F'Kombinazzjonijiet ta' Drogi Sinerġiċi Skrin bbażati fuq Silico minn Mediċini Ħwawar: Każ li juża Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Modulu ta' newroprotezzjoni

In-newroprotezzjoni hija l-mekkaniżmi u l-istrateġiji użati biex jipproteġu kontra korriment newronali jew deġenerazzjoni fis-CNS wara disturbi akuti (eż. puplesija jew korriment/trawma fis-sistema nervuża) jew bħala riżultat ta' mard newrodeġenerattiv kroniku (eż. Parkinson's, Alzheimer's, Sklerożi Multipla). L-għan tan-newroprotezzjoni huwa li tillimita disfunzjoni/mewt newronali wara korriment tas-CNS u tipprova żżomm l-ogħla

integrità possibbli tal-interazzjonijiet ċellulari fil-moħħ li tirriżulta f'funzjoni newrali mhux disturbata. Kif jidher minn Fig. 4, xi miri fuq il-mogħdija tas-sinapsi serotonerġika huma involuti fil-funzjoni tan-newroprotezzjoni. Pereżempju, il-produzzjoni ta' prostaglandini permezz ta' PTGS1 u PTGS2 (magħrufa wkoll bħala COX-1 u COX-2) hija medjatur essenzjali fl-evokazzjoni ta' mekkaniżmi anti-infjammatorji u ġodda favur ir-riżoluzzjoni56. Studju reċenti wera li l-espressjoni tal-ġeni ta' ADCY5, enzima li tikkatalizza l-ġenerazzjoni ta' cAMP57, titnaqqas permezz tal-metilazzjoni tal-promotur f'linji taċ-ċelluli HCC umani indotti minn COX-2-58. Ibbażat fuq l-analiżi ta 'hawn fuq, nispekulaw li l-akkumulazzjoni ta' COX-2 tista 'tinfluwenza s-sekrezzjoni ta' sAPP , il-qsim ta 'APP maqsum minn -secretase li huwa modulat minn cAMP u jkompli jeżerċita l-effett newroprotettiv59,60. Ir-riżultati tagħna juru li n-newroprotezzjoni għandha rwol importanti fit-trattament tan-newroinfjammazzjoni.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-PREVENTJONI TAL-FUNZJONI TAL-MARDA TA' PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Validazzjoni Sperimentali

Il-Vijabilità taċ-Ċelloli tal-Mikroglia BV2 Ittrattati Mill-Komposti

Iċ-ċelloli tal-mikroglia BV2 (8 × 104 ċelluli/ ml) huma mitmugħa b'konċentrazzjonijiet ta' 37.5 sa 300 μM għal kull millilitru tal-midja tal-kultura mingħajr serum tal-erba' komposti għal 24 siegħa. Aħna nqisu l-vijabbiltà taċ-ċelluli tal-grupp ta 'kontroll ikkultivat fin-nuqqas ta' serum b'inqas minn 0.1% DMSO bħala 100% (Fig. 5 (a-d)). L-ebda ċitotossiċità ċellulari sinifikanti ma hija osservata fid-dożaġġi preskritti tal-gruppi.

Validazzjoni tas-sinerġija tad-droga u l-effett potenzjali kontra l-infjammazzjoni in vitro

Biex jiġu vvalutati aktar ir-riżultati miksuba in silico, erba 'komposti li jkopru tliet pari sinerġistiċi, jiġifieri isoacteoside, 2'-acetylatteoside, echinacoside, u verbascoside, huma magħżula biex jeżaminaw l-effetti sinerġistiċi tad-droga tagħhom u l-effett anti-infjammatorju potenzjali bl-użu ta' ċelluli BV2 trattati b'LPS. B'mod partikolari, aħna nwettqu analiżi tal-western blot għall-espressjoni tal-proteini iNOS u COX-2 biex nikkonfermaw is-sinerġija u l-effetti anti-infjammatorji tal-kombinazzjonijiet ta 'mediċini mbassra.

Kif muri f'Fig. 5(e–g), il-livelli ta' proteini iNOS u COX-2 fil-pannell tal-linji taċ-ċelluli BV2 ittestjati huma rrappurtati. Aħna nosservaw li jew fil-kura isoacteoside jew 2′-acetylatteoside, l-espressjonijiet tal-proteini ta 'iNOS u COX-2 fiċ-ċelloli BV2 it-tnejn naqsu b'mod sinifikanti f'livelli ta' doża differenti. Madankollu, it-trattament bil-kombinazzjoni ta 'isoacteoside u 2'-acetylatteoside jinduċi żieda sinifikanti fil-fatturi infjammatorji iNOS u COX -2 (Fig. 5(e)). Figura 5(f) turi dantrattament echinacoside jew verbascoside, bħala aġent wieħed, jikkawża tnaqqis fl-espressjoni ta' iNOS u COX-2. Barra minn hekk, kif mistenni, it-trattament b'echinacoside flimkien ma' verbascoside f'konċentrazzjoni ta' 150 μM irriżulta fi tnaqqis aktar evidenti fil-

livelli ta' espressjoni ta' proteini (iNOS u COX-2), li jindikaw l-effetti sinerġistiċi anti-infjammatorji ta' din il-kombinazzjoni ta' mediċini. Bl-istess mod, kif indikat fil-Fig. 5(g), il-kombinazzjoni ta 'echinacoside u 2'-acetylatteoside turi effett sinerġistiku sinifikanti fuq l-inibizzjoni ta' COX -2 fil-konċentrazzjoni ta '75 μM jew 300 μM. Madankollu, għal iNOS, fid-dożaġġ ta '300 μM, il-kombinazzjoni tirrappreżenta soppressjoni mmarkata tal-proteina. B'kuntrast, insibu li m'hemm l-ebda effetti ovvji ta' inibizzjoni kemm fuq iNOS kif ukoll fuq COX-2 dwar il-kombinazzjoni ta 'isoacteoside u 2′-acetylatteoside jew echinacoside u verbascoside fil-konċentrazzjoni ta' 75μM (Figura 2 Supplimentari), barra minn hekk, trattament ma 'pari oħra juri effett ħafna aktar dgħajjef meta mqabbel ma' l-aġenti singoli fid-dożaġġ ta '150 jew 300μM li jista' jidher fil-Fig. 5 (e-g).

Fil-qosor, l-istudju in vitro jipprovdi informazzjoni addizzjonali għall-iskrinjar ta’ kombinazzjonijiet ta’ mediċini b’effetti potenzjalment anti-infjammatorji u juri l-affidabbiltà tal-istrateġija tal-iskrin in silico.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TRATTAMENT TA' NEWROINFLAMMATION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussjoni

In-newroinfjammazzjoni hija implikata fil-maġġoranza tal-mard newroloġiku, psikjatriku u ta' żvilupp newroloġiku li mhux biss hija konsegwenza iżda tista' tkun kawża tal-patoloġija. Madankollu, it-trattamenti attwali għan-newroinfjammatorji huma l-aktar monoterapiji, limitati minn effetti sekondarji magħrufa kif nafu, inibituri COX-2 jistgħu jwasslu għal difetti kardjovaskulari bi tweġiba għal trattament fit-tul, u trattament immirat għat-TNF jista’ jikkawża infezzjoni permezz immunosoppressjoni. Approċċi terapewtiċi kombinatorji jistgħu jkunu imperattivi biex itejbu t-trattament ta 'mard kumpless bil-vantaġġi li ġejjin: ir-robustezza tan-netwerk ikkonfrontata u l-kumpens tal-bypass, iż-żieda fl-effikaċja klinika filwaqt li tinżamm tossiċità minima umana, u d-dożaġġ imnaqqas ta' kull kompost63. Madankollu, l-esplorazzjoni tal-kombinazzjonijiet sinerġistiċi tal-mediċini fost il-komposti derivati ​​minn mediċini tal-ħxejjex ibbażati fuq il-farmakoloġija tas-sistema hija ristretta mir-raġuni ewlenija possibbli għal ammonti kbar ta 'komposti.

Fix-xogħol, l-ewwel niksbu 63 kompost bijoattiv potenzjali mill-ħxejjex aromatiċi Cistanche tubulosa, li tissodisfa l-kriterji (DL Akbar minn jew ugwali għal 0.18) għal aktar analiżi bl-għajnuna tal-previżjoni li hija indispensabbli biex tgħarbel aktar molekuli promettenti bi proprjetajiet mixtieqa. Wara l-immappjar tal-mira 133 tat-63 kompost bijoattiv potenzjali għad-database, ikollna 43 mira relatati man-newroinfjammazzjoni, u mbagħad l-analiżi ta 'raggruppament tal-GOBP tal-miri mbassra probabbilment tista' tikkontribwixxi għat-trattament tan-newroinfjammazzjoni. Ir-riżultat analitiku tan-netwerk CT wera grad medju għal kull kompost ta '11.209 u 7.651 għal kull mira, rispettivament, u 38 minnhom aġġustaw aktar minn 7 miri (akbar mill-grad medju). Pereżempju, echinacoside (mol41) imbassar b'7 miri, verbascoside (mol33), b'9 miri, jew tableside B (mol57), bi 8 miri jista' jkollu rwoli ewlenin fin-newroprotezzjoni f'konformità mal-letteratura li qed tiżdied.

Nilħqu miri terapewtiċi diretti bħal APP, MAPT (magħrufa wkoll bħala Tau), PPARG70, MMP9, MMP2, u HTR2A (magħrufa wkoll bħala 5-HT2A), GRIN2B (subunità tat-tip NMDA tar-riċettur ionotropiku tal-glutamate 2B), u GRIA1 (glutamate ionotropic receptor AMPA tip subunità 1) jew miri potenzjali downstream bħal PTGS274 jew NOS275 li huma assoċjati ma 'newroinfjammazzjoni jew mard varji tas-sistema nervuża.

L-analiżi tan-netwerk tal-Compound-Target-Pathway turi 12-il kompost mill-aqwa 10 par ta’ drogi permezz tal-algoritmu PEA, konnessi mat-43 mira potenzjali u l-mogħdijiet marbuta man-newroinfjammazzjoni, pereżempju, passaġġ ta’ sinjalazzjoni tal-kalċju, interazzjoni newroattiva ligand-riċettur jew Mogħdija ta 'sinjalazzjoni TNF u l-bqija. Fis-sistema, dawn il-komposti mbassra jistgħu jaġixxu mhux biss fuq il-proteini tal-mogħdijiet upstream iżda wkoll downstream assoċjati ma 'newroinflammation u bijomarkaturi infjammatorji, b'mod partikolari. Barra minn hekk, tiġi pprovduta informazzjoni addizzjonali għall-iskrinjar ta' kombinazzjonijiet ta' mediċini b'effetti potenzjalment anti-infjammatorji u l-affidabbiltà tal-istrateġija tal-iskrin in silico tiġi vverifikata permezz ta' validazzjoni sperimentali. Il-mogħdija tan-newroinfjammazzjoni hija magħmula mill-mogħdija tal-marda ta 'Alzheimer, il-mogħdija ta' sinjalazzjoni tal-Kalċju, mogħdija ta 'sinjalazzjoni GnRH, mogħdija ta' sinjalazzjoni VEGF, u s-sinapsi serotonerġika. Ir-riżultati analitiċi spjegawlna b'mod distint li l-mewt taċ-ċelluli, l-infjammazzjoni, u l-moduli ta 'newroprotezzjoni huma eżemplati biex jiddeċifraw il-mekkaniżmu ta'Cistanche tubulosa għat-trattament ta 'newroinfjammazzjoni.

In-newroinfjammazzjoni takkumpanja diversi mard newrodeġenerattiv li jista 'jkun mhux biss konsegwenza iżda trigger ta' patoloġija, għalhekk, terapiji anti-infjammatorji huma ssuġġeriti li jkunu approċċ ta 'trattament promettenti. Għad-diżappunt tagħna, għalkemm irrealizzajna l-limitazzjonijiet tal-monoterapiji, l-evalwazzjoni u l-mekkaniżmi sottostanti tat-terapiji kombinati għadhom l-isfidi ewlenin fl-iżvilupp tal-istrateġija alternattiva ġdida. Dan ix-xogħol għalhekk jista 'joffri opportunitajiet terapewtiċi ġodda għan-newroinfjammazzjoni u jista' jiftaħ triq ġdida għall-iskoperta ta 'kombinazzjonijiet ta' mediċini minn prodotti naturali.

Materjali u metodi

Ġbir ta' Komposti

Total ta' 66 ingredjent kimiku ta' Cistanche tubulosa jinġabru manwalment minn TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, inklużi 26 phenylethanoid glycosides, 22 iridoids, 4 lignans, 7 monoterpene glycosides, 2 sustanzi nitroġenużi, 3 benzene acryloyl zokkrijiet, 1 sterol, 1 ketol. Peress liglikosidi f'Cistanche tubulosahuma ġeneralment idrolizzati biex jilliberaw l-aglycone li mbagħad jiġi assorbit fil-mukoża intestinali, għalhekk, nieħdu l-molekuli mingħajr glycolic u in konsiderazzjoni, li huma mmarkati bħala _qt. Dan wassal għall-ġenerazzjoni tal-103 komposti. Dawn il-molekuli huma pprovduti fit-Tabella Supplimentari S1.

Evalwazzjoni ta' Tixbiha tad-Droga

Biex tikseb il-komposti bijoattivi potenzjali minn Cistanche tubulosa, aħna nevalwaw ix-xebh tad-droga ta 'dawn l-ingredjenti billi nikkalkulaw ix-xebh ta' Tanimoto bejn il-komposti tal-ħxejjex u l-proprjetajiet molekulari medji tas-sustanzi kimiċi kollha fid-database Drugbank. U, il-mudell ta 'tbassir DL ġie applikat b'suċċess f'ħafna studji, biex jintgħażlu komposti bijoattivi. Fix-xogħol, l-indiċi DL Akbar minn jew ugwali għal 0.18 tal-kandidati huwa definit bħala l-valur tal-limitu biex ikun adattat aħjar għall-analiżi sussegwenti.

Tbassir tal-Mira tad-Droga

L-identifikazzjoni tal-miri ta' effikaċja għal komposti ewlenin tibqa' pass ewlieni għall-progress tal-komposti fl-iżvilupp tad-droga. Hawnhekk, żewġ għodod interni: SysDT u WES jitwettqu biex tiġi derivata l-informazzjoni tal-mira molekulari għas-sajd tad-droga. SysDT huwa mudell in-solo li jitwettaq bil-kombinazzjoni ta 'informazzjoni kimika, ġenomika u farmakoloġika bbażata fuq żewġ għodod matematiċi qawwija: Random Forest (RF) u Support Vector Machine (SVM) biex tittratta l-kwistjoni tal-identifikazzjoni tal-mira b'mod effettiv. Il-mudell miksub serva bħala pjattaforma siewja għat-tbassir ta 'interazzjonijiet ta' mediċina-mira bi preċiżjoni ġenerali ta '97.3%, preċiżjoni ta' tbassir attivata ta '87.7%, u preċiżjoni ta' tbassir inibita ta '99.8%. Biex jinqabdu komponenti aktar promettenti, il-kriterji tal-filtrazzjoni huma definiti bħala valur RF akbar minn jew ugwali għal 0.7 jew SVM akbar minn jew ugwali għal 0.8 f'dan l-istudju.

Is-similarità tal-ensemble peżat (WES) huwa mudell komputazzjonali qawwi ġdid biex jidentifika l-miri diretti tal-mediċina tal-ingredjenti bijoattivi attwali. Bħala għodda ġdida, il-mudell miksub jaħdem tajjeb fit-tbassir tal-irbit b'sensittività medja ta '85% (SEN) u l-mudelli mhux vinkolanti b'71% (SPE) bl-erji medji taħt il-kurvi operattivi tar-riċevitur (ROC, AUC) ta’ 85.2% u konkordanza medja ta’ 77.5%. Il-miri miksuba huma mmappjati aktar ma' Uniprot biex sussegwentement jiġu normalizzati l-ismijiet u l-organiżmi tagħhom. Hawnhekk, aħna nagħżlu biss il-miri tal-Homo sapiens għal aktar analiżi. Il-miri kandidati tal-komposti magħżula huma mmappjati mad-database tas-CTD biex jiksbu l-mard relatat tagħhom u fl-aħħar aħna ngħarblu miri potenzjali relatati man-newroinfjammazzjoni.

GO Arrikkiment U Analiżi Għall-Miri

Biex tinvestiga l-proċessi bijoloġiċi involuti tal-miri miksuba, aħna nimmappjaw il-miri għal DAVID u t-termini b'valur P inqas minn 0.05 huma magħżula f'din it-taqsima.

Analiżi tal-Kombinazzjoni tad-Droga

Fix-xogħol preċedenti tagħna, qafas ta 'farmakoloġija tas-sistema ġie sfruttat biex ibassar kombinazzjonijiet ta' mediċini fuq mudell iddisinjat ġdid, imsejjaħ il-Probabbiltà Ensemble Approach (PEA) biex tanalizza l-effikaċja klinika u l-effetti avversi ta 'kombinazzjonijiet ta' mediċini. Fid-dettall, netwerk Bayesian li jintegra ma 'algoritmu ta' xebh ġie żviluppat biex jimmudella l-kombinazzjonijiet minn effetti molekulari u farmakoloġiċi komposti. Imbagħad ġiet ippreżentata l-evalwazzjoni magħquda li kopriet l-effikaċja klinika u l-effetti avversi għall-pari mbassra. Fil-qosor, juri li l-PEA jista 'jbassar l-effikaċja tal-pari b'ispeċifiċità u sensittività għolja (AUC=0.90) fix-xogħol tagħna. F'dan ix-xogħol, aħna nagħżlu l-aqwa għaxar kombinazzjonijiet ta 'mediċini bbażati fuq il-probabbiltajiet ta' sinerġija tagħhom, li jirrappreżentaw il-possibbiltà li tinduċi sinerġija bejn żewġ komposti.

Netwerk/Pathway Bini U Analiżi

Biex tinvestiga r-relazzjonijiet bejn l-ingredjenti attivi u l-mard infjammatorju, in-netwerk tal-mira kompost (CT) u n-netwerk tal-mogħdija tal-mira kompost (CTP) huma ġġenerati minn Cytoscape 2.8.1, pakkett bijoinformatiku popolari għall-viżwalizzazzjoni tan-netwerk bijoloġiku u l-integrazzjoni tad-dejta. Il-proprjetajiet kwantitattivi tan-netwerk huma analizzati miż-żewġ plugins li ġejjin Network Analyzer u CentiScaPe 1.2. Fin-netwerk grafiku, in-nodi jindikaw jew komposti, miri, jew mogħdijiet filwaqt li t-truf jikkodifikaw l-interazzjoni tad-droga-mira. Biex tesplora aktar l-effetti bijoloġiċi ta 'kif il-miri ċellulari jaħdmu permezz tal-modulazzjoni ta' mogħdijiet ta 'metaboliżmu multipli, "mogħdija" inkorporata hija mmuntata mill-informazzjoni aġġornata dwar il-patoloġija tan-newroinfjammazzjoni. L-ewwelnett, billi tuża l-immappjar tagħhom fuq id-database KEGG, il-profili fil-mira miksuba huma aggregati f'diversi mogħdijiet. Wara li tabbanduna s-sezzjonijiet indiretti, allura, mogħdija relattivament sintetizzata hija integrata manwalment minħabba d-dejta patoloġika u klinika.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-KURA TAL-MARDA TA' PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Validazzjoni Sperimentali

Preparazzjoni tal-Kampjuni

Echinacoside, verbascoside, isoacteoside u 2′-acetylatteosidejinxtraw minn Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Ċina). Kampjuni tat-test huma maħlula f'dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA) biex jiksbu 100 mM, bħala soluzzjoni stokk, u mbagħad maħżuna f'4 gradi. Id-dilwizzjonijiet finali tad-DMSO miżjuda mal-medium tal-kultura qatt ma qabżu 0.1% li żgura li ma kien hemm l-ebda effett fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli.

Kultura taċ-Ċelloli

Iċ-ċelluli tal-mikroglia tal-ġurdien BV2 huma oriġinarjament żviluppati mill-Bank taċ-ċelluli tal-Akkademja tax-Xjenzi Ċiniża ta’ Shanghai u kkultivati ​​f’kompiti ta’ 25 jew 75 cm2 b’mezz ta’ Eagle modifikat ta’ Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, USA) supplimentat b’10% serum tal-fetu bovin (FBS) (Gibco BRL, USA), peniċillina G (100 unità/mL) u streptomycin (100 mg/mL) f'inkubatur umidifikat b'5% CO2/95% O2 f'37 grad.

Assaġġ tal-Vijabilità taċ-Ċelluli

Iċ-ċelluli tal-mikroglia BV2 jinżergħu fi pjanċa ta' 96-bir b'densità ta' 1 × 105 ċelluli/ml, wara li jkunu inkubati għal 18-il siegħa, iċ-ċelloli jiġu ttrattati b'100 ul ta' medju frisk bi jew mingħajr konċentrazzjonijiet indikati varji ta' kampjuni tat-test għal 24 siegħa addizzjonali. Assaġġ CCK-8 (BestBio, Shanghai, iċ-Ċina) huwa metodu konvenjenti u affidabbli biex tiddetermina l-vijabbiltà taċ-ċelloli. Biex neliminaw l-isfond tal-kampjuni tat-test, aħna narmi l-medju tal-kultura kollu, u wara jiġi miżjud 100 ul/bir ta 'medja friska li jkun fiha 10% soluzzjoni CCK-8 imbagħad. Il-valuri OD f'450 nm jinqraw fuq microplate reader (Molecular Devices, California, USA) wara inkubazzjoni ta '3 sigħat f'37 grad u 5% CO2.

Analiżi Western Blot

Il-proteina ċellulari hija estratta minn linji taċ-ċelluli bl-użu ta' Qproteome™ Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen, il-Ġermanja) wara l-proċeduri indikati mill-protokoll tal-manifattur. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) huwa applikat għall-kwantifikazzjoni tal-proteini. Ammonti ekwivalenti ta' proteina (50ug) huma żnaturati billi jagħli f'100 grad għal 10 min b'2*laemmli buffer ta' tagħbija tal-kampjun (Bio-Rad, USA) flimkien ma' 5% -mercaptoethanol fi proporzjon ta' 1:1 u mgħobbija għal kull korsija fuq 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide minigels), elettrotransferred fuq 0.45 μm polyvinylidene fuoride membranes (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) għal 150 min f'200 mA. Sussegwentement, il-membrani huma mblukkati fi 3% albumina tas-serum bovin (BSA) f'temperatura tal-kamra u inkubati bl-antikorpi primarji iNOS u COX-2 (Abcam) f'4 gradi matul il-lejl. Wara tliet ħasliet bir-reqqa f'Tris-buffered Saline-Tween (TBST) kull wieħed għal 5 minuti, il-membrani jiġu sondati b'antikorpi sekondarji konjugati ma 'horseradish peroxidase (HRP) (dilwizzjonijiet 1:10000; Abcam) għal 1.5 sigħat f'temperatura tal-kamra. Il-meded immunoreattivi mbagħad jiġu viżwalizzati bl-użu ta 'kit ta' skoperta ta 'kimiluminixxenza ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) wara ħasil darbtejn f'TBST u darba f'TBS, kull darba għal 5 min. Il-valuri densitometriċi huma normalizzati bl-użu ta' -actin bħala kontroll intern tat-tagħbija.

Analiżi Statistika

Id-dejta hija ppreżentata bħala mezz ± żball standard, u l-analiżi Western blot hija ripetuta fi tliet esperimenti indipendenti bl-istess riżultat. Analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda tintuża biex tqabbel id-differenzi tal-mezzi għal tliet gruppi jew aktar, is-sinifikat statistiku jiġi analizzat bit-test t tal-Istudent bejn żewġ gruppi.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TRATTAMENT TAL-MARDA TA' PARKINSON U TAL-MARDA TA' ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%