Attività Immunostimulatorja Ta' Polisakkaridi Estratti bl-Ilma Minn Cistanche Deserticola Bħala Aġġuvant tal-Pjanti in Vitro U in Vivo

Introduzzjoni

Il-vaċċini huma importanti għall-kontroll jew il-prevenzjoni tal-mard. Vaċċini ġġenerati ġodda u li qed jiżviluppaw bħalissa huma antiġeni rikombinanti purifikati ħafna b'sigurtà ogħla, iżda antiġeni purifikati ma jistgħux jistimulaw rispons immuni sodisfaċenti meta mqabbla ma 'preparazzjonijiet patoġeniċi attenwati jew inattivati. Bl-għajnuna ta’ adjuvanti, il-vaċċini jistgħu jinduċu reazzjonijiet immuni persistenti [1,2]. Adjuvants qawwija ġodda huma kkonċernati ħafna fiż-żewġ vaċċinil-iżvilupp u s-saħħa tal-bniedem. Sal-lum, diversi adjuvants ġew identifikati u studjati b'mod estensiv. Dawn l-aġġuvanti jagħtu l-vaċċini b'diversi vantaġġi, inkluż it-tnaqqis tal-ammont meħtieġ ta 'antiġeni, il-minimizzazzjoni tan-numru ta' tilqim meħtieġ għal reazzjonijiet immuni normali, u l-induzzjoni ta 'risponsi immuni aktar rapidi, usa' u aktar b'saħħithom.3–5]. Għalkemm ġew żviluppati ħafna adjuvants potenti, bħal lipopolysaccharide (LPS) u adjuvant komplut ta 'Freund (FCA), mhumiex applikati b'mod wiesa' minħabba t-tossiċità tagħhom. Għalhekk, ftit adjuvanti biss, bħal Alum, huma liċenzjati għall-użu kliniku [6]. B'mod ġenerali, għandhom jiġu żviluppati aġġuvanti aktar effettivi u aktar sikuri biex jippromwovu vaċċini profilattiċi u terapewtiċi aħjar kontra mard infettiv u mhux infettiv.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-IMMUNITÀ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Is-sigurtà hija fattur ta 'konsiderazzjoni importanti fl-iżvilupp ta' adjuvants. Kostitwenti erbaċej Ċiniżi jinkludu nutrijenti u komposti attivi importanti, bħal komposti fenoliċi u polisakkaridi, li jistgħu jaġixxu bħala immunostimulanti qawwija [7-9]. Fosthom, il-polisakkaridi minn ħxejjex tradizzjonali Ċiniżi ġew esplorati b'mod wiesa 'minħabba l-attivitajiet immunostimulatorji tagħhom u t-tossiċità baxxa. Pereżempju, l-inulina hija adjuvant immuni mingħajr it-tossiċità ta 'adjuvants oħra bħal FCA. AdvaxTM delta inulin adjuvant ukoll tejjeb b'suċċess l-immunoġeniċità tal-vaċċin [10,11]. Astragalus, magħruf ukoll bħala Huangqi fiċ-Ċiniż u Radix Astragali bil-Latin, huwa mqassam b'mod wiesa 'madwar id-dinja. Polysaccharide huwa wieħed mill-ingredjenti attivi ewlenin tiegħu responsabbli għall-attività immunomodulatorja. Studji sperimentali wrew li Astragalus polysaccharide kellu effetti immunomodulatorji qawwija kemm in vitro kif ukoll in vivo [12, 13]. Lycium barbarum polysaccharides bħala aġġuvant tal-vaċċin wera wkoll titjib tajjeb u effetti stimulanti [14, 15]. Dawn l-istudji ssuġġerew li l-polisakkaridi tal-ħxejjex Ċiniżi kienu kandidati ideali għall-iżvilupp awżiljarju.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, "Rou Cong Rong" biċ-Ċiniż) hija ħaxixa tradizzjonali Ċiniża siewja u komunement meqjusa bħala "ġinseng tad-deżerti" minħabba l-effetti toniċi superjuri tagħha. Huwa mqassam f'reġjuni aridi jew semi-aridi f'Xinjiang. Fiċ-Ċina, iz-zokk imnixxef tiegħu intuża bħala ikel toniku għal mijiet ta 'snin [16, 17]. Għal ħafna snin, is-CD mgħolli intuża bħala ikel toniku biex jikkura l-indeboliment ikkawżat minn tensjoni żejda, li jissuġġerixxi li huwa sigur għall-amministrazzjoni orali. Dan l-impjant huwa kkunsidrat ħafna minħabba l-funzjonijiet mediċinali wiesgħa tiegħu. Studji riċenti fitokimiċi u farmakoloġiċi wrew li l-polisakkaridi kienu l-komponenti bijoloġikament attivi ewlenin u kellhom diversi effetti bijoloġiċi, inklużiattività immunomodulatorja, effett anti-ossidanti, u effetti anti-infjammatorji[18–21]. Madankollu, l-attività ta 'titjib immuni ta' polisakkaridi estratti bl-ilma minn C. deserticola f'Xinjiang rari kienet irrappurtata.

Huwa magħruf sew li DCs huma ċelluli importanti li jippreżentaw l-antiġenu (APCs) li jipprovdu sinjali meħtieġa biex jinbdew risponsi immuni u jimmodulaw ċelluli intrinsika u adattivi. Xi adjuvanti li jtejbu l-assorbiment tal-antiġen mid-DCs jistgħu jżidu molekuli ko-stimulatorji jew MHC uittejjeb l-immunità. Meta tibda l-maturazzjoni tad-DCs, jiġu prodotti aktar molekuli ko-stimulatorji u ċitokini u DCs juru fenotipi distinti [22, 23].

F'dan l-istudju, aħna l-ewwel sfruttajna jekk WPCD jistax jippromwovi l-attivazzjoni tad-DCs permezz tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni TLR4 in vivo. Peress li d-DCs kienu r-rabta bejn ir-risponsi immuni intrinsiċi u adattivi, aħna ipoteżijna li l-attivazzjoni tad-DCs stimulata minn WPCD tinfluwenza r-riżultat tal-immunità adattiva. Aħna eżaminajna r-rispons immuni speċifiku għall-ovalbumin (OVA) fil-ġrieden ittrattati b'WPCD, inklużi titri ta 'subklassi IgG, IgG1, u IgG2a, proliferazzjoni T- u B-, u l-produzzjoni ta' ċitokini. Aħna investigajna jekk it-trattament WPCD iżżidx l-attività taċ-ċelluli DCs u Treg fil-milsa ta 'dawn il-ġrieden. Is-sejbiet tagħna wrew l-attività immunomodulatorja potenzjali tal-polisakkaridi naturali minn C. deserticola u espandew l-ambitu tal-applikazzjoni tagħha.

materjali u metodi

Annimali

Ġrieden femminili C57BL/6, BALB/c, jew ICR ta 'tmien sa għaxar ġimgħat inxtraw mill-Ewwel Sptar tal-Università Medika ta' Xinjiang (Urimuqi, Xinjiang, iċ-Ċina). Il-ġrieden kienu miżmuma taħt kundizzjonijiet ħielsa mill-patoġeni skont il-linji gwida tal-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali (ACUC) tal-Università ta 'Xinjiang għas-Saħħa u l-Benessri tal-Annimali. Il-proċeduri tal-esperimenti tal-annimali kienu ġew approvati mill-AUCC tal-Università ta 'Xinjiang.

Estrazzjoni ta' estratti milwiema

C. deserticola hija pjanta fil-Provinċja ta 'Xinjiang fiċ-Ċina. Il-polisakkarid mhux raffinat inkiseb permezz ta 'estrazzjoni ta' ilma u preċipitazzjoni ta 'l-etanol. Fil-qosor, 100 g ta' C. deserticola imnixxef ġie mitħun fi trab u mbagħad iffiltrat. It-trab ġie refluxed b'etere tal-pitrolju f'temperatura tal-kamra ripetutament u mbagħad refluxed b'etanol anidru għal 1 siegħa biex jitneħħew l-ingredjenti ikkuluriti u l-lipidi. Ir-residwi ġew estratti b'ilma jagħli għal tliet darbiet u l-estratti ġew miġbura flimkien, ċentrifugati f'4000 rpm għal 10 min, u refluxed f'60˚C għal 4 sigħat. Erba 'darbiet ta' volum ta '95% etanol ġew miżjuda fis-soluzzjoni biex jippreċipita polisakkaridi mhux raffinati. Il-polisakkaridi mhux raffinati ġew maħlula mill-ġdid f'ilma distillat u ttrattati b'reaġent Sevage biex jitneħħew il-proteini. L-estratti ġew maħlula f'PBS u sterilizzati permezz ta' filtru ta' 0.22-μm. Fl-aħħarnett, il-kontenut totali taz-zokkor tal-WPCD kien 59.58%, kif indikat mill-analiżi tal-fenol-aċidu sulfuriku [24].

Ġenerazzjoni ta' DCs

Il-BM-DCs ġew iġġenerati skont il-metodu deskritt qabel b'modifiki ħfief [25]. DCs tal-mudullun mill-ġrieden C57BL/6 ġew imlaħlaħ b'medja kompluta RPMI-1640 (Gibco) supplimentata b'10% serum tal-għoġol tal-fetu (Hyclone). Iċ-ċelloli miġbura ġew sospiżi mill-ġdid f'medja RPMI-1640 b'50 μM -mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO) u 20 ng/mL murina GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) u inkubati f'37˚ C f'atmosfera ta' 5% CO2. Nofs il-medja tal-kultura ġiet sostitwita b'medja friska li fiha GM-CSF kull 1-2 ijiem. Iċ-ċelloli nġabru f'Jum 6, ittrattati b'dożi differenti ta 'WPCD, u LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) għal 24 siegħa, u mbagħad ivvalutati permezz ta' ċitometrija tal-fluss.

Sejbien ta 'maturazzjoni ta' DCs u attivazzjoni taċ-ċelluli T in vitro

L-effett ta 'maturazzjoni in vitro ta' WPCD fuq BM-DCs ġie evalwat abbażi tar-riżultati tal-analiżi fenotipika mill-FACs. F'Jum 7, BM–DCs minn C57BL/6 ġew indotti fil-preżenza ta' GM-CSF u mbagħad ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1, u 0.2 mg/mL) għal 12-il siegħa fi tliet kopji. LPS (100 ng/mL) intuża bħala kontroll pożittiv. Wara li BM-DCs inħaslu f'PBS u Fc Block (BD Biosciences, CA) intużat biex jipprevjeni t-twaħħil ta 'antikorpi mhux speċifiċi, iċ-ċelloli ġew imtebba' fil-PBS bl-użu tal-CD40, CD11c, CD{ {23}}, CD80, u antikorpi MHC-II (BD) għal 20 min f'37˚C. Iċ-ċelloli mtebbgħin ġew skoperti minn FACs Calibur (BD). L-analiżi tad-dejta saret bis-softwer FlowJo (Tree Star).

Fl-esperiment tal-maturazzjoni tad-DCs in vitro, inġabru wkoll supernatanti tal-kultura taċ-ċelluli biex janalizzaw IL-12 u TNF- bl-użu ta' kits ta' analiżi taċ-ċitokini (Boster, Wuhan, iċ-Ċina) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-assorbiment f'450 nm tkejjel b'apparat li jaqra l-pjanċa ELISA (Bio-Rad, USA). Il-kwantitajiet ta' ċitokini fil-kampjuni ġew ikkalkulati b'kurvi standard ta' ċitokini rikombinanti skond il-metodu lineari ta' rigressjoni.

Biex tiġi ttestjata l-attività stimulatorja alloġenika tagħhom, l-esperiment ta 'reazzjoni tal-limfoċiti mħallta (MLR) sar skont il-metodu preċedenti [26] permezz ta' assaġġ MTT (Sigma, St Louis, MO). Fil-qosor, BM-DCs minn ġrieden C57BL/6 użati bħala ċelloli stimulaturi ġew irkuprati f'Jum 7 f'medja RPMI -1640 flimkien ma 'GM-CSF u ttrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta' WPCD għal 12-il siegħa f'37˚C. Iċ-ċelluli ġew maħsula u sospiżi mill-ġdid f'medja RPMI-1640 qabel il-kisi fil-pjanċa tal-24-tajjeb. Iċ-ċelloli ta' risposta tas-sospensjoni singleplenocyte ġew iżolati minn ġrieden BALB/c. BM-DCs tħalltu ma 'splenocytes skond il-proporzjonijiet ta' 1:5 u 1:10. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'37˚C f'atmosfera ta' 5% CO2 għal tlett ijiem fi tliet kopji. It-trattament LPS intuża bħala kontroll pożittiv. Il-kulturi sussegwentement ġew miżjuda b'20 μL ta' MTT għall-kultivazzjoni finali ta' 4-h. L-assorbanzi fil-wavelength tal-kejl (490 nm) u l-wavelength ta 'referenza (650 nm) ġew imkejla għall-analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli T. Il-kampjuni kollha tkejlu kontra kontroll fl-isfond.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAS-SISTEMA IMMUNI TIEGĦEK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Trattament b'inibitur TLR4 in vitro

BM-DCs ġew ittrattati minn qabel b'5 μM TAK-242 (inibitur ta' TLR4, Medchemexpress Inc. USA) għal siegħa u mbagħad ikkultivati ​​flimkien b'diversi konċentrazzjonijiet ta' WPCD (100 u 200 ug/ mL) għal 12-il siegħa fil-preżenza jew in-nuqqas ta’ Golgi Stop fi tliet kopji. Fil-kontroll pożittiv, LPS ġie miżjud. Ċelloli u supernatanti ġew skoperti mill-FACs għall-analiżi tal-markaturi tal-wiċċ CD86 u CD40 u mill-ELISA għall-analiżi taċ-ċitokini TNF-a u IL-12, rispettivament.

Protokoll ta' tilqim

Test ta' tossiċità akuta

Fit-test tat-tossiċità orali akuta f'dan l-istudju, intużaw 40 ġrieden ICR adulti b'saħħithom. Il-ġrieden ICR kienu sajmu (ikel iżda mhux ilma matul il-lejl) qabel id-dożaġġ. WPCD ingħata mill-ħalq rispettivament f'dożi ta' 0, 50, 500, jew 5000 mg/kg piż tal-ġisem lil kull annimal għal 7 ijiem. Ġrieden ittrattati bis-salina u trattati bl-alum ġew inklużi fil-grupp ta 'kontroll. L-annimali ġew osservati kuljum għal 14-il jum konsekuttiv. Il-ġrieden ġew osservati individwalment biex jirreġistraw il-mortalità u s-sinjali kliniċi. Barra minn hekk, il-piżijiet tal-ġisem u l-konsum tal-ikel u l-ilma ġew imkejla matul l-esperiment. Fl-14 Jum, l-indiċi tal-milsa jew tat-timu ġie kkalkulat bħala (piż tal-milsa jew tat-timu/piż tal-ġisem) × 10.

Sejbien ta 'attività immunomodulatorja WPCD in vivo.

Biex tinvestiga jekk WPCD kellhiex attività immunomodulatorja, ovalbumin (OVA) (Sigma) intuża bħala l-antiġen mudell, u ġrieden ICR femminili ġew separati b'mod każwali f'7 gruppi (grupp ta 'kontroll negattiv (0.9% NaCl u WPCD 400 ug) ) u l-kontroll pożittiv (Alum 200 ug b'OVA)). Il-ġrieden ingħataw taħt il-ġilda darbtejn b'10 ug OVA waħdu jew WPCD b'OVA skont id-doża ta' 20, 100, jew 400 ug b'intervall ta' 2-ġimgħa. Kampjuni tad-demm u milsa nkisbu wara t-tilqim booster biex jinstabu titers IgG, is-sottoklassijiet IgG, proliferazzjoni ta 'splenocyte u cytokine, markaturi tal-wiċċ DCs, u frekwenza Treg.

Sejbien ta' antikorpi speċifiċi għall-OVA

Tittri u sottoklassijiet ta' IgG speċifiċi għall-OVA ġew eżaminati mill-ELISA skont il-metodu preċedenti [27]. Pjanċi ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) ġew miksija matul il-lejl u mbagħad imblukkati. Kampjuni tas-serum ġew dilwiti serjali għall-analiżi tat-titer IgG jew is-sejbien ta 'IgG1 u IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Il-pjanċi mbagħad ġew inkubati b'PBST li kien fih IgG, IgG1 u IgG2a kontra l-ġrieden konjugat bl-HRP għal siegħa f'37˚C. Ir-reazzjoni kolorimetrika ġiet żviluppata b'tetramethylbenzidine (TMB) u mbagħad l-assorbanzi f'450 nm/655 nm ġew imkejla u espressi bħala unitajiet ta 'densità ottika (OD).

Sejbien ta 'proliferazzjoni ta' splenoċiti u ċitokini

Il-proliferazzjoni tal-isplenoċiti ġiet iddeterminata mill-assaġġ MTT. Fil-21 Jum wara l-ewwel tilqim, inkisbet suspensjoni waħda ta’ splenocyte. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI-1640 fi pjanċi ta' 96-bir skond il-konċentrazzjoni ta' 1 × 106 ċelluli/bir fi tliet kopji. Il-kulturi ġew stimulati b'OVA (konċentrazzjoni finali 10 ug/mL), ConA (konċentrazzjoni finali 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO), u LPS (konċentrazzjoni finali 100 ng/mL) għal 48 siegħa f'37˚C . Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​għal 48 siegħa u 20 μL (5 mg/mL) ta 'MTT (Sigma, St Louis, MO) ġew miżjuda f'kull bir u inkubati għal 4 sigħat oħra. Wara li żiedet 50 μL ta 'DMSO f'kull bir biex twaqqaf l-iżvilupp tal-kulur (Sigma), il-pjanċi nqraw f'570 nm minn qarrej tal-pjanċa mikrotiter (BioRad, CA, USA). Il-proliferazzjoni ta 'splenocyte kienet espressa bħala indiċi ta' stimulazzjoni (SI), li kien il-proporzjon OD570 nm ta 'bir stimulat għal bir mhux stimulat.

Ir-rendimenti ta 'IL-4 u IFN- fiċ-ċelluli T ġew imkejla permezz ta' tbajja ta 'ċitokini intraċellulari skond protokoll ippubblikat b'modifiki minuri [27, 28]. Suspensjoni waħda ta' splenocyte ġiet ippreparata fil-21 Jum wara l-ewwel tilqim. Wara l-liżi taċ-ċelluli ħomor tad-demm, l-isplenocyte (2 × 106 ċelluli/mL) ġew inkubati b'OVA (10 ug/mL) għal stimulazzjoni 4- siegħa u l-waqfien ta' Golgi (BD) ġie miżjud għal 12-il siegħa inkubazzjoni, PMA bħala pożittiv kontroll. Iċ-ċelloli nġabru, inħaslu b'PBS, imtebba' b'CD4-FITC/CD8-FITC, u ffissati u permeabilizzati b'Cytofix/Cytoperm kit (BD) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Tbajja intraċellulari taċ-ċitokini twettqet bil-konċentrazzjoni xierqa ta' antikorpi IL-4-PE jew IFN- -APC f'4˚C għal 20 min. Ċelloli mtebbgħin ġew skoperti mill-FACs. L-analiżi tad-dejta saret fil-FlowJo.

Valutazzjoni tal-maturazzjoni tad-DCs u ċ-ċelloli Treg fil-milsa

Għall-analiżi tal-maturazzjoni tad-DC mill-isplenoċiti fil-ġrieden, it-tbajja tal-wiċċ taċ-ċelluli twettqet b'antikorpi CD11c-PE, CD40-FITC, u CD80-APC. Fit-3 Jum wara l-ewwel tilqim, inkisbet sospensjoni ta’ splenocyte singolu (1 × 106 ċelluli/mL) u ċ-ċelloli ġew soġġetti għal tbajja doppja. L-intensitajiet fluworexxenti ġew imkejla mill-FACs Calibur u d-dejta mkejla ġiet analizzata minn FlowJo.

Biex tosserva jekk WPCD jistax jirregola 'l isfel il-frekwenza taċ-ċelluli CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg. Suspensjoni waħda ta' splenoċiti ġiet ippreparata f'Jum 7 wara t-tieni tilqim. L-isplenocyte (2 × 106 ċelluli/mL) kien soġġett għal tbajja tal-wiċċ taċ-ċellula b'antikorp CD4-APC, segwit minn tbajja taċ-ċitokin nukleari bl-antikorpi CD25-FITC u Foxp3-PE xierqa mal-kit regolatorju tat-tbajja taċ-ċelluli T tal-ġurdien (eBiosciences) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-frekwenza taċ-ċelloli CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg ġiet ittestjata fuq FACs. L-analiżi tad-dejta saret fil-FlowJo.

Analiżi statistika

Analiżi f'direzzjoni waħda tat-testijiet tal-varjanza (ANOVA) (Tukey's Multiple-Comparison Test) saret biex tanalizza d-differenzi fost gruppi sperimentali multipli. Il-valuri kollha huma espressi bħala medja ±SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Riżultati WPCD ippromwova l-maturazzjoni u l-funzjoni tal-BM-DCs in vitro

L-immunità adattiva hija determinata mill-attivazzjoni ta 'DCs, inklużi t-tipi ta' molekuli ko-stimulatorji u ċitokini [29, 30]. Inizjalment, investigajna jekk WPCD jistax jippromwovi l-espressjoni ta 'molekuli ko-stimulatorji. Skond dożi differenti ta 'WPCD, BM-DCs

minn C57BL/6 ġew amministrati. Il-livelli ta 'espressjoni ta' CD11c, CD86, CD80, CD40, u MHC-II fiċ-ċelloli ġew analizzati (Fig 1). Iċ-ċelloli gated b'SSC u FSC wrew li t-trattament b'dożi differenti ta 'WPCD ma biddilx il-morfoloġija ta' BM-DCs (dejta mhux murija). Il-livelli ta' espressjoni ta' CD86, CD80, u CD40 kienu rregolati b'mod sinifikanti 'l fuq b'mod dipendenti fuq id-doża meta mqabbla mal-grupp mhux ittrattat u laħqu l-plateau taħt id-doża ta' 20 ug/mL ta' WPCD, iżda d-differenza kienet mhux sinifikanti meta mqabbel mal-grupp LPS (Fig 1A-1C). Il-livell ta 'espressjoni ta' MHC-II żdied b'mod sinifikanti għall-valur massimu tiegħu taħt id-doża ta '50 ug / mL (Fig 1D). Ir-riżultati tal-analiżi tal-markaturi tal-wiċċ ċellulari wrew li DCs ittrattati b'LPS jew WPCD wrew livelli ta' espressjoni miżjuda b'mod sinifikanti ta' CD86, CD80, CD40, u MHC-II u promossi l-maturazzjoni fenotipika.

Xi aġġuvanti jistgħu jżidu molekuli ko-stimulatorji fuq DCs jew jinduċu direttament is-sekrezzjoni ta 'ċitokini. IL-12 u TNF- huma ċ-ċitokini ewlenin għall-attivazzjoni tar-rispons immuni Th1. Aħna analizzajna r-rendiment taċ-ċitokini f'BM-DCs fuq trattament WPCD. Wara li BM-DCs ġew ittrattati b'kontenut differenti ta 'WPCD għal 12-il siegħa, is-supernatant inġabar biex jinstab il-kontenut ta' IL-12 u TNF- b'kit ELISA. WPCD jista' jżid il-produzzjoni ta' IL-12 (Fig 2A) u TNF- (Fig 2B) b'mod dipendenti fuq id-doża. Ir-riżultati wrew li WPCD jista' jinduċi l-maturazzjoni funzjonali tad-DCs.

F'rispons immuni, huwa meħtieġ li d-DCs jiġu attivati ​​funzjonalment. Imbagħad, il-livell ogħla ta 'proliferazzjoni taċ-ċelluli T alloġeniċi kien indott minn DCs kompletament maturi. Għalhekk, ir-rispons funzjonali tad-DCs għal WPCD ġie investigat minn MLR. Il-kapaċità allostimulatorja tad-DCs indotti minn WPCD, simili għal LPS, tjiebet b'mod drammatiku b'mod dipendenti mid-doża fil-proporzjon indikat (Fig 2C u 2D). Ir-riżultati indikaw li WPCD tejbet il-preżentazzjoni tal-antiġen u ottimizza r-rispons taċ-ċelluli T minn MLR in vitro.

WPCD ippromwova l-maturazzjoni tad-DCs permezz tal-mogħdija TLR4

Jista 'jiġi dedott mir-riżultati ta' hawn fuq li BM-DCs attivati ​​minn WPCD indikaw espressjonijiet simili tal-molekula tal-wiċċ tad-DCs għal LPS (ligand TLR4). Aħna għalhekk ipoteżijna li BM-DCs huma attivati ​​minn WPCD permezz tal-mogħdija TLR4. Wara li BM-DCs ġew ittrattati minn qabel b'TAK-242 (inibitur TLR4) u kkultivati ​​flimkien ma' WPCD u LPS għal 12-il siegħa, l-espressjoni ta' CD40, CD86, TNF-a, jew IL{{12 }} ġiet skoperta minn FACs jew ELISA. Kif muri fil-Fig 3A u 3B, it-trattament TAK-242 irriżulta fl-espressjonijiet irregolati b'mod sinifikanti 'l isfel ta' CD40 u CD86 indotti minn LPS jew WPCD, u produzzjoni ta 'ċitokini ta' IL-12 jew TNF-a naqsu wkoll b'mod sinifikanti (Fig 3C u 3D). Ir-riżultati indikaw li WPCD jista 'jattiva l-maturazzjoni DC permezz tal-mogħdija TLR4.

WPCD saħħaħ l-immunità umorali u ċellulari

Għat-tqabbil, aħna evalwajna l-effetti ta 'WPCD fuq l-elicitation ta' rispons immuni umorali fi ġrieden immunizzati bl-OVA. Qabel it-tilqim u fil-Jiem 14, 21,

35, u 49 wara l-ewwel tilqim, inġabar id-demm biex jinstab serum tat-titer IgG u tas-sottoklassijiet IgG permezz tal-ELISA. Ir-rispons ta 'l-antikorpi IgG għal OVA żdied biż-żieda fid-doża ta' amministrazzjoni ta 'WPCD (100 u 400 ug) b'mod dipendenti mid-doża (Fig 4). L-aħjar konċentrazzjoni kienet 100 ug/mL ta 'WPCD u żiedet ir-risponsi IgG b'darbtejn meta mqabbla mal-OVA waħdu fil-Jiem 21, 35 u 49 (Fig 4A). Żidiet konsiderevoli fil-livelli ta 'antikorpi IgG1 u IgG2a speċifiċi għal OVA taħt 20 u 100 ug ta' amministrazzjoni ta 'WPCD inkisbu meta mqabbla mal-grupp OVA fis-serum f'Jum 35 (Fig 4B). Sadanittant, Alum ippromwova biss il-livelli ta 'espressjoni ta' antikorpi IgG u IgG1 speċifiċi għall-OVA fil-ġrieden immunizzati. WPCD waħdu ma wassalx għal antikorpi speċifiċi għall-OVA. Ir-riżultati ta 'hawn fuq indikaw li WPCD iġġenera titri ta' antikorpi ogħla u reazzjonijiet Th1/Th2 aktar bilanċjati minn Alum.

Il-proliferazzjoni tal-isplenoċiti hija indikatur ieħor tal-immunità ċellulari. ConA jistimula ċelluli T u LPS jistimula l-proliferazzjoni taċ-ċelluli B. Fil-21 Jum wara l-ewwel tilqim, inkisbet sospensjoni ta’ splenocyte wieħed u stimulata rispettivament b’OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptide, ConA (5 ug/mL), u LPS ( 5 ug/mL) għal 48 siegħa. Imbagħad il-proliferazzjoni taċ-ċelluli T ġiet imkejla bil-metodu MTT. WPCD jista 'jippromwovi b'mod sinifikanti l-antiġen OVA, Con A-mitogen, u l-proliferazzjoni ta' splenocyte stimulata mill-mitoġen LPS fil-ġrieden immunizzati b'OVA u WPCD (Fig 5) u l-konċentrazzjoni ottimali ta 'WPCD kienet 100 ug/mL. Din id-dejta indikat li WPCD bħala aġġuvant tal-vaċċin fil-ġrieden immunizzati bl-OVA jista 'jinduċi b'mod aktar effettiv l-attivazzjoni ta' ċelluli T u ċelluli B minn Alum.

L-adjuvants WCPD ittestjati kollha fformulati b'vaċċini OVA ġġeneraw immunità umorali u ċellulari ugwalment qawwija (Figuri 4 u 5). Ibbażat fuq din id-dejta, biex nevalwaw aktar l-influwenzi WPCD fuq ir-rispons taċ-ċelluli T helper (Th) speċifiċi għall-OVA, aħna analizzajna aktar l-espressjonijiet taċ-ċitokini fiċ-ċelluli CD8+ u CD4+ T permezz taċ-ċitometrija tal-fluss (Fig 6) . F'Jum 21 wara l-ewwel tilqim, splenocyte wieħed ta 'ġrieden ġie iżolat u mbagħad ko-kultivat ma' l-OVA (10 ug / mL). Ir-rendiment IL-4 fiċ-ċelluli CD4+ T fil-grupp mogħti b'100 ug OVA/WPCD kien ogħla b'mod sinifikanti minn dak fil-grupp OVA/Alum u l-grupp OVA u simili għal dak f'PMA (Fig 6A). Barra minn hekk, ir-rendiment ta' IFN fiċ-ċelluli CD8+ u CD4+ T tjiebet ukoll b'mod sinifikanti fil-ġrieden mogħtija b'OVA/WPCD (20, 100, u 400 ug) (Fig 6B u 6C). Meta mqabbel ma 'adjuvant Alum, WPCD wera kapaċità aħjar li jinduċi sekrezzjonijiet IL-4 u IFN- miċ-ċelluli T.

Il-maturazzjoni stimulata minn WPCD tad-DCs u t-tnaqqis fil-frekwenza Treg in vivo DCs huma rikonoxxuti bħala l-APCs l-aktar potenti involuti fil-bidu tar-risponsi immuni primarji. Għalhekk, f'Jum 3 wara l-ewwel tilqim, investigajna wkoll l-effetti ta 'WPCD fuq CD40 u CD80 fuq DCs fil-milsa fil-ġrieden (Fig 7A u 7B). Il-ġrieden fil-grupp 100-ug OVA/WPCD ipproduċew livelli ogħla b'mod sinifikanti ta' CD40 u CD80 fuq DCs minn dawk fil-grupp OVA/Alum. Din id-dejta wriet li WPCD jista 'jattiva DCs u jinduċi maturazzjoni DC fil-ġrieden. Iċ-ċelloli Treg jistgħu jibbilanċjaw it-tolleranza u r-risponsi immuni. Biex tinvestiga aktar kif WPCD modula r-rispons immuni, iċ-ċelloli Treg fil-milsa fil-ġrieden kienu mtebbgħin b'kit tat-tbajja' taċ-ċelluli T regolatorju tal-ġurdien. Fil-21 Jum wara l-ewwel tilqim, ġiet osservata frekwenza mnaqqsa taċ-ċelluli CD{25+ Foxp{3+ Treg fiċ-ċelluli CD4+ T totali (Fig 7C). Meta mqabbel mal-gruppi OVA u OVA/Alum, il-grupp WPCD wera frekwenza Treg mnaqqsa b'mod sinifikanti.

Evalwazzjoni tas-sigurtà ta 'WPCD fil-ġrieden

Biex nistmaw it-tossiċità akuta orali, wettaqna t-test tat-tossiċità akuta. Il-ġrieden mogħtija mill-ħalq b'5000 mg/kg piż tal-ġisem ma wrew l-ebda imġieba anormali jew effetti sekondarji u ma nstabet l-ebda mortalità fit-test ta 'evalwazzjoni tat-tossiċità. L-ebda differenza sinifikanti fiż-żieda fil-piż tal-ġisem, l-indiċi tat-Tymus u l-indiċi tal-Mulsa ma ġiet irreġistrata fost diversi gruppi ta 'ġrieden amministrati b'dożi differenti ta' WPCD u ma kellhom l-ebda differenza sinifikanti (Tabella 1). L-ebda mortalità ma ġiet osservata wara 14-il jum. Għalhekk, il-valur LD50 ta 'WPCD kien aktar minn 5000 mg għal kull kg ta' piż tal-ġisem.

Biex jiġi ttestjat jekk WPCD kellux effetti negattivi fuq it-tkabbir tal-ġrieden, qabel u wara t-tilqim taħt il-ġilda, il-piż tal-ġisem ġie ddeterminat rispettivament għal kull ġrieden (Tabella 2). Fl-osservazzjoni sussegwenti tal-ġrieden, ma ġewx osservati effetti sekondarji jew imġieba anormali. Barra minn hekk, il-piż tal-ġisem tal-ġrieden amministrati b'WPCD u l-ġrieden amministrati b'soluzzjoni salina jew OVA/Alum ma wrew l-ebda differenza sinifikanti. Dawn ir-riżultati ta' osservazzjoni wrew li l-amministrazzjoni ta' WPCD kienet sigura.

Diskussjoni

L-adjuvants huma komponenti ewlenin fil-vaċċini [31]. Minħabba l-avvanzi fil-ġenomika u l-proteomika, aktar u aktar rikombinanti u molekuli sintetiċi tal-vaċċin huma identifikati. Għalhekk, huma meħtieġa aktar adjuvants u formulazzjonijiet. Xi adjuvants potenti huma ġeneralment relatati ma 'żieda fit-tossiċità, pereżempju, FCA. Għalhekk, huwa meħtieġ li tinstab formulazzjoni sigura li jkun fiha komponenti sinerġistiċi differenti eventwalment issuq ir-rispons immuni mixtieq.Il-polisakkaridi minn ħwawar Ċiniżi mhumiex tossiċiu ma juru l-ebda effetti sekondarji sinifikanti [32,28]. Adjuvant sikur huwa meħtieġ għal ċertu vaċċin.

Cistanche deserticola hija ħaxixa tonika importanti u teżisti b'mod wiesa 'f'artijiet niexfa u deżerti sħan fil-majjistral taċ-Ċina. Cistanche deserticola hija mħassba b'mod wiesa 'minħabba l-bijoattivitajiet tagħha inklużi l-effetti immunomodulatorji, antiossidanti, antibatteriċi u antitumorali [20,21]. Sar xi progress fil-karatterizzazzjoni strutturali u l-attività immunoloġika ta 'Cistanche deserticola, li hija kandidat tajjeb għall-iżvilupp ta' aġġuvanti. Aħna evalwajna b'mod sperimentali l-effetti adjuvanti u l-mekkaniżmu ta 'WPCD in vitro u in vivo. L-amministrazzjoni taħt il-ġilda ta' WPCD ippromwoviet b'mod sinifikanti r-risponsi immuni umorali u ċellulari billi żiedet l-antikorpi tas-serum u l-proliferazzjoni tal-limfoċiti, ittejjeb l-espressjoni ta' ċitokini, irregolat 'l fuq il-maturazzjoni tad-DC, u rregola l-isfel il-frekwenza ta' CD4+ CD{{5} } Ċelloli Foxp3+ Treg.

DCs huma APCs ewlenin għall-priming taċ-ċelluli T naive. L-attivazzjoni tad-DCs hija importanti għall-adjuvants. DCs, speċjalment DCs derivati ​​mill-mudullun tal-marieni, ħafna drabi jintużaw biex jevalwaw adjuvants u vaċċini. Iċ-ċitometrija tal-fluss tista' tiddistingwi ċ-ċelloli li ġew attivati ​​wara li jinqabad antiġenu miċ-ċelloli tal-madwar. Fl-analiżi FCM, il-grad ta 'aggregazzjoni ta' stimulat

ċelluli huwa indikatur indirett tal-valutazzjoni tas-sigurtà tal-immunomodulaturi [3]. Għalhekk, id-dejta tal-attività awżiljarja tal-WPCD f'DCs in vitro tista' tipprovdi informazzjoni siewja għal mudelli tal-annimali. Ibbażat fuq il-mudell BM-DC, il-livelli ta 'espressjoni ta' MHC-II, CD86, CD80, u CD40, il-produzzjoni taċ-ċitokini, u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli T alloġeniċi ġew skoperti fil-medda ottimali ta 'konċentrazzjoni WPCD. Il-livelli ta' espressjoni ta' MHC-II, CD86, CD80, u CD40 kienu regolati 'l fuq f'BM-DCs u r-rendimenti ta' TNF-a u IL-12 żdiedu b'mod dipendenti fuq id-doża. Ġiet osservata l-proliferazzjoni taċ-ċelluli T alloġeniċi. Il-morfoloġija tal-BM-DCs ma nbidlitx. Billi jinduċi l-attivazzjoni ta 'BM-DCs u s-sekrezzjoni ta' ċitokini infjammatorji in vitro, l-adjuvant WPCD jista 'jżid b'mod sinifikanti l-ammont ta' antiġen u n-numru ta 'APCs ​​u jistimula ċelluli T biex inixxu IFN-, li jikkontribwixxi għat-titjib tal-attività immunomodulatorja.

DiversiPolysaccharides erbaċej Ċiniżihuma kapaċi jattivaw is-sistema immuni u jippossjedu abbiltajiet adjuvanti eċċellenti permezz tal-istimulazzjoni tal-maturazzjoni tad-DC mill-mogħdija TLR4 [33,28]. Għalhekk, nassumu li TLR4 jipparteċipa fil-mogħdija tas-sinjalar tal-maturazzjoni tad-DCs indotta minn WPCD. Kif mistenni, it-trattamenti bl-inibituri ta' TLR4 irriżultaw fi tnaqqis sinifikanti ta' TNF-a u IL-12. Barra minn hekk, l-inibizzjoni tal-mogħdija TLR4 fixklet ukoll l-espressjoni ta 'CD40 u CD80 fuq DCs, li jindika li l-maturazzjoni ta' DCs kienet dipendenti fuq TLR4. Għalhekk, huwa ovvju li TLR4 jipparteċipa fil-maturazzjoni tad-DCs indotta minn WPCD.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-IMMUNITÀ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

L-aħjar doża ta' aġġuvanti u formulazzjoni tal-vaċċin hija determinata empirikament f'ħafna esperimenti. Biex tesplora r-relazzjoni doża-rispons ta 'WPCD adjuvant u antiġeni OVA fil-ġrieden, għażilna dożi WPCD differenti bbażati fuq dejta rrappurtata qabel minn BM-DCs in vitro biex namministraw taħt il-ġilda ġrieden ICR darbtejn. Sibna li WPCD żied b'mod sinifikanti r-rendiment ta 'antikorpi speċifiċi għall-OVA u indotta rispons immuni Th1/Th2 bilanċjat b'titjib tal-livelli IgG1 u IgG2a. Speċjalment, il-livell IgG2a kien ogħla minn dak ittrattat bl-Alum fl-aħjar doża. Għalhekk, WPCD irriżulta f'livelli ogħla ta 'antikorpi speċifiċi u effikaċja ogħla bl-injezzjonijiet aktar baxxi.

Vaċċini ġodda jeħtieġu l-induzzjoni ta 'risponsi ċellulari qawwija, li jinvolvu antikorpi, ċelluli T helper (Th), u limfoċiti T ċitotossiċi (CTLs). Il-vaċċin terapewtiku għandu l-għan li jinduċi risponsi aktar b'saħħithom taċ-ċelluli T. L-adjuvant ideali jsaħħaħ il-qawwa tal-vaċċin u jippromwovi l-immunità medjata miċ-ċelluli mingħajr ma jikkawża effetti tossiċi [34]. Fost l-osservazzjonijiet f'mudelli ta 'ġrieden immunizzati, WPCD wassal għal żieda fil-proliferazzjoni ta' splenoċiti speċifiċi għall-OVA u mhux speċifiċi meta mqabbla ma 'Alum. Xi adjuvanti jirregolaw ċitokini u s-sistema immuni. Pereżempju, saponini jistgħu jistimulaw risponsi immuni medjati minn ċelluli għal antiġen li normalment jinduċi biss antikorpi. Aħna għażilna IL-4 u IFN- bħala l-indikaturi biex nevalwaw indirettament il-livelli tal-immunitajiet fil-ġrieden. WPCD jista' jinduċi aktar sekrezzjonijiet ta' IL-4 u IFN- minn Alum. Għalhekk, risponsi qawwija taċ-ċelluli T helper u tnixxijiet taċ-ċitokini ġew osservati bħala riżultat tat-tilqim WPCD, li jissuġġerixxi li WPCD jista' jistimula b'mod aktar effiċjenti limfoċiti biex jissekrixxu ċ-ċitokin tat-tip Th1-u ċ-ċitokin tat-tip Th2-minn Alum.

Aġġuvanti li jinfluwenzaw il-preżentazzjoni tal-antiġen jistgħu jaffettwaw proċessi immuni kumplessi. Iċ-ċelloli Treg jistgħu jimmodulaw ir-risponsi Th1 u Th2 [35]. Doża xierqa ta 'WPCD tista' tippromwovi l-maturazzjoni ta 'DCs fil-ġrieden billi żżid il-livelli ta' espressjoni ta 'CD80 u CD40 u tamplifika l-kapaċità ta' preżentazzjoni ta 'antiġen OVA fir-rispons immuni bikri. Ir-riżultati sperimentali tal-attivazzjoni tad-DCs u l-frekwenza Treg wrew li WPCD indotta maturazzjoni tad-DCs u naqqset il-frekwenza Treg fil-milsa fil-ġrieden. Dawn ir-riżultati wrew li WPCD tejjeb l-effikaċja tal-vaċċini OVA billi żied l-immirar taċ-ċelloli li jippreżentaw l-antiġenu u jippromwovi l-attivazzjoni speċifika taċ-ċelluli T.

Fl-iżvilupp ta 'adjuvants, huwa diffiċli li b'mod selettiv jinduċi r-rispons immuni xieraq kontra l-infezzjoni korrispondenti. Aġġuvant xieraq għandu jkollu effetti sekondarji baxxi u tossiċità għall-bnedmin jew l-annimali. Għalhekk, is-sigurtà tal-WPCD għandha tiġi kkunsidrata, inklużi l-effetti sekondarji immedjati u fit-tul. F'dan l-istudju, esplorajna t-tossiċità akuta ta 'WPCD u l-effett negattiv ta' WPCD fuq il-prestazzjoni tat-tkabbir tal-ġrieden għal 110 jum. Ir-riżultati tat-tossiċità akuta tal-WPCD wrew li l-piż tal-ġisem, l-indiċi tat-timu, jew l-indiċi tal-Mulsa ma kellhom l-ebda differenza sinifikanti. Il-valur LD50 ta 'WPCD kien aktar minn 5000 mg għal kull kg ta' piż tal-ġisem. Matul l-osservazzjoni sussegwenti sperimentali tal-ġrieden, ma nstabet l-ebda effetti sekondarji jew imġieba anormali fil-ġrieden. Dawn ir-riżultati indikaw li WPCD kien sigur.

Bħala konklużjoni, f'dan l-istudju, WPCD, polysaccharide mhux raffinat estratt mill-C. deserticola minn Xinjiang, esebit xi proprjetajiet ta 'adjuvants. Pereżempju, WPCD tejjeb kemm ir-risponsi Th1 kif ukoll Th2 billi attiva DCs, żied ir-risponsi tal-antikorpi, u jtejjeb il-produzzjoni taċ-ċitokini. Barra minn hekk, esplorajna l-mekkaniżmu tal-effikaċja tal-WPCD billi analizzat il-maturazzjoni u l-funzjoni tad-DCs permezz tal-mogħdija TLR4 in vitro. Fil-ġrieden ittrattati biss b'WPCD, ma ġie osservat l-ebda effett sekondarju ovvju. Għalhekk, WPCD kellu attività immunostimulatorja ogħla fir-risponsi immuni ċellulari u umorali. Aġġuvanti huma taħlita ta 'diversi komposti. Taħlita ta 'diversi estratti mhux raffinati jista' jkollha effetti ta 'benefiċċju akbar minn estratt ta' pjanta waħda. Huwa meħtieġ li jiġu esplorati b'mod sistematiku l-estratti tal-WPCD, jiġu ttestjati l-effikaċja u s-sigurtà tagħhom, u jiġu spjegati l-mekkaniżmi tal-effetti tagħhom.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-IMMUNITÀ PHGS75% ECH 30% ACT 12%