Immaġini Il-Kliewi: Minn Mikroskopija Dawl Sa Super-riżoluzzjoni
Mar 17, 2022
Kuntatt: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelotti1,2, Giulia Antonelli1,2 Carolina Conte1,2u Paola Romagnani1,2
ASTRATT
Il-kisbiet importanti fikliewimekkaniżmi fiżjoloġiċi u patofiżjoloġiċi jistgħu fil-biċċa l-kbira jiġu attribwiti għall-progress fit-teknoloġija tal-mikroskopija. Ħafna minn dak li nafu dwar l-arkitettura tal-kliewihija bbażata fuq id-deskrizzjonijiet fundamentali ta 'mikroskopisti anatomiċi li jużaw mikroskopija tad-dawl u aktar tard minn analiżi ultrastrutturali pprovduta minn mikroskopija elettronika. Dawn iż-żewġ tekniki ntużaw għall-ewwel sistemi ta 'klassifikazzjoni tal-mard tal-kliewi u għall-aġġornamenti kostanti tagħhom. Aktar reċentement, serje ta 'tekniki ta' immaġini ġodda żiedu l-analiżi f'dimensjonijiet ulterjuri ta 'ħin u spazju. Il-mikroskopija konfokali ppermettietna naraw b'mod sekwenzjali sezzjonijiet ottiċi tul l-assi z u d-disponibbiltà ta 'softwer ta' analiżi speċifiku pprovdiet rendering tridimensjonali ta 'kampjuni ta' tessut eħxen. Il-mikroskopija multifoton ippermettietna ninvestigaw fl-istess ħinkliewifunzjoni u struttura f'ħin reali. Il-mikroskopija tal-immaġini tal-fluworexxenza tul il-ħajja ppermettietna nistudjaw id-distribuzzjoni spazjali tal-metaboliti. Il-mikroskopija b'super-riżoluzzjoni żiedet is-sensittività u r-riżoluzzjoni sa livelli nano-skala. Bil-mikroskopija krijo-elettroniċi, ir-riċerkaturi jistgħu jivviżwalizzaw il-bijomolekuli individwali f'livelli atomiċi direttament fit-tessuti u jifhmu l-interazzjoni tagħhom f'livelli subċellulari. Fl-aħħarnett, l-ispettrometrija tal-massa tal-immaġini ta 'desorbiment/jonizzazzjoni assistita bil-laser ippermettiet il-kejl ta' mijiet ta 'molekuli differenti fl-istess ħin fuq sezzjonijiet tat-tessuti b'riżoluzzjoni għolja. Din ir-reviżjoni tipprovdi ħarsa ġenerali lejn disponibblikliewistrateġiji tal-immaġini, b'fokus fuq l-impatt possibbli tat-titjib teknoloġiku l-aktar reċenti.
Kliem ewlieni:immunoistokimika,kliewibijopsija, podoċiti,prossimalitubuli, ċelloli staminali
Cistanche herba għall-mard tal-kliewi, ikklikkja hawn biex tikseb il-kampjun
INTRODUZZJONI
Il-tal-kliewikumplessità strutturali affaxxinanti hija meħtieġa biex tissodisfa l-funzjonijiet fiżjoloġiċi varji tagħha. Fil-bidu, tistudja l-kliewikienet limitata għal osservazzjonijiet makroskopiċi u l-kontribut tagħhom għad-dijanjosi tal-mard tal-kliewi kien bla dubju limitat. Ġew deskritti manifestazzjonijiet kliniċi iżda l-mekkaniżmi patoġenetiċi sottostanti ma kinux magħrufa. Il-kisbiet fil-fehim tal-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija tal-kliewi jistgħu jiġu attribwiti fil-biċċa l-kbira għall-progress kontinwu fil-qasam tal-mikroskopija. Tentattivi ta'kliewil-immaġini beda żmien twil ilu [1]. Fl-1666, l-anatomista Malpighi eżaminakliewitessut b'mikroskopju tad-dawl li kellu qawwa stmata li tkun 25–30 u ddeskriva għall-ewwel darba l-glomerulus bħala 'glandola li fiha l-awrina kienet isseparata mid-demm'[2]. Din il-kontribuzzjoni ġiet injorata sal-1842 meta l-istrutturi tan-nephron ġew żvelati b'mikroskopju tad-dawl 10 darbiet aktar b'saħħtu minn Sir William Bowman. Bowman skopra l-kapsula periglomerulari (aktar tard imsejħa l-kapsula Bowman) bħala konnessa anatomikament mal-ewwel parti tat-tubuli [3]. Fl-1862, Jacob Henle iddeskriva s-segment tat-tubuli qisu loop li ħa ismu, jgħaqqad it-tubuli kortikali u l-papilla renali.
Grazzi għall-introduzzjoni ta 'mikroskopija tad-dawl, klassifikazzjoni istomorfoloġika ta'kliewimardsar possibbli [1]. Iċ-ċans li wieħed josserva dak li kien qed jiġri fil-kliewi morda ppermettiet li wieħed jifhem li l-bidliet patoloġiċi varjaw b'mod konsiderevoli bejn pazjenti b'manifestazzjonijiet kliniċi simili. Madankollu, l-ewwel studji dwar bidliet patoloġiċi fit-tessut renali saru fuq kampjuni ta 'awtopsja, li wasslu l-aktar għad-deskrizzjoni ta' mard kroniku. In-nuqqas ta 'informazzjoni dwar l-evoluzzjoni tal-patoloġiji tal-kliewi u l-problema teknika tal-fenomeni awtolitiċi, korrelatati mal-użu ta' tessuti post-mortem, illimitaw l-għarfien tal-mard tal-bniedem. Fl-1951, l-introduzzjoni takliewibijopsija ppermettiet osservazzjoni diretta u studju mhux biss ta 'mard tal-kliewi kroniku iżda wkoll akut. Sadanittant, il-mikroskopija gradwalment saret aktar sofistikata b'sensittività u riżoluzzjoni progressivament miżjuda sa livelli nanoskala. F'din ir-reviżjoni, aħna se nipprovdu ħarsa ġenerali lejn l-iskoperti fundamentali tal-kliewi li saru possibbli mill-avvanzi fit-teknoloġija tal-mikroskopija, b'fokus fuq il-possibbiltajiet li jevolvu mill-iżviluppi tekniċi l-aktar reċenti.
IMMUNOPATOLOĠIJA VIŻWALIZZATA TAL-KLIEWA
Immunotikkettjar u mikroskopija fluworexxenti
Il-possibbiltà li jinkiseb framment rappreżentattiv ta 'tessut ħaj ppermettiet l-applikazzjoni ta' tekniki emerġenti li kienu jeħtieġu preservazzjoni massima tat-tessut, bħall-metodi immunoistokimiċi (l-ewwel fluworexxenti, imbagħad enżimatiċi). Fil-fatt, fl-1950, Coons żviluppaw il-metodu ta 'tikkettjar ta' antikorpi b'isocyanate tal-fluworexxeina, jiġifieri, immunofluworexxenza, mingħajr ma jeqirdu l-kapaċità li jirreaġixxu speċifikament mal-antiġeni tat-tessuti tagħhom. Minn dak iż-żmien 'l hawn l-immunofluworexxenza ġiet inkorporata fil-proċedura dijanjostika għall-valutazzjoni ta' kampjuni ffriżati tal-bijopsija renali. Għall-ewwel darba, dawn it-tekniki ppermettew l-osservazzjoni ta 'immunoglobulini intrarenali (Igs) u jikkumplimentaw depożiti f'pazjenti affettwati mill-glomerulonefrite, li jikkontribwixxu għad-diskriminazzjoni ta' patofiżjoloġiji differenti sottostanti ċerti leżjonijiet tat-tessuti mhux speċifiċi, pereżempju, fi glomerulonefrite crescentic [4]. Barra minn hekk, il-possibbiltà li jiġi osservat mudell ta 'tbajja' karatteristiku u l-akkoppjar tal-fluworexxeina ma' antikorpi għajr Immunoglobulin G (IgG) wasslet għar-rikonoxximent ta 'depożiti ta' Immunoglobulin A (IgA) fin-nefropatija IgA, kif ukoll depożiti komplementari fil-glomerulonefrite post-infettiva. u glomerulonefrite membranoproliferattiva [4].
Mikroskopija konfokali
Il-mikroskopija tal-fluworexxenza għaddiet minn titjib tekniku konsiderevoli bl-introduzzjoni tal-mikroskopija konfokali fl-aħħar tas-snin tmenin. Elementi ewlenin fil-mikroskopija konfokali huma illuminazzjoni tal-punt iffukata u skennjata fuq il-kampjun u apertura konfokali varjabbli (pinhole) quddiem id-ditekter li tippermetti l-ġbir tad-dawl minn sezzjoni rqiqa biss madwar il-pjan fokali (imsejħa sezzjoni ottika). Il-mikroskopija konfokali ppermettiet l-ewwel studji in vivo tal-kliewi f'mudelli sperimentali u l-osservazzjoni tat-teħid u t-trasport ta' molekuli fluworexxenti minn tubuli intatti.kliewiwara micropuncture. Dan ippermetta studji tal-funzjoni tubulari f'kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u patoloġiċi [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, minħabba l-limitu tad-diffrazzjoni tad-dawl viżibbli, photobleaching, u fototossiċità.
FEhim TAL-BARRIJA TAL-FILTRAZZJONI GLOMERULAR: MIKROSKOPIJA ELETTRONA
L-ewwel tentattiv biex jingħeleb il-limitu tar-riżoluzzjoni tal-mikroskopji tad-dawl u tal-fluworexxenza kien fl-1931 meta Ernst Ruska u Max Knoll ivvintaw il-mikroskopju elettroniku (EM), li juża raġġ ta 'elettroni aċċellerati, minflok raġġ ta' dawl, bħala sors ta 'eċċitazzjoni, u għandu qawwa ta' riżoluzzjoni ogħla minn mikroskopji tad-dawl (sa 0.2 nm). Għal din l-innovazzjoni, fl-1986 Ernst Ruska ingħata l-Premju Nobel għall-Fiżika. Grazzi għall-qawwa ta 'riżoluzzjoni miżjuda, malajr deher evidenti li l-glomerulus ma kienx sempliċiment filtru mekkaniku, iżda organu estremament kumpless magħmul minn tliet saffi: ċelloli endoteljali, il-membrana tal-kantina glomerulari (GBM), u podoċiti [9]. Trażmissjoni EM (TEM) ippermetta l-viżwalizzazzjoni taċ-ċelluli glomerulari minn ġewwa [10] u żvelat li ċ-ċelloli endoteljali kellhom korpi taċ-ċelluli fenestrati rqaq, filwaqt li l-podoċiti kellhom korpi taċ-ċelluli kbar, u jestendu proċessi primarji u sekondarji tas-'saqajn' ankrati mal-GBM u interkonnessi permezz junctions lineari (id-dijaframma żgħira) (Figura 1B). Barra minn hekk, l-iskannjar EM (SEM), li jaqbad elettroni backscatered, ippermetta l-viżwalizzazzjoni ta 'ċelluli glomerulari mill-wiċċ ta' barra tagħhom [10] u żvela li l-proċessi tas-sieq ta 'podocytes ġirien interdiġitati u koprew il-GBM (Figura 1C). L-EM baqgħet strument qawwi mhux biss għall-komprensjoni tal-ultrastruttura glomerulari normali iżda wkoll għall-fehim.kliewiil-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija [11]. Bosta studji mwettqa fuq kampjuni umani jew f'mudelli sperimentali wrew li proċessi ta' mard differenti huma assoċjati ma' sett ta' mudelli distintivi ta' alterazzjonijiet ultrastrutturali, li jimplika aktar aġġornamenti fuq sistema ta' klassifikazzjoni li tevolvi ta'kliewimard. Il-ħila teknika li wieħed jivviżwalizza aktar kumplessità ta' l-ultrastruttura tal-kliewi approvat l-ispeċjalizzazzjoni ta' 'nefro'patologi.
Teknika SEM reċenti, ibbażata fuq ditekter sensittiv ħafna, ippermettiet l-istudju tal-parti l-aktar profonda tad-dijaframma tal-qasma u żvelat li kienet ikkaratterizzata minn pori b'daqsijiet differenti [12]. Fil-firien, il-bidu ta 'proteinurja kien assoċjat ma' pori kbar, u qajjem il-possibbiltà li bidliet ultrastrutturali tad-dijaframma tal-qasma jistgħu jkunu kawżattivi għall-bidliet fil-permselectivity glomerulari [12]. Bħala avvanz tekniku ulterjuri, SEM b'wiċċ imblokk ippermetta l-passaġġ minn viżjoni 2D għal 3D tal-barriera tal-filtrazzjoni glomerulari b'riżoluzzjoni suffiċjenti biex issegwi n-nanostruttura tal-proċessi ċellulari l-irqaq f'ġrieden b'saħħithom, ġrieden morda, u matulkliewiżvilupp [13, 14].
Fl-aħħarnett, l-akkoppjar ta 'EM ma' sistema ta 'mikroanaliżi tar-raġġi X (mikroskopija tar-raġġi X) ippermetta analiżi elementali ta' ċelloli jew partijiet ta 'ċelloli f'livell ultrastrutturali. Il-mikroskopija tar-raġġi X tuża TEM ta 'skannjar b'raġġ ta' elettroni dejjaq biex teċita l-kampjun. L-impatt tal-elettroni ta 'enerġija għolja mir-raġġ bl-atomi fil-kampjuni jipproduċi enerġija fil-forma ta' fotoni tar-raġġi-X. Dan is-sinjal tar-raġġi X, miġbur b'ditekter semikonduttur li jxerred l-enerġija, jintuża biex jidentifika l-elementi preżenti fil-kampjun, b'riżoluzzjoni ta', fl-aħjar, 30 nm. Ġolkliewiqasam, il-mikroanaliżi tar-raġġi X ġiet utilizzata b'suċċess minn Beck u Thurau biex tistudja t-trasport tal-jone tat-tubuli transepiteliali [15] u l-konċentrazzjoni elementali intraċellulari fiċ-ċelloli tubulari [16].
VIŻWALIZZAZZJONI TAL-FIŻOLOĠIJA RENALI B'MIKROSKOPIJA MULTIPHOTON
Il-mikroskopija multifoton (MPM) ipprovdiet avvanz ulterjuri filkliewiriċerka, jiġifieri, il-possibbiltà li fl-istess ħin jiġu investigati l-funzjoni renali u r-relazzjonijiet tal-istruttura f'ħin reali [17]. Differenti minn mikroskopji tad-dawl konvenzjonali, l-eċitazzjoni ta 'żewġ fotoni tiddependi fuq l-assorbiment simultanju ta' żewġ fotoni bid-doppju tal-wavelength ta 'eċċitazzjoni li huwa meħtieġ biex teċita l-fluworophore f'eċitazzjoni klassika ta' foton wieħed (Figura 1D). L-użu ta 'lejżers ta' eċċitazzjoni tal-infra-aħmar pulsati disponibbli kummerċjalment b'enerġija baxxa żied il-penetrazzjoni tat-tessut fil-fond u mminimizza l-fototossiċità (Figura 1D). Dan ippermetta lir-riċerkaturi jivviżwalizzaw proċessi ċellulari dinamiċi direttament f'annimali ħajjin, karatteristika li qabel ma kinitx tista' tinkiseb b'xi teknika oħra. MPM jippermetti l-kwantifikazzjoni ta 'funzjonijiet renali bażiċi u alterazzjonijiet patoloġiċi bħal permeabilità glomerulari, fluss tad-demm vaskulari, rata ta' filtrazzjoni glomerulari single-nephron, u fluss tubulari [17] (Figura 1E u F). Barra minn hekk, l-MPM jippermetti l-istudju ta 'proċessi intraċellulari b'rispons għal korriment, inkluż il-mewt taċ-ċelluli u t-tixrid, ir-rolling tal-lewkoċiti, u r-reklutaġġ u t-tfixkil tal-GBM [17]. Aktar titjib tekniku ippermetta immaġini intravitali fit-tul fuq ġranet sa ġimgħat [18] li, flimkien ma 'ġrieden transġeniċi li jesprimu proteini fluworexxenti, intużaw biex jintraċċaw id-destin ta' ċelluli singoli direttament in vivo fil-kliewi b'saħħithom u feruti [19] u biex jifhmu aħjar il-mekkaniżmi tal-bidla taċ-ċelluli renali u r-riġenerazzjoni.
Tekniki ta 'l-immaġini mingħajr tikketta kienu wkoll possibbli bl-MPM, li jisfruttaw l-awtofluworexxenza naturali ta' nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NADH) biex jistudja l-istat redox taċ-ċelloli tubulari wara l-ħsara [20]. Barra minn hekk, intużat it-tieni ġenerazzjoni armonika mill-collagen fibrillari biex tikkwantifika d-depożizzjoni tal-collagen, markatur tal-fibrożi renali [21]. It-tieni ġenerazzjoni armonika hija proċess ottiku mhux lineari li fih żewġ fotoni ta 'eċitazzjoni bl-istess wavelength jinteraġixxu ma' strutturi mhux ċentrimetriċi f'tessuti bijoloġiċi, bħal kollaġen jew mikrotubuli, u jiġġeneraw foton ġdid b'nofs il-wavelength.
Innovazzjoni reċenti ta 'mikroskopija intravitali kienet l-introduzzjoni ta' endoskopju multiphoton minjaturizzat użat b'suċċess biex jimmaġina kliewi fi ġrieden ħajjin anestetizzati [22]. Dan l-MPM minimament invażiv jista 'jwitti t-triq għal dijanjosi in vivo f'ħin reali, mingħajr tneħħija tat-tessuti, u fi żmien qasir ħafna.
IL-KLIEWA FIT-3D: TEKNIKA TA' KLIERA TAT-TESSUTI U MIKROSKOPIJA TA' ESPANSJONI
Minkejja t-titjib teknoloġiku, wieħed mil-limiti prinċipali għal immaġini volumetriċi aktar profondi huwa l-opaċità tat-tessut renali, li jagħmel il-kliewiwieħed mill-aktar organi ottikament sfida. Din hija r-raġuni għaliex it-tekniki tat-tindif tat-tessuti qajmu ħafna interess [23]. L-għan ta 'dawn l-approċċi huwa li jikkonvertu tessut opak f'wieħed trasparenti, li jippreservaw il-proteini u eventwalment il-markaturi fluworexxenti, biex jimmaġina slices ta' tessut ħoxnin. Il-kombinazzjoni tal-ikklerjar ottiku b'mikroskopija avvanzata tipprovdi l-possibbiltà ta 'analiżi morfometrika, bħall-kwantifikazzjoni tal-volum u n-numru glomerulari, f'tessuti ħoxnin jew saħansitra fil-kliewi intatti [24]. Applikazzjonijiet oħra jinkludu l-analiżi ta 'segmenti tubuli distinti [25], il-funzjonijiet tagħhom [26], u l-kwantifikazzjoni tat-telf ta' podoċiti [27].
Biex tfassal volumi kbar ta 'tessut u, fl-istess ħin, issolvi dettalji strutturali fini, reċentement ġie introdott approċċ tekniku ġdid, jiġifieri, mikroskopija ta' espansjoni (ExM). L-idea hi li tespandi fiżikament organu sħiħ 4- biex 5-jintewa filwaqt li jiġu ppreservati l-arkitettura ġenerali u l-kontenut tal-proteome 3D. Bl-użu ta 'polimeru li qed jespandi, sintetizzat direttament fil-kampjun, molekuli eqreb mil-limitu tad-diffrazzjoni tad-dawl huma separati iżotropikament fl-ispazju għal distanzi akbar u għalhekk jistgħu jiġu solvuti ottikament anke b'mikroskopju fluworexxenti konvenzjonali. Barra minn hekk, l-ExM jipprovdi trasparenza ottika akbar u jnaqqas it-tifrix tad-dawl, li jippermetti li wieħed jivviżwalizza volum akbar ta 'tessut. Bl-użu ta 'dan l-approċċ, il-lokalizzazzjoni ta' proteini multipli fid-dijaframma tal-qasma u l-GBM jistgħu jiġu dissekjati anke b'mikroskopju konfokali normali [28]. Pereżempju, jista' jiżvela t-tħassir tal-proċess tas-sieq fil-ġrieden proteinuriċi, kemm f'2D kif ukoll f'3D, b'riżoluzzjoni nanometru li qatt ma ntlaħqet qabel [29]. Riċentement ExM intuża għall-valutazzjoni istopatoloġika klinika ta 'kampjuni inkorporati fil-paraffin diġà mtebbgħin b'ematossilin u eosina [30]. Din it-teknika tista' tivvjalizza t-tħassir tal-proċess tas-sieq f'livell nanoskala li qabel kien possibbli biss bl-EM. L-avvanzi fl-immaġini volumetriċi jippermettu analiżi 3D b'riżoluzzjoni għolja tal-organu kollu b'tali mod li l-limitazzjoni ewlenija għall-immaġni fil-fond issa hija rappreżentata mill-kapaċità tal-antikorpi li jippenetraw it-tessut.
STUDJU TAL-PROFIL METABOLIKU: MIKROSKOPIJA TA' L-IMMAĠINI TA' GĦALL-ĦAJJA-FLUORESĊENZA-DOMINJU TAL-FREKWENZA
Il-kliewihuwa organu metaboliku b'kontenut għoli ta 'mitokondrija. Il-forma mnaqqsa ta 'NADH u metaboliti oħra huma fluworexxenti b'mod naturali u din l-awtofluworexxenza tista' tintuża bħala indiċi tal-istat redox [20]. Madankollu, l-ispettri ta 'emissjoni ta' dawn il-fluworofori endoġeni huma jikkoinċidu, u l-identifikazzjoni tagħhom separatament kienet impossibbli. Iżda l-ħajjiet tal-fluworexxenza (jiġifieri t-tnaqqis tal-ħin tal-fluworexxenza) instabu li kienu differenti b'mod sinifikanti. Għalhekk il-mikroskopija tal-immaġni tal-fluworexxenza (FLIM) tippermetti l-istudju tal-profili metaboliċi [31]. Riċentement, bl-użu ta’ taħlita ta’ MPM u FLIM, sar possibbli li jiġu kkaratterizzati firem metaboliċi speċifiċi għaċ-ċelluli u li jiġu mmonitorjati bidliet metaboliċi in vivo waqtkliewimarda [32]. FLIM huwa mistenni li jipprovdi aktar għarfien dwarkliewimetaboliżmu in vivo fis-saħħa u l-mard.
NIMPUSTA IR-RIŻOLUZZJONI LIL LIMITI: L-IMMAĠNIJIET TA’ SUPER-ROLUZZJONI TAL-KLIEWA
Il-mikroskopija tad-dawl standard tiffaċċja limitu tar-riżoluzzjoni ottika lil hinn minn 200 nm. Teknoloġiji ġodda, imsejħa super-resolution imaging, issa jippermettu li l-mikroskopija fluworexxenti tagħmel immaġni lil hinn mill-limitu tad-diffrazzjoni tagħha bħala punt tat-tluq tal-era tan-nanoskopija [33]. Dawn l-approċċi jgħaqqdu riżoluzzjoni nanoskopika mal-vantaġġi tat-tikkettar tal-fluworexxenza b'ħafna kuluri. Bħala rikonoxximent tal-impatt potenzjali ta 'dawn l-innovazzjonijiet, il-Premju Nobel tal-Kimika 2014 ingħata lil Eric Betzig, Stefan Hell, u William Moerner 'għall-iżvilupp ta' mikroskopija ta 'fluworexxenza super solvuta. Jistgħu jiġu applikati strateġiji differenti ta 'immaġini ta' super-riżoluzzjoni biex jindirizzaw mistoqsijiet bijoloġiċi differenti. Dawn l-approċċi jistgħu jinġabru f'żewġ kategoriji ewlenin, skont jekk is-super-riżoluzzjoni hijiex sfruttata fil-livell ta 'molekuli singoli jew f'ensembles [33].
Tekniki bbażati fuq ensemble
Tekniki bbażati fuq ensemble jiksru l-limitu tad-diffrazzjoni billi jimmodula temporalment u spazjalment ir-raġġ tad-dawl ta 'eċitazzjoni. Fost dawn, l-immaġini tat-tnaqqis tal-emissjonijiet stimulati b'super-riżoluzzjoni (STED) juża żewġ lejżers, lejżer ta' eċċitazzjoni u laser ta' tnaqqis (laser STED) superimpost, mibdul fl-aħmar, b'forma ta' donut, biex irażżan l-emissjoni tal-fluworexxenza mill-fluworofori li jinsabu barra. iċ-ċentru tal-eċitazzjoni. Din is-soppressjoni tinkiseb permezz ta 'emissjoni stimulata u tippermetti l-ġbir biss tas-sinjal li joriġina minn post fokali b'dimensjoni taħt il-limitu tad-diffrazzjoni (Figura 2A). L-immaġini STED intużaw għall-immaġni tad-dijaframma tal-qasma b'mod ottikament ikklerjatkliewitessuti (Figura 2B–c') u ppermettew il-lokalizzazzjoni tad-distribuzzjoni spazjali ta 'podocin u nephrin fuq skala nanometru sa mill-inqas 30 lm ta' fond [34]. Barra minn hekk, il-possibbiltà li tiġi osservata u kkwantifikata t-tħassir tal-proċess tas-sieq f'mudell sperimentali tista 'tagħmel l-immaġni STED utli għal studji tal-barriera tal-filtrazzjoni glomerulari [34].
Il-mikroskopija STED teħtieġ protokolli speċifiċi għall-preparazzjoni tal-kampjuni, fluworofori speċjali, u taħriġ tekniku. Għal din ir-raġuni, matul l-aħħar ftit snin ingħatat aktar attenzjoni lil teknika oħra ta 'super-riżoluzzjoni, mikroskopija ta' illuminazzjoni strutturata (SIM), li tista 'testendi l-limitu tad-diffrazzjoni b'fattur ta' tnejn kemm lateralment kif ukoll axjalment. SIM juża setup ta 'mikroskopju ta' kamp wiesa 'b'mudell ta' illuminazzjoni b'strixxi fin, li jippermetti l-qbid ta 'informazzjoni ta' frekwenza għolja (li tikkorrispondi għal dettalji fini fil-kampjun) fi frekwenzi spazjali aktar baxxi. Billi takkwista immaġini multipli b'mudelli ta 'illuminazzjoni ta' fażijiet u orjentazzjonijiet differenti, tista 'tiġi rikostruzzjoni immaġni b'riżoluzzjoni għolja (Figura 3A). SIM hija kompatibbli ma 'fluworofori standard, ma teħtieġx preparazzjoni speċifika tal-kampjun, u tippermetti viżwalizzazzjoni 3D. Minħabba dawn il-vantaġġi kollha, saru studji differenti biex tiġi evalwata l-possibbiltà li tintuża SIM bħala għodda dijanjostika rapida [35], pereżempju, b'ħin ta' tibdil potenzjali iqsar minn EM. Riċentement SIM 3D u proċessar awtomatizzat tal-immaġni intużaw bħala għodda dijanjostika rapida ta 'tħassir tal-proċess tas-sieq bl-użu ta' sezzjonijiet tal-paraffin ta 'rutina minn bijopsiji ta' pazjenti b'mard ta 'bidla minima [36] (Figura 3B u C). Din il-kapaċità li jiġu identifikati b'suċċess alterazzjonijiet f'mard magħruf li juri patoloġija fuq skala nanoskala kkonfermat SIM bħala għodda promettenti għad-dijanjostika ta' rutina.
Metodi ta' immaġini bbażati fuq il-lokalizzazzjoni ta' molekula waħda
Dawn it-tekniki jiddependu fuq il-possibbiltà li jinxtegħlu u jintfew ċiklikament molekuli fluworexxenti individwali li huma qrib wisq biex jiġu solvuti. F'dawn l-approċċi, molekuli f'reġjun limitat mid-diffrazzjoni jistgħu jiġu attivati f'punti ta 'ħin differenti sabiex ikunu jistgħu jiġu immaġni individwalment u sussegwentement lokalizzati bi preċiżjoni tan-nanometru billi jinstabu b'mod komputazzjoni ċ-ċentri tagħhom (Figura 3D). Fost dawn l-approċċi, il-mikroskopija ta 'rikostruzzjoni ottika stochastic (STORM) ġiet introdotta għall-ewwel darba fikliewiriċerka fl-2013, bi studju li żvela l-organizzazzjoni molekulari kkomplikata tal-GBM bi preċiżjoni nanometru, inkluża l-orjentazzjoni tal-molekuli fi ħdan [37]. F'mudell tal-ġurdien ta 'sindromu nefrotiku konġenitali rari, STORM żvelat l-integrazzjoni u l-orjentazzjoni korretta ta' laminin 521 fi ħdan il-GBM wara injezzjoni ġol-vini, u fetaħ it-triq għal għażliet terapewtiċi avvanzati għall-pazjenti [38]. Studju ieħor iddeskriva l-organizzazzjoni taċ-ċitoskeletru tal-actin fil-podoċiti f'riżoluzzjoni fuq skala molekulari [39] (Figura 3E–I). Bħala sejba ġdida, il-podoċiti fihom qatet ta' actin kontrattili konnessi ma' qatet ta' actin mhux kontrattili fil-proċessi tas-saqajn. F'mudelli ta 'korriment ta' podoċiti, l-istruttura ta 'l-actin fil-proċessi tas-sieq żarmat, li wassal għall-kollass ta' l-istruttura kontrattili fil-ġisem prinċipali [39].
IL-VIŻWALIZZAZZJONI TA' STRUTTURI 3D TA' BIJOMOLEKULI FUNDAMENTALI FIL-LIVELL ATOMIKU: MIKROSKOPIJA KRIJO-ELETTRONIKA
Sa ftit ilu, il-possibbiltà li tiġi studjata l-istruttura tal-bijomolekuli fundamentali kienet limitata għall-mikroskopija elettronika, b'riżoluzzjoni ta 'ftit nanometri. Ostakli tekniċi, bħal ħsara fil-kampjun minn raġġ ta 'elettroni intens, kuntrast ta' immaġini baxx, u movimenti ta 'molekuli wara interazzjoni ma' elettroni jew diffikultajiet biex jippreservaw l-ilma f'kampjuni bijoloġiċi fil-vakwu applikat ġewwa l-kamra EM, li jagħmilha impossibbli li jiġu solvuti molekuli taħt dan id-daqs . It-tkessiħ tal-kampjun jista 'jnaqqas l-evaporazzjoni tal-ilma u l-ħsara kkawżata mill-elettroni [40]. Minn din l-idea, cryo-EM ġie introdott fis-snin ħamsin. Ftit snin ilu, l-introduzzjoni ta 'ditekter ġdid ta' għadd ta 'elettroni wieħed finalment imbuttat ir-riżoluzzjoni lil hinn mil-limiti preċedenti. Fl-2017, il-Premju Nobel fil-Kimika ingħata lil Jacques Dubochet, Joachim Frank, u Richard Henderson għall-'iżvilupp ta' mikroskopija krijoelettroniċi għad-determinazzjoni ta' struttura b'riżoluzzjoni għolja ta' bijomolekuli f'soluzzjoni'. Dawn l-avvanzi issa jippermettu determinazzjoni strutturali ta 'bijomolekuli f'soluzzjoni [41].
Filkliewiriċerka, l-istrutturi tal-proteini fundamentali ġew determinati fil-livell atomiku [42, 43]. Fosthom, l-istruttura tal-poliċistin uman-2, li l-mutazzjonijiet tagħha huma responsabbli għall-poliċistiku awtosomali dominantikliewimarda [44], u l-istruttura tar-riċettur temporanju potenzjali kanoniku 6 kanali tal-joni, li l-mutazzjonijiet tagħhom jikkawżaw FSGS fil-bnedmin [43], ġew determinati b'riżoluzzjoni ta 'ftit angstroms [44].
IL-FEHM TAL-BAŻI MOLEKOLARI TAL-MARD TAL-KLIEI: IL-MIKROSKOPIJA INTEGRATIVA TAL-KLIEI
L-aħħar ftit snin raw interess akbar f'approċċi mingħajr tikketti li kapaċi jimmappjaw speċifikament u simultanjament l-ispettru totali tal-molekuli fit-tessuti [45]. Fost dawn, l-ispettrometrija tal-massa tal-immaġini ta 'desorbiment/jonizzazzjoni bil-laser matrix-as-sisted (MALDI-IMS) tippermetti l-kejl ta' mijiet ta 'molekuli differenti fl-istess ħin direttament fuq sezzjonijiet tat-tessuti b'riżoluzzjoni għolja. F'esperiment MALDI-IMS, sezzjoni ta 'tessut irqiq, iffriżat jew inkorporat fil-paraffin, hija miksija b'matriċi li tassorbi l-enerġija tal-lejżer u tippromwovi l-jonizzazzjoni ta' analiti tat-tessut. L-analiżi fl-ispettrometru tal-massa tiġġenera spettru għal kull koordinata x/y. Sussegwentement għall-kejl MALDI, l-istess sezzjoni tat-tessut tista 'tiġi mtebba' bi proċeduri istokimiċi u immunoistokimiċi tradizzjonali biex jintegraw il-mudell molekulari b'dettalji istoloġiċi. Fir-riċerka tal-kliewi, MALDI-IMS jintuża biex jistudja drogi, metaboliti, lipidi, peptidi, u proteini f'tessuti normali u morda [45].
Waħda mill-applikazzjonijiet l-aktar frekwenti ta 'MALDI-IMS hija l-identifikazzjoni ta' markaturi molekulari biex tikklassifika l-karċinoma taċ-ċelluli renali [46] u biex jiġi stabbilit il-marġni veru bejn it-tessut kanċeruż u normali fil-livell molekulari kif ukoll istoloġiku [47]. MALDI-IMS intuża wkoll b'suċċess biex tistudja t-tossiċità tal-mediċina renali biex tipprovdi skoperta bikrija ta 'tossiċitàkliewimekkaniżmi ta' ħsara medjati minn kandidati farmaċewtiċi [48]. Barra minn hekk, MALDI-IMS jintuża biex jistudja l-lipidi u r-rwol tagħhom f'patoloġiji renali, bħal nefropatija dijabetika [49], ħsara akuta fil-kliewi [50], u poliċistiċi.kliewimard [51], u wkoll biex jiżvelaw profili metaboliċi endoġeni għal fehim aktar profond tal-mekkaniżmi relatati mal-mard [52]. L-identifikazzjoni tal-profili molekulari ġiet iffinalizzata wkoll għal bijomarkaturi possibbli li jistgħu jkunu bijomarkaturi dijanjostiċi u pronjostiċi potenzjali ġodda [53, 54].
KONKLUŻJONIJIET U PERSPETTIVI FUTUR
Titjib kostanti fit-tekniki tal-immaġini solviet progressivament ħafna ostakli tekniċi kritiċi fihomkliewiriċerka u ppermettew ritratt dinamiku tal-istruttura u l-funzjoni fil-kliewi normali u morda. Tabilħaqq, il-miġja ta 'teknoloġiji ġodda tal-mikroskopija ppermettiet skoperti xjentifiċi fundamentali u sussegwentement bidlet il-fehma tagħna tal-fiżjoloġija u l-patofiżjoloġija tal-kliewi li issa jistgħu jiġu viżwalizzati fi 3D u anke ffilmjati f'vidjows, fejn iż-żmien jirrappreżenta r-raba' dimensjoni. Bl-innovazzjoni teknoloġika reċenti tal-mikroskopija super-riżoluzzjoni u l-avvanz ta 'tekniki ta' immaġini molekulari, ir-riċerkaturi issa jistgħu Ħares bijo-molekuli individwali direttament fit-tessuti u jiddeterminaw kif jinteraġixxu f'livelli ċellulari u subċellulari.
Il-possibbiltà li jiġu applikati dawn l-għodod għal patoloġiċikliewikampjuni, li jiffokaw fuq id-dettalji molekulari u subċellulari fil-bijopsiji kliniċi, għandhom jgħinu fir-riklassifikazzjonijiet tal-mard. Jekk u, meta dan se joħloq impatt fuq id-dijanjosi tal-mard tal-kliewi jew saħansitra fuq il-ġestjoni tal-pazjent, bħalissa mhux ċar.
FINANZJAMENT
Il-finanzjament ġie pprovdut mill-Kunsill Ewropew tar-Riċerka taħt il-programm ta’ riċerka u innovazzjoni Orizzont 2020 tal-Unjoni Ewropea (ftehim ta’ għotja 648274).
REFERENZI
1. Weening JJ, Jennette JC. Tragwardi storiċi fil-patoloġija renali. Virchows Arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666
3. Bowman W. Dwar l-istruttura u l-użu tal-korpi Malpighian tal-kliewi, b'osservazzjonijiet dwar iċ-ċirkolazzjoni minn dik il-glandola. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. Iż-żieda tal-patoloġija renali fin-nefroloġija: l-istruttura ddawwal il-funzjoni. Jien JKilwaDis 2013; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo confocal laser scanning microscopy and micropuncture fil-firien intatti. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25
6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 imblokk preferenzjali jirriġenera podocytes mitlufa fin-nephrons kortikali billi jimmira mekkaniżmu intrinsiku ta 'rispons podocyte-proġenitur.KilwaInt 2018; 94:1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. L-ipertrofija taċ-ċelluli tubulari relatata mal-endoċiklu u l-proliferazzjoni tal-proġenitur jirkupraw il-funzjoni renali wara akutakliewikorriment. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Intuwizzjonijiet ġodda dwar mudelli strutturali li ltaqgħu magħhom fil-glomerulosclerosis. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Anatomija funzjonali tal-kliewi. Hosp Pract 1978; 13
10. Liapis H. Electron microscopy inkliewiriċerka: jara huwa jemmen. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. ML qawwi, Evers P. It-tielet dimensjoni fid-dijanjosi renali. Mikroskopija elettronika tal-iskannjar tal-kliewi normali u anormali. S Afr Med J 1979; 55:174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. Immaġini tal-ultrastruttura poruża tal-qasma tal-filtrazzjoni epiteljali glomerulari. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et al. Vinculin huwa meħtieġ biex iżżomm l-integrità tal-barriera glomerulari.KilwaInt 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. Proċess morfoloġiku ta 'żvilupp tal-podoċiti żvelat permezz ta' mikroskopija elettronika ta 'skannjar tal-wiċċ tal-blokka. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rick R, Dorge A, Beck FX et al. Mikroanaliżi tar-raġġi-X tas-sonda tal-elettroni tat-trasport tal-joni transepiteljali.Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Konċentrazzjonijiet elementali intraċellulari fiċ-ċelloli tubulari tal-kliewi. Analiżi ta 'mikroprobe elettroni. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Novel in vivo techniques to visualizekliewianatomija u funzjoni. Kidney Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. Eċitazzjoni multiphoton ta 'tul ta' mewġ twil hija vantaġġuża għall-intravitalkliewiimmaġini.KilwaInt 2016; 89: 712–719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. It-traċċar tad-destin taċ-ċelluli epiteljali glomerulari in vivo bl-użu ta 'immaġini multiphoton serjali f'mudelli ġodda tal-ġurdien b'tikketti ta' nisel fluworexxenti. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, et al. L-immaġini multifoton tiżvela differenzi fil-funzjoni mitokondrijali bejn is-segmenti tan-nephron. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302