tiġi żgurata s-sikurezza tar-ritratti tagħha, u wkoll biex tifhem ir-rwol u r-relazzjoni bejn l-istruttura kimika u l-potenzjal ta 'kompost li jkun fotoreattiv. Kontribuzzjonijiet tal-Awtur: Analiżi Formali, BA; Kitba—Tħejjija ta' Abbozz Oriġinali, BA; Kunċettwalizzazzjoni IFA, HC, u JG: Riżorsi, IFA, HC, JMSL, u JG; Kitba—Reviżjoni u Editjar, IFA, HC, JMSL, u JG; Superviżjoni, IFA, HC, u JG; Akkwist ta' Finanzjament, IFA, HC, JMSL, u JG L-awturi kollha qraw u qablu mal-verżjoni ppubblikata tal-manuskritt.Finanzi: Din ir-riċerka ma rċeviet l-ebda finanzjament estern.Dikjarazzjoni tal-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali: Mhux applikabbli.Dikjarazzjoni ta' Kunsens Informat: Mhux applikabbli.Data Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà: Id-dejta kollha ppreżentata f'dan l-istudju tinsab fl-artiklu.Rikonoxximenti: Dan ix-xogħol huwa ffinanzjat minn fondi nazzjonali minn FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, fl-ambitu tal-proġett UIDP/04378/2020, UIDB /04378/2020 tar-ResearchUnit on Applied Molecular Biosciences-UCIBIO u l-proġett LA/P/0140/2020 tal-AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB u UIDB/00081/2020 għotja ffinanzjata minn FCT/MCTES (PIDDAC). Kunflitti ta' Interess: L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess.Disponibbiltà tal-Kampjun: Mhux applikabbli.

Referenzi

1. Zillich, OV; Schweigert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polifenoli bħala ingredjenti attivi għal prodotti kożmetiċi. Int. J. Kosmet. Sci. 2015, 37, 455–464. [CrossRef]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Natasa, S.; Artur, B.; Giuseppe, G. Effetti benefiċi tal-polifenoli fuq mard kroniku u tixjiħ. Fil-Polifenoli: Proprjetajiet, Irkupru, u Applikazzjonijiet; Galanakis, CM, Ed.; Pubblikazzjoni Woodhead: Kidlington, UK, 2018; pp. 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. Ir-rwol tal-polifenoli fis-sistemi tas-saħħa tal-bniedem u tal-ikel: Mini-reviżjoni. Quddiem. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA L-effetti tal-polifenoli u bijoattivi oħra fuq is-saħħa tal-bniedem. Ikel Funct. 2019, 10, 514–528. [CrossRef]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polyphenols: Mit-teorija għall-prattika. Ikel 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MY; Nikolenko, VN; Bulygin, KV; Mikhaleva, LM; et al. Mutazzjonijiet mitokondrijali u mitoepigenetics: Iffoka fuq ir-regolamentazzjoni ta 'risponsi indotti mill-istress ossidattiv fil-kanċer tas-sider. Semin. Kanċer Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Targeting stress ossidattiv fil-mard: Wegħda u limitazzjonijiet ta 'terapija antiossidanti. Nat. Dun Drug Discov. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Jistgħu komposti fenoliċi tal-pjanti jipproteġu l-ġilda minn materja partikulata fl-arja? Antiossidanti 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Studju komparattiv dwar l-attività tal-protezzjoni tal-ġilda ta 'estratt b'ħafna polyphenol u estratt b'ħafna polysaccharide minn Sargassum vachellianum. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Phytoconstituents bħala formulazzjonijiet kosmetiċi ġodda fotoprotettivi. Pharmacogn. Rev 2010, 4, 1–11. [CrossRef]