Il-Konjugati tal-Antikorp li jistimulaw l-immunità jqanqlu Attivazzjoni Majelojde Robusta U Immunità Dejjiema kontra t-tumur (Parti 1)

Biex titgħallem aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattjadavid.wan@wecistanche.com

Astratt

Riċetturi ta 'rikonoxximent tal-mudell innat, inklużi riċetturi li jixbħu n-nol (TLRs), jistgħu jbiddlu l-mikroambjent tat-tumur u l-immunità primarja adattiva kontra t-tumur.Madankollu, agonisti TLR ma ġewx ittollerati sew minħabba tossiċitajiet assoċjati ma 'attivazzjoni immuni mifruxa wara amministrazzjoni sistemika.Biex tiddisinja terapewtika li hija adattata għall-kunsinna sistemika ukapaċi li jqanqlu rispons immirat għat-tumur, żviluppajna klassi ġdida ta’ konjugati ta’ antikorpi li jistimulaw l-immunità (ISACs) li jinkludu agonist TLR7/8 konjugat ma’ antikorpi li jimmiraw it-tumur.ISACs anti-HER2 amministrati b'mod sistemiku kienu tollerati tajjeb in vivo u wasslu għal attivazzjoni robusta ta 'ċelluli majelojdi intratumorali, li rriżultaw fit-tneħħija tat-tumur u memorja immunoloġika sussegwenti.Il-qawwa in vitro u l-effikaċja in vivo kienu jeħtieġu attività tandem immexxija minn funzjonalità Fc intatta u agoniżmu TLR biex jippermettu fagoċitosi u immunità kontra t-tumur medjata miċ-ċelluli T.Il-memorja immunoloġika medjata mill-ISAC ma kinitx limitata għal HER2, peress li ġrieden ittrattati b'ISAC kienu protetti milli jisfidaw mill-ġdid b'tumur HER2-negattiv.Dawn ir-riżultati jipprovdu raġuni qawwija għall-iżvilupp kliniku ta 'ISACs u juru li s-sinerġija bejn Fc R u TLR7/8 sinjalazzjoni tikkontribwixxi għall-mekkaniżmu ta' immunità kontra t-tumur medjata minn ISAC.

Ikklikkja hawn biex titgħallem aktar dwar Cistanche

Introduzzjoni

Qabel tmiem is-seklu 20, il-pazjenti bil-kanċer ġeneralment kellhom tliet modalitajiet ta 'trattament disponibbli: risezzjoni kirurġika, radjazzjoni u kimoterapija. L-emerġenza tal-immunoterapija tal-kanċer żiedet ir-raba 'modalità qawwija li espandiet ħafna r-repertorju tal-onkoloġija li bdiet bl-approvazzjoni ta' rituximab għal-limfoma mhux ta 'Hodgkin u testendi għall-adozzjoni mifruxa ta' inibituri tal-punti ta 'kontroll 1,2. Madankollu, kwalunkwe terapija waħda, inkluża l-immunoterapija, hija temporanjament limitata sakemm ma tiġġenerax risponsi bijoloġiċi u immunoloġiċi dejjiema li jegħlbu l-eteroġeneità tat-tumur u l-piż mutazzjonali 3-5. Inibituri tal-punti ta' kontroll bħal antikorpi anti-PD-1 u PD-L1 itejbu drastikament ir-riżultati f'diversi indikazzjonijiet, inkluż f'pazjenti b'piż għoli ta' mutazzjoni tat-tumur jew instabbiltà tal-mikrosatelliti, u determinant wieħed tas-suxxettibilità tat-tumur għall-immunoterapija tal-punt ta' kontroll huwa l-firxa ta' pre -infiltrazzjoni taċ-ċelluli T eżistenti. Pazjenti b'tumuri "kesħa" li għandhom infiltrat ta' ċelluli T skarsa huma inqas risponsivi għall-imblokk tal-punt ta' kontroll u għandhom pronjosi agħar meta mqabbla ma' pazjenti b'tumuri "sħan" fejn ċelluli T immunosoppressati reattivi għat-tumur huma preżenti fil-mikroambjent tat-tumur (TME) 6,7 . Il-bijopsija tat-tumur u l-immunoistokimika jindikaw li ċelluli professjonali li jippreżentaw l-antiġen (APCs) bħal ċelluli dendritiċi (DCs) ħafna drabi huma aktar frekwenti fi ħdan it-TME minn ċelluli T, għalkemm għadhom suxxettibbli għal mekkaniżmi immunosoppressivi 8,9. Minħabba l-preżenza ta 'ċelluli majelojdi fit-TME u r-rwol tagħhom fil-promozzjoni tal-attivazzjoni taċ-ċelluli T, kien hemm sforz dejjem akbar biex jiġu żviluppati terapiji li jattivaw APCs assoċjati mat-tumur biex iġibu immunità mifruxa taċ-ċelluli T u rispons immuni anti-tumorali effettiv.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 donaturi. (d) Rituximab ġie rreaġit b'SATA permezz ta' residwi ta' lisina biex jikkonverti amini ħielsa fi gruppi sulfhydryl protetti qabel id-deacetylation b'hydroxylamine u reazzjoni sussegwenti b'T785-MCC biex jagħti r-rituximab-ISAC. (e) Analiżi LC-MS tar-rituximab-ISAC wara t-trattament PNGase F. DAR ġie kkalkulat ibbażat fuq iż-żieda tal-massa tal-linker-agonist ta' 606 g/mol. (f) Rituximab jew rituximab-ISAC ttikkettjati b'mod fluworexxenti ġew inkubati b'ċelluli tat-tumur CD20 flimkien ma 'Toledo f'4 gradi għal sagħtejn qabel l-analiżi permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Id-dejta hija minn esperiment wieħed b'kampjuni triplikati u hija rappreżentattiva ta' 2 esperimenti.(gh) APCs majelojdi umani iżolati friski ġew ikkultivati ​​b'rituximab, T785, rituximab, u T785 jew ir-rituximab-ISAC fil-preżenza ta 'ċelluli tat-tumur CD20 flimkien ma' Toledo ttikkettjati b'CFSE bi proporzjon effettur 3:1 għall-mira. Il-konċentrazzjoni ta’ rituximab tidher fuq l-assi X bil-konċentrazzjoni ta’ T785 f’dawn l-analiżijiet tkun konsistenti mal-ammont ta’ T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 donaturi (medja u SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Issa huwa dokumentat sew li l-kunsinna lokali ta’ aġenti immunostimulatorji f’mudelli prekliniċi tista’ terġa’ tipprogramma APCs soppressi residenti tat-tumur f’ċelloli attivati ​​kapaċi jipproċessaw u jippreżentaw antiġeni assoċjati mat-tumur, inklużi neoantiġeni, għal ċelluli T li sussegwentement jimmedjaw l-immunità kontra t-tumur 10–13. . Strateġija waħda bħal din li saret pijunier minn Carmi et al wriet li l-kunsinna intratumorali ta’ antikorpi alloġeniċi li jimmiraw it-tumur b’agonist -3 tar-riċettur Toll-like (TLR) jew b’TNF u CD40L salvaw funzjonalment APCs assoċjati mat-tumur li wasslu għal assorbiment mtejjeb ta’ antiġen u induzzjoni sussegwenti ta 'immunità taċ-ċelluli T kontra t-tumur. Din l-istrateġija ta 'kombinazzjoni, li influwenzat il-funzjoni ta' l-effettitur ta 'l-antikorpi b'agonist ta' TLR, wasslet għall-eradikazzjoni ta 'tumuri primarji u leżjonijiet metastatiċi u pproteġiet lill-ospitant mir-rikorrenza tat-tumur 11,14. Bl-istess mod, antikorp agonistiku anti-OX40 flimkien ma 'agonist TLR9, CpG, APCs attivati ​​u ċelluli T fi ħdan it-tumur, li jirriżulta f'effikaċja impressjonanti kontra tipi multipli ta' tumuri fil-ġrieden 13. It-traduzzjoni effettiva ta 'strateġiji ta' attivazzjoni APC fil-klinika qed tkun investigat f'indikazzjonijiet multipli b'dejta klinika f'pazjenti b'melanoma li tissuġġerixxi li l-kunsinna intra-tumurali ta' agonisti TLR9 flimkien ma' antikorp anti-PD-1 jista' jwassal għal tnaqqis tat-tumur u risponsi aboskopali f'leżjonijiet mhux injettati 15. Bl-istess mod, bosta gruppi qed isegwu agonisti TLR7/8 għall-immunoterapija tat-tumur peress li l-mudell ta 'espressjoni ta' TLR7/8 fl-APCs tal-bniedem jirrifletti aktar mill-qrib il-mudell ta 'espressjoni ta' TLR7 u TLR9 f'APCs16-18 murini. Fl-aħħar mill-aħħar, l-adozzjoni ta 'strateġiji ta' twassil intra-tumorali, jekk effikaċi, se tkun limitata mill-aċċessibbiltà tat-tumur peress li l-kunsinna sistemika ta 'agonisti immuni li jimmiraw APCs ġiet ristretta minn tossiċità, half-lives qosra, u twassil sub-ottimali għal siti fil-mira.L-għan tagħna kien li niddisinjaw konjugat ta 'antikorpi li jistimula l-immunità (ISAC) li jinkludi antikorp monoklonali li jimmira t-tumur konjugat ma' agonist immuni bħala approċċ terapewtiku ġdid biex iqajjem immunità anti-tumur dejjiema. L-amministrazzjoni sistemika tal-ISAC qanqlet attivazzjoni lokalizzata tal-APC fit-TME li kienet dipendenti fuq Fcfunzjoni effettur u attivazzjoni TLR filwaqt li jiġu evitati tossiċitajiet tipiċi assoċjati mal-kunsinna sistemika ta 'agonisti TLR. Barra minn hekk, l-amministrazzjoni sistemika ta 'dawn il-konjugati lill-ġrieden li jġorru t-tumur ippermettiet l-ipproċessar u l-preżentazzjoni tal-antiġeni liċ-ċelloli T li jwasslu għal immunità sostnuta kontra t-tumur f'mudelli multipli li huma reżistenti għall-antikorp mhux konjugat li jimmira t-tumur.

Riżultati

Disinn u Karatterizzazzjoni ISAC Biex tkun tista' ssir konjugazzjoni ta' agonist TLR ma' antikorp, intużaw għodod ta' docking molekulari biex jiddisinjaw agonist ġdid TLR7/8 (T785) b'butyl-amine li serva bħala punt ta' twaħħil aċċessibbli għas-solvent mal-antikorp ( Figura 1A, Figura Supplimentari 1A–C). T785 ingaġġa TLR7 uman b'EC50 ta' 0.643 μM u TLR8 uman b'EC50 ta' 1.60 μM f'linji ta' ċelluli HEK293 li jesprimu flimkien NF-κB-inducible sekreted alkaline phosphatase reporter u jew TLR7 jew TLR8 (Figura 1B). ). L-ispeċifiċità ta 'T785 għal TLR7/8 ġiet ikkonfermata mill-inkapaċità ta' T785 li jinduċi attività NF-κB fiċ-ċelloli reporter HEK293 li m'għandhomx espressjoni TLR7/8 (Figura Supplimentari 2A). Biex tikkonferma l-attività agonistika fiċ-ċelloli primarji, monoċiti u DCs iżolati friski, imsejħa APCs majelojdi (~ 96 fil-mija monoċiti, 4 fil-mija DC; Figura Supplimentari 3A), li jesprimu kemm TLR7 kif ukoll TLR8, ġew stimulati matul il-lejl b'1 μM T785 jew R848, a agonist TLR7/8 stabbilit sew u kkaratterizzat 19. T785 u R848 stimulaw APCs majelojdi b'mod simili (Figura 1C) 20,21. L-attività ta 'T785 ġiet ikkonfermata wkoll f'DCs plasmacytoid tal-bniedem iżolati friski (pDCs), li jesprimu TLR7 iżda mhux TLR8 (Figura Supplimentari 2B). Biex jiġu investigati l-effetti tal-ISACs f'kulturi umani in vitro, ISAC ġie ġġenerat b'rituximab (Figura 1D), antikorp monoklonali anti-CD20 klinikament validat użat għat-trattament ta' tumuri malinni taċ-ċelluli B, permezz ta' konjugazzjoni ma' T785 f'reazzjoni f'diversi stadji. b'crosslinkers eterobifunzjonali kompatibbli 22. L-effiċjenza tal-konjugazzjoni T785-ISAC ġiet imkejla b'LC-MS wara deglycosylation ma PNGase F, li rriżultat f'proporzjon medju tad-droga għal antikorp (DAR) ta' 1.71 (Figura 1E). Aħna kkonfermajna li l-ISAC żamm rabta komparabbli ma' CD20 wara esperimenti ta' ċitometrija tal-fluss bis-CD20- li tesprimi l-linja taċ-ċelluli tat-tumur ta' Toledo, linja taċ-ċelluli kkaratterizzata tajjeb derivata minn pazjent b'limfoma mifruxa ta' ċelluli kbar (Figura 1F) 23. T 785-ISAC li jorbot mar-riċetturi Fc umani (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) ġie vvalutat minn Biacore u kien komparabbli ma' rituximab (Tabella Supplimentari 1).ISACs jattivaw APCs majelojdi umani Il-potenzjal immunostimulatorju tar-rituximab T{{777 }}ISAC ġie vvalutat wara kokultura ta' APCs majelojdi umani iżolati friski b'CD20 ittikkettati b'CFSE flimkien ma' ċelluli tat-tumur Toledo għal 18-il siegħa. APCs majelojdi kkultivati ​​b'rituximab T785-ISAC għaddew minn bidliet morfoloġiċi rapidi konsistenti mal-morfoloġija tad-DCs, filwaqt li l-morfoloġija tad-DC ma kinitx osservati f'kokulturi inkubati b'rituximab, T785 jew taħlita ekwimolari ta' rituximab, u T785 (Figura 1G). APCs stimulati b'rituximab T785-ISAC baqgħu vijabbli u dendritiċi fil-morfoloġija sa tmint ijiem filwaqt li APCs stimulati bit-taħlita kienu l-aktar mhux vijabbli sat-tmien jum (Figura 1H). Analiżi multicolor taċ-ċitometrija tal-flusswara 18-il siegħa indikaw li APCs stimulati b'rituximab T785-ISAC irregolaw 'l isfel CD14 u CD16 u fl-istess ħin irregolaw 'l fuq CD123, markatur tal-wiċċ taċ-ċelluli muri litkun regolata 'l fuq fuq DCs majelojdi attivati ​​24. Bil-maqlub, APCs stimulati b'rituximab,T785 jew it-taħlita ma modulawx l-espressjoni ta 'dawn il-markaturi (Figura 1I, Figura Supplimentari 4A, strateġija ta' gating deskritta f'Figuri Supplimentari 3BC).

APCs umani stimulati b'rituximab T785-ISAC irregolaw ukoll molekula costimulatory CD86 b'mod dipendenti mid-doża, b'xejriet simili osservati b'regolazzjoni 'l fuq ta' CD40 u HLA-DR konsistenti mal-fenotip ta' APCs attivati ​​(Figura 1I & Figura Supplimentari 4B). Bidliet dipendenti mid-doża fl-espressjoni tal-markatur tal-wiċċ kienu konsistenti kemm jekk evalwati bħala intensità medjana tal-fluworexxenza (MFI, Figura 1) jew bħala l-perċentwali tal-popolazzjoni totali ta 'ċelluli li hija pożittiva għall-markatur rispettiv (Figura 5 Supplimentari). Analiżi sussegwenti ta 'supernatanti mingħajr ċelluli wriet li APCs stimulati minn rituximab T785-ISAC ħarġu kwantitajiet ogħla ta' TNF u IL-1 (Figura 2J u Figura Supplimentari 4C). Il-potenzjal immunostimulatorju ta' T785-ISACs ma kienx ristrett għal rituximab, peress li T{785-ISAC iġġenerat bit-trastuzumab wassal ukoll għal attivazzjoni majelojde msaħħa (Figura 4D Supplimentari). Il-kapaċità ta 'APCs ​​stimulati mill-ISAC li jqanqlu preżentazzjoni ta' antiġen u cross-priming ta 'ċelluli CD8 flimkien ma' T ġiet evalwata bl-użu tas-sistema ta 'antiġen mudell ovalbumin (OVA) 25,26. Splenic CD11c flimkien ma 'DCs iżolati minn ġrieden wildtype ġew ikkultivati ​​matul il-lejl b'kumplessi immuni ffurmati b'OVA u jew l-antikorp anti-OVA jew ISAC. DCs mgħobbija bl-OVA ġew ikkwantifikati u inkubati b'ċelluli OT-I CD8 flimkien ma 'T li għandhom speċifiċità TCR għall-peptide OVA, SIINFEKL, ikkumplimentat ma' MHC-I. Preżentazzjoni inkroċjata mtejba medjata minn ISAC kontra l-OVA, kif imkejjel mill-ammont ta 'MHC-I, peptide SIINFEKL marbut, u cross-priming imtejjeb kif imkejjel minn CD8 flimkien ma' proliferazzjoni taċ-ċelluli T (Figuri Supplimentari 6A & 6B).ISACs iġibu TLR amplifikati u sinjalazzjoni intraċellulari assoċjata ma 'Fc R f'APCs ​​majelojdi umani L-attivazzjoni ta' Fc Rs u TLRs tinduċi kaskata ta 'sinjalazzjoni fosfo kumplessa, u l-kobor u l-karatteristiċi ta' dawn ir-risponsi huma differenti fost diversi sottogruppi ta 'ċelluli immuni 27. Investigajna l-mogħdijiet ta' sinjalazzjoni intraċellulari downstream involuti f'diversi tipi ta’ ċelluli fi ħdan kokulturi PBMC-tumur stimulati bir-rituximab T785-ISAC meta mqabbla ma’ kontrolli ta’ taħlita ekwimolari bl-użu ta’ ċitometrija tal-massa (CyTOF) 28. Sottogruppi ta’ lewkoċiti (jiġifieri monoċiti, ċelluli CD4 flimkien ma’ T) ġew identifikati permezz ta’ clustering SPADE bl-użu ta’ markaturi ta’ nisel b'ċelluli fil-mira li jinkludu kemm ċelluli tat-tumur CD20 flimkien ma' Toledo kif ukoll ċelluli B b'saħħithom 29. Avvenimenti ta' fosforilazzjoni assoċjati ma' sinjalazzjoni TLR (pIRF7) u Fc R (pERK1/2) żdiedu 15-il minuta wara l-istimulazzjoni bit-T785-ISAC f'monoċiti u cDCs, meta mqabbla mat-taħlita tal-komponenti individwali 30,31. Is-sinjalar intraċellulari kien fil-biċċa l-kbira ristrett għal ċelloli ta’ oriġini majelojde (monoċiti u cDCs) kif ukoll pDCs, likollha jesprimu l-Fc Rs u TLR7 u/jew TLR8 meħtieġa. Fil-monoċiti u s-cDCs, l-istimulazzjoni indotta mill-ISAC rriżultat ukoll f'fosforilazzjoni ogħla b'mod sinifikanti ta 'MAPKAPK2, p38, CREB, u proteina ribosomal S6 (RPS6), rekwiżit biex tinbeda sinteżi ta' proteini downstream (Figura 2A-C & Figura Supplimentari 7A). CD141 flimkien ma’ cDCs u CD1c flimkien ma’ cDCs wrew livelli komparabbli ta’ pIRF7 fiż-żewġ sottogruppi ta’ CDC, filwaqt li l-livelli ta’ RPS6 u pERK1/2 kellhom xejra ogħla f’CD141 flimkien ma’ cDCs, li jisbqu f’CD8 plus T cell priming u preżentazzjoni inkroċjata tal-antiġeni, meta mqabbla ma’ CD1c flimkien ma' cDCs (Figura 7B Supplimentari).

Il-kinetika tal-istimulazzjoni T785-ISAC kienet konsistenti mad-dinamika tas-sinjalar mistennija: il-fosforilazzjoni ERK1/2 laħqet il-quċċata wara 5 minuti, filwaqt li l-partner downstream tagħha RPS6 ma laħaqx l-ogħla fosforilazzjoni sal-punt tal-ħin tal-15-minuta (Supplimentari Figura 7C). Din il-kinetika tappoġġja d-dinamika mistennija hekk kif is-sinjalar jippropaga maż-żmien, u jissuġġerixxi li hemm rispons ta 'sinjalazzjoni sostnut u amplifikat għall-istimulazzjoni tal-ISAC tal-APCs. Minħabba r-rispons amplifikat osservat wara l-istimulazzjoni ISAC assoċjata mal-mogħdijiet tas-sinjalar Fc R u TLR, imbagħad użajna l-Algoritmi ta’ Viżwalizzazzjoni Rescaled ta’ Densità Reċiproka (DREMI) u d-Density Rescaled Viżwalizzazzjoni kondizzjonali (DREVI) biex tikkwantifika s-saħħa ta’ relazzjonijiet f’pari fi ħdan il-mogħdijiet tas-sinjalar Fc R u TLR 32. Dawn l-algoritmi jiġġeneraw plots DREVI għall-viżwalizzazzjoni, fejn iż-żona taħt il-kurva (AUC) hija indikatur tal-intensità tas-sinjal ġenerali, il-punt tal-inflessjoni (IP) huwa kejl tal-limitu tal-attivazzjoni, u l- Il-punteġġ DREMI jikkwantifika d-dipendenza f'pari taż-żewġ fosfoproteini inkwistjoni. Din l-analiżi identifikat punteġġi DREMI miżjuda li jindikaw dipendenza mtejba f'pari bejn proteini assoċjati ma' mogħdijiet ta' sinjalazzjoni Fc R u TLR wara stimulazzjoni T785-ISAC meta mqabbla mal-kontrolli tat-taħlita ekwimolari (Figura 2D). Interdipendenza qawwija bejn pERK1/2 u pIRF7 ġiet osservata b'mod uniku wara stimulazzjoni b'T785-ISAC, iżda mhux taħlita, kif indikat minn punteġġ DREMI miżjud, intensità tas-sinjal amplifikata, u limitu ta' attivazzjoni mnaqqas meħtieġ għall-fosforilazzjoni IRF7 (Figura 2D ). Din l-analiżi indikat ukoll limitu ta' attivazzjoni mnaqqas meħtieġ biex tinbeda t-traduzzjoni tal-proteini (fosforilazzjoni RPS6) wara stimulazzjoni ISAC kif ikkwantifikat minn punteġġi DREMI miżjuda u IPs imnaqqsa għall-kombinazzjonijiet f'pari ta' pERK1/2-pRPS6 u pIRF7-pRPS6 . Barra minn hekk, il-livell ta 'fosforilazzjoni RPS6 ġie amplifikat bħala riżultat ta' fosforilazzjoni ERK1/2 jew IRF7 kif determinat minn AUCs pairwise miżjuda (Figura 2D). Dawn ir-riżultati magħquda mhux biss jikkonfermaw is-sinjalar tal-ISAC permezz tal-mogħdijiet mistennija Fc R u TLR iżda barra minn hekk, jappoġġjaw sinerġija bejn iż-żewġ mogħdijiet li jirriżultaw f'limiti ta 'attivazzjoni mnaqqsa u intensitajiet tas-sinjali amplifikati.

Figura 3: ISACs jeħtieġu funzjoni effettur Fc u agonist TLR biex jimmedjaw l-attivazzjoni majelojde. APCs majelojdi umani iżolati friski ġew ikkultivati ​​għal 18-il siegħa fil-preżenza ta 'ċelluli tat-tumur CD20 flimkien ma' Toledo fi proporzjon effettur 3:1 għal mira u (a) 80 nM tar-rituximab-ISAC bi jew mingħajr 1 μM R406, (b) rituximab-ISACs fuq l-iżotip tal-antikorp indikat, (c) rituximab-ISAC jew rituximab-ISAC deglycosylated (ISAC-deglycosylated). (ac) Iċ-ċelloli ġew analizzati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss u d-dejta hija rrappurtata bħala intensità medjana tal-fluworexxenza. (d) Ċelloli reporter HEK-Blue-TLR7 jew TLR8 ġew ikkultivati ​​għal 18-il siegħa fil-preżenza ta 'T785 jew TLRnull qabel il-valutazzjoni tal-attività SEAP indotta minn NF-κB. Data murija humaminn esperiment 1 u rappreżentattiv ta' mill-inqas 3 esperimenti. (e) APCs majelojdi umani iżolati friski ġew ikkultivati ​​għal 18-il siegħa fil-preżenza ta 'ċelluli tat-tumur CD20 flimkien ma' Toledo u r-rituximab-ISACs indikati u analizzati b'ċitometrija tal-fluss (dejta murija bħala medjanintensità tal-fluworexxenza). (ae) Id-dejta murija hija rappreżentattiva ta' 1-4 esperimenti addizzjonali u Akbar minn jew ugwali għal 3 donaturi għal kull esperiment (medja u SEM). Is-sinifikat statistiku huwa definit bħala *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISACs jeħtieġu funzjoni effettur Fc biex jimmedjaw l-attivazzjoni ta 'APCs ​​majelojdi. Il-kontribut ta' l-attività Fc għall-funzjoni ISAC ġie investigat wara l-ablazzjoni ta 'sinjalar Fc R downstream b'R406, inibitur ta' molekula kinase żgħira ta 'Syk li jipprevjeni t-trasduzzjoni tas-sinjali downstream ta' Fc Rs attivanti 33,34 . Iż-żieda ta' R406 abrogat l-attivazzjoni majelojde medjata minn T785-ISAC kif muri min-nuqqas ta' regolazzjoni 'l fuq tal-molekula costimulatory CD86 iżda ma bidlitx ir-rispons ċellulari għall-attivazzjoni ta' TLR7/8 minn T785 (Figura 3A & Figura Supplimentari 8). L-inibizzjoni ta' Syk b'R406 ħassar ukoll is-sinjalar fil-monoċiti wara stimulazzjoni T785-ISAC, bilivelli mnaqqsa b'mod sinifikanti ta 'MAPKAPK fosforilati-2, ERK1/2, u IRF7 imkejla (Figura Supplimentari 7D).Minħabba din id-dejta, rituximab T785-ISACs ġew ifformulati b'DARs komparabbli fuq kull wieħed mill-erba' iżotipi li jseħħu b'mod naturali biex jiddefinixxu sa liema punt l-attività T{785-ISAC tvarja b'affinitajiet magħrufa ta' rbit ta' Fc R 35,36. ISACs ta' rituximab aglycosylated u fucosylated ġew investigati wkoll, peress li glycosylation jaqla' l-irbit ta' Fc R filwaqt li fucosylation iżżid l-affinità ta' rbit għal FCGR3A 37. Il-kapaċità immunostimulatorja tar-rituximab T785-ISAC kienet korrelatata mal-affinità Fc R tal-isotip tal-antikorp (Figura 37). 3B). Bil-maqlub, l-IgG1 fucosylated (IgG1-AF), wildtype IgG1, u IgG3 T785-ISACs qanqlu attivazzjoni majelojde, bl-IgG1-AF T{785-ISAC jinduċi l-ogħla livelli ta' CD86 upregulation (Figura 3B). Deglycosylation tar-rituximab wildtype T785-ISAC ma PNGase F, li jnaqqas l-affinità tal-irbit Fc-Fc R irriżulta f'attività stimulatorja immuni ISAC imnaqqsa in vitro, li tappoġġja l-importanza ta 'reġjun Fc funzjonalment attiv (Figura 3C).

ISACs jeħtieġu agoniżmu TLR biex jimmedjaw l-attivazzjoni majelojde Il-kontribut tal-attività TLR fuq il-funzjoni ISAC ġie investigat wara l-ablazzjoni tal-agoniżmu TLR billi tneħħi l-2-amino pyridine minn T785 li huwa maħsub li jifforma pont tal-melħ b'residwi kritiċi ta' aspartate fit-twaħħil bwiet ta' TLR7 u TLR8 38 (TLRnull, Figura 3D). Il-kompost TLRnull kien konjugat ma' rituximab (TLRnull ISAC) u ġie vvalutat għall-potenzjal ta' attivazzjoni majelojde fil-preżenza ta' ċelluli tat-tumur CD20 flimkien ma' in vitro. It-TLRnull ISAC ma induċiex regolazzjoni 'l fuq tal-molekula costimulatory CD86 jew immodula l-espressjoni ta' CD14 jew CD123, li jindika li l-agoniżmu TLR huwa meħtieġ għall-fenotip ta 'attivazzjoni osservat b'T785-ISACs (Figura 3E). Barra minn hekk, it-TLRnull ISAC ma induċiex fosforilazzjoni ta' IRF-7 fil-monoċiti, konsistenti mal-inabbiltà tiegħu li jingaġġa TLR7/8 (Figura Supplimentari 7E). Trastuzumab T785-ISAC amministrat b'mod sistematiku jelimina t-tumuri fin-nuqqas ta' Attività taċ-ċelluli B, T, jew NK f'mudelli ta 'tumur xenograft uman Il-kapaċità ta' ISACs li jinduċu qerda medjata minn majelojdi u newtrofili ta 'tumuri solidi fin-nuqqas ta' attività taċ-ċelluli B, T u NK ġiet evalwata bl-użu ta 'mudelli ta' xenograft uman 39,40. Trastuzumab, antikorp li jimmira HER2-klinikament validat, intgħażel għall-investigazzjoni biex jiġi determinat jekk it-trastuzumab T785-ISAC jistax jegħleb ir-reżistenza tat-tumur għal trastuzumab f'mudelli ta' HER2 flimkien ma' tumuri solidi (Figura 4 u Figura 9 Supplimentari ) 41,42. L-ewwel, l-amministrazzjoni sistemika ta' trastuzumab T785-ISAC tqabbel mal-kunsinna intra-tumorali ta' taħlita ta' trastuzumab u T785. It-trastuzumab T785-ISAC ipprovoka rigressjoni u tneħħija tat-tumur filwaqt li l-għoti ta' taħlita ekwimolari ta' komponenti pprovda benefiċċju terapewtiku minimu meta mqabbel ma' trastuzumab waħdu (Figura 4A). Studji sussegwenti li jqabblu l-ISACs immirati għat-tumur mal-kontrolli tal-isotip xierqa tagħhom ikkonfermaw li l-attività kontra t-tumur kienet teħtieġ it-tumur fil-mira (Figura 4B u Figura Supplimentari 10). Importanti, l-amministrazzjoni sistemika tat-trastuzumab T785- ISAC u l-kontroll tal-isotip tiegħu kienu ttollerati tajjeb, b'impatt minimu fuq il-piż tal-ġisem (Figura Supplimentari 11).Biex jiġi ddeterminat jekk il-mekkaniżmu ta’ azzjoni li jikkontribwixxi għall-effikaċja tal-ISAC in vivo huwiex simili għal dak deskritt in vitro, Fc-inkompetenti (trastuzumab N297A-ISAC) u trastuzumab TLRnull-ISAC ġew ittestjati fl-istess mudell ta’ xenograft tat-tumur tas-sider f’parallel ma' trastuzumab wildtype T785-ISAC.Filwaqt li t-trastuzumab T785-ISAC wassal għal rigressjoni u tneħħija tat-tumur, kemm l-ISACs Fc-inkompetenti kif ukoll it-TLRnull naqsu milli jqanqlu attività kontra t-tumur (Figura 4C).Flimkien din id-dejta tindika rekwiżit għall-immirar tat-tumur u kemm l-ingaġġ tal-Fc R kif ukoll tat-TLR għall-attività ISAC kontra t-tumur.

Il-kontribut differenzjali tan-newtrofili kontra ċelluli majelojdi oħra fil-medjazzjoni tal-effetti kontra t-tumur ġie vvalutat minn tnaqqis speċifiku għaċ-ċelluli.In-newtrofili tnaqqsu bl-użu ta' antikorp Ly6G, filwaqt li tnaqqsu kemm in-newtrofili kif ukoll l-APCs immaturi (monoċiti)inkiseb b'antikorp anti-Gr1.Iċ-ċelloli fagoċitiċi ġew eżawriti bl-użu ta' liposomi mgħobbija b'clodronate.Sibna li ċ-ċelloli fagoċitiċi, preżumibbilment makrofaġi, ikkontribwew b'mod sinifikanti għall-medjazzjoni tal-attività kontra t-tumur wara t-trattament ISAC (Figura 4D).Madankollu, it-tnaqqis tan-newtrofili b'anti-Ly6G ma kellu l-ebda impatt fuq l-effikaċja tal-ISAC.It-tnaqqis ta 'Gr1 ma kellux impatt immedjatament fuq l-effikaċja medjata mill-ISAC iżda naqqas it-tul tal-kontroll tat-tumur (Figura 4D).Biex jistħarrġu l-abbiltà tat-T785-ISACs biex jikkontrollaw it-tkabbir tat-tumur f'mudelli b'inqasL-espressjoni HER2, immudellajna l-effikaċja fil-mudell tat-tumur li jesprimi HER2-medju reżistenti għat-trastuzumab, JIMT-1.Il-linja taċ-ċelluli tal-kanċer JIMT-1 hija stmata li għandha madwar 6.5 x105 kopji tal-wiċċ HER2 u tesprimi livell imnaqqas ta'HER2 meta mqabbel mal-linja taċ-ċelluli tat-tumur HCC1954 permezz taċ-ċitometrija tal-fluss 43.Filwaqt li l-trastuzumab T785-ISAC naqas b'mod sinifikanti t-tkabbir tat-tumur meta mqabbel mal-isotip ISAC jew kontrolli ta' trastuzumab, ma ġiet osservata l-ebda rigressjoni jew tneħħija tat-tumur (Figura 4E).Aħna ipoteżijna li pertuzumab, li jorbot epitope HER2 distint mis-sit ta' rbit ta' trastuzumab, iżid l-Fc-clustering, u sussegwentement itejjeb l-ADCP u l-effikaċja tal-ISAC fil-mudell JIMT-1.Il-kombinazzjoni tat-trastuzumab T785-ISAC ma' pertuzumab wasslet għal effikaċja mtejba b'mod sinifikanti u rigressjoni sinifikanti tat-tumur (Figura 4F).Mingħajr l-istimulazzjoni immuni tat-trastuzumab T785-ISAC, il-kombinazzjoni ta' pertuzumab ma' trastuzumab ma pprovdiet l-ebda benefiċċju.

Imbagħad investigajna l-avvenimenti molekulari u ċellulari skattati minn trastuzumab T785-ISAC li fl-aħħar mill-aħħar jirriżultaw f'effikaċja kontra t-tumur.Bidliet bikrija fl-espressjoni tal-ġeni fit-tumuriġew imkejla bil-panel ta 'profiling immuni NanoString ġurdien pan-kanċer, li jiżvela upregulation sinifikanti ta' 13.7 fil-mija tal-ġeni fi żmien 24 siegħa ta 'trattament inklużi ġeni assoċjati ma' sinjalazzjoni TLR7 u attivazzjoni (IRF -7, ġeni assoċjati NF-kB)meta mqabbel ma' 0-0.1 fil-mija wara t-trattament b'trastuzumab jew isotip T785-ISAC (Figura 4G) 44.Analiżi tal-mogħdijiet tal-espressjoni tal-ġeni evalwati minn nSolver Advanced Analysis Pathway Score żvelat upregulation sinifikanti tal-firem ewlenin tal-ġeni relatati mal-immunità (Funzjonijiet Macrophage, Funzjonijiet DC, Ipproċessar u Preżentazzjoni tal-Antiġeni) li kienukonsistenti mas-sejbiet in vitro u in vivo li l-interazzjonijiet Fc-Fc R huma kritiċi għall-attività medjata mill-ISAC (Figura 4H u Figura Supplimentari 12).Il-punteġġi tal-firma tal-ġeni assoċjati ma' kimokini u ċitokini kienu elevati ħafna wara trattament ta' trastuzumab T785-ISAC, konsistenti mal-kwantifikazzjoni tal-proteina mwettqa billi tkejjel is-sekrezzjoni taċ-ċitokini u l-kimokini fit-tumur 24 siegħa wara l-għoti (Figura 4Hu Figura Supplimentari 13).Dawn is-sejbiet, f'kongruwenza mad-dejta tal-effikaċja in vitro u in vivo, jindikaw rispons robust medjat minn TLR u Fc R huwa indott mill-ISAC.

Iċ-ċitometrija tal-fluss u l-IHC intużaw biex jevalwaw jekk iż-żieda fl-attivazzjoni medjata minn T785-ISAC u l-espressjoni tal-chemokine fl-aħħar wasslux għar-reklutaġġ ta' ċelluli effettur immuni.L-infiltrati immuni majelojdi ġew profilati permezz ta' ċitometrija tal-fluss 24 siegħa u 7 ijiem wara l-għoti ta' doża waħda ta' trastuzumab T785-ISAC jew trastuzumab u mqabbla ma' kontrolli mhux ittrattati.Analiżi tat-tumuri 24 siegħa wara t-trattament żvelatinfiltrazzjoni ta’ CD11b flimkien ma’ Ly6C flimkien ma’ monoċiti u CD11b flimkien ma’ Ly6G flimkien ma’ granuloċiti fit-tumuri kkurati b’trastuzumab jew trastuzumab T785-ISAC meta mqabbla mal-kontrolli mhux ittrattati (Figura 4I).Sebat ijiem wara t-trattament, CD11b flimkien ma' CD11c flimkien ma' F4/80 flimkien ma' APCs majelojdi pożittivi żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp ittrattat b'trastuzumab T785-ISAC meta mqabbel ma'trastuzumab jew kontrolli mhux ittrattati (Figura 4I) 45,46.Din iż-żieda fl-APCs majelojdi tista 'tkunattribwit għaż-żieda sinifikanti fil-produzzjoni ta' kimokini relatati mal-majojdi wara t-trattament ta' trastuzumab T785-ISAC.Filwaqt li ma kienx hemm żieda sinifikanti fil-frekwenza tal-APCs majelojdi fil-{0}}siegħa ħin, iċ-ċelloli ta' dan il-fenotip ġew attivati ​​wara t-trattament ta' trastuzumab T785-ISAC, kif imkejjel permezz ta' regolazzjoni 'l fuq ta' CD40 fuq il-wiċċ taċ-ċellula , meta mqabbel mal-istess popolazzjoni minn trastuzumab jew kontrolli mhux ittrattati (Figura 4I).Din is-sejba, flimkien mad-dejta NanoString, turi aktar l-abbiltà tat-trastuzumab T785-ISAC li jimpenja u jattiva ċ-ċelloli majelojdi fil-mikroambjent tat-tumur.Minħabba l-pożittività CD11b tal-APCs majelojdi osservata ġimgħa wara t-trattament, l-infiltrat bikri tal-monoċiti jista 'jkun prekursuri għall-popolazzjoni tal-APCs majelojdi li timmatura fit-tumuri kkurati b'ISAC iżda mhux f'tumuri kkurati b'trastuzumab.Madankollu, għad irid jiġi ddeterminat kif l-avvenimenti pro-infjammatorji prossimali mkejla 24 siegħa wara l-istimulazzjoni tal-ISAC minn NanoString u MSD fl-aħħar mill-aħħar influwenzaw avvenimenti distali bħall-maturazzjoni taċ-ċelluli majelojdi fil-mikroambjent tat-tumur li qed jittrasforma fil-punt tal-ħin tal-ġurnata aktar tard 6- , u fl-aħħar mill-aħħar, influwenzat ir-rigressjoni u t-tneħħija tat-tumur.
Fl-aħħarnett, l-IHC twettqet biex tevalwa l-preżenza u l-post ta' popolazzjonijiet ewlenin ta' ċelluli immuni fit-tumur wara t-trattament bit-trastuzumab T785-ISAC meta mqabbel mal-kontrolli tiegħu.Konsistenti maċ-ċitometrija tal-fluss tal-jum 7, ċelluli li jesprimu F4/80it-tumur u r-reġjun peritumorali kienu elevati f'jum 9 wara trattament wieħed b'trastuzumab T785-ISAC (Figura 4J).Barra minn hekk, trattament ISAC immirat irriżulta f'żieda drammatika fiċ-ċelloli CD11c plus fir-reġjun peritumorali li ma dehritx wara trattament ta 'antikorpi rHER2 jew trattament b'isotip jew isotip-ISAC (Figura 4J).L-elevazzjoni fiċ-ċelluli CD11c plus biċ-ċitometrija tal-fluss u l-IHC kienet ukoll evidenzjata fid-dejta NanoString, li fiha l-espressjoni tal-mRNA ta 'ITGAX kienet elevata b'mod sinifikanti fil-ġranet 6 u 9 wara l-amministrazzjoni ta' trastuzumab T785-ISAC (Figura 14 Supplimentari).

Figura 5: T785-ISACs iġibu effetti robusti kontra t-tumur fil-mudell tat-tumur syngeneic MMC. (ah) Ġrieden FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) ġew impjantati bil-linja taċ-ċelluli tat-tumur MMC. (a) Ġrieden nisa ġew randomised meta l-volum tat-tumur laħaq madwar 500 mm3. Ġrieden imbagħad ġew ittrattati permezz ta' injezzjoni intraperitoneali b'5 mg/kg q5d x 2 ta' antikorp HER2 tal-ġrieden kontra l-firien, HER2 T785-ISAC tal-ġrieden kontra l-firien, jew iżotip T785-ISAC (TA99) (n =4-7 ġrieden għal kull driegħ). (b, c) Ġrieden maskili ġew randomised meta l-volum tat-tumur laħaq madwar 500 mm3 u kien ittrattat minn qabel li jibda ġurnata qabel id-data tat-trattament inizjali b'liposomi ta' kontroll mgħobbija b'clodronate jew ta 'kontroll għat-tnaqqis tal-fagoċiti (6 ċikli, sa Jum 15) jew kontra -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 jum wara l-aħħar trattament tagħhom ġew ikkontestati bil-linja taċ-ċelluli tat-tumur MMC. Ġrieden naïve tat-tumur servew bħala kontrolli tal-impjantazzjoni (n=5 ġrieden għal kull grupp). (ad) Id-dejta hija rappreżentattiva ta' mill-inqas 2 esperimenti. Ġrieden ġew ewtanizzati b'mod uman darba tumurilaħaq 2,000 mm3. Id-dejta tintwera għal dawk il-gruppi li fihom ma kien laħaq l-ebda tumuri2,000 mm3. (ei) Koorti ta' ġrieden ġew randomised meta l-volumi tat-tumur tat-tumuri MMC laħqu madwar 500 mm3 u ttrattati b'5 mg/kg ISAC jew antikorpi ta' kontroll iddożati f'jum 0 u jum 5. Tumuri ġew ipproċessati għall-kejl taċ-ċitokini b'MSD , analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss, kwantifikazzjoni tal-mRNA NanoString, jew iffissat bil-formalina u inkorporat fil-paraffin għalimmunoistokimika fil-ħinijiet murija. (e) Il-plots tal-vulkan juru bidla log2 darbiet tal-espressjoni tal-ġeni f'tumuri ta' kontroll ittrattati vs isotip imkejla minn NanoString f'24 siegħa (n=5 ġrieden għal kull grupp). Bidliet b'valur p aġġustat ta' < 0.05="" huma="" murija="" bl-aħmar.="" (f)="" punteġġi="" tal-firma="" tal-ġeni="" kkwantifikati="" b'nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" għal="" tumuri="" analizzati="" 24="" siegħa="" wara="" t-trattament="" (n="5" ġrieden="" għal="" kull="" grupp).="" (g,="" h)="" analiżi="" taċ-ċitometrija="" tal-fluss="" tal-kompożizzjoni="" ċellulari="" tat-tumuri="" u="" l-istat="" ta="" 'attivazzjoni="" 24="" siegħa="" u="" 6="" ijiem="" wara="" l-bidu="" tat-trattament="" (n="4" ġrieden="" għal="" kull="" grupp).="" id-dejta="" hija="" rappreżentattiva="" ta'="" mill-inqas="" 2="" esperimenti.="">Immaġini rappreżentattivi kif ukoll kwantifikazzjoni ta 'F4/80, CD11c, u CD8 IHC ta' tumuri maħsuda 6 ijiem wara kull trattament indikat. Il-vireg tal-iskala huma 50 μm. (ai) Id-dejta hija rrappurtata bħala medja u SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

T785-ISACs immirati għat-tumur iġibu rigressjoni tat-tumur fil-mudell tat-tumur MMC sinġeniku
Biex nivvalutaw il-kapaċità tal-ISACs li jimmedjaw l-effikaċja kontra t-tumur fil-preżenza ta’ ċelluli B, T u NK, użajna linja taċ-ċelluli tal-karċinoma mammarja tal-ġurdien (MMC) li tesprimi HER2 (rHER2) tal-firien sinġeniċi li kienet derivata minn mammarja spontanja. karċinoma fil-ġrieden rHER2- li jesprimu FVB.Biex tiġi minimizzata l-immunoġeniċità bejn l-ispeċi assoċjata mal-espressjoni ta’ rHER2 f’MMC, ġrieden transġeniċi li jesprimu l-far Her2 b’mod endoġenu taħt il-kontrolltal-promotur MMTV intużaw bħala l-ospitanti (Figura Supplimentari 15) 47. Billi ntrabtu l-preżenza ta 'sistema immuni kompletament intatta, aħna immiraw li nivvalutaw il-kapaċità tal-ISAC biex jiġġieldu tumuri b'piż kbir ta' tumuri ta '500 mm3, peress li tumuri akbar huma ġeneralment aktar diffiċli biex tiġi ttrattata f'mudelli pre-kliniċi 48. L-amministrazzjoni sistemika tat-trattamenti kollha, inkluż ir-rHER2 T785-ISAC, kienet ittollerata tajjeb, b'impatt minimu fuq il-piż tal-ġisem (Figura Supplimentari 16A). Ir-rHER2 T785-ISAC biss, madankollu, kien kapaċi jfejjaq ġrieden li jġorru tumuri kbar u stabbiliti (Figura 5A). Kif deher fil-mudell tal-xenograft, studji ta 'tnaqqis taċ-ċelluli wrew li attività sinifikanti kontra t-tumur intilfet meta ċ-ċelloli fagoċitiċi kienu eżawriti b'liposomi mgħobbija bil-clodronate (Figura 5B). Filwaqt li l-ISAC mhux mistenni jaġixxi direttament fuq iċ-ċelluli T, ġrieden ittrattati minn qabel b'antikorp li jbattu CD8-tilfu l-abbiltà li jneħħu t-tumuri wara żewġ amministrazzjonijiet ta' rHER2 T785-ISAC (Figura 5C). Dan jissuġġerixxi ISACs immirati għat-tumur jistgħu jaġixxu indirettament permezz taċ-ċelluli T, wara l-preżentazzjoni ta 'antiġeni assoċjati mat-tumur. Konsistenti mal-preżenza ta 'memorja immunoloġika, ġriedenimfejqa minn tumuri MMC wara trattament rHER2 T 785-ISAC kienu protetti kontra sfida mill-ġdid tat-tumur (Figura 5D).

Biex tkompli tesplora l-mekkaniżmu sottostanti l-effikaċja ISAC fil-mudell syngeneic, imbagħad investigajna l-bidliet ċellulari, traskrizzjoni, u cytokine fil-mikroambjent tat-tumur wara dożaġġ ISAC. Żewġ koorti ta' ġrieden li kellhom tumuri MMC kbar ġew ittrattati b'rHER2 T785-ISAC jew kontrolli. Tumuri mill-ewwel koorti nħasdu 24 siegħa wara d-dożaġġ (Jum 1) meta t-tumuri kollha kienu ta 'daqs simili (Figura Supplimentari 16B). Il-koorti l-oħra ngħatat it-tieni doża 5 ijiem wara l-ewwel, imbagħad maħsuda 24 siegħa wara (Jum 6), f'liema punt it-tumuri fil-gruppi ta' trattament kollha kibru b'mod miżurabbli ħlief dawk ittrattati b'T785-ISAC (Figura Supplimentari 16B ). It-tumuri ġew analizzati permezz ta 'IHC, espressjoni ta' mRNA, u sekrezzjoni ta 'ċitokini f'lisati ta' proteini. Aktar appoġġ għall-osservazzjonijiet tagħna fil-mudelli tal-xenograft li l-immirar tat-tumur huwa meħtieġ għall-attività ISAC, l-analiżi tal-mRNA tat-tumuri 24 siegħa wara t-trattament rHER2 T785-ISAC wriet upregulation drammatika ta '34.1 fil-mija tal-ġeni fl-immuni tal-ġrieden NanoString pan-kanċer. panel ta' profiling meta mqabbel ma' tumuri ittrattati b'isotip. L-antikorp anti-rHER2 waħdu kellu biss impatt żgħir fuq l-espressjoni tal-ġeni (3.5 fil-mija tal-ġeni analizzati) filwaqt li l-isotip T785-ISAC mhux immirat ma affettwax l-espressjoni tal-ġeni (Figura 5E). Kif jidher fil-mudell tal-ksenograft HCC1954, il-ġeni assoċjati ma 'sinjalazzjoni u attivazzjoni medjata minn TLR7-kienu rregolati b'mod sinifikanti mill-rHER2 T785-ISAC li jimmiraw it-tumur, indikattiv ta' rispons robust medjat minn TLR (Figura 5E). L-analiżi tal-mogħdija tal-espressjoni tal-ġeni għal darb'oħra żvelat upregulation sinifikanti tal-firem tal-ġeni ewlenin relatati mal-immunità, inklużi firem għall-analiżi tal-mogħdija tal-espressjoni tal-ġeni, żvelat upregulation sinifikanti tal-firem tal-ġeni ewlenin relatati mal-immunità wara t-trattament rHER2 T785-ISAC, inklużi dawk assoċjati ma 'kimokini u ċitokini (Figura 5F). Il-kwantifikazzjoni tal-proteini twettqet fuq l-istess tumuri kif analizzati minn NanoString, u konsistenti mas-sejbiet tal-firma tal-ġeni, żdiedu b'mod sinifikanti l-livelli ta 'ċitokini u chemokines pro-infjammatorji ġew imkejla f'24 siegħa wara t-trattament rHER2 T785-ISAC (Figura 17 Supplimentari). ). Il-punteġġi tal-firma tal-ġeni kienu wkoll elevati b'mod sinifikanti għall-Ipproċessar u l-Preżentazzjoni tal-Antiġeni, il-Funzjoni taċ-Ċellola Dendritika, u l-Funzjoni tal-Macrophage, u appoġġaw aktar ir-rispons medjat minn anFc-Fc R u mmexxi mill-fagoċitosi 24 siegħa wara rHER2 T785-ISACtrattament (Figura 5F u Figura Supplimentari 18). Minbarra l-punteġġi tal-firma tal-ġeni elevati b'mod sinifikanti affiljati ma 'rispons robust medjat minn TLR- u Fc R, il-punteġġ tal-firma tal-ġeni għall-Funzjonijiet taċ-ċelluli T żdiedet ukoll b'mod sinifikanti fi żmien 24 siegħa mit-trattament rHER2 T785-ISAC, u aktar appoġġa l- konstatazzjoni li ċ-ċelloli T huma meħtieġa għall-effikaċja medjata mill-ISAC (Figura 5F u Figura Supplimentari 18).

Biex jikkaratterizzaw iċ-ċelloli immuni li jistgħu jikkontribwixxu għaż-żieda bikrija fil-produzzjoni ta’ ċitokini proinfjammatorji u kimokini, it-tumuri ġew analizzati permezz ta’ ċitometrija tal-fluss 24 siegħa wara l-ewwel doża ta’ rHER2 T785-ISAC jew il-kontrolli, u 6 ijiem wara l-bidu ta’ kura, 24 siegħa wara t-tieni doża. Analiżi ta’ tumuri fl-1 Jum żvelat infiltrazzjoni ta’ CD11b flimkien ma’ Ly6C flimkien ma’ monoċiti fit-tumuri ttrattati b’rHER2 T785-ISAC, u CD11b flimkien ma’ Ly6G flimkien ma’ granuloċiti fit-tumuri ttrattati b’rHER2 mAb jew rHER2 T{785-ISAC , iżda mhux il-kontrolli tal-isotip ISAC jew tal-antikorpi tal-isotip (Figura 5G). Il-livelli ta' monoċiti żdiedu saħansitra aktar f'tumuri kkurati b'rHER2 T785-ISAC wara 6 ijiem. Simili għal dak li osservajna fil-mudell tal-ksenograft HCC1954, APCs majelojdi (CD11b plus CD11c plus F4/80 plus ) kienu elevati b'mod sinifikanti f'jum 6 wara t-trattament rHER2 T785-ISAC meta mqabbla mal-kontrolli (Figura 5G u Figura Supplimentari 19). ). Barra minn hekk, l-APCs majelojdi nstabu li ġew attivati ​​speċifikament fil-grupp ittrattat b'rHER2 T785- ISAC fiż-żewġ punti tal-ħin, kif imkejjel permezz ta 'regolazzjoni 'l fuq ta' CD40 fuq il-wiċċ taċ-ċellula (Figura 5H). Importanti, żieda fl-APCs majelojdi tumorali ma tkejletx wara t-tnaqqis tal-fagoċiti bl-użu ta' liposomi mgħobbija b'clodronate (Figura 20 Supplimentari). Fl-aħħarnett, l-IHC twettqet biex tevalwa l-preżenza u l-lok tal-popolazzjonijiet ewlenin taċ-ċelluli immuni fil-mudell MMC wara t-trattament bl-rHER2 T785-ISAC. Kif deher fil-mudell tal-ksenograft HCC1954, it-trattament bl-rHER2 T785-ISAC irriżulta f'żieda drammatika fiċ-ċelloli CD11c plus u F4/80 plus fir-reġjun peritumorali li ma dehritx wara trattament b'antikorpi rHER2 jew trattament b'isotip. jew iżotip T785-ISAC (Figura 5I). B'mod konsistenti mal-espressjoni bikrija tal-kimokini taċ-ċelluli T u ż-żieda fil-punteġġ tal-firma tal-ġene għall-Funzjoni taċ-Ċellula T, infiltrazzjoni sinifikanti taċ-ċelluli CD8 plus dehret minn IHC fit-tumuri tal-ġrieden ittrattati T785-ISAC rHER2 fis-6 jum, billi Tbajja CD8 fil-ġrieden ittrattati b'antikorp anti-rHER2 jew kontrolli tal-isotip baqgħu baxxi (Figura 5I). Żieda fit-tbajja ta' CD8 flimkien ma' IHC, flimkien ma' espressjoni tal-ġeni amplifikata ta' ġeni assoċjati mal-funzjoni taċ-ċelluli T u t-tneħħija tat-tumur CD8-dipendenti, jappoġġjaw il-potenzjal tat-T{785-ISAC li jdawwar tumur kiesaħ jaħraq.CL{ {58}}ISACs iġibu rigressjoni tat-tumur f'HER2-mudell ta' tumur xenograft li jesprimi medja Biex nuru li l-ISACs huma pjattaforma robusta f'diversi payloads li jistimulaw l-immunità, żviluppajna ISAC bl-użu ta' agonist TLR7 magħruf, CL264 b'DAR komparabbli mat-trastuzumab T785-ISAC (Figura 6A u Figura Supplimentari 21). Il-kapaċità ta' trastuzumab ISACs prodotti b'CL264 jew T785 biex jimmedjaw l-attivazzjoni majelojde intra-tumorali ġiet ivvalutata fil-mudell ta' xenograft HCC1954 24 siegħa wara amministrazzjoni waħda ta' trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC jew trastuzumab T{{73}ISAC. . Attivazzjoni mtejba majelojde kienet osservata b'trastuzumab CL264-ISAC kif evidenzjat minn espressjoni ta' CD40 miżjuda fuq CD11b li jinfiltraw it-tumur flimkien ma' CD11c flimkien ma' F4/80 flimkien ma' APCs majelojdi meta mqabbla ma' trastuzumab jew trastuzumab T{785-ISAC (Figura 6B ).Biex jiġi ddeterminat jekk il-kapaċità mtejba ta' attivazzjoni majelojde tal-CL264-ISAC tradottax f'attività akbar kontra t-tumur in vivo, it-trastuzumab CL264-ISAC tqabbel mal-T785-ISAC fil-mudelli tat-tumur HER2High HCC1954 u HER2Med JIMT-1. Filwaqt li t-tnejnTrastuzumab ISACs medjaw rigressjoni sħiħa tat-tumur fil-mudell HCC1954 HER2High, il-CL264-ISAC wera żieda fl-attività kontra t-tumur fil-mudell JIMT-1 HER2Med li jissuġġerixxi li l-qawwa ISAC u l-abbiltà li jimmiraw tumuri b'densità ta' antiġeni aktar baxxa jistgħu tkun marbuta (Figura 6C–D).

Iż-żewġ ISACs kienu tollerati tajjeb, iżda osservajna telf temporanju fil-piż tal-ġisem ta' 5-10 fil-mija f'annimali kkurati jew bit-trastuzumab CL264-ISAC jew bir-rituximab CL264-ISAC, bil-piż tal-ġisem jirkupra għal jew 'il fuq mil-linja bażi bit-tielet doża (Figura Supplimentari 16A). Is-sekrezzjoni sistemika taċ-ċitokini kienet imkejla wara trattament b'T785-ISAC jew CL264-ISAC. Livelli baxxi ta' TNF tkejlu fis-serum tal-annimali erba' sigħat wara l-għoti tat-T785-ISAC, filwaqt li kemm il-CL264-ISACs immirati kif ukoll dawk tal-isotip wasslu għal livelli ogħla ta' sekrezzjoni ta' TNF b'mod sistemiku (Figura 11 Supplimentari) . Huwa improbabbli li dawn l-effetti bejn T785 u CL264 ISACs kienu dovuti għal impatt dirett tal-ISAC fuq it-tkabbir taċ-ċelluli tat-tumur, peress li l-ISAC ma inibixxix il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer in vitro (Figura 9 Supplimentari).

Il-CL264-ISACs iġibu t-tneħħija tat-tumur u l-memorja immunoloġika f'mudelli ta' tumuri sinġeniċi Minħabba ż-żieda fil-qawwa u l-effikaċja osservati bil-CL264-ISAC f'mudelli ta' xenograft ta' tumur uman b'densità varjata ta' antiġen HER2, wara kkaratterizzajna l-attività ta' CL 264-ISACs f'mudelli ta' tumuri sinġeneiċi. Simili għat-T785-ISAC fil-mudell MMC, il-CL264-ISAC wassal għal rigressjoni u tneħħija tat-tumur b'mod dipendenti fuq iċ-ċelluli T, li wassal għal memorja immunoloġika dejjiema (Figura Supplimentari 22A). Biex nivvalutaw l-effikaċja tal-ISAC f'mudell ta' tumur sinġeniku b'espressjoni ta' antiġenu mnaqqsa, żviluppajna linja taċ-ċelluli CT26 li tesprimi b'mod stabbli HER2 tal-firien (CT26-rHER2). Importanti, madwar 8.5 fil-mija taċ-ċelloli CT26 ma jesprimux rHER2 wara l-impjantazzjoni tat-tumur (Figura 6E). Ġrieden Wildtype Balb/c ittrattati bir-rHER2 CL264-ISAC wrew immunità sostanzjali kontra t-tumur f'dak li 75 fil-mija (6 minn 8) tal-ġrieden neħħew it-tumuri tagħhom u baqgħu ħielsa mit-tumur għat-tul tal-esperiment, billi ħadd mill-ġrieden ittrattati bl-antikorp anti-rHER2 ma kellu rigressjoni sħiħa (Figura 6F). Ġie osservat telf ta' piż temporanju ta' madwar 10 fil-mija tal-piż tal-ġisem wara trattament rHER2 CL264-ISAC, bil-piż tal-ġisem jirkupra bi tmint ijiem wara l-bidu tal-istudju (Figura Supplimentari 22B). Aħna vvalutajna jekk ir-rHER2 CL264-ISAC ikmedjatx memorja immunoloġika kontra tumur nieqes mill-espressjoni tal-antiġen immirat, rHER2, billi sfidaw ġrieden li qabel kienu mfejqa minn tumuri CT26-rHER2 bil-linja taċ-ċelluli CT26 tal-ġenituri li ma kellhiex rHER2 espressjoni. Ġrieden preċedentement imfejqa minn tumuri CT26-rHER2 b'rHER2 ISAC kienu protetti bis-sħiħ mill-isfida mal-linja taċ-ċelluli CT26 tal-ġenituri (Figura 6I). It-tnaqqis taċ-ċelluli T CD4 u CD8 qabel l-isfida mill-ġdid tat-tumur wera li ċ-ċelluli T huma meħtieġa għall-protezzjoni. Fl-aħħarnett, aħna ttestjajna jekk il-memorja immunoloġika żviluppata fil-ġrieden imfejqa qabel bl-ISAC kinitx speċifika għall-antiġeni assoċjati mat-tumur tat-tumur primarju ttrattat. Matul l-isfida mill-ġdid tat-tumur CT26 tal-ġenituri, il-ġrieden ġew ikkontestati fl-istess ħin b'tumur differenti, 4T1, impjantat fil-ġenb kontralaterali. Id-dejta turi li l-iżvilupp tal-memorja immunoloġika kienspeċifiċi għal antiġeni assoċjati mat-tumur CT26 distinti minn rHER2, peress li t-tkabbir tat-tumur ta 'tumuri 4T1 ma kienx affettwat (Figura 6G).