Kif tipprevjeni u tnaqqas il-formazzjoni ta 'ġebel fil-kliewi?

għal aktar informazzjoni:ali.ma@wecistanche.com

Parti Ⅰ Ⅱ: L-everżjoni tal-fosfatidilserina regolata minn phospholipid scramblase attivat b'sinjalazzjoni TGF-1/Smad fl-istadju bikri tal-formazzjoni tal-ġebel fil-kliewi

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

għal aktar informazzjoni:ali.ma@wecistanche.com

Introduzzjoni

Urolithiasis hija waħda mill-aktar mardiet komuni li jaffettwaw lill-bnedmin u hija assoċjata ma 'kumplikazzjonijiet uroloġiċi multipli [1]. Ossalat tal-kalċju (CaOx) allegatament jweġġa 'ċelluli tubulari tal-kliewi kkultivati, wara li l-fosfatidilserina tal-membrana taċ-ċellula (PS) tinqaleb mis-saff ta' ġewwa għas-saff ta 'barra in vitro biex tilgħab rwoli importanti f'ġebel fil-kliewiformazzjoni [2]. Sejbiet simili ġew irrappurtati minn diversi studji [3-6]magħmula fil-livell ċellulari. Madankollu, il-mekkaniżmu sottostanti esternalizzazzjoni PS fiċ-ċelloli tat-tubuli renali kkawżati minn ħsara medjata minn CaOx għadu mhux ċar. Studji preċedenti wrew li konċentrazzjoni għolja ta 'oxalate tal-kalċju twassal għall-produzzjoni żejda ta' speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS)[7], li sussegwentement tikkontribwixxi għall-esternalizzazzjoni ta' PS fiċ-ċelloli tat-tubuli renali biex tirriżulta f'nukleazzjoni u tkabbir ta 'kristalli CaOx [8]. ROS u perossidazzjoni tal-lipidi jattivaw bil-qawwa phospholipid scramblase (PLSCR)[9], filwaqt li l-espożizzjoni għal kenniesa ROS, bħal glutathione, coenzyme Q10, jew idebenone (a sintetiku coenzyme Q10 omolog), inaqqas l-attivazzjoni ta 'PLSCR f'mard poliċistiku tal-kliewi [10] . PLSCR, li huwa ankrat mal-membrana taċ-ċellula[11], jiffunzjona bħala waħda mit-tliet enzimi li jinqalbu fosfolipidi li kapaċi jikkatalizzaw il-moviment rapidu f'żewġ direzzjonijiet tal-PS fuq iż-żewġ naħat tal-membrana tul gradjent ta 'konċentrazzjoni [12]. Taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi, il-membrana taċ-ċellula tinsab fi stat asimmetriku, u PLSCR m'għandu l-ebda effett fuq il-membrana [13]. Madankollu, wara l-ħsara taċ-ċelluli ewkarjotiċi, PLSCR jiġi attivat u jċaqlaq PS mis-saff ta 'ġewwa għal dak ta' barra[14,15]. Barra minn hekk, l-espressjoni żejda taċ-ċelluli K1 tal-ovarji tal-ħamster Ċiniż PLSCRin allegatament tistimula l-esternalizzazzjoni tal-PS, u ttejjeb il-moviment 'il barra ta' PS lejn il-wiċċ taċ-ċellula waqt l-apoptożi [16]. Għalhekk, aħna ipoteżijna li PLSCR huwa wkoll involut fl-esternalizzazzjoni tal-PS fil-membrana taċ-ċelluli tat-tubuli renali permezz tal-attivazzjoni ta 'ROS.

Mekkaniżmu molekulari potenzjali ta 'produzzjoni ta' ROS indotta mill-ossilat iseħħ permezz ta 'induzzjoni ta' sinjalazzjoni TGF- 1/Smad, li jista 'jkollha rwol fil-produzzjoni ta' ROS [17,18]. Tabilħaqq, is-sinjalar TGF- 1/Smad huwa rrappurtat li huwa involut f'numru kbir ta' mard tal-kliewi, bħal glomerulonefrite, fibrożi interstizjali renali, u nefrolitiasi[19]. Barra minn hekk, ċelluli mononukleari ttrattati b'TGF- 1 juru PSesternalizzazzjoni fil-membrana taċ-ċellula billi jikkawżaw il-flip-ping ta 'PS mis-saff ta' ġewwa sas-saff ta 'barra [20]. Madankollu, sa fejn nafu aħna, ir-relazzjoni bejn is-sinjalar TGF- 1/Smad u PSeversion fil-membrani taċ-ċelluli tat-tubuli renali għadha mhux magħrufa. Aħna ipoteżijna li TGF- 1 jipparteċipa fl-everżjoni tal-PS fil-membrani taċ-ċelluli tat-tubuli renali billi jattiva PLSCR fl-istadju bikri tal-farġebel fil-kliewiformazzjoni medjata minn ROS.

Għalhekk, investigajna jekk is-sinjalar TGF- 1/Smad jistimulax l-esternalizzazzjoni tal-PS permezz tal-attivazzjoni ROS u jekk TGF jattivax PLSCR fil-membrana taċ-ċelluli tat-tubuli renali matul l-istadju bikri ta'ġebel fil-kliewiżvilupp in vitro u in vivo, u b'hekk jistabbilixxi pedament teoretiku għall-etjoloġija taġebel fil-kliewiformazzjoni.

Ikklikkja għal Cistanche DHT għal mard tal-kliewi

materjali u metodi

Mudell tal-firien tal-formazzjoni tal-ġebel fil-kliewi CaOx fi stadju bikri

Sittin firien Wistar maskili ta' 3-xahar nodfa li jiżnu 200±20 g ġew ipprovduti miċ-Ċentru tal-Annimali Sperimentali tal-Università Medika ta' Harbin u miżmuma f'temperatura tal-kamra (22 grad ±2 grad ) u 50-70 fil-mija umdità. Wara 3 ijiem ta 'tgħammir adattiv, ġew maqsuma b'mod każwali fi tliet gruppi (20 firien/grupp)—kontroll,ġebel fil-kliewi, uġebel fil-kliewiflimkien ma' SB431542 (inibitur tal-passaġġ ta' sinjalazzjoni TGF- 1/Smad).

Ġebla fil-kliewiIl-formazzjoni tinbeda bħala bidla patoloġika bikrija wara korriment taċ-ċelluli tubulari tal-kliewi [21,22]. Biex tistudja dan il-proċess ta 'korriment, mudell far ta' stadju bikriġebel fil-kliewiformazzjoni ġiet stabbilita, peress li approċċ standardizzat għadu ma ġiex irrappurtat. Biex tosserva l-bidliet bikrija wara l-ħsara taċ-ċelluli tubulari tal-kliewi, applikajna l-metodu rrappurtat minn Liet al. [23]. Fil-qosor, il-firien fil-grupp ta 'kontroll ġew amministrati 2 mL ta' ilma distillat kuljum permezz ta 'gavage orali, filwaqt li l-firien fil-ġebel fil-kliewigrupp ġew amministrati 2 mL ta 'soluzzjoni ta' 1 fil-mija ethylene glycol u 1 fil-mija soluzzjoni NHCl kuljum permezz ta 'gavage orali. Il-firien fil-ġebel fil-kliewiflimkien mal-grupp SB431542 ġew injettati intraperitoneally b'SB431542 ko-solvent (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, iċ-Ċina) kull 7 ijiem [24]. L-ikel u l-ilma ġew ipprovduti ad libitum. Fl-14-il jum, il-firien ġew ewtanizzati b'doża eċċessiva anestetika (pentobarbital sodium, 200 mg/kg, permezz ta' injezzjoni intraperitoneali) u l-kliewi tagħhom tneħħew. Il-kliewi tax-xellug ġew ippreservati immedjatament fin-nitroġenu likwidu għall-iskoperta ta 'proteini sussegwenti. Il-kliewi tal-lemin ġew iffissati, u mbagħad deidrati u inkorporati fix-xama 'tal-paraffin. L-istudji kollha fuq l-annimali saru skont il-Gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju. Il-proċeduri sperimentali ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Użu tal-Esperiment tal-Annimali tal-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università Medika ta 'Harbin (Numru ta' approvazzjoni: 2020005, Harbin, iċ-Ċina).

Formazzjoni tal-kristall fit-tessut renali

Il-kampjuni tat-tessuti ġew imtebba bl-użu tal-metodu Pizzolato [23] u l-kristalli CaOx ġew osservati taħt mikroskopju ottiku tad-dawl polarizzat (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Ċina). Reġjuni pożittivi għal Pizzolato ġew imkejla u espressi bħala etajiet permill tal-erja totali tat-tessuti ta 'sezzjonijiet trasversali bl-użu ta' ImageJ 1.49v (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, USA).

Sejbien ta 'PS fil-membrana taċ-ċelluli tubulari tal-kliewi in vivo permezz ta' ċitometrija tal-fluss

L-espożizzjoni tal-PS taċ-ċelluli epiteljali tal-kliewi ġiet evalwata bl-użu ta' analiżi tat-tbajja' ta' Annexin V ittikkettat bl-isothiocyanate tal-fluorescein (FITC), kif deskritt qabel [2]. Iċ-ċelloli ġew osservati (f'kull grupp) taħt mikroskopju laser konfokali (Olympus, Tokyo, Ġappun). L-ammont ta 'esternalizzazzjoni PS ġie determinat bħala l-perċentwal ta' ċelluli pożittivi għall-Annexin V. Il-fluworexxenza ta' Annexin V tal-kampjuni kienet imkejla bl-użu ta' ċitometru tal-fluss (eċċitazzjoni 488 nm/emissjoni 530 nm; Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Kejl tal-livelli ta' TGF- 1 u Smad7 fil-membrana taċ-ċelluli tubulari tal-kliewi permezz ta' western blotting

Wara l-irkupru tal-kampjuni tat-tessut iffriżat, il-proteina ġiet estratta bl-użu tal-kit ta 'estrazzjoni tal-proteini tal-membrana naturali ProteoExtract(M-PEK)(MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA), u l-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata bl-użu ta' analiżi tal-proteina Bio-Rad kit (Hercules, CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Sussegwentement, 40ug ta 'proteina ġew mgħobbija fuq ġel SDS-polyacrylamide ta' 8 fil-mija (ġel ta 'stivar 100 V, ġel li jirrisolvi 200 V) għal 1h f'kurrent kostanti ta' elettrodu ta '300mA. Il-proteini fil-ġel ġew trasferiti fuq membrana tan-nitrocellulose (Kexing Co., Beijing, China), imblukkata għal siegħa f'37 grad f'5 fil-mija trab tal-ħalib xkumat, u inkubati matul il-lejl f'4 gradi C b'nagħaġ anti-far TGF 1 ( ab208466;Abcam, Cambridge, UK) u Smad7 (66,478; Proteintech, Wuhan, iċ-Ċina) antikorpi [25]. Ġie miżjud antikorp sekondarju tal-fenek kontra n-nagħaġ tikkettat bil-perossidażi tal-horseradish (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Beijing, iċ-Ċina) u inkubat f'37 grad għal siegħa. Is-sinjal ġie skopert bl-użu tar-reaġent imsaħħaħ tal-kimiluminixxenza (Abcam). Meded pożittivi ġew analizzati bl-użu ta 'softwer ta' analiżi tad-densità ottika tal-ġel Gel-Pro 4.0, u tkejlet id-densità ottika kumulattiva (valur IOD), bil-valur R jirrappreżenta l-kontenut relattiv ta 'proteina kif ġej: R=valur IOD ta' referenza ta ' PLSCR(mira)/valur IOD ta' referenza ta' GAPDH (proteina ta' referenza).

Kultura taċ-ċelluli u interferenza RNA

Linja taċ-ċelluli epiteljali tal-kliewi (ċelluli MDCK, CCL34, passaġġi 53-90; ATCC, Manassas, VA, l-Istati Uniti) ġiet imkabbra fil-medju Eagle modifikat ta' Dulbecco supplimentat b'antibijotiċi (10{{1{{14} }}} U/mL peniċillina, 100 mg/mL streptomycin; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) u 10 fil-mija serum bovin tal-fetu (Life Technologies Co.) f'37 grad f'5 fil-mija CO, atmosfera u subkultivat b'0.25 fil-mija trypsin u 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (Life Technologies Co., CA, USA). Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'CaOx (0.5 mM; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) għal sagħtejn u b'0.5 mM CaOx u 100 ug/mL antikorp newtralizzanti anti-TGF- 1 （R&D Systems, Minneapolis , MN, USA) għal sagħtejn. L-esperimenti kollha saru fi tliet kopji.

Biex jiġi ddeterminat ir-rwol ta 'PLSCRin PS eversion, ċelluli epiteljali tubulari renali ġew trasfettati b'PLSCR siRNA [26]. siRNA kien iddisinjat u sintetizzat minn Anhui General Biological System(Anhui, Ċina; ara Tabella 1).LipofectamineTM 2000(Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)kien użat għat-trasfezzjoni skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur . Wara 24 siegħa ta 'trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew diġeriti bi trypsin, ċentrifugati f'1000 × g għal 5 min, maħsula darbtejn b'PBS u ċentrifugati mill-ġdid. Is-supernatant ġie mormi, u l-pellet ġie sospiż f'PBS biex tifforma sospensjoni ta 'ċellula waħda ta' densità 1 × 10 gradi ċelluli/mL. Ir-rata pożittiva ta 'espressjoni FAM(carboxyfluorescein) kienet ta' 93 fil-mija ± 5 fil-mija kif determinata minn ċitometrija tal-fluss. Biex tiġi vvalutata aktar ir-relazzjoni bejn TGF 1 u PLSCR, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'0.5 mM CaOx jew 10ng/mL TGF- 1 għal 2 sigħat u sussegwentement trasfettati b'PLSCR siRNA.

Kejl tal-livell tal-PLSCR f'membrani taċ-ċelluli tubulari tal-kliewi permezz ta' western blotting

Il-proteina ġiet estratta bl-użu ta 'kit ta' estrazzjoni ta 'proteini tal-membrana naturali ProteoExtract(Chemical Book Co., Beijing, China), u l-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet determinata bl-użu ta' kit ta 'assaġġ ta' proteina Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Beijing, China). Sussegwentement, 40 ug ta 'proteina ġew mgħobbija fuq ġel SDS-polyacrylamide ta' 8 fil-mija (ġel ta 'stivar 100 V, ġel li jirrisolvi 200 V) għal siegħa f'kurrent kostanti ta' 300 mA. Proteini fil-ġel ġew trasferiti fuq membrana tan-nitrocellulose (Kexing Co., Shenzhen, China) u mblukkati b'5 fil-mija ħalib xkumat għal siegħa f'37C u inkubati matul il-lejl f'4 gradi b'antikorp monoklonali PLSCR kontra l-firien tan-nagħaġ (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, iċ-Ċina). Imbagħad ġie miżjud antikorp sekondarju tal-fenek kontra n-nagħaġ tikkettat bil-perossidasi tal-horseradish (1:400) u t-taħlita ġiet inkubata f'37 grad C għal 1 h. Wara l-ħasil tal-membrana, is-sinjal ġie skopert b'reaġent kimiluminixxenti mtejjeb (Abcam, Guang-zhou, China). Meded pożittivi ġew analizzati bl-użu ta 'softwer ta' analiżi tad-densità ottika Gel-Pro 4.0gel, u tkejjel il-valur IOD, bil-valur R jirrappreżenta l-kontenut relattiv ta 'proteina kif deskritt hawn fuq.

Tabella 1 sekwenzi siRNA għal PLSCR

Kejl tad-distribuzzjoni tal-fosfatidilserina tal-membrana

L-ammont ta 'everżjoni PS tal-membrana taċ-ċellula ġie ddeterminat bl-użu tal-metodu tat-tifi tal-fluworexxenza deskritt minn Kim et al.[27] u t-tim tar-riċerka tagħna [2], b'nitrobenzene-2-oxa-1,3-diazole(NBD, Shanghai, China) bħala s-sonda tal-fluworexxenza. Wara li ttikketta l-PS fis-saff ta 'barra tal-membrana taċ-ċellula b'NBD, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'PBS li kien fih 5 mM diisopropylfluorophosphate. Minn hemm 'il quddiem, PBS li fih l-ossilat tal-kalċju (1.0 mM) ġie miżjud u ċ-ċelloli ġew inkubati f'37 grad. Ammont ugwali ta 'sospensjoni taċ-ċelluli ġie skarikat kull 10 minuti, u l-intensità tal-fluworexxenza ġiet irreġistrata bl-użu ta' spettrofluworometru RF-5000 (Shimadzu, Kyoto, Ġappun). Is-settings ta 'l-ispettrofluworometru kienu kif ġej: wisa' ta 'qasma ta' 10 nm għal wavelength ta 'emissjoni ta' 530 nm; u wisa' ta' qasma ta' 5 nm għal wavelength ta' eċċitazzjoni ta' 470 nm. Sussegwentement, il-valur medju tal-fluworexxenza (FT) ġie rreġistrat matul is-snin 50. L-intensità medja tal-fluworexxenza mnaqqsa (FD) ġiet irreġistrata wkoll wara li tintuża soluzzjoni dithionite biex titfi l-fluworexxenza NBD mis-saff ta 'barra taċ-ċellula. Minn hemm 'il quddiem, 1 fil-mija (w/v)Triton X-100 ġie miżjud biex jippermeabilizza l-membrana taċ-ċellula. Il-fluworexxenza NBD mis-saff ta 'ġewwa tal-membrana taċ-ċellula mbagħad ġiet imkessħa, u l-intensità tal-fluworexxenza (FO) ġiet irreġistrata. Il-perċentwal ta 'NBD-PS fil-lobuli ta' ġewwa ġie kkalkulat aktar tard bl-użu ta 'l-ekwazzjoni li ġejja: perċentwal-età ta' NBD-PS internalizzat =100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Il-perċentwal tal-esternalizzazzjoni tal-PS ġie ddeterminat skont il-prinċipju użat għall-kejl tal-internalizzazzjoni tal-NBD-PS. Il-perċentwal ta 'NBD-PS fil-lobuli ta' barra ġie kkalkulat ukoll bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja: perċentwal ta 'NBD-PS fil-lobuli ta' barra =100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Analiżi statistika

Varjabbli kontinwi huma espressi bħala medja±devjazzjoni standard. Intużaw test ta' rank-sum paired mhux parametriku, test t, u test chi-square. L-analiżi kollha twettqu bl-użu tas-softwer SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Riżultati b'P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Riżultati

Is-sinjalar TGF- 1/Smad jistimula l-esternalizzazzjoni tal-PS in vivo

Formazzjoni tal-kristall fit-tessut renali tal-mudell tal-far

Biex jiġi stabbilit mudell tal-far ta 'stadju bikriġebel fil-kliewiformazzjoni, ethylene glycol u ammonju klorur ġew amministrati lill-istonku tal-firien għal ġimgħatejn, u mbagħad kull sezzjoni tal-kliewi ġiet eżaminata b'mikroskopju diġitali. Fil-kampjuni tal-grupp ta 'kontroll, strutturi tubulari normali tal-kliewi ġew osservati mingħajr formazzjoni ta' kristalli f'jum 14 (Fig.1A). Meta t-tessut tal-kliewi mill-ġebel fil-kliewigrupp kien osservat bil-mikroskopija, it-tubuli renali dehru dilatati b'mikrokristalli viżibbli; akkumulazzjoni okkażjonali ta 'kristalli CaOx kienet osservata f'xi tubuli renali, li jindika t-twaqqif b'suċċess ta' mudell ta 'firien ta' stadju bikriġebel fil-kliewiformazzjoni u l-ġenerazzjoni ta 'ħsara taċ-ċelluli tat-tubuli renali.

Preżenza ta 'PS fil-membrana taċ-ċelluli tubulari tal-kliewi

Annexin V-FITC, molekula fluworexxenti li torbot mal-PS fuq il-wiċċ taċ-ċellula, tintuża ħafna biex tiskopri r-ridistribuzzjoni tal-PS. Fl-istudju tagħna, iċ-ċelloli MDCK fil-kontroll normali,ġebel fil-kliewi, uġebel fil-kliewiflimkien ma 'gruppi SB431542 kienu osservati taħt mikroskopju laser confocal (Fig.1B). Ir-rata PS-eversion żdiedet fil-ġebel fil-kliewigrupp meta mqabbel ma’ dak fil-grupp ta’ kontroll (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">ġebel fil-kliewiflimkien ma 'grupp SB431542 wera livell bażali aktar baxx ta' esternalizzazzjoni PS minn dawk fil-kliewiġebelgrupp (P<0.05, fig.="" 1c,="">

Kejl tal-livelli TGF- 1 u Smad7

Il-livell TGF- 1 fil-ġebel fil-kliewigrupp ġie kkwantifikat minn western blotting. Blot tipiku tal-Punent huwa muri f'Fig.2A flimkien mal-analiżi densitometrika tal-livell TGF- 1. Il-valuri ġew normalizzati għal dawk tal-kontroll u espressi bħala l-proporzjon ta 'TGF- 1 għal tubulin. Iż-żieda ta 'ethylene glycol u NH Cl żiedet b'mod sinifikanti l-livell ta' TGF - 1 u naqqset il-livell Smad7 meta mqabbel ma 'dawk fiċ-ċelloli ta' kontroll (Fig.2A); madankollu, it-trattament b'SB431542 flimkien ma' ethylene glycol u NH Called naqas b'mod sinifikanti l-livell ta 'TGF- 1 u żied il-livell Smad7 meta mqabbel ma' dawk f'ċelloli ttrattati b'ethylene glycol u NH, Cl.

TGF jattiva l-attività PLSCR fil-membrana taċ-ċelluli tat-tubuli renali in vitro

PLSCR

Il-livell ta 'PLSCR ġie evalwat permezz ta' western blotting. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'CaOx għal sagħtejn. Il-livell tal-PLSCR kien negliġibbli fiċ-ċelloli tal-kontroll iżda żdied b'mod sinifikanti fil-grupp CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Indeboliment NBD-PS moviment 'il ġewwa

Aħna ddeterminajna movimenti 'l ġewwa u 'l barra ta' PS fil-membrana taċ-ċelluli epiteljali tubulari renali biex nevalwaw l-attività PLSCR. Biex tivvaluta jekk PLSCR jinfluwenzax il-moviment ta 'PS mill-fuljett ta' barra għall-fuljett ta 'ġewwa tal-membrana tal-plażma, aħna integrajna PS ittikjati b'mod fluworexxenti (NBD-PS) fil-fuljett ta' barra tal-membrana tal-plażma u mmonitorjajna l-internalizzazzjoni tagħha (Fig.3). L-ammont ta 'NBD-PS internalizzat minn ċelluli MDCK fil-gruppi ta' kontroll u CaOx kien ta 'madwar 46.2 fil-mija u 17.8 fil-mija, rispettivament. Għalhekk, ir-rata ta 'internalizzazzjoni PS fiċ-ċelloli tal-grupp CaOx kienet sinifikament aktar baxxa minn dik fiċ-ċelloli tal-grupp ta' kontroll (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Fig. 1 Il-formazzjoni tal-kristall u l-esternalizzazzjoni tal-PS ġew osservati fil-gruppi ta 'kontroll, ġebel fil-kliewi, u ġebel fil-kliewi flimkien ma' SB431542.

(A) Formazzjoni tal-kristall fit-tessut renali f'jum 14; vleġġa tindika strutturi mikrokristallini. (B) Ċelloli MDCK ġew osservati permezz ta 'mikroskopija tal-laser konfokali.

(C) Plottijiet ċitometriċi tal-fluss tar-rata ta 'everżjoni. (D) Rata ta' everżjoni ( fil-mija ). Trijanglu jindika P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">ġebel fil-kliewigrupp

Moviment ta' barra NBD-PS imtejjeb

Biex jiġi ddeterminat jekk it-trasport 'il barra ta' PS huwiex affettwat mill-oxalate, iċ-ċelluli MDCK ġew ittikkettati intraċellulari b'NBD-PS, u ġie determinat il-limitu tal-moviment tiegħu għall-fuljett tal-eżempji-mic. Il-mezz ta 'inkubazzjoni kien fih albumina tas-serum bovin (1 fil-mija w/v), li estratt malajr NBD-PS espress fil-wiċċ. Madwar 34.5 fil-mija ta 'NBD-PS emigraw lejn il-fuljett ta' barra fiċ-ċelloli ta 'kontroll, filwaqt li r-rata ta' trasferiment ta 'PS 'il barra fiċ-ċelloli tal-grupp CaOx żdiedet għal 75.3 fil-mija meta mqabbla ma' dik tal-NBD-PS tikkettat ta 'ġewwa totali, li kienet akbar b'mod sinifikanti minn li fiċ-ċelloli tal-grupp ta' kontroll (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Fig.2 Espressjoni TGF- 1/Smad fil-kontroll, ġebla fil-kliewi, u ġebla fil-kliewi flimkien mal-gruppi SB431542, u espressjoni PLSCR fil-membrana taċ-ċelluli tat-tubuli renali.

(A)TGF- 1/Smad espressjoni. (B) Livelli relattivi ta' phospholipid scramblase (PLSCR) u blot rappreżentattiv b'espressjoni normalizzata għal dik ta' GAPDH.P<>

Trijanglu jindika P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

Agħfas HAWN GĦALL-PARTI Ⅱ