L-Estratt ta' Herba Cistanche Itejjeb l-Istatus tal-Glutathione Mitokondrijali U r-Respirazzjoni fil-Qlub tal-Firien, B'Induzzjoni Possibbli ta' Proteini ta' Separazzjoni

Introduzzjoni

Ir-riperfużjoni ta’ mijokardju li qabel kien iskemiku tikkawża serje ta’ bidliet mitokondrijali, inkluż żieda fil-produzzjoni ta’ speċi ta’ ossiġnu reattiv (ROS), Ca2+tagħbija żejda, u tnaqqis fil-produzzjoni ta 'adenosine triphosphate (ATP), li kollha jistgħu jwasslu għal nekrożi u/jew mewt taċ-ċelluli medjata mill-apoptożi (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Peress li l-mitokondrija għandhom rwol kruċjali fid-determinazzjonifid-destin tal-kardjomijoċiti wara sfida iskemija/riperfużjoni (I/R), il-protezzjoni kontra l-korriment mijokardijaku I/R għandha għalhekk tkun immirata lejn il-preservazzjoni tal-integrità strutturali u funzjonali mitokondrijali. Il-manutenzjoni tal-metaboliżmu tal-enerġija mitokondrijali wara l-isfida I/R hija partikolarment importanti minħabba li l-funzjoni kontrattili tal-qalb hija kważi kompletament dipendenti fuq ATP iġġenerat mill-mitokondrija. Il-kardjomijoċiti li huma ħajjin iżda li ma jikkuntrattawx huma ta' użu żgħir ħafna.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-IMMUNITÀ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, il-pjanta mnixxfa kollha ta 'Cistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), hija pjanta parassitika li tikber prinċipalment fiż-żoni tad-deżert tat-tramuntana u l-grigal taċ-Ċina. Herba Cistanche, klassifikata bħala ħaxix "Jang-invigorating" fil-mediċina Ċiniża, huwa preskritt għal defiċjenza tal-kliewi, sterilità femminili, u stitikezza li tirriżulta minn nixfa tal-musrana f'pazjenti senili (Chen, 1998). Studji preċedenti fil-laboratorju tagħna wrew li metanolestratt ta' Herba Cistancheiżid il-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mijokardijaku (Leung & Ko, 2008) u jipproteġi kontra l-korriment mijokardijaku I/R fil-firien (Leung, 2006). Billi l-istimulazzjoni tal-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP kienet parallela bit-titjib fit-trasport tal-elettroni mitokondrijali (Leung & Ko, 2008), il-kardjoprotezzjoni kontra l-ħsara I/R mogħtija mit-trattament ta 'Herba Cistanche kienet assoċjata ma' tnaqqis fit-tnaqqis tal-ATP mijokardijaku (Leung, 2006). Fl-istudju preżenti, biex niddefinixxu r-rwol tal-mitokondrija fl-azzjoni kardjoprotettiva ta 'Herba Cistanche, investigajna l-effett tat-trattament ta' Herba Cistanche fuq l-istatus tal-glutathione mitokondrijali, il-kontenut ta 'Ca2+, il-potenzjal tal-membrana, u r-rata ta' respirazzjoni, fil-qlub tal-firien .

materjali u metodi

Materjal erbali

Herba Cistanche inxtara minn negozjant tal-ħxejjex lokali (bbażat f'Hong Kong) (Lee Hoong Kee). Il-ħwawar ġiet awtentikata mill-fornitur u kampjun ta 'vawċer (HKUST00301) ġie depożitat fid-Dipartiment tal-Bijokimika, l-Università tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta' Ħong Kong (HKUST). L-estrazzjoni tal-metanol tal-ħaxix twettqet, ibbażata fuq studji preċedenti li jindikaw li tali estratt saħħaħ il-ġenerazzjoni ta 'ATP mitokondrijali u protett kontra l-ħsara I / R fil-qlub tal-firien (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Fil-qosor, Herba Cistanche (400 g) inqatgħet f'biċċiet żgħar u estratt bit-tisħin taħt rifluss fi 300mL ta 'metanol f'60 grad għal 2h, kif deskritt qabel (Leung & Ko, 2008). Il-proċedura ġiet ripetuta darbtejn. L-estratt miġbur ġie mnixxef billi s-solvent jiġi evaporat taħt pressjoni mnaqqsa; ir-rendiment kien 42% (w/w) dwar l-ammont ta 'ħwawar mhux raffinat. L-estratt inħażen f'4 gradi sakemm jintuża. Għalkemm il-ħxejjex Ċiniżi huma tradizzjonalment estratti bl-ilma għall-konsum orali, il-metanol intuża fl-istudju preċedenti tagħna għall-konvenjenza fl-ipproċessar u l-ħażna tal-kampjuni (Yim & Ko, 2002), u sibna li l-estrazzjoni tal-metanol kienet sodisfaċenti fl-aspetti kollha.

Kura tal-annimali u trattament tad-droga

Firien adulti nisa Sprague-Dawley (8-10 ġimgħat; 200-230 g) kienu miżmuma f'kamra kkontrollata bl-umdità, b'ċiklu ta 'dlam/dawl ta' 12-il siegħa, f'madwar 22 grad, u ppermettew ikel u ilma ad libitum. L-annimali ġew assenjati b'mod każwali għal gruppi differenti, b'ħames annimali f'kull grupp. Il-firien irċevew il-Estratt ta' Herba Cistancheintragastrikament ({{0}}.2 g/mL fl-ilma) fi 0.5g/kg jew 1.0 g/kg għal 3 ijiem konsekuttivi. Annimali ta' kontroll (mhux ittrattati) irċevew ilma biss. Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-aħħar dożaġġ, inkiseb tessut ventrikulari tal-qalb minn annimali anestetizzati għal analiżi bijokimika. Il-protokolli sperimentali kollha ġew approvati mill-Kumitat tal-Prattika tar-Riċerka, HKUST.

Preparazzjoni ta' frazzjonijiet mitokondrijali

Tessuti ventrikulari tal-qalb ikkapuljat (~{{0}}.6g) ġew omoġenizzati f'{2}}darbiet (w/v) eċċess ta 'buffer sukrożju kiesaħ fis-silġ [0.32M sukrożju, 1mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] bl-użu ta' omoġenizzatur tat-Teflon-ħġieġ, f'4000 rpm, b'25-30 strokes. Il-gerbub mitokondrijali ġew ippreparati minn omoġenati tat-tessuti biċ-ċentrifugazzjoni f'800 × g f'4 gradi għal 30min, u l-purità ġiet iddeterminata permezz ta 'kejl tal-attivitajiet speċifiċi relattivi ta' succinate dehydrogenase u lactate dehydrogenase fis-supernatant u l-pellet, rispettivament, kif deskritt qabel (Evans, 1992). Il-gerbub mitokondrijali ġew sospiżi f'1mL ta 'buffer omoġenizzat.

Kejl tal-livelli ta 'glutathione mnaqqsa mitokondrijali u glutathione ossidizzat

Il-livelli ta' glutatijon imnaqqas mitokondrijali (GSH) ġew determinati b'mod enżimatiku bl-użu ta' 5,59-dithiobis(2- nitrobenzoic acid) (DTNB) u glutathione reductase (GR), fi protokoll modifikat minn Griffith (198{{17} }). Alikwot (210 µL) tal-frazzjoni mitokondrijali tħallat ma' 90 µL ta' 10% (v/v) 5-aċidu sulfosaliċiliku (SSA) u l- it-taħlita ġiet ċentrifugata f'600 × g għal 10min. Biex jitkejlu l-livelli ta 'glutathione ossidizzat (GSSG), ammonti ta' 100µL ta 'supernatanti SSA tħalltu ma' 10 µL ta '20% (w/v) 2-vinylpyridine u 10 µL 60% (v/v) triethanolamine f'tubi mikrofuge. Kull tubu tħalla joqgħod f'temperatura tal-kamra għal mill-inqas siegħa. Taħlita ta 'reazzjoni li fiha 0.63mM DTNB u 0.053mM NADPH (nikotinamide adenine dinucleotide fosfat imnaqqas) f'buffer tal-fosfat (0.1M, b'5mM Na2 EDTA; pH7.5) ġiet inkubata minn qabel fi 30 grad għal 2min. Alikwot (30 µL) jew ta’ supernatant ta’ kampjun SSA (glutathione totali) jew kampjun GSSG ġie miżjud ma’ bir ta’ pjanċa ta’ mikrotiter ta’ 96-bir, u 180 µL ta’ taħlita ta’ reazzjoni msaħħna minn qabel, li fiha 0.525U/ mL GR, ġie miżjud wara. Bidliet fl-assorbiment f'412nm ġew immonitorjati spettrofotometrikament għal 5min. Il-konċentrazzjonijiet ta 'GSH u GSSG ġew stmati minn kurvi ta' kalibrazzjoni bl-użu ta 'GSH u GSSG [maħlul fi 3% (w/v) SSA] bħala standards u espressi bħala nmol/mg proteina. Il-livelli ta' GSH ġew stmati billi naqqas id-doppju tal-ammont ta' GSSG minn dak ta' GSH totali.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kejl tal-kontenut ta' Ca2+ mitokondrijali

Il-kontenut ta' Ca{{0}}} mitokondrijali tkejjel bl-użu ta' sonda ta' fluworexxenza sensittiva għal Ca{{-5N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) li juża Victor2 Multi-Label Counter (Mudell 1420; PerkinElmer, Turku, il-Finlandja), kif deskritt f'Menze et al. (2005). Il-kostanti ta' dissoċjazzjoni Ca2+ (valuri Kd) ġew determinati bl-użu ta' kit ta' kalibrazzjoni Ca{2+ validu fil-medda ta' konċentrazzjoni 1–1000 µM; valuri Kd stmati kienu 90–100 µM, b'affidabilità għolja, skont id-dejta tal-manifattur tal-kit. Alikwot (25µL) tal-frazzjoni mitokondrijali (0.5mg proteina/mL konċentrazzjoni finali) tħallat ma' 25 µL buffer ta' inkubazzjoni {100mM KCl u 30mM MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]; pH7.2} fi 96-pjanċa sewda tal-mikrotiter. It-taħlita ġiet inkubata f'25 grad għal 15-il minuta; Imbagħad ġew miżjuda 25 µL digitonin (50 µg/mL) u 25 µL Fluo-5N AM ester (1 µM f'0.005% (w/v) Pluronic F-127). Billi tiffaċilita l-permeazzjoni tal-membrana, id-digitonin medja d-dħul mitokondrijali ta 'żebgħa fluworexxenti. Sibna li l-livelli ta' Fluo-5N fi preparazzjonijiet mitokondrijali tal-qalb tal-firien żdiedu 20-darbiet fil-preżenza ta' digitonin. It-taħlitiet ta 'reazzjoni ġew inkubati f'25 grad għal 30 minuta, u l-qari tal-fluworexxenza tkejjel f'wavelength ta' eċċitazzjoni ta '488nm u wavelength ta' emissjoni ta '532nm. Il-kontenuti ta' Ca2+ mitokondrijali ġew stmati bl-użu ta' kurva ta' kalibrazzjoni u espressi bħala µmol/mg proteina.

Kejl tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali

Il-potenzjal tal-membrana (ΔΨm) ġie vvalutat b'metodu modifikat minn dak ta 'Bonavita et al. (2003), bl-użu ta 'żebgħa fluworexxenti, is-sonda katjonika lipofilika 5,596,69- tetrachloro-1,193,39-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, komunement imsejjaħ JC-1. Alikwoti (50 µL) ta’ frazzjonijiet mitokondrijali (aġġustati għal 1mg proteina/mL) ġew inkubati f’37 grad b’50 µL ta’ soluzzjoni ta’ substrat (li fihom 6mM pyruvate u 6mM malate), 25 µL ta’ soluzzjoni ta’ adenosine diphosphate (ADP) trattat minn qabel (30mMDP), u 25 µL ta' 3 µM JC-1, fid-dlam. Il-valuri ΔΨm inkisbu billi tkejjel il-fluworexxenza f'535nm (FL1) kontra 580nm (FL2), bl-użu tal-Victor2 MultiLabel Counter. JC-1 jifforma aggregati fil-mitokondrija, li jirriżultaw f'valuri għolja ta' fluworexxenza FL2 u li jindikaw potenzjal mitokondrijali normali. Telf ta' ΔΨm iwassal għal tnaqqis fil-fluworexxenza FL2 (aggregati JC-1 sa ċertu punt) u żieda konkomitanti fil-fluworexxenza FL1 (minn monomeri JC-1). Id-dejta kienet espressa bħala proporzjonijiet tal-valuri tal-fluworexxenza FL1/FL2. Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), aġent ta ' kollass ΔΨm, intuża biex jivvalida l-assaġġ.

Kejl tar-respirazzjoni mitokondrijali

Ir-rata ta 'respirazzjoni mitokondrijali kienet imkejla f'37 grad bl-użu ta' strument Hansatech Oxygraph-Plus mgħammar b'elettrodu ta 'ossiġnu tat-tip Clark (Sarasota, FL, USA). Frazzjonijiet mitokondrijali (0.6mg proteina/mL) ġew sospiżi f'respiration buffer li kien fih 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, 0.5mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), u 2mM KH2 PO4; pH 7.2. Wara inkubazzjoni f'37 grad għal 2min, kull kampjun irċieva 50 µL soluzzjoni ta' substrat (5mM piruvat u 5mM malat). Ir-rati ta 'respirazzjoni tkejlu fil-preżenza (Stat 3) ta' 1mM ADP u wara fosforilazzjoni ta 'l-ADP kollu għal ATP (Stat 4). Il-proporzjon tar-rati ta 'l-Istat 3:State 4respiration huwa l-indiċi tal-kontroll respiratorju, li jindika l-issikkar ta' l-akkoppjar bejn ir-respirazzjoni u l-fosforilazzjoni (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Qabel iż-żieda tas-soluzzjoni tas-sottostrat, ir-rata ta 'respirazzjoni tal-Istat 1 ġiet imkejla sal-bidu tar-respirazzjoni tal-Istat 2, u r-rata ta' respirazzjoni tal-Istat 2 ġiet stmata qabel iż-żieda tal-ADP.

Analiżi statistika

Id-dejta ġiet analizzata b'analiżi one-way tal-varjanza (ANOVA) għal paraguni ta' gruppi multipli. Il-valuri tal-inqas differenza sinifikanti (LSD) intużaw biex jidentifikaw differenzi sinifikanti bejn iż-żewġ gruppi meta l-valuri p kienu < 0.05.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Riżultati

Kif muri fil-Figuri 1 u 2, trattament b'metanolestratt ta' Herba Cistanche({{0}}.5 jew 1.0g/kg/jum×3) tejbet b'mod sinifikanti l-istatus tal-glutathione mitokondrijali fil-qlub tal-firien, kif muri minn żidiet dipendenti mid-doża fil-livelli ta' GSH (11-30%) u tnaqqis fil- Livelli GSSG (31%).

Il-kura b'Herba Cistanche naqqset il-livelli ta' Ca2+ mitokondrijali fil-qlub tal-firien b'mod dipendenti fuq id-doża meta mqabbla mal-kontrolli; soppressjoni kienet 41% f'doża ta '1.0 g/kg (Figura 3).

It-trattament b'Herba Cistanche żied il-ΔΨm mitokondrijali, kif muri minn tnaqqis (14-16%) fil-proporzjon FL1/FL2. CCCP (100 µM) ikkawża kollass ΔΨm, kif indikat minn żieda fil-proporzjon FL1/FL2 (Figura 4).

Trattament Herba Cistancherespirazzjoni mitokondrijali mtejba, kif muri minn rata ogħla b'mod sinifikanti ta 'respirazzjoni Stat 3 (84%) f'annimali tat-test meta mqabbla mal-kontrolli (Tabella 1). Il-livelli ta 'respirazzjoni tal-Istat 2 u tal-Istat 4 żdiedu b'47 u 80%, rispettivament, iżda l-istimulazzjoni tar-respirazzjoni tal-Istat 4 ġiet imrażżna kompletament minn 1mM guanosine -5'-diphosphate, inibitur ta' proteina ta 'uncoupling 2/3. It-trattament b'Herba Cistanche ma affettwax l-indiċi tal-kontroll respiratorju, kif stmat mill-proporzjon tar-rati ta' respirazzjoni Stat 3/Stat 4.

Diskussjoni

Il-mitokondrija iżolata minn qlub tal-firien ittrattati b'Herba Cistanche wrew status ta 'glutathione mtejjeb, kif indikat minn livelli miżjuda ta' GSH u livelli mnaqqsa ta 'GSSG. Iż-żamma tal-istatus redox tal-glutathione mitokondrijali hija kritika għall-kardjoprotezzjoni kontra l-korriment I/R (Chiu & Ko, 2003). Il-kontenut ta' Ca2+ ċitosoliku jiżdied waqt l-iskemija mijokardijaka, permezz tal-assorbiment mill-uniporter ta' Ca2+ tal-membrana ta' ġewwa (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), li jwassal għal Ca{{6} mitokondrijali } akkumulazzjoni. Ir-riżultati tagħna jindikaw li t-trattament bl-estratt ta 'Herba Cistanche tejjeb l-istatus redox tal-glutathione mitokondrijali u naqqas il-livell ta' Ca 2+ mitokondrijali, li jista 'joffri protezzjoni kontra korriment I/R mijokardijaku (Leung, 2006). L-inkapaċità tat-trattament b'Herba Cistanche, f'doża ogħla ta' 1.0 g/kg, biex ikompli jonqos il-livelli ta' GSSG u Ca2+, tista' tkun relatata mal-eżistenza ta' mekkaniżmu regolatorju li jillimita lilu nnifsu li jaffettwa l-potenzjal redox tal-glutathione u l-istatus tal-kalċju fil-mitokondrija.

Il-mitokondrija jiġġeneraw gradjent tal-protoni elettrokimiku madwar il-membrana ta 'ġewwa, permezz tat-trasport tal-elettroni. Dan il-gradjent jintuża minn ATP synthase biex fosforilata ADP għal ATP. Tnaqqis tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali, bħal f'ipoksja / riossiġenazzjoni wara korriment ta 'kardjomijoċiti kkultivati ​​(Chiu et al., 2008), jirriżulta fi tnaqqis fil-ġenerazzjoni ta' ATP. It-trattament b'Herba Cistanche, li jista' jżid il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali mijokardijaka, possibbilment itejjeb il-ġenerazzjoni ta' ATP, partikolarment waqt riperfużjoni post-iskemika. Għal darb'oħra, l-eżistenza ta 'mekkaniżmu regolatorju li jillimita lilu nnifsu tista' tispjega għaliex l-effetti tat-trattament ta 'Herba Cistanche fuq il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali mhumiex dipendenti mid-doża.

It-trattament ta 'Herba Cistanche żied ħafna r-rata ta' respirazzjoni tal-Istat 3 fil-mitokondrija tal-qalb tal-firien, kif evalwat mill-konsum tal-ossiġnu. Din is-sejba hija konsistenti mar-riżultati miksuba minn kejl in vitro u situ tal-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali (Leung & Ko, 2008). B'mod intriganti, għalkemm it-trattament ta 'Herba Cistanche naqqas il-livell ta' stat fiss ta 'ATP mijokardijaku (dejta mhux murija), it-trattament saħħaħ il-ġenerazzjoni ta' ATP mitokondrijali. L-involviment ta' respirazzjoni mhux akkoppjata jista' jispjega dawn l-osservazzjonijiet diskrepanti. Il-fosforilazzjoni ossidattiva mhux akkoppjata sseħħ meta l-protoni jiġu mċaqalqa tul il-membrana ta 'ġewwa mitokondrijali lura fil-matriċi mitokondrijali, u b'hekk jinħela l-potenzjal tal-membrana ffurmat mill-katina tat-trasport tal-elettroni. Dan jirriżulta fi tnaqqis tal-forza li tmexxi l-protoni li tmexxi l-formazzjoni tal-ATP (Garvey, 2003). Bħala konsegwenza, il-konċentrazzjoni ta' Ca2+ u l-produzzjoni ta' ROS fil-mitokondrija huma attenwati b'mod drammatiku (Teshima et al., 2003). Dan is-suġġeriment huwa konsistenti mar-riżultati tal-istudju preżenti, li wera tnaqqis fil-livelli ta' Ca2+ mitokondrijali fil-qlub ittrattati b'Herba Cistanche. Rigward respirazzjoni mhux akkoppjata, sinteżi ta 'proteini uncoupling (UCPs) tista' tiġi indotta minn kura b'Herba Cistanche. L-UCPs huma magħrufa li jiskoppjaw il-fosforilazzjoni ossidattiva, u l-espressjoni ta 'UCP1 fil-qlub tal-ġrieden transġeniċi protetti kontra ħsara mijokardijaka indotta minn I/R (Hoerter et al., 2004). L-effett ta 'uncoupling ta' UCPs kien inibit minn difosfati u trifosfati tan-nukleotidi tal-purini (bħal ADP, ATP, guanosine diphosphate (GDP) u GTP) (Echtay et al., 2002). Fl-istudju preżenti, parametri mitokondrijali bħall-potenzjal tal-membrana u r-rata ta 'respirazzjoni ġew imkejla fil-preżenza ta' ADP (bħala sottostrat); l-effett ta' diżakkoppjar tal-UCPs kien għalhekk inibit. Madankollu, meta r-rata ta' respirazzjoni tal-Istat 4 mitokondrijali kienet imkejla fin-nuqqas ta' ADP, din ir-rata kienet ogħla fil-mitokondrija ppreparati minn qlub ittrattati b'Herba Cistanche milli fi qlub ta' kontrolli mhux ittrattati. Ir-rata ta' respirazzjoni tal-Istat 4 tirrifletti l-konsum tal-ossiġnu mill-mitokondrija meta l-protoni jnixxu lura fil-matriċi mitokondrijali permezz ta' mekkaniżmu li ma jinvolvix F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). L-involviment possibbli tal-UCPs fiż-żieda indotta minn Herba Cistanche fir-respirazzjoni tal-Istat 4 huwa appoġġjat mis-sejba li dan it-titjib kien mrażżan mill-PGD (Bento et al., 2007).

Bħala konklużjoni, it-trattament b'Herba Cistanche jista' jtejjeb l-istatus tal-glutathione mitokondrijali, inaqqas il-livell ta' Ca2+ mitokondrijali, u jżid il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali u r-rata ta' respirazzjoni fil-qlub tal-firien. It-titjib tal-istatus tal-glutathione mitokondrijali u l-kapaċità funzjonali, u l-induzzjoni putattiva tal-UCPs, jistgħu jkunu relatati mal-kardjoprotezzjoni mogħtija minnTrattament Herba Cistanchewara korriment I/R.

NATURALI CISTANCHE TUBULOSA PLANT CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%