Proprjetajiet Benefiċi għas-Saħħa tal-Estratt taż-Żerriegħa tad-Dwieli U L-Influwenza tiegħu fuq Markers Bijokimiċi Magħżula fid-Demm, Fwied U Kliewi tar-Rattus Norvegicus
Mar 10, 2022
Astratt:Il-kadmju (Cd) huwa metall tqil li jseħħ fl-oqsma kollha tal-ambjent, inkluża l-katina tal-ikel. Fil-ġisem, tikkawża stress ossidattiv billi tipproduċi radikali ħielsa li huma ta 'ħsara għaċ-ċelloli. L-estratt taż-żerriegħa tal-għeneb (GSE) fih firxa wiesgħa ta 'komponenti bijoloġikament attivi li jgħinu biex jinnewtralizzaw l-effetti negattivi tar-radikali ħielsa. F'dan l-istudju, ġew immonitorjati l-effetti ta 'GSE ippreparat minn kultivari tad-dwieli semi-reżistenti Staġun, li huwa rikka fil-fenoliċi, fuq markaturi bijokimiċi ta' firien kannella esposti għall-effetti tal-kadmju. GSE żied l-attività antiossidant fil-plażma u, fil-kliewiu l-fwied, il-kontenut ta 'Cd kien imnaqqas b'mod sinifikanti mill-ko-amministrazzjoni tal-GSE. Għaldaqstant, iż-żieda fil-kontenut tal-krejatinina u l-attività tal-alanine aminotransferase u t-tnaqqis tal-attivitajiet ta 'catalase u superoxide dismutase ikkawżati mill-kadmju tnaqqsu mill-ko-amministrazzjoni ta' GSE. Ir-riżultati ta 'dan ix-xogħol jiżvelaw li l-estratt taż-żerriegħa tal-għeneb joffri effett protettiv kontra l-konsum ta' metalli tqal fl-organiżmu.
1. Introduzzjoni
Il-kadmju (Cd) huwa metall tqil li jseħħ fl-oqsma kollha tal-ambjent; huwa parti mill-qoxra tad-Dinja, jinsab fl-ilma, jakkumula fil-pjanti, u huwa preżenti fl-organiżmi. Minbarra l-katina tal-ikel (f'termini ta' pjanti, il-biċċa l-kbira taċ-ċereali, l-għelejjel tal-għeruq, u l-ħxejjex huma sorsi, filwaqt li fost l-organi tal-annimali, primarjament il-fwied ukliewihuma sors), sors importanti ta 'kadmju għall-bnedmin huwa d-duħħan tas-sigaretti, exhalations minn diversi tipi ta' kombustjoni, industriji metallurġiċi, u xi installazzjonijiet elettriċi [1,2]. Fil-ġisem, il-kadmju jeħel b'mod predominanti ma 'metallothionein, albumina, u proteini oħra tal-plażma fid-demm. Il-kadmju huwa metall tossiku perikoluż li jikkawża stress ossidattiv billi jipproduċi radikali ħielsa li jagħmlu ħsara liċ-ċelloli. Ir-radikali ħielsa jistgħu jagħmlu ħsara lill-proteini, il-lipidi, l-enżimi u d-DNA, u għalhekk għandhom jiġu newtralizzati minn antiossidanti qabel ma jidħlu fiċ-ċelloli [3].
Jekk mhux newtralizzat, is-Cd jikkawża d-diżintegrazzjoni taċ-ċelluli ħomor tad-demm [4], jakkumula fl-organiżmu—, speċjalment fil-fwied ukliewi—u, minħabba x-xebh tiegħu maż-żingu, li huwa element essenzjali, jidħol faċilment f'reazzjonijiet enżimatiċi u jipparteċipa fi proċessi bijokimiċi [5]. Huwa eliminat biss bil-mod ħafna u b'diffikultà mill-organiżmu [6]. Huwa magħruf sew li l-antiossidanti jista 'jkollhom effett protettiv kontra l-istress ossidattiv u l-ħsara tal-metall tqil, u dan ix-xogħol sperimentali kien ibbażat fuq dan il-fatt. L-estratt taż-żerriegħa tal-għeneb (GSE) fih firxa wiesgħa ta 'komponenti bijoloġikament attivi fil-matriċi tiegħu [7] li jgħinu biex jinnewtralizzaw l-effetti avversi tar-radikali ħielsa. GSE jipproteġi ċ-ċelloli mill-ħsara billi jirregola l-ħsara ossidattiva ċellulari, inaqqas il-ħsara lill-organi, itejjeb il-bilanċ bejn l-ossidanti u l-antiossidanti, u jnaqqas ir-rilaxx ta 'medjaturi infjammatorji. Għandu wkoll effetti anti-infjammatorji, antiapoptotiċi u pro-proliferattivi [8]. Il-kontenut għoli ta' flavan-3-ol jew procyanidins ikkondensati, li qed jiġu investigati bħala metodu alternattiv ta' trattament għal mard serju, huwa partikolarment sinifikanti [9,10]. Madankollu, il-kontenut u l-kompożizzjoni tal-fenoli taż-żerriegħa tal-għeneb, kif ukoll l-attività antiossidanti tal-estratt taż-żerriegħa, jistgħu jiġu influwenzati minn kultivari tad-dwieli, għeruq, kundizzjonijiet klimatiċi, jew tekniki tat-tkabbir [11-13] u, għalhekk, proprjetajiet antiossidanti, kif kif ukoll l-effetti protettivi ta 'estratt tal-konkrit, ma jistgħux jiġu mbassra faċilment. L-għan ta’ dan ix-xogħol kien li jistudja l-effett protettiv ta’ GSE ippreparat minn cultivar tad-dwieli semi-reżistenti Cerason fuq markaturi bijokimiċi fid-demm, fil-plażma, fil-fwied, ukliewita’ firien kannella li kienu ġew esposti għall-effetti tal-kadmju.
Kliem ewlieni:estratt taż-żerriegħa tal-għeneb; antiossidanti; kadmju; rattus norvegicus; Markers bijokimiċi; effett protettiv; kliewi, Renali
CISTANCHE SE TTEJB IL-FUNZJONI TAL-KLIEI/RENALI
2. Riżultati u Diskussjoni
2.1. Attività Antiossidanti u Kompożizzjoni Fitokimika tal-Estratt taż-Żerriegħa tal-Għeneb
L-estratt taż-żerriegħa tal-għeneb ippreparat mill-varjetà semi-reżistenti Cerason ġie ttestjat għal attività antiossidanti, kontenut polifenoliku totali, u antiossidanti individwali magħżula. L-attività antiossidant ġiet iddeterminata spettrofotometrikament bl-użu ta 'erba' metodi bbażati fuq prinċipji differenti (DPPH• , ABTS• plus , FRAP, FR) u l-komposti polifenoliċi totali ġew determinati bil-metodu Folin–Ciocalteu. Skont il-metodu użat, l-attività antiossidant varjat minn 7 sa 31 mg / g ekwivalenti ta 'aċidu galliku (GAE) u l-kontenut polifenoliku totali kien 9.3 mg / g GAE (Tabella 1). Ir-riżultati ta 'din il-parti tal-esperiment indikaw il-potenzjal antiossidant għoli fiż-żerriegħa tal-għeneb.
2.2. Determinazzjoni In Vivo tal-Effett tal-Estratt taż-Żerriegħa tal-Għeneb fil-Firien
2.2.1. Determinazzjoni tal-Kontenut ta' Kadmju fid-Demm, Fwied, u KliewiIl-kadmju huwa l-iktar metall tossiku prevalenti fl-għalf. Wara l-amministrazzjoni orali, huwa assorbit mill-imsaren, ittrasportat lejn il-fwied, u konjugat ma 'gruppi thiol ta' metallothionein (MT). Barra minn hekk, is-Cd jista’ wkoll ikun marbut ma’ albumina, jew proteini oħra fid-demm [14]. Sussegwentement, is-Cd jakkumula fil-ġisem, jitneħħa biss bil-mod mill-ġisem permezz tal-awrina u l-ħmieġ u għandu half-life bijoloġika ta 'madwar 20 sena. L-akbar ammont (madwar terz) ta 'kadmju jinstab fil-kliewikortiċi. Fid-demm, il-biċċa l-kbira tal-kadmju (madwar 90 fil-mija) huwa preżenti fiċ-ċelluli ħomor tad-demm. Huwa tossiku għal firxa wiesgħa ta 'organi u l-miri ewlenin huma l-kliewi, għadam u pulmuni [15–17]. GSE ġie rrappurtat li jbaxxi l-konċentrazzjonijiet tal-kadmju fiċ-ċelluli ħomor tad-demm u fil-kliewi,billi l-kontenut tiegħu fil-fwied ġie rrappurtat li jiżdied [14]. Ir-riżultati għall-kontenut ta 'kadmju fid-demm f'dan l-istudju huma murija fil-Figura 1A. Fil-bidu tal-esperiment, instabu 3.2 µg/kg ta’ kadmju fid-demm tal-annimali. Matul l-esperiment, wara 14-il jum, il-valur medju tal-kadmju fil-grupp biż-żieda ta 'GSE u kadmju kien ogħla b'mod sinifikanti minn fi gruppi oħra (10.8 µg/kg, p=0.023). Wara 28 jum, il-varjabbiltà tad-dejta kienet għolja wisq biex tosserva sinifikat statistiku.
Fil-bidu tal-esperiment, ma nstab l-ebda kadmju fil-fwied (Figura 1B) tal-annimali sperimentali. Għaldaqstant, l-ebda kadmju ma ġie skopert fil-fwied tal-annimali mill-gruppi ta 'kontroll u GSE matul l-esperiment. Min-naħa l-oħra, wara 14-il jum ta 'l-esperiment, il-valur medju tal-kadmju fil-grupp biż-żieda ta' kadmju kien 5.8 mg/kg u fil-grupp biż-żieda ta 'kadmju u GSE, il-valur medju kien 5.2 mg/kg. Dawn iż-żewġ valuri kienu differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta 'kontroll (p=0.002 u p=0.018 għall-grupp tal-kadmju biss u l-grupp bil-kadmju u GSE, rispettivament). Wara 28 jum, il-valur medju fil-grupp biż-żieda ta 'kadmju kien żdied għal 6.7 mg/kg, li kien differenti b'mod sinifikanti mil-livell tal-kadmju fil-grupp biż-żieda ta' kadmju u GSE, li kienu naqsu ftit għal 4.8 mg/kg (p=0.008).
Fil-bidu tal-esperiment, l-ebda kadmju ma nstab fil-kliewi(Figura 1C) tal-annimali sperimentali. Għaldaqstant, ma nstab l-ebda kadmju fil-kliewital-annimali mill-gruppi ta' kontroll u GSE matul l-esperiment. Min-naħa l-oħra, wara 14-il jum, il-valur medju tal-kadmju fil-grupp biż-żieda ta 'kadmju kien 9.5 mg/kg u fil-grupp biż-żieda ta' kadmju u GSE, il-valur medju kien 6.5 mg/kg. Dawn iż-żewġ valuri kienu differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta' kontroll (p <0.001 għaż-żewġ="" gruppi).="" wara="" 28="" jum,="" il-valur="" medju="" fil-grupp="" biż-żieda="" tal-kadmju="" kien="" żdied="" għal="" 16.6="" mg/kg,="" li="" kien="" differenti="" b'mod="" sinifikanti="" mil-livell="" tal-kadmju="" fil-grupp="" biż-żieda="" tal-kadmju="" u="" l-gse,="" li="" żdiedu="" ftit="" biss="" għal="" 10.4="" mg/="" kg="" (p="0.009)." għalhekk,="">kliewiu fil-fwied, il-kontenut ta 'Cd tbaxxa b'mod sinifikanti mill-amministrazzjoni tal-GSE. GSE fih komposti fenoliċi li jistgħu jikkelaw is-Cd, u b'hekk inaqqsu l-akkumulazzjoni ta 'Cd. Il-formazzjoni ta 'dawn il-kelati probabbilment irriżulta f'kapaċità mnaqqsa tal-proteini li jorbtu s-Cd, li għalhekk jistgħu jiġu eliminati b'mod aktar effettiv mill-ġisem [18].
2.2.2. Determinazzjoni tal-Kreatinina u Kontenut Urea
Fir-rigward tal-akkumulazzjoni tal-kadmju fil-kliewi, il-kliewihuwa wieħed mill-aktar organi fil-mira importanti għat-tossiċità indotta minn Cd. Għalhekk, il-kliewimarkaturi tal-krejatinina u l-urea ġew determinati fil-plażma. Id-determinazzjoni tal-krejatinina hija indikatur tajjeb tal-filtrazzjoni glomerulari u tintuża prinċipalment biex timmonitorja l-kors tal-mard tal-kliewi. Ir-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni tal-krejatinina u l-filtrazzjoni glomerulari hija iperbolika; hekk kif tonqos il-filtrazzjoni glomerulari, is-sekrezzjoni tal-krejatinina tonqos ukoll [19]. Żieda fil-konsum tal-kadmju tal-metall tqil twassal għalħsara fil-kliewi, u għalhekk naqqset l-effiċjenza tas-sekrezzjoni tal-krejatinina. Bħala riżultat, livell elevat tal-kreatinina fid-demm jindika arenalidiżordni [20].
Fl-istudju tagħna, il-livelli ta 'kreatinina żdiedu b'Cd, f'konformità ma' riżultati ppubblikati qabel [21]. Il-valur medju tal-kontenut tal-krejatinina (Figura 2A) fl-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 3.0 mg/L. Fil-grupp li rċieva l-kadmju, kien hemm żieda sinifikanti fil-valuri mmonitorjati għal 5.1 mg/L (wara 14-il jum, p=0.015) u għal 6.2 mg/L (wara 28 jum, p < 0.001).="" fil-grupp="" li="" għalih="" gse="" ġie="" ko-amministrat="" mal-kadmju,="" iż-żieda="" f'dan="" il-markatur="" kienet="" aktar="" baxxa="" (4.2="" mg/l="" wara="" 14-il="" jum="" u="" 5.5="" mg/l="" wara="" 28="" jum)="" u="" statistikament="" sinifikanti="" biss="" wara="" 28="" jum,="" meta="" mqabbla="" mal-kontroll="" (="" p="">< 0.001).="" għalhekk,="" iż-żieda="" fil-konċentrazzjoni="" tal-krejatinina="" naqqset="" mill-ko-amministrazzjoni="" ta="" 'gse,="" li="" tissuġġerixxi="" tnaqqis="" tal-effett="" tossiku="" ikkawżat="" mill-kadmju.="" fil-grupp="" li="" rċieva="" gse="" biss,="" kien="" hemm="" valuri="">
L-urea hija kwantitattivament l-aktar prodott degradanti importanti ta 'aċidi amminiċi u proteini. Huwa ffurmat fil-fwied minn ammonja rilaxxata minn reazzjonijiet ta 'deamination matul il-metaboliżmu ta' l-aċidu amminiku. Huwa eliminat mill-organiżmu prinċipalment mill-kliewipermezz ta' filtrazzjoni glomerulari u assorbiment mill-ġdid tubulari [22]. Fil-każ ta’mard tal-kliewi, ir-rata tal-produzzjoni tal-urea taqbeż ir-rata tat-tneħħija tagħha, li tirriżulta f'żieda fil-livell tal-urea fid-demm. Barra minn hekk, il-kadmju jinibixxi l-inkorporazzjoni ta 'aċidi amminiċi fil-proteini, u jikkawża uremija [21]. Min-naħa l-oħra, meta l-funzjoni tal-fwied tonqos, is-sintesi tal-urea tonqos u għalhekk ukoll il-konċentrazzjoni tagħha fil-plażma [20]. Għalhekk, il-konċentrazzjoni tal-urea fid-demm tiddependi fuq il-kontenut tal-proteini tad-dieta,renalieskrezzjoni, u l-funzjoni metabolika tal-fwied.
Fl-istudju tagħna, il-livelli ta 'urea żdiedu b'Cd, f'konformità ma' riżultati ppubblikati qabel [21]. Il-valur medju tal-kontenut tal-urea (Figura 2B) fl-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 207 mg/L. Fil-grupp li rċieva kadmju, kien hemm żieda sinifikanti fil-valuri mmonitorjati għal 329 mg/L (wara 14-il jum) u 425 mg/L (wara 28 jum). Fil-grupp li għalih GSE ġie ko-amministrat mal-kadmju, iż-żieda f'dan il-markatur kienet biss ftit aktar baxxa—325 mg/L wara 14-il jum u 381 mg/L wara 28 jum. Iż-żewġ gruppi li rċevew biss kadmju u kadmju flimkien ma' GSE kienu differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta' kontroll wara 14 (p=0.001 u p=0.002, rispettivament) u 28 jum tal-esperiment (p < 0.001)="" għat-tnejn).="" fil-grupp="" li="" rċieva="" gse="" biss,="" instabu="" valuri="">
2.2.3. Determinazzjoni tal-Attività Antiossidanti tal-Plażma
Il-kadmju jinduċi firxa ta 'effetti konnessi primarjament ma' stress ossidattiv. Peress li Cd mhuwiex redox-attiv, ma jiġġenerax speċi ta 'ossiġnu reattivi direttament. Madankollu, il-produzzjoni tagħhom wara espożizzjoni għal Cd ġiet irrappurtata f'ħafna studji u riveduta minn Cuypers et al. [23]. Il-mekkaniżmi li jwasslu għal disturb redox waqt l-espożizzjoni għal Cd jinkludu t-tnaqqis ta 'glutathione mnaqqas ikkawżat mill-affinità ta' Cd għal gruppi thiol, is-sostituzzjoni ta 'Fe b'Cd fil-proteini li twassal għal konċentrazzjonijiet miżjuda ta' Fe ħieles redox-attiv, disfunzjoni mitokondrijali, u induzzjoni ta ' NADPH oxidases, li jikkatalizzaw il-formazzjoni ta 'radikali superoxide [23]. Matul stress ossidattiv, komposti antiossidattivi bħall-fenoli jistgħu jtemmu l-produzzjoni ta 'speċi reattivi ġodda permezz tal-konverżjoni tagħhom għal forom radikali stabbli. Għalhekk, estratti tal-pjanti sinjuri fil-fenoliċi jistgħu jipprovdu effetti protettivi kontra Cd jew komposti li fihom Cd [24].
F'dan l-istudju, il-valur medju tal-attività antiossidanti fil-plażma (Figura 3) fl-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 0.71 mg/L. Ġiet osservata żieda żgħira fil-gruppi sperimentali kollha meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll. Madankollu, l-unika differenza sinifikanti kienet dik bejn il-grupp ittrattat bil-GSE u l-grupp ta 'kontroll wara 28 jum (p=0.012), li tikkonferma effett pożittiv ta' GSE fuq l-attività antiossidant fil-plażma. Ir-riżultati rrappurtati qabel huma ambigwi; kultant, instabet żieda fil-potenzjal antiossidant tal-plażma kkawżata minn GSE [25] u xi kultant le [14].
2.2.4. Determinazzjoni ta' Attivitajiet ALT u AST
L-istress ossidattiv huwa relatat ma 'telf ta' integrità funzjonali tal-arkitettura tal-membrana kkawżat minn żieda fil-perossidazzjoni tal-lipidi. Min-naħa tagħha, iż-żieda fil-permeabilità tal-membrana ċitoplasmika twassal għat-tnixxija ta 'enzimi markaturi epatiċi (ALT u AST) fid-demm [14]. Tabilħaqq, ALT u AST huma dijanjostikament sinifikanti anke f'ħsara limitata fil-fwied minħabba intossikazzjoni u ż-żieda tagħhom fis-serum ikkawżata mill-kadmju ġiet irrappurtata aktar kmieni [14] u ġiet ikkonfermata minn dan l-istudju. Il-valur medju tal-attività ALT (Figura 4A) fl-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 0.84 µkat/L. Fil-grupp li rċieva l-kadmju, ġiet irreġistrata żieda sinifikanti fil-valuri mmonitorjati għal medja ta’ 1.52 µkat/L wara 14-il jum (p <{8}}.001), u="" 1.87="" µkat/l="" wara="" 28="" jum="" (p="" {{{{="" 13}}.004).="" fil-grupp="" li="" għalih="" gse="" ġie="" ko-amministrat="" mal-kadmju,="" iż-żieda="" ta’="" dan="" il-markatur="" kienet="" ferm="" aktar="" bil-mod="" milli="" fil-grupp="" li="" rċieva="" biss="" kadmju="" (1.23="" µkat/l="" wara="" 14-il="" jum="" u="" 1.92="" µkat/l="" wara="" 28="" jum).="" wara="" 14-il="" jum="" tal-esperiment,="" dan="" il-grupp="" kien="" differenti="" kemm="" mill-grupp="" ta'="" kontroll="" (p="0.009)" kif="" ukoll="" mill-grupp="" tal-kadmju="" (p="0}.026)," filwaqt="" li,="" wara="" 28="" jum,="" kien="" differenti="" b'mod="" sinifikanti="" mill-grupp="" ta'="" kontroll="" biss="" (p="0.003)." fil-grupp="" li="" rċieva="" gse="" biss,="" il-valuri="" żdiedu="" wkoll="" għal="" 1.17="" µkat/l="" wara="" 14-il="" jum.="" dan="" il-valur="" kien="" differenti="" b'mod="" sinifikanti="" mill-grupp="" ta'="" kontroll="" (p="0.024)" u="" kien="" komparabbli="" mal-valur="" tal-grupp="" li="" rċieva="" kemm="" gse="" kif="" ukoll="" kadmju.="" wara="" 28="" jum,="" il-valuri="" tal-grupp="" ta="" 'gse="" biss="" jixbħu="" lill-grupp="" ta'="">
Il-valur medju tal-kontenut AST (Figura 4B) fl-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 2.07 µkat/L. Fil-grupp li rċieva l-kadmju, żieda statistikament sinifikanti fil-valuri osservati ġiet irreġistrata biss wara 28 jum tal-esperiment (3.52 µkat/L, p=0.001). B'mod sorprendenti, fil-grupp li għalih GSE ġie ko-amministrat mal-kadmju, iż-żieda ta 'dan il-markatur kienet aktar mgħaġġla u differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta' kontroll kemm wara 14-il jum kif ukoll 28 jum (2.67 u 2.84 µkat/L, rispettivament, p {{15} }}.043 għat-tnejn), għalkemm il-valur kien kemmxejn inqas minn dak tal-grupp tal-kadmju biss wara 28 jum. Il-varjant tal-GSE biss kellu valuri normali.
Fl-esperiment tagħna, l-amministrazzjoni tal-GSE setgħet tnaqqas iż-żieda fl-attività ALT. Dan l-effett jikkorrispondi mar-riżultati rrappurtati preċedentement [14] u forsi ikkawżat mit-tneħħija tal-perossidi tal-lipidi permezz tat-trasferiment tal-idroġenu minn kompost fenoliku għall-perossidu tal-lipidi li jkun fih radikali ħielsa. Min-naħa l-oħra, fit-tul, dan l-effett kien baxx. Iż-żieda fl-attività AST ikkawżata mill-kadmju kienet pjuttost aċċellerata mill-amministrazzjoni tal-GSE. Madankollu, fit-tul, kien hemm tnaqqis żgħir fl-attività AST. Għalhekk, GSE jista 'jikkumpensa parzjalment għall-effett tossiku tas-Cd fuq il-membrani taċ-ċelluli.
2.2.5. Determinazzjoni ta 'SOD u Attivitajiet CAT fil-Fwied
Minbarra l-parteċipazzjoni diretta f'reazzjonijiet ossidattivi, il-kadmju jinibixxi l-attività ta 'enzimi antiossidanti bħal SOD u CAT, enzimi li kapaċi jidditossifikaw ir-radikali superossidi u l-perossidu tal-idroġenu, rispettivament [14]. SOD hija enzima li effettivament itfi r-radikali superossidu u tikkonvertih fil-perossidu tal-idroġenu inqas tossiku, li jista 'jiġi dekompost aktar minn catalase jew peroxidase [26]. Il-CAT hija enzima li tinsab fi kważi l-organiżmi ħajjin kollha li huma esposti għall-ossiġnu. Jaġixxi bħala katalist għad-dekompożizzjoni tal-perossidu tal-idroġenu f'ilma u ossiġnu [27]. Għandu wieħed mill-ogħla numri ta 'konverżjoni fost l-enzimi [28] u, bħala enzima antiossidant, huwa wieħed mill-mekkaniżmi protettivi li jwasslu għaż-żamma tal-bilanċ fil-ġisem tal-bniedem [29]. Il-mekkaniżmu ta 'tnaqqis indott minn Cd fl-attivitajiet ta' l-enzimi huwa probabbilment rabta diretta ta 'Cd mas-siti attivi ta' l-enzimi [30].
It-tnaqqis fl-attivitajiet SOD u CAT kien osservat ukoll f'dan l-istudju. Fil-bidu tal-esperiment, l-attività medja tal-enzima SOD fil-fwied (Figura 5A) tal-annimali sperimentali kienet 18.4 U/mg tal-proteina. Wara 14-il jum tal-esperiment, l-attività SOD kienet ogħla b'mod sinifikanti fil-grupp li rċieva GSE (21.1 U/mg) milli fiż-żewġ gruppi li jirċievu l-kadmju (p <0.001 u="" p="" {{{="" 9}}.009="" għall-kadmju="" biss="" u="" għall-kadmju="" bi="" gruppi="" gse,="" rispettivament),="" iżda="" biss="" fil-grupp="" li="" rċieva="" kadmju="" waħdu="" kienet="" attività="" sod="" aktar="" baxxa="" b'mod="" sinifikanti="" (16.7="" u/mg)="" milli="" fil-grupp="" ta="" 'kontroll="" (p="0" .005).="" wara="" 28="" jum="" tal-esperiment,="" iż-żewġ="" gruppi="" li="" jirċievu="" l-kadmju="" kienu="" differenti="" b'mod="" sinifikanti="" kemm="" mill-grupp="" ta'="" kontroll="" (16.4="" u/mg,="" p="0.002" u="" 17.6="" u/mg,="" p="0.023" għall-kadmju="" biss="" u="" kadmju="" b'gse,="" rispettivament)="" u="" l-grupp="" trattat="" b'gse="" biss="" (p="">< 0.001="" u="" p="0.005" għall-kadmju="" biss="" u="" kadmju="" b'gse,="">
Fil-bidu tal-esperiment, l-attività medja tal-enzima CAT fil-fwied (Figura 5B) kienet 32.7 U/mg tal-proteina. Wara 14-il jum tal-esperiment, l-attività CAT kienet ogħla b'mod sinifikanti fil-grupp li rċieva GSE (33.5 U/mg) milli fiż-żewġ gruppi li jirċievu l-kadmju (p=0.002 u p=0.031 għall- kadmju biss u kadmju ma 'gruppi GSE, rispettivament), iżda biss fil-grupp li rċieva kadmju waħdu kienet attività CAT inqas b'mod sinifikanti (23.8 U/mg) milli fil-grupp ta' kontroll (p=0.005). Madankollu, wara 28 jum, l-attività CAT fil-grupp li rċieva GSE flimkien mal-kadmju naqset aktar għal 27.1 U/mg, laħqet il-valuri tal-grupp tal-kadmju biss (25.8 U/mg), u kienet differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta' kontroll (p { {21}}.033). Il-grupp trattat b'GSE kien biss differenti b'mod sinifikanti miż-żewġ gruppi tal-kadmju (p=0.026 u p=0.012 għall-kadmju biss u l-kadmju b'GSE, rispettivament). Interessanti, it-tnaqqis ikkawżat mill-kadmju naqas mill-ko-amministrazzjoni tal-GSE. Għal CAT, dawn l-effetti tal-GSE ġew osservati qabel [14]. L-effett kelanti tal-komposti fenoliċi li jinsabu fil-GSE x'aktarx inaqqas il-kapaċità tal-kadmju li jorbot mas-sit attiv tal-enzima.
2.2.6. Determinazzjoni tal-Kontenut MT
Il-kadmju mhuwiex soġġett għal xi konverżjonijiet metaboliċi diretti, iżda fit-tessuti kollha, huwa prinċipalment marbut ma 'metallothionein (MT). MT tappartjeni għal grupp ta 'proteini intraċellulari, b'piż molekulari baxx, b'ħafna cysteine b'piż molekulari ta' 6-10 kDa. Ir-rwol primarju tal-MT fl-organiżmu jinkludi ż-żamma tal-omeostażi taż-żingu, id-diżintossikazzjoni tal-metalli tqal, u l-protezzjoni kontra l-istress ossidattiv. L-espressjoni MT hija induċibbli minn ħafna fatturi eżoġeni u endoġeni bħal radjazzjoni UV, metalli tqal, ormoni tal-istress, radikali tal-ossiġnu ħielsa, medjaturi ta 'infjammazzjoni, infezzjoni, trawma u onkoġenesi [31,32]. MT huwa fil-biċċa l-kbira sintetizzat fil-fwied ukliewiu rilaxxati fid-demm. Anki jekk l-MT huwa responsabbli għall-akkumulazzjoni tal-kadmju fit-tessuti billi jnaqqas l-eskrezzjoni tiegħu, l-MT jipproteġi kontra t-tossiċità akuta kif ukoll kronika indotta minn Cd [33]. Fl-istudju tagħna, il-kontenut MT kien immonitorjat fid-demm, fwied, ukliewi.
Il-valur medju tal-kontenut MT fid-demm (Figura 6A) tal-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 23.9 nmol/g. Wara 14-il jum, il-bidliet kienu minimi u, wara 28 jum, ġiet osservata varjabbiltà kbira bejn ir-repliki, li kkawżaw inkonklussività statistika (p=0.948). Il-valur medju tal-kontenut MT għall-kliewi(Figura 6B) tal-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 21.46 nmol/g. Il-valuri ma nbidlux b'mod sinifikanti fl-ebda grupp sperimentali matul l-esperiment (p=0.938). Il-valur medju tal-kontenut MT fil-fwied (Figura 6C) tal-annimali sperimentali fil-bidu tal-esperiment kien 17.15 nmol/g. Wara 14-il jum, il-kontenut MT żdied bi ftit fil-gruppi sperimentali kollha u d-differenzi mill-grupp ta' kontroll kienu sinifikanti għall-grupp ta' Cd biss u l-grupp ta' GSE biss (p=0.008 u p=0 .046, rispettivament). Wara 28 jum, il-kontenut MT fil-grupp GSE reġa' lura għall-valur tal-grupp ta 'kontroll, filwaqt li l-kontenut MT fil-grupp Cd baqa' żdied u kien differenti kemm mill-grupp ta 'kontroll kif ukoll mill-grupp GSE (p=0.046 u p=0.035, rispettivament). Fil-grupp li kien qed jirċievi GSE flimkien mal-kadmju, il-kontenut ta’ MT ma kienx differenti b’mod sinifikanti mill-kontroll—li kien konformi mal-kontenut aktar baxx ta’ kadmju misjub fil-fwied ta’ dan il-grupp—meta mqabbel mal-grupp ta’ Cd biss (id-differenza kienet sinifikanti wara 28 jum tal-esperiment).
B'kollox, bidliet statistikament sinifikanti fil-kontenut MT ikkawżat minn Cd kienu osservati biss fil-fwied. Preċedentement, kienet irrappurtata żieda MT fid-demm ta 'annimali esperimentali li jirċievu l-kadmju [34]. F'dan il-każ, ir-riżultati jissuġġerixxu li d-ditossifikazzjoni tas-Cd permezz ta 'MT tista' pjuttost iseħħ fil-fwied.
3. Materjali u Metodi
3.1. Disinn ta 'EsperimentFirien kannella tal-ġeneru Wistar (tmien ġimgħat, 235 ± 3 g) kienu maqsuma f'erba 'gruppi ta' sitt individwi: A) grupp ta 'kontroll ta' firien wara dieta ordinarja (n=6); B) grupp ta' firien li d-dieta tagħhom ġie miżjud GSE (200 mg GSE/jum) (n=6); C) grupp mogħti kadmju (2 mg Cd/jum—konkret, CdCl2 maħlul fl-ilma) (n=6); u D) grupp mogħti dieta li jkun fiha kadmju (2 mg Cd/jum) li miegħu ġie miżjud GSE (200 mg GSE/jum) (n=6). L-estratt ittieħed miż-żerriegħa tal-varjetà tad-dwieli Cerason; il-preparazzjoni u l-karatterizzazzjoni tiegħu huma deskritti fit-Taqsima 3.2. (Estratt taż-żerriegħa tad-dwieli). L-estratt kien miżun kuljum f'doża ta '200 mg, qabel ma ngħata lill-firien kannella sperimentali (200 mg GSE għal kull far; 0.85 g/L kg ta' massa tal-ġisem). Il-GSE ġie amministrat bl-ilma. Il-firien ingħataw taħlitiet ta' għalf niedja u ilma (trabi) li ma jagħmilx ħsara ad libitum. Darba fil-ġimgħa, l-annimali kellhom il-friex tagħhom mibdula. Wara 14 u 28 jum sperimentali, tliet annimali minn kull grupp ġew ewtanizzati u d-demm tagħhom inġabar permezz ta 'titqib tal-qalb. Qabel il-ġbir, medikazzjoni intraperitoneali ġiet assenjata b'Fraxiparin (0.01 mL/kg) u, wara dan, l-annimali ngħataw diethyl ether taħt anestesija tan-nifs. Kampjun tad-demm imbagħad inġabar f'mikro tubi tat-test miksija bl-eparina (jew tubi b'EDTA-għal analiżi ta' MT u kadmju; mingħajr ċentrifugazzjoni sussegwenti), u dan kien segwit minn ċentrifugazzjoni ġentili (800 g/10 min) u l-ġbir tad-demm. plażma għal aktar analiżi. Il-fwied u drittkliewiġew estratti għal aktar analiżi. L-istudju sar skont id-Dikjarazzjoni ta 'Ħelsinki, u l-protokoll ġie approvat mill-Kummissjoni Espert għall-Iżgurar tal-Benessri tal-Annimali Sperimentali tal-Università ta' Mendel fi Brno (għall-proġett IGA-ZF/2016-AP011).
3.2. Estratt taż-żerriegħa tad-dwieli
Iż-żerriegħa tad-dwieli (varjetà Cerason—Merlot × Seibel 13 666) ġew magħżula, imnaddfa, imnixxfa, u mitħun. L-għażla saret permezz tal-karfa fuq magna tas-separazzjoni, fejn iż-żrieragħ kienu sseparati mill-qxur. Iż-żrieragħ separati b'dan il-mod ġew sussegwentement laħlaħ, iż-żrieragħ vojta tneħħew, u ż-żrieragħ li kien fadal ġew imnaddfa. Iż-żerriegħa mnaddfa u maħsula ġew imnixxfa f'dryer f'50 ◦C għal 12-il siegħa. Dan kien segwit minn tħin taż-żrieragħ bl-użu ta' grinder tal-laboratorju IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Staufen im Breisgau, il-Ġermanja). Iż-żrieragħ mitħun ġew estratti f'75 fil-mija etanol għal 120 siegħa (22 ◦C, imħawwad f'50 RPM; IKA KS 260 Basic, manifattur: IKA Werke, Staufen im Breisgau, il-Ġermanja) fi proporzjon ta 'parti waħda taż-żerriegħa mitħun għal għaxar partijiet ta' etanol (m/m). Wara dan, l-estratt tqiegħed f'tubi tat-test ta '25 mL (Eppendorf, Hamburg, il-Ġermanja) u ċentrifugat (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, il-Ġermanja) f'4 ◦C u RCF 25,000× g. Kampjun ċentrifugat ittieħdet mit-tubu tat-test u ttrasferit għal flixkun tad-distillazzjoni tal-evaporatur vakwu (IKA RV 10 diġitali VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, il-Ġermanja), fejn l-etanol evapora. L-evaporazzjoni seħħet f'vakwu f'90 ◦C, u l-estratt ġie trasferit għal dixxijiet Petri u lajofilizzat f'vakwu f'53 ◦C (lyophilizer Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, ir-Repubblika Ċeka). Wara li ġie ppreparat, l-estratt ġie amministrat lill-annimali esperimentali.
CISTANCHE SE TTEJB L-INFEZZJONI TAL-KLIEI/KLIEWA
3.3. Determinazzjoni ta 'Attività Antiossidanti u Kontenut Polifenoliċi Totali
Sabiex tiġi żgurata l-oġġettività tar-riżultati, intużaw erba 'metodi fundamentalment differenti biex tiġi ddeterminata l-attività antiossidanti. Il-kampjuni ġew analizzati fuq spettrofotometru awtomatiku BS-400 (Mindray, Shenzen, iċ-Ċina). Il-kampjuni kollha ġew analizzati fi tliet kopji, il-valur li jirriżulta jikkorrispondi għall-medja ta 'dawn il-kejl. Dawn l-analiżi saru wara Sochor et al. [35].
3.3.1. Determinazzjoni ta 'Attività Antiossidanti Bl-użu tal-Metodu ABTS
Soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-attività antiossidanti permezz ta 'assaġġ ABTS ġiet ippreparata billi tħallat żewġ soluzzjonijiet—soluzzjoni 1: 7 mM soluzzjoni ta' ABTS ippreparata billi tiżen m=9.60 mg għal kull 5 mL ta 'ilma distillat; u soluzzjoni 2: 4.95 mM soluzzjoni ta' persulfate tal-potassju ppreparata billi tiżen m=1.67 mg għal kull 5 mL ta' ilma distillat. Is-soluzzjoni li tirriżulta ġiet dilwita 1:10 b'ilma distillat u titħalla fid-dlam u kiesaħ għal 12-il siegħa. Imbagħad, 150 µL ta’ reaġent R1 (7 mM ABTS u 4.95 mM persulfat tal-potassju) ġew ippattjati f’kuvettes tal-plastik, segwiti biż-żieda ta’ 3 µL tal-kampjun, u mkejla fi spettrofotometru (λ=660 nm) għal 12 min. Skont il-kurva tal-kalibrazzjoni, l-assorbanza ġiet ikkonvertita fil-kontenut ekwivalenti ta 'aċidu galliku; l-attività antiossidant ġiet ikkalkulata mill-kurva tal-kalibrazzjoni bl-użu ta 'aċidu galliku bħala standard (10-200 mg · L1), u r-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti ta' aċidu galliku.
3.3.2. Determinazzjoni ta 'Attività Antiossidanti Bl-użu tal-Metodu DPPH
L-ewwel, intiżen m {{0}}.35 mg ta 'radikali DPPH. Dan l-ammont ġie trasferit għal flixkun volumetriku ta' 250 mL u magħmul bil-metanol. Imbagħad, 150 µL ta’ reaġent R1 (0.095 mM DPPH) ġew ippappjati f’kuvettes tal-plastik, segwiti miż-żieda ta’ 15 µL tal-kampjun li jrid jitkejjel. It-test DPPH huwa bbażat fuq il-kapaċità tar-radikali ħielsa stabbli 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl li jirreaġixxi mad-donaturi tal-idroġenu. DPPH juri assorbiment qawwi fl-ispettru tal-ispettru ultravjola-viżibbli (UV-VIS). L-assorbiment tkejjel għal 12-il minuta f'λ=505 nm. Skont il-kurva tal-kalibrazzjoni, l-assorbanza ġiet ikkonvertita għal kontenut ekwivalenti ta 'aċidu galliku.
3.3.3. Determinazzjoni ta 'Attività Antiossidanti Bl-użu tal-Metodu ta' Qawwa Antiossidanti li Tnaqqas Ferriku
Intużaw tliet soluzzjonijiet biex tiġi ddeterminata l-attività antiossidanti bl-użu tal-metodu tal-qawwa antiossidant li jnaqqas il-ferrik (FRAP)—(1) Soluzzjoni TPTZ: 10 mM TPTZ (m=78.02 mg) maħlul f'25 mL ta' 40 mM HCl; (2) Soluzzjoni FeCl3: 20 mM FeCl3 (m=135.13 mg) maħlul f'25 mL ta 'ilma distillat; u (3) soluzzjoni buffer aċetat: 0.02 M buffer aċetat pH 3.6 (m=775 mg aċetat tas-sodju maħlul f'250 mL ta 'ilma distillat, pH aġġustat bl-aċidu aċetiku). It-tliet soluzzjonijiet tħalltu fil-proporzjon 1:1:10 (TPTZ: FeCl3: buffer aċetat). Imbagħad, 150 µL ta’ reaġent ġew pipettati f’kuvettes tal-plastik u ġew miżjuda 3 µL tal-kampjun. L-assorbiment tkejjel għal 12-il minuta f'λ=605 nm. L-attività antiossidant ġiet ikkalkulata mill-kurva tal-kalibrazzjoni bl-użu ta 'aċidu galliku bħala standard (10-200 mg · L1). Ir-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti ta' aċidu galliku.
3.3.4. Determinazzjoni ta 'Attività Antiossidanti Bl-użu tal-Metodu Radikali Ħieles tal-Klorofilla
Total ta' 200 µL ta' reaġent R1 (0.1 M HCl, estratt tal-klorofilla, buffer ta' reazzjoni, katalizzatur) ġie pipettat f'kuvettes tal-plastik u mbagħad ġew miżjuda 8 µL tal-kampjun. Dan il-metodu juża l-abbiltà tal-chlorophyllin (melħ tas-sodju-ram tal-klorofilla) li jaċċetta u jagħti elettroni filwaqt li jibdel b'mod stabbli l-massimu ta 'assorbiment. Dan il-proċess huwa kkundizzjonat mill-ambjent alkalin u ż-żieda ta 'katalizzatur. L-assorbiment tkejjel għal 12-il minuta f'λ=450 nm. L-aħħar valuri tal-kejl intużaw għall-kalkolu. Ir-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti ta' aċidu galliku.
3.3.5. Determinazzjoni tal-Konċentrazzjoni Totali tal-Polyphenol
Il-metodu Folin–Ciocalteu intuża biex jiddetermina l-komposti polifenoliċi totali. Il-kampjuni kollha ġew analizzati fi tliet kopji, u l-valur li jirriżulta nkiseb bħala l-medja ta 'dawn il-kejl. Kampjun ta' 40 µL ġie pipettat f'cuvette (3 mL) u dilwit b'1960 µL ta' ilma distillat. Sussegwentement, 50 µL ta’ reaġent Folin–Ciocalteu ġew miżjuda mal-kuvette. It-taħlita tħawwad sewwa u, wara 3 min, ġew miżjuda 300 µL ta' soluzzjoni ta' 20 fil-mija Na2CO3 decahydrate. It-taħlita ta 'reazzjoni tħawwad u inkubata f'22 ◦C għal 120 min. Wara dan iż-żmien, l-assorbanza (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, il-Ġermanja) ġiet imkejla f'λ=750 nm kontra vojt. Ir-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti ta' aċidu galliku.
3.4. Determinazzjoni ta' Antiossidanti permezz ta' HPLC
Determinazzjoni ta' Komponenti Antiossidanti Individwali bl-Użu ta' Kromatografija Likwida ta' Prestazzjoni Għolja bi Spettrometru tal-Massa. Analiżi ta' kampjuni użati għall-istima ta' flavonoids u proanthocyanins saru f'sistema kromatografika Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA) li tikkonsisti mill- apparati li ġejjin: ġibjuni tal-fażi mobbli, degasser, pompa binarja, ġibjun tal-kampjuni b'autosampler, u ditekter tal-massa b'Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA). Is-separazzjoni tal-kampjuni twettqet f'kolonni kromatografiċi Zorbax SB C18 b'dimensjonijiet 50 × 2.1 mm u d-daqs tal-partiċelli 2.7 µm. Il-perjodu ta 'analiżi kien dejjem 6 min. Ir-rata sħabi tal-gass trasportatur kienet 0.6 mL·min1. Il-komponent organiku tal-fażi mobbli kien grad ta 'gradjent ta' metanol (solvent B) u l-kostitwent akweju kien fih 0.05 M ta 'format ta' l-ammonju (solvent A). Il-gradjent tal-fażi li tiċċaqlaq kien kif ġej: ħin 0 min: 50 fil-mija tas-solvent A u 50 fil-mija tas-solvent B; ħin 2.5 min: 100 fil-mija tas-solvent A u 0 fil-mija tas-solvent B; ħin 5 min: 50 fil-mija tas-solvent A u 50 fil-mija tas-solvent B. It-temperatura tat-termostat tal-kolonna ġiet aġġustata għal 45 ◦C.
CISTANCHE SE TTEJB L-UĠIGĦ TAL-KLIEI/KLIEWA
3.5. Determinazzjoni ta' Markers Bijokimiċi Magħżula
Markers bijokimiċi fid-demm, fil-plażma, fil-fwied, ukliewital-annimali ġew immonitorjati biex jiġi ddeterminat l-effett protettiv tal-GSE kontra l-effetti negattivi tal-kadmju. Twettqu l-analiżi li ġejjin: (1) Analiżi tal-plażma: attività antiossidant totali tal-plażma, krejatinina, urea, ALT, AST. (2) Analiżi tad-demm: MT. (3) Analiżi tal-fwied: SOD, CAT, MT. (4)Kilwaanaliżi: MT.
3.5.1. Id-determinazzjoni tal-Attività Antiossidanti Totali tal-Plażma,Il-krejatinina, l-urea, l-ALT, u l-AST A BS{{0}} analizzatur bijokimiku awtomatizzat (Mindray, Shenzen, iċ-Ċina) intuża biex janalizza l-attività antiossidant totali tal-plażma, krejatinina, urea, ALT, u AST. Determinazzjoni tal-Attività Antiossidanti Totali tal-Plażma Il-metodu tar-radikali ħielsa intuża biex jiddetermina l-attività antiossidanti tal-plażma [35]. Dan il-metodu juża l-abbiltà tal-chlorophyllin (il-melħ tas-sodju-ram tal-chlorophyll) li jaċċetta u jagħti elettroni filwaqt li jibdel b'mod stabbli l-massimu ta 'assorbiment. Dan il-proċess huwa kkundizzjonat mill-ambjent alkalin u ż-żieda ta 'katalizzatur. Total ta '200 µL ta' reaġent R1 (0.1 M HCl, estratt ta 'chlorophyllin, buffer ta' reazzjoni, u katalizzatur) ġie pipettat f'kuvettes tal-plastik, u wara ġew miżjuda 8 µL tal-kampjun. L-assorbiment tkejjel għal 12-il minuta f'λ=450 nm, u l-aħħar valur tal-kejl intuża għall-kalkolu. L-attività antiossidanti ġiet ikkalkulata mill-kurva tal-kalibrazzjoni bl-użu tal-aċidu galliku bħala standard u r-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti tal-aċidu galliku.
Determinazzjoni tal-Kontenut tal-KreatininaIl-prinċipju tal-metodu huwa d-determinazzjoni fotometrika tal-kumpless tal-kulur tal-krejatinina b'picrate alkalin, li r-rata ta 'formazzjoni tiegħu hija proporzjonali għall-konċentrazzjoni tal-krejatinina fil-kampjun. Kitt dijanjostiku minn Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, il-Ġermanja) intuża biex jiddetermina l-krejatinina. Total ta' 180 µL ta' reaġent R1 (0.16 mM idrossidu tas-sodju) ġie pipettat fil-kuvette, segwit biż-żieda ta' 10 µL tal-kampjun u 30 µL tar-reaġent R2 (4 mM picric acid). L-assorbiment tkejjel għal sitt minuti f'λ=505 nm. Il-valur tal-assorbiment tar-reaġent R1 waħdu mal-kampjun u l-valur tal-assorbiment wara 6 min inkubazzjoni bir-reaġent R2 intużaw għall-kalkolu.
Determinazzjoni ta' Alanine AminotransferaseKit dijanjostiku minn Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, il-Ġermanja) intuża biex jiddetermina l-ALT. L-ewwel, 150 µL tar-reaġent R1 (100 mM Tris buffer pH 7.5; 500 mM L-alanine, 1200 U/L lactate dehydrogenase) u 15 µL ta 'kampjun tal-plażma ġew awtomatikament pipettati fil-kuvettes. Sussegwentement, 30 µL ta' reaġent R2 (15 mM 2-ossoglutarate, 0.18 mM NADH) ġew awtomatikament pipettati u t-taħlita ġiet inkubata għal 5 min. L-assorbiment kien imkejjel f'λ=340 nm. Il-valuri ta' assorbiment tar-reaġent R1 waħdu mal-kampjun u l-valuri ta' assorbiment wara 5 min inkubazzjoni mal-kampjun intużaw għall-kalkolu. Ir-riżultat ġie kkonvertit skont il-kurva tal-kalibrazzjoni għall-attività tal-enzima f'µkat/L.
Determinazzjoni ta' Aspartate AminotransferaseKit dijanjostiku minn Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, il-Ġermanja) intuża biex jiġi determinat l-AST. L-ewwel, 150 µL ta 'reaġent R1 (80 mM Tris buffer pH 7.8, 240 mM L-aspartate, 1200 U/L malate dehydrogenase) u 15 µL ta' kampjun tal-plażma ta 'annimali sperimentali ġew awtomatikament pipettati fil-kuvettes. Sussegwentement, it-taħlit u l-inkubazzjoni saru f'37 ◦C għal 270 s. Sussegwentement, 30 µL ta 'reaġent R2 (15 mM 2-ossoglutarate, 0.18 mM NADH) ġew awtomatikament pipettati u t-taħlita ġiet inkubata għal 5 min. L-assorbiment kien imkejjel f'λ=340 nm. Il-valuri ta' assorbiment tar-reaġent R1 waħdu mal-kampjun u l-valuri ta' assorbiment wara 5 min inkubazzjoni mal-kampjun intużaw għall-kalkolu. Ir-riżultat ġie kkonvertit skont il-kurva tal-kalibrazzjoni għall-attività tal-enzima f'µkat/L.
Determinazzjoni ta' UreaIl-proċedura li ġejja ntużat biex tiddetermina l-urea: 200 µL ta’ reaġent R1 (Tris buffer pH 7.8, ADP, urease, u GLDH) u 200 µL ta’ reaġent R2 (2-oxoglutarate, NADH) ġew awtomatikament pipettati f’kuvettes, segwit minn kampjun ta' volum 4 µL, wara li t-taħlita ġiet imħallata u inkubata f'37 ◦C għal 30 s. Sussegwentement, l-assorbanza f'λ=340 nm ġiet imkejla u wara 60 s oħra, l-assorbanza ġiet imkejla mill-ġdid. Il-valuri tal-assorbiment wara 30 s u wara 60 s oħra ntużaw għall-kalkolu. Il-valuri tnaqqsu minn xulxin u r-riżultat ġie kkonvertit skont il-kurva tal-kalibrazzjoni għall-kontenut tal-urea.
Determinazzjoni ta 'proteini totali bl-użu tal-metodu BiuretId-determinazzjoni tal-proteini totali bil-metodu Biuret hija deskritta fid-dettall f'pubblikazzjoni oħra [9]. Total ta '180 µL ta' reaġent Biuret (15 mM tartrat tas-sodju tal-potassju, 100 mM NaI, 5 mM KI, u 5 mM CuSO4) ġie pipettat fil-kuvette, segwit minn 45 µL tal-kampjun. Wara għaxar minuti ta' inkubazzjoni f'37 ◦C, ġiet imkejla l-assorbenza f'wavelength λ=546 nm. Il-prinċipju hawnhekk huwa r-reazzjoni tar-rabta tal-peptide ma 'Cu (II) f'ambjent alkalin, bil-formazzjoni ta' kulur blu-vjola. Il-valur ta' assorbiment tar-reaġent waħdu u l-valur ta' assorbiment wara għaxar minuti ta' inkubazzjoni mal-kampjun intużaw għall-kalkolu.
3.5.2. Determinazzjoni ta 'Superoxide Dismutase (SOD) u Catalase (CAT) Determinazzjoni ta' Attività SOD, Intuża kit kummerċjali (19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) biex tiddetermina l-attività SOD (SOD, EC 1.15.1.1). Il-kejl sar f'kuvette tal-plastik fuq analizzatur awtomatiku BS 400 (Mindray, Shenzen, iċ-Ċina). L-ewwel, 200 µL ta 'reaġent R1 (20 × soluzzjoni WST dilwita b'buffer) ġew ippappjati fil-kuvette u r-reaġent ġie inkubat f'37 ◦C għal 108 s (1 min, 48 s). Imbagħad, 20 µL ta’ kampjun ġew ippattjati u, fi 378 s (6 min, 18 s), ir-reazzjoni nbdiet billi żżid 20 µL ta’ reaġent R2 (167× buffer dilwit enzyme solution). It-taħlita ġiet inkubata għal 72 s (1 min, 12 s) u mbagħad l-assorbiment tkejjel f'λ=450 nm. Il-kinetika tar-reazzjoni ġiet imkejla għal 180 s (3 min) u l-assorbenza nqrat kull disa' sekondi. L-istrument ikkalkula ż-żieda medja fl-assorbiment kull minuta (∆A) u l-attività SOD tal-kampjuni mkejla, skont l-ekwazzjoni tal-kalibrazzjoni. Ir-riżultati ġew espressi f'U/mL u sussegwentement ikkonvertiti f'mg ta' proteina.
3.5.3. Determinazzjoni tal-Kontenut ta' MetallothioneinId-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-metallothionein fid-demm, fwied, ukliewital-firien kannella twettqet bl-użu tat-teknika tat-tqaxxir tat-trasferiment adsorbenti (AdTS) b'voltametrija tal-polz differenzjali (DPV). Għall-analiżi, ttieħdu 200 µL tas-supernatant analizzat u ħallat ma' 1 800 µL tar-reaġent ta' Brdicka f'reċipjent tal-kejl, u wara twettqet id-determinazzjoni elettrokimika nnifisha. L-assaġġ sar f'konformità ma' protokoll deskritt qabel [37]. Intużat konnessjoni klassika bi tliet elettrodi. L-elettrodu tax-xogħol kien elettrodu tal-waqgħa tal-merkurju mdendlin (HMDE) b'erja ta 'waqgħa ta' 0.4 mm2, filwaqt li l-elettrodu ta 'referenza kien Ag/AgCl/3 M KCl u l-awżiljarju kien elettrodu tal-platinu. L-elettrolit bażi (1 mmol·L1 [CO(NH3)6] Cl3 u 1 mol·L1 ta 'ammonju buffer; NH3(aq) flimkien ma' NH4Cl, pH 9.6) inbidel għal kull kampjun imkejjel. Il-parametri DPV kienu kif ġej: potenzjal inizjali 0.7 V, potenzjal finali 1.75 V, tbaqbieq 5 s, ħin ta 'depożizzjoni 240 s, ħin ta' modulazzjoni 0.0 5 s, ħin tal-intervall 0.25 s, pass potenzjali 0.00105 V, rata tal-iskannjar 0.0042 V/s, u amplitudni tal-modulazzjoni 0.02505 V. Id-determinazzjoni tal-MT saret fuq apparat tal-kejl li jikkonsisti f'695 Autosampler imqabbad ma' unità ta' kejl VA Stand 693 u kkontrollata minn unità ta 'kontroll TraceAnalyser 693 VA (kollha Metrohm, Herisau, l-Isvizzera). Is-sistema kollha tal-kejl tkessaħ għal 4 ◦C bl-użu ta 'Julabo F25 (Julabo, Seelbach, il-Ġermanja). Il-voltammograms miksuba ġew esportati lejn il-programm VA Database 2.2 (Metrohm, Herisau, l-Isvizzera), u l-kampjuni analizzati ġew deossiġenati bit-tbaqbieq attiv ta 'argon b'purità ta' 99.999 fil-mija.
3.5.4. Determinazzjoni tal-Kontenut tal-Kadmju fid-Dekompożizzjoni, Fwied, u Kliewi tal-Kampjuni Estrattur tal-microwave Ethos One (Milestone, Sorisole, l-Italja) intuża għad-dekompożizzjoni tal-fwied ukliewikampjuni, u Multiwave 3000 Microwave Extractor (Anton Paar Graz, l-Awstrija) intuża għad-dekompożizzjoni tal-kampjuni tad-demm. Il-mineralizzazzjoni seħħet b'mod imxarrab, bl-użu ta' 65 fil-mija aċidu nitriku (HNO3 supra pur) (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) u 30 fil-mija idroġenu perossidu (H2O2 supra pur) (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) Total ta '0.4 g ta' fwied jewkliewikampjun kien miżun f'serje ta 'kontenituri Teflon, u 5 mL ta' 65 fil-mija HNO3, 3 mL ta '30 fil-mija H2O2, u 2 mL ta' Milli Q H2O ġew miżjuda mal-kampjun. Il-kontenituri ingħalqu u l-istrument beda skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Id-dekompożizzjoni tal-microwave damet għal 40 min f'210 ◦C. Sussegwentement, il-kampjuni tkessħu għal 45 min u nħażnu f'4 ◦C f'kontenituri tal-PE. Total ta '0.01 g ta' kampjun tad-demm ġie miżun f'serje ta 'kontenituri tal-ħġieġ, u 300 µL ta' 65 fil-mija HNO3 u 200 µL ta '30 fil-mija H2O2 ġew miżjuda mal-kampjun. Il-kontenituri ingħalqu u l-istrument beda skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Id-dekompożizzjoni tal-microwave damet għal 40 min f'temperatura ta '140 ◦C. Sussegwentement, il-kampjuni ġew imkessħa għal 45 min u maħżuna f'4 ◦C sakemm id-determinazzjoni mill-AAS.
Determinazzjoni ta' Kadmju permezz ta' Spettrometrija ta' Assorbiment AtomikaIl-kadmju ġie determinat fuq apparat tas-Sistemi AA Agilent 280/240 Series (Agilent Technologies). Il-fwied ukliewikampjuni ġew analizzati fi fjamma aċetilena-arja (Fa AAS), u l-kampjuni tad-demm permezz ta 'atomizzazzjoni elettrotermali (ETA AAS) f'wavelength ta' 228.8 nm. Serje ta’ kalibrazzjoni b’konċentrazzjonijiet ta’ 0–20 µg·L għal analiżi fuq ETA AAS u 0–10 mg·L1 għal Fa AAS ġiet ippreparata minn soluzzjoni standard ta’ kadmju (Analytika Praha, Prag, ir-Repubblika Ċeka), b'konċentrazzjoni ta' 1.000 ± 0.002 g·L1. Dan kien segwit minn kejl tas-soluzzjonijiet tas-serje tal-kalibrazzjoni u l-kostruzzjoni tal-kurvi tal-kalibrazzjoni, u wara l-mineralizzazzjoni tad-demm, fwied, ukliewikampjuni ġew imkejla.
3.6. Analiżi StatistikaIl-kejl kollu sar fi tliet kopji. Valuri outlier ġew identifikati bit-test Grubbs u esklużi (b'kollox, instabu żewġ outliers). Qabel l-analiżi statistika, id-dejta ġiet trasformata permezz ta 'trasformazzjoni logaritmika u analizzata b'ANOVA one-way (kull punt ta' ħin separatament) b'test Tukey HSD post-hoc. Il-limitu għas-sinifikat statistiku ġie stabbilit bħala p <>
4. Konklużjonijiet
Kien hemm xejra farmaċewtika u ekonomika riċenti biex tfittex mediċini ġodda fost metaboliti sekondarji tal-pjanti, li huma sustanzi li jistgħu jgħinu biex jipproteġu kontra firxa ta 'mard. Grazzi għall-komponenti bijoloġikament attivi importanti li ż-żerriegħa tad-dwieli fihom fil-matriċi tagħhom, jistgħu jintużaw (u diġà huma) għal skopijiet mediċi. L-estratti taż-żerriegħa tal-għeneb huma magħrufa li jipproteġu t-tessuti kontra ħsara ossidattiva relatata mal-istress ikkawżat mill-kadmju tal-metall tqil tossiku. Din il-protezzjoni probabbilment hija influwenzata mill-kompożizzjoni fenolika taż-żerriegħa tal-għeneb użata. F'dan l-istudju, estratt taż-żerriegħa tal-għeneb ippreparat mill-varjetà semi-reżistenti Cerason b'kontenut fenoliku pjuttost għoli ġie ttestjat għal effetti protettivi kontra alterazzjonijiet indotti mill-kadmju. Il-GSE studjat kien kapaċi jżid l-attività antiossidant fil-plażma meta jingħata waħdu u jnaqqas il-kontenut ta’ kadmju fil-fwied ukliewital-firien meta jingħataw flimkien. Għaldaqstant, iż-żidiet ta 'l-enzima markatur epatiku ALT ukliewiil-krejatinina markatur ikkawżata mill-kadmju tbaxxew minn GSE. Barra minn hekk, it-tnaqqis fl-attivitajiet tal-enzimi antiossidanti SOD u CAT ikkawżat mill-kadmju naqas bil-ko-amministrazzjoni tal-GSE. Dawn ir-riżultati juru li GSE huwa aġent protettiv qawwi kontra l-effetti tal-metalli tqal.