Espressjoni tal-ġeni immuni u Netwerks Funzjonali fi Klassijiet Distinti ta' Lupus Nefrite Ⅰ

ASTRATT

Għan Biex tesplora l-utilità tal-pjattaforma NanoString fiiluċidazzjoni tal-kliewitraskrizzjonijiet immuni għall-klassi III, IV, u V lupus nefrite (LN) bl-użu ta’ koorti retrospettiva ta’iffissat fil-formalina inkorporat fil-paraffin(FFPE) tessut tal-bijopsija tal-kliewi.

Metodi: Analiżi tat-traskrizzjoni tal-ġene immuni twettqet bl-użu tal-pjattaforma NanoString nCounter fuq RNA minn LN (n=55), marda tal-membrana tal-kantina rqiqa (TBM) (n=14) u nefropatija membranuża (MN) (n{ {2}}) FFPEbijopsija tal-kliewitessut. Kampjuni ta' LN kienu jikkonsistu minn bijopsiji ta' klassi waħda III (n=11), IV (n=23) u V (n=21) mingħajr ebda leżjonijiet imħallta. L-espressjoni tal-ġeni differenzjali twettqet b'NanoString nSolver, b'viżwalizzazzjonijiet ta 'plots tal-vulkan u mapep tas-sħana ġġenerati f'R. Traskrizzjonijiet sinifikanti ġew interrogati biex jiġu identifikati netwerks funzjonali bl-użu ta' termini STRING u Gene ontogeny.

IKKLIKKJA HAWN BIEX TIKSEB FORMULAZZJONI TAL-ĦEJAR TA' CISTANCHE GĦALL-KLIEI

Riżultati Meta mqabbel ma 'TBM, identifikajna 52 ġeni espressi b'mod differenzjat komuni għat-tliet klassijiet LN kollha. L-analiżi tal-mogħdija wriet arrikkiment għal mogħdijiet tas-sinjalar, komplement u MHC II tal-interferon tat-tip I (IFN), bil-biċċa l-kbira juru l-ogħla espressjoni fil-klassi IV LN. Il-bijopsiji LN tal-klassi IV tagħna wrew ukoll regolazzjoni għolja sinifikanti tas-sinjalar NF-κB u arrikkiment immunoloġiku meta mqabbla mal-bijopsiji LN tal-klassi V. Traskrizzjonijiet mill-passaġġ tat-tip I IFN jiddistingwu klassi V LN minn MN.

Konklużjoni L-analiżi transcriptomic tas-sezzjoni kollha tal-kliewi tagħna pprovdiet għarfien dwar il-profil molekulari tal-klassi III, IV u V LN. Id-dejta enfasizzat mogħdijiet importanti komuni għat-tliet klassijiet u mogħdijiet arrikkit fil-bijopsiji LN tal-klassi IV tagħna. Il-kapaċità li jiġu żvelati mogħdijiet molekulari fl-LN bl-użu ta 'sezzjonijiet sħaħ tal-bijopsija FFPE jista' jkollha utilità klinika fl-għażla tat-trattament għal LN.

INTRODUZZJONI

Lupus nefrite(LN) hija manifestazzjoni importanti ta 'sistemikulupus eritematosus(SLE) u tiżviluppa f’madwar 40% tal-pazjenti.1 Il-prevalenza tagħha hija influwenzata mill-età (ogħla fl-SLE tal-bidu tat-tfulija) u l-etniċità (ogħla f’pazjenti mhux Kawkasi) u hija assoċjata inversament mal-istatus soċjoekonomiku.2 Il-bijopsija tal-kliewihija parti importanti mill-ġestjoni tal-LN3 4 u saru sforzi sinifikanti biex il-bidliet li dehru fil-bijopsija jiġu relatati mal-patoġenesi, l-għażla tat-trattament u l-pronjosi.1 Kritika għal dan kien l-iżvilupp ta’ sistema ta’ klassifikazzjoni tal-LN li inkorporat definizzjonijiet standardizzati ta 'leżjonijiet ta' bijopsija biex titnaqqas il-varjabbiltà bejn ir-rappurtar.

Is-Soċjetà Internazzjonali tan-Nefroloġija/Soċjetà tal-Patoloġija Renal (ISN/RPS) 2003 klassifikazzjoni ta 'kunsens ta' LN5 iddeskriviet sitt klassijiet: LN mesangjali minimu (klassi I); LN proliferattiv mesanġjali (klassi II); fokali LN (klassi III); LN diffuż li jista' jinqasam aktar f'LN proliferattiv segmentali diffuż (klassi IV-S) u globali diffuż (klassi IV-G); LN membranuża (klassi V) u LN skleroża avvanzata (klassi VI). Leżjonijiet glomerulari attivi (A, eż., iperċellulari endokapillari, nekrożi fibrinojde, crescents ċellulari u mikroċellulari) u kroniċi (C, eż., sklerożi glomerulari, crescents fibrużi) ġew definiti u indikati wkoll meta ddeskrivew il-klassijiet III u IV. Pereżempju, il-klassi IV-G (A) iddeskriviet LN proliferattiv globali diffuż b'leżjonijiet attivi. Ġie propost aġġornament għal din il-klassifikazzjoni.6 Ir-rakkomandazzjonijiet inkludew l-eliminazzjoni tas-suddiviżjonijiet tal-klassi IV-S u IV-G peress li dawn ma jinfluwenzawx ir-riżultat. F'meta-analiżi, l-okkorrenza ta 'waħda minnhommard tal-kliewi fl-aħħar stadjujewirduppjar tal-krejatinina fis-serumma kienx differenti bejn il-klassijiet IV-S u IV-G.7 Ġie propost ukoll li d-deskritturi attivi u kroniċi jiġu sostitwiti b’indiċijiet ta’ attività u kroniċità derivati ​​mill-attività tal-lupus NIH u s-sistema ta’ punteġġ8, biex b’hekk tkun tista’ ssir valutazzjoni kwantitattiva tal-attività (a punteġġ ta' 0 sa 24) u kronika (punteġġ ta' 0 sa 12).

Il-klassi LN hija kritika biex tinforma l-ġestjoni.3 L-immunosoppressjoni hija rakkomandata fil-klassi attiva III u IV LN iżda mhux fil-klassi II LN. Id-deċiżjoni li tinstiga immunosoppressjoni fil-klassi V LN hija influwenzata mill-grad ta 'proteinurja u r-rispons tagħha għall-imblokk ta' renin-angiotensin-aldosterone. In-nuqqas ta' kontroll tal-proteinurja 12-il xahar wara t-trattament huwa assoċjat ma' progressjoni għal mard kroniku tal-kliewi9–11 għalhekk l-għan tal-ġestjoni huwa li titnaqqas il-proteinurja bil-għan ta' rispons kliniku sħiħ (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Il-klassi LN waħedha hija inqas robusta biex tinforma r-riżultati għaliexfatturi ta’ riskju għall-iżvilupp ta’ mard kroniku tal-kliewijinkludukaratteristiċi kliniċiu minħabba li jinkludu karatteristiċi istoloġiċi mhux maqbuda mid-definizzjonijiet tal-klassi LN. Dawn jinkludu l-grad ta 'fibrożi interstizjali u atrofija tubulari (IFTA) u leżjonijiet glomerulari speċifiċi bħal nekrożi fibrinojde u crescents fibrużi.12 Il-kwantifikazzjoni ta' leżjonijiet individwali tal-kliewi magħżula u definiti sew tista 'tinforma pronjosi. Dan huwa evidenti fin-nefropatija IgA fejn il-punteġġ taċ-ċellulità mesanġjali, l-iperċelularità endokapillari, l-isklerożi segmentali, l-atrofija tubulari, il-fibrożi interstizjali u n-nofs tan-nofs biex jiffurmaw il-punteġġ MEST-C intwera li jgħin fit-tbassir tar-riskju.13–15 Ir-reviżjonijiet proposti għall-ISN Il-klassifikazzjoni ta' kunsens /RPS 2003 ta' LN tista' tindirizza dawn in-nuqqasijiet6 iżda għadha bbażata fuq l-użu tal-morfoloġija. Konsegwentement, hemm bżonn li jiġu studjati l-mogħdijiet molekulari fi ħdan il-bijopsiji LN u nifhmu kif dawn jirrelataw mal-klassijiet LN16 17 u r-riżultati tat-trattament.18 19 F'termini ta' utilità klinika, l-analiżi traskrittomika tal-bijopsiji tal-kliewi hija l-aktar. avvanzat fid-dijanjosi ta’ rifjut tal-kliewi medjat mill-antikorpi fejn żieda fl-espressjoni tat-traskrizzjonijiet tal-ġeni fit-tessut tal-bijopsija ġiet miżjuda, sakemm issir il-validazzjoni, ma’ kriterji morfoloġiċi vvalidati. bijopsija fl-SLE, użajna t-teknoloġija NanoString biex nistudjaw l-espressjoni ta’ 750 traskrizzjonijiet immuni u relatati mal-infjammazzjoni f’sezzjonijiet inkorporati fil-paraffin (FFPE) iffissati fil-formalin minn 55 bijopsija LN, 14-il bijopsija b’mard tal-membrana rqiqa tal-kantina (TBM) u 9 bijopsiji b’ nefropatija tal-membrana (MN).

METODI

Kampjuni: Tessut tal-bijopsija tal-kliewi FFPE inkiseb minn kampjuni żejda arkivjati ta' LN, TBM, u MN għal użu kliniku u fejn tessut adegwat kien disponibbli għall-analiżi. Bijopsiji tal-lupus jew b'leżjonijiet imħallta jew b'ċikatriċi sinifikanti ġew esklużi. TBM intuża bħala kontroll tal-mard minħabba nuqqas ta 'disponibbiltà ta' bijopsiji tal-kliewi normali. Il-parametri kliniċi nġabru mir-rekords tas-saħħa retrospettivament. Il-matriċi tal-punteġġ tal-Interferon (IFN) inkisbet kif irrappurtat qabel.21 Ir-rispons sħiħ ġie definit bħala proporzjon tal-proteina tal-awrina/kreatinina (uPCR) ta<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% sa sena wara l-bijopsija. Ir-rispons parzjali kien definit bħala uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

Estrazzjoni tal-RNA

Sitt taqsimiet ta 'tessut sħaħ ħoxnin ta' 10 μm inkisbu b'mikrotomu minn kull blokka FFPE, wara t-tneħħija ta 'żewġ sezzjonijiet ta' 4 μm. Biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni inkroċjata, it-tagħmir ġie mnaddaf b'RNase Away bejn il-kampjuni, u ntużat xafra friska għal kull kampjun. L-iżolament tal-RNA tat-tessut kollu twettaq fl-istess jum bl-użu tal-Kit RNeasy FFPE (Qiagen, #73504) u l-konċentrazzjoni tal-RNA ġiet evalwata minn spettrofotometru NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; dejta supplimentari onlajn S1).

Analiżi tat-traskriptome

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >doppju (medja+2 SD) ta' sondi ta' kontroll negattiv. L-għadd kien normalizzat għall-medja ġeometrika ta '10 ġeni ta' manutenzjoni (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB, u ZC3H14), magħżula hekk kif kienu espressi fit-tipi kollha ta 'kampjuni. L-għadd normalizzat għall-kampjuni kollha huma elenkati fid-dejta supplimentari onlajn S2.

Analiżi statistika

L-espressjoni tal-ġeni differenzjali (DGE) twettqet bl-użu tal-algoritmu ta' analiżi avvanzata ta' solver (V.4) Fast/Approxi mate li juża l-mudell binomjali negattiv simplifikat għas-sondi kollha ħlief fejn l-algoritmu ma jikkonverġix u jintuża l-metodu ta' rigressjoni lineari. LN, MN jew il-klassi LN (III, IV u V) intużaw bħala l-varjabbli indipendenti u TBM bħala l-grupp ta 'referenza tagħna. L-għadd tal-limitu ġie stabbilit għal 100 u l-frekwenza ta' osservazzjoni fi ħdan il-kampjuni stabbilita għal 8%; Il-valur P ġie aġġustat bl-użu tal-metodu Benjamini-Hochberg bil-limitu ta 'skoperta falza għal stabbilit għal 0.05. Il-plots tal-vulkan ġew prodotti bl-użu tal-pakkett tal-Vulkan Imtejjeb (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) f'R.22 Il-viżwalizzazzjoni tan-netwerk tal-assoċjazzjoni tal-proteini funzjonali saret bl-użu tad-database STRING (https:// string-db.org/) , bl-użu tan-netwerk STRING sħiħ. It-truf tan-netwerk ġew definiti b'kunfidenza, u l-interazzjonijiet ġew stabbiliti għall-ogħla punteġġ ta 'interazzjoni ta' kunfidenza (Akbar minn jew ugwali għal 0.9). Nodi skonnettjati fi ħdan in-netwerks ma ġewx murija. Ġeni espressi b'mod differenzjat sinifikanti ġew evalwati għall-arrikkiment tat-termini tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) (Proċessi Bijoloġiċi, Funzjonijiet Molekulari, Komponent Ċellulari), mogħdijiet Reactome u clusters tan-netwerk lokali STRING. Netwerks ta' interazzjoni viżwali ġew iġġenerati b'arrikkimenti funzjonali f'termini GO (Proċessi Bijoloġiċi) u analiżi STRING. Dijagramma Venn proporzjonali taż-żona ta’ ġeni espressi b’mod differenzjat li jikkoinċidu bejn is-subklassijiet LN ġiet iġġenerata b’BioVenn (www.biovenn. nl).23 Dejta minn softwer ta’ solver ta’ analiżi avvanzata nqrat fl-ambjent statistiku R u l-viżwalizzazzjoni tad-dejta saret bl-użu ta’ boxplots, analiżi tal-komponenti prinċipali, plots tal-vulkan u mapep tas-sħana. Il-mapep tas-sħana ġew iġġenerati bl-użu ta 'punteġġi Z ta' għadd normalizzat u pheatmap f'R. Clusters ġew analizzati bl-użu tat-test eżatt ta 'Fisher. Analiżi tal-varjanza bit-test ta' paraguni multipli ta' Sidak intużat għat-tqabbil ta' gruppi multipli. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta 'GraphPad Prism (V.8.0).

Dikjarazzjoni tal-pazjent u l-involviment tal-pubbliku (PPI).

Dan l-istudju kien parti mill-konsorzju MASTERPLANS u kollaboraturi tal-pazjenti pparteċipaw f’kull linja ta’ ħidma inkluż dan l-istudju. Ġie prodott glossarju ta' termini minn PPI biex jippermetti aktar involviment mal-komunità usa' tal-pazjenti u s-sejbiet tar-riċerka ġew inklużi fil-jiem ta' reviżjoni lay. Reviżjonijiet lajċi tal-pubblikazzjonijiet huma kondiviżi fuq il-websajt MASTERPLANS (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans).

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Shop Għal Aktar Speċifikazzjonijiet Dettalji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

IKOLLOK ESTRAT TA' CISTANCHE ORGANIKU NATURALI B'25% ECHINACOSIDE U 9% ACTEOSIDE GĦALL-KLIEI