GSK3 Inibizzjoni Permezz Fosforilazzjoni Fuq Ser389 Kontrolli Neuroinflammation
Oct 24, 2023
Astratt: L-inibizzjoni ta 'Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) mill-fosforilazzjoni ta' Ser9 taffettwa ħafna proċessi fiżjoloġiċi, inkluż ir-rispons immuni. Madankollu, il-konsegwenzi ta 'inibizzjoni ta' GSK3 permezz ta 'fosforilazzjoni alternattiva ta' Ser389 għadhom ikkaratterizzati ħażin. Hawnhekk eżaminajna n-newroinfjammazzjoni fil-ġrieden GSK3 Ser389 knock-in (KI), li fihom il-fosforilazzjoni ta 'Ser389 GSK3 hija indebolita. In-numru ta 'mikroglia/makrofaġi infiltrati attivati, astroċiti, u newtrofili infiltrati kien ogħla b'mod sinifikanti f'dawn l-annimali meta mqabbel mal-kontropartijiet C57BL/6J wild-type (WT), li jissuġġerixxi li n-nuqqas ta' inattivazzjoni ta' GSK3 permezz ta' fosforilazzjoni ta' Ser389 jirriżulta fi grad baxx sostnut. newroinfjammazzjoni. Barra minn hekk, l-attivazzjoni taċ-ċelluli gliali u l-infiltrazzjoni tal-moħħ taċ-ċelloli immuni bi tweġiba għal-lipopolysaccharide (LPS) fallew fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI. Tali effetti kienu speċifiċi għall-moħħ, peress li l-immunità periferali ma kinitx affettwata bl-istess mod. Barra minn hekk, il-fosforilazzjoni tal-kumpless IkB kinase (IKK) bi tweġiba għal LPS falliet fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI, filwaqt li l-fosforilazzjoni STAT3 kienet ikkonservata bis-sħiħ, li tissuġġerixxi li l-mogħdija ta 'sinjalazzjoni NF-κB hija affettwata speċifikament minn din il-mogħdija regolatorja GSK3. B'mod ġenerali, is-sejbiet tagħna jindikaw li l-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 tikkontrolla r-rispons infjammatorju tal-moħħ, u tqajjem il-ħtieġa li jiġi evalwat ir-rwol tiegħu fil-progressjoni ta 'patoloġiji newroinfjammatorji.
cistanche tubulosa—Anti-infjammatorji
Kliem ewlieni: newroinfjammazzjoni; mikroglia; astroċiti; newtrofili; Sinjali NF-κB; ċitometrija tal-fluss
X'tagħmel il-ħwawar cistanche—Anti-infjammatorji
Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche
【Staqsi għal aktar】Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Introduzzjoni
Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) huwa serine-threonine kinase b'ispeċifiċità wiesgħa. GSK3 jirregola proċessi differenti bħall-infjammazzjoni, it-tkabbir taċ-ċelluli, id-divrenzjar taċ-ċelluli u l-metaboliżmu tal-enerġija u huwa implikat f'mard relatat mal-età bħad-dijabete, il-marda ta 'Alzheimer u l-kanċer [1]. Iż-żewġ iżoformi GSK3, GSK3 u GSK3 , huma espressi kullimkien, iżda l-funzjonijiet tagħhom mhumiex jikkoinċidu għal kollox [2]. GSK3 huwa attiv b'mod kostituttiv, għalkemm l-attività tiegħu tista 'tiġi inibita permezz ta' sekwestrazzjoni f'kumplessi ċitosoliċi kif ukoll permezz ta 'fosforilazzjoni f'residwi Ser9 u Ser389 [3]. Il-fosforilazzjoni indotta minn Akt ta 'GSK3 f'Ser9 hija mogħdija regolatorja ta' GSK3 preżenti fil-biċċa l-kbira tat-tipi ta 'ċelluli, u hija l-mogħdija default biex tillimita l-attivazzjoni ta' GSK3 u tevita l-mewt taċ-ċelluli. B'kuntrast, sibna li l-fosforilazzjoni Ser389 indotta minn p38 MAPK hija ristretta għal tessuti speċifiċi bħall-moħħ, it-timu u l-milsa [4] u li l-espressjoni tal-moħħ ta 'fosfo-Ser389 GSK3 hija regolata b'mod żvilupp [5]. Il-fosforilazzjoni ta 'GSK3 minn Ser389 hija attivata primarjament mir-rispons tal-waqfiet tad-DNA double-strand u huwa kritiku li titħalla t-tiswija tad-DNA [6,7]. Għalhekk, filwaqt li l-fosforilazzjoni fuq Ser9 hija l-mogħdija ewlenija għall-inattivazzjoni ta 'GSK3 ċitoplasmika, il-fosforilazzjoni ta' Ser389 tintuża biex tinattiva l-pool nukleari ta 'GSK3 biex tiżdied is-sopravivenza waqt it-tiswija tad-DNA DSB [8]. In-nuqqas ta' inattivazzjoni ta' GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 b'reazzjoni għal DSB iwassal għal żieda fil-mewt taċ-ċelluli minn nekroptożi [6,7]. Dan huwa rilevanti ħafna minħabba li t-tip nekroptotiku ta 'mewt huwa aktar infjammatorju u nstab f'mard infjammatorju [9]. Madankollu, b'differenza mill-fosforilazzjoni ta 'Ser9, l-implikazzjonijiet tal-fosforilazzjoni ta' GSK3 fuq Ser389 għadhom ikkaratterizzati ħażin. Numru ta 'studji appoġġaw l-assoċjazzjoni bejn GSK3 u l-infjammazzjoni. Għalhekk, l-attivazzjoni ta' GSK3 minn stimoli infjammatorji bħal stress, infezzjoni, jew trawma tippromwovi l-produzzjoni ta' ċitokini pro-infjammatorji bħal IL-6, IL{-1, u IFN, filwaqt li l-inibizzjoni ta' GSK3 trażżan is-sintesi ta' medjaturi pro-infjammatorji u jżid il-produzzjoni ta' IL-10 miċ-ċelloli immuni [10]. GSK3 jista 'jiġi attivat minn lipopolysaccharide (LPS), waħda mill-endotossini immunostimulatorji ewlenin ta' batterji Gram-negattivi [11,12]. Malli torbot l-LPS batterjali ma 'riċetturi li jixbħu Toll (TLRs), GSK3 jimmedja r-rilaxx ta' ċitokini infjammatorji fiċ-ċelloli tas-sistema immuni intrinsika [13]. Barra minn hekk, ġie rrappurtat li l-għoti ta 'inibituri GSK3 lil ġrieden ittrattati b'doża letali ta' LPS iżżid b'mod sinifikanti s-sopravivenza tal-annimali [14]. Minkejja dawn l-effetti pro-infjammatorji assoċjati ma 'GSK3, ġew dokumentati wkoll effetti anti-infjammatorji [15,16]. Għalhekk, ir-regolamentazzjoni GSK3 hija kritika biex jinżamm il-bilanċ bejn ċitokini pro- u anti-infjammatorji wara l-attivazzjoni tat-TLR [17]. Il-fattur nukleari kB (NF-kB) jimmedja l-produzzjoni ta 'ċitokini pro-infjammatorji u huwa wieħed mill-fatturi ta' traskrizzjoni ewlenin attivati minn TLRs. Diversi awturi kkonfermaw li GSK3 huwa kapaċi jattiva s-sinjalar NF-kB permezz ta 'fosforilazzjoni tal-kumpless IkB kinase (IKK), li fosforila IkB u jirrilaxxa NF-kB attiv. Fattur ieħor ta' traskrizzjoni fosforilat minn GSK3 huwa transducer tas-sinjal u attivatur tat-traskrizzjoni-3 (STAT3), li jimmedja n-newroinfjammazzjoni fil-kuntest ta' xokk settiku [18]. Il-fosforilazzjoni ta' STAT3 minn GSK3 tirriżulta fi traslokazzjoni u attivazzjoni nukleari. Barra minn hekk, GSK3 jinibixxi l-attivitajiet ta' traskrizzjoni CREB u AP-1 anti-infjammatorji, u jamplifikaw l-espressjoni ta 'ċitokini proinfjammatorji [10,19]. Iċ-ċelloli tal-mikroglia huma makrofaġi residenti fis-CNS. Flimkien ma 'lewkoċiti infiltrati, l-attivazzjoni tal-mikroglia għandha rwol kritiku fin-newroinfjammazzjoni. L-astroċiti huma wkoll ċelluli gliali b'funzjonijiet newroimmuni peress li huma crosstalk ma 'mikroglia, lewkoċiti, u ċelluli endoteljali, u b'hekk jimmodulaw kemm ir-risponsi immuni innati kif ukoll adattivi [20]. L-attivazzjoni tal-mikroglia u l-astroċiti bi tweġiba għal stimuli infjammatorji (gliosis) hija kkaratterizzata minn bidliet ċellulari kbar li jinkludu proliferazzjoni, ipertrofija u rilaxx ta 'ċitokini [21]. GSK3 kien involut fl-iżvilupp ta 'gliosis bi tweġiba għal LPS jew b'espressjoni żejda ta' GSK3 newrali [22]. Hemm ukoll evidenza li r-reattività glial u n-newroinfjammazzjoni indotta minn GSK3 jistgħu jiġu medjati bl-attivazzjoni tal-mogħdija NF-kB fil-moħħ [19,23]. B'kuntrast, l-inattivazzjoni ta 'GSK3 tnaqqas ir-reattività glial, tirrestrinġi r-rispons newroinfjammatorju, u żżid l-attività CREB anti-infjammatorja fiċ-ċelloli newrali [24]. Konsegwentement, ġie ssuġġerit li GSK3 għandu rwol fundamentali fil-progressjoni ta 'disturbi newroinfjammatorji, bħall-marda ta' Alzheimer u l-isklerożi multipla [25]. Il-fosforilazzjoni hija mekkaniżmu regolatorju tal-attività GSK3 b'implikazzjonijiet kbar għall-kontroll tar-rispons immuni. Għalhekk, l-inibizzjoni ta’ GSK3 permezz ta’ fosforilazzjoni klassika ta’ Ser9 tirregola l-produzzjoni ta’ medjaturi anti-infjammatorji u tnaqqas ir-rilaxx ta’ ċitokini pro-infjammatorji [26], għalkemm hija wkoll involuta fir-riżoluzzjoni ta’ infjammazzjoni f’mudell ta’ kolite sperimentali indotta minn trinitrobenzene sulfonic acid. [27]. Fi ħdan il-moħħ, inibizzjoni difettuża ta 'GSK3 mill-fosforilazzjoni ta' Ser9 kienet relatata ma 'newropatoloġiji infjammatorji bħall-marda ta' Parkinson [28] u skizofrenija [29]. B'kuntrast, minkejja l-livelli għoljin ta 'phospho-Ser389 GSK3 misjuba fil-moħħ [4], għadu mhux magħruf jekk din il-mogħdija għall-inattivazzjoni ta' GSK3 għandhiex rwol fl-irfinar tan-newroinfjammazzjoni. Hawnhekk, aħna ninvestigaw ir-rwol possibbli tal-inattivazzjoni GSK3 medjata mill-fosforilazzjoni Ser389 fin-newroinfjammazzjoni bl-użu ta 'ġrieden GSK3 KI li fihom GSK3 Ser389 ġie sostitwit b'Ala biex jipprevjeni l-fosforilazzjoni C-terminal ta' GSK3 [7,8]. Ir-riżultati tagħna juru li n-nuqqas ta 'GSK3 inattiv permezz ta' fosforilazzjoni f'Ser389 taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi jwassal għal newroinfjammazzjoni kronika ta 'grad baxx kif ukoll in-nuqqas ta' rispons għal stimuli infjammatorji bħal LPS. Din l-infjammazzjoni kronika tidher li hija speċifika għall-moħħ peress li s-sistema immuni periferali hija fil-biċċa l-kbira mhux affettwata. Aħna nuru wkoll li n-nuqqas ta 'phospho-Ser389 GSK3 fil-moħħ tal-ġrieden GSK3 KI jirregola s-sinjalar NF-kB, li huwa avveniment ċentrali fil-kontroll tan-newroinfjammazzjoni. Għalhekk, is-sejbiet tagħna jipprovdu appoġġ għall-involviment tal-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 f'newropatoloġiji infjammatorji.
2. Riżultati
2.1. In-nuqqas ta' inattivazzjoni ta' GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 iwassal għal Żieda fl-Infjammazzjoni Bażali.
L-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz ta' fosforilazzjoni fuq Ser9 ġiet assoċjata ma 'stadju anti-infjammatorju fil-moħħ [30]. Għalkemm l-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz ta' fosforilazzjoni fuq Ser389 hija importanti biex titnaqqas il-mewt newronali kkawżata minn waqfiet tad-DNA double-strand fil-moħħ, l-ebda studju ma investiga jekk din il-mogħdija tistax tirregola wkoll ir-rispons newroinfjammatorju. Aħna, għalhekk, użajna l-ġrieden GSK3 Ser389 KI deskritti qabel, li fihom Ser389 jiġi sostitwit b'Ala, biex tipprevjeni l-fosforilazzjoni ta 'Ser389. Aħna eżaminajna ċelloli immuni residenti u infiltrati fil-moħħ kollu (ħlief ċerebellum u basal li jinxtamm) minn ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI permezz ta 'dissoċjazzjoni mekkanika tat-tessut u l-gradjent Percoll, wara protokoll ottimizzat qabel biex tinkiseb taħlita bilanċjata ta' ċelloli residenti u infiltrati. fil-moħħ, inklużi mikroglia/makrofaġi, astroċiti, newtrofili infiltrati u limfoċiti [31]. Iċ-ċelloli mbagħad ġew analizzati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss bl-użu ta' markaturi standard (Figura S1 f'Materjali Supplimentari) [31-33]. Mikroglia/makrofaġi attivati u ta' mistrieħ ġew identifikati bħala CD11b + CD45high u CD11b + CD45low, rispettivament, filwaqt li l-popolazzjoni limfoċitika kienet immarkata bħala CD45+CD11b− [32,34]. In-newtrofili kienu kkaratterizzati bħala ċelluli CD45+Ly6G+; u l-astroċiti ġew definiti fi ħdan il-popolazzjoni CD45− bl-espressjoni tal-antiġenu tal-wiċċ taċ-ċellula-2 (ACSA-2). Dan il-markatur jintuża għall-iskoperta ta 'astroċiti li qed jiżviluppaw u adulti [35]. Ir-regolazzjoni 'l fuq ta' ACSA-2 ġiet osservata f'astroċiti reattivi assoċjati ma 'kundizzjonijiet infjammatorji, bħal demjelinazzjoni awtoimmuni [36]. Preċedentement sibna li n-numru ta' astroċiti ACSA-2+ fl-imħuħ tal-ġrieden jiżdied wara t-trattament bl-LPS, u b'hekk jindika aktar li l-livell ta' espressjoni ta' ACSA-2 jikkorrelata mal-attivazzjoni tal-astroċiti b'rispons għal stimuli infjammatorji [31]. Għalkemm ACSA-2 jista' jiġi espress ukoll f'sottopopolazzjoni żgħira ta' mikroglia u makrofaġi [35], dawn iċ-ċelloli huma fil-popolazzjoni CD45+. L-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss tal-iżolati taċ-ċelluli tal-moħħ mill-ġrieden taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi wriet żieda notevoli fil-frazzjoni ta 'mikroglia/makrofaġi attivati fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI meta mqabbla mal-ġrieden WT (Figura 1a). B'kuntrast, il-persentaġġ ta 'mikroglia ta' mistrieħ naqas fil-imħuħ tal-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 1b). Barra minn hekk, kien hemm żieda notevoli fil-preżenza ta 'astroċiti ACSA-2+ (jiġifieri, astroċiti attivati) fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 1c). Rigward l-infiltrazzjoni taċ-ċelluli immuni fil-moħħ, kien hemm akkumulazzjoni ċara ta 'newtrofili fil-moħħ tal-ġrieden GSK3 Ser389 KI relattiva għall-ġrieden WT (Figura 1d), li turi aktar il-preżenza ta' rispons infjammatorju kontinwu fil-moħħ tal-ġrieden GSK3 Ser389 KI taħt fiżjoloġiċi. kundizzjonijiet. Madankollu, il-frekwenza tal-lewkoċiti CD{45+CD11b− (l-aktar ċelluli limfoċitiċi) fil-moħħ ma kinitx affettwata fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 1e). Flimkien, dawn ir-riżultati juru li n-nuqqas li jinibixxi GSK3 permezz ta 'fosforilazzjoni f'Ser389 iwassal għal rispons infjammatorju kroniku innat fil-moħħ li jikkawża reattività bejn mikroglia u astroċiti.
Figura 1. L-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 taffettwa popolazzjonijiet taċ-ċelluli tal-moħħ implikati fin-newroinfjammazzjoni. Imħuħ kemm mill-ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI tneħħew u ġew ipproċessati għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss ta' (a) CD11b++CD45high activated microglia/macrophages, (b) CD11b++CD45low rying microglia, (c) ACSA -2+ astroċiti, (d) newtrofili Ly6G+, u (e) limfoċiti CD11b−. L-istogrammi jirrappreżentaw in-numru taċ-ċelluli, espress bħala l-perċentwal ta' ċelluli CD45- (astroċiti) jew ċelluli CD45+ (il-popolazzjonijiet l-oħra kollha). Id-dejta tintwera bħala medja ± SEM (n=7–9). Student t-test ġie applikat biex iqabbel il-ġenotipi. *, p < {{20}}.05; **, p < 0.01. WT, tat-tip selvaġġ; KI, u GSK3 Ser389 knockin.
2.2. Nuqqas ta 'Effett ta' Fosforilazzjoni GSK3 f'Ser389 fuq Ċelloli tal-Msa
Biex tesplora jekk l-istat infjammatorju mibdul misjub fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI huwiex ristrett għall-moħħ jew jekk l-effett huwiex ukoll sistemiku, għamilna analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss għall-popolazzjonijiet differenti taċ-ċelluli fil-milsa. In-newtrofili ġew identifikati bħala ċelluli Ly6G+. L-espressjoni ta 'Ly6G kienet varjabbli ħafna peress li tiddependi fuq l-istadju ta' maturazzjoni taċ-ċelloli, kif muri qabel [37]. Barra minn hekk, ċelluli majelojdi monoċitiċi ġew ittikkettati bħala ċelluli Ly6G–CD38+CD11b+. Dawn il-monoċiti / makrofaġi ppreżentaw żewġ popolazzjonijiet distinti b'mod ċar ibbażati fuq il-livelli ta 'espressjoni ta' CD38, kif irrappurtat qabel [38]. Ċelloli CD8+, ċelluli CD4+, u ċelluli B220+ (ċelluli B) ġew evalwati wkoll (Figura S2 f'Materjali Supplimentari).
Figura 2. Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss turi popolazzjonijiet simili taċ-ċelluli tal-milsa fil-ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI. Wara d-dissoċjazzjoni taċ-ċelluli tal-milsa, intużat ċitometrija tal-fluss biex jiġi vvalutat in-numru ta’ (a) newtrofili Ly6G+, (b) CD38+CD11b+ monoċiti/makrofaġi, (c) CD4+ ċelluli, (d) Ċelloli CD8+, u (e) ċelluli B220+. L-istogrammi juru n-numri taċ-ċelluli espressi bħala perċentwal taċ-ċelloli totali. Id-dejta tikkorrispondi mal-medja ± SEM (n=5–7). Student t-test ġie applikat biex iqabbel il-ġenotipi. WT, tat-tip selvaġġ; KI, GSK3 Ser389 knockin.
2.3. LPS Mhuwiex kapaċi jżid in-Newroinflammation fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI
Sussegwentement, investigajna jekk l-abolizzjoni tal-fosforilazzjoni ta 'Ser389, minbarra li tikkawża infjammazzjoni tonika bażali, tistax ukoll taffettwa r-rispons infjammatorju attivat minn LPS. Ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI ġew injettati intraperitonealment b'doża subletali (0.5 mg/kg) ta 'lipopolysaccharide batterjali (LPS). Ir-rispons infjammatorju tal-moħħ ġie eżaminat tlett ijiem wara peress li trattament bħal dan intwera qabel li jipproduċi infjammazzjoni ta 'grad baxx fl-imħuħ tal-ġrieden [39,40]. Dan ir-rispons LPS jixbaħ ukoll lill-istat infjammatorju kroniku osservat f'diversi mard newroloġiku, inklużi d-dipressjoni, l-ansjetà u l-marda ta 'Parkinson [41,42]. Kif mistenni, LPS indotta reattività glial fil-ġrieden WT, kif determinat miż-żieda fil-frekwenza ta 'mikroglia / makrofaġi attivati (Figura 3a) u tnaqqis fil-frekwenza ta' mikroglia ta 'mistrieħ (Figura 3b). B'kuntrast, LPS naqas milli jikkawża xi rispons infjammatorju ulterjuri fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 3a, b). Tabella 1 tqabbel direttament il-kobor tar-risponsi LPS bejn iż-żewġ ġenotipi. Barra minn hekk, dan it-trattament LPS żied il-perċentwal ta 'astroċiti ACSA-2+ fil-ġrieden WT, kif irrappurtat qabel [31], iżda mhux fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 3c). Rigward l-infiltrazzjoni tal-moħħ taċ-ċelloli immuni, LPS ikkawża akkumulazzjoni ta 'newtrofili fil-ġrieden WT iżda ma kellu l-ebda effett fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 3d). Fl-aħħarnett, l-amministrazzjoni ta 'LPS ma ppromwovitx akkumulazzjoni ta' limfoċiti fil-moħħ la fil-ġrieden WT jew GSK3 Ser389 KI (Figura 3e). B'kollox, dawn l-osservazzjonijiet jindikaw li l-inattivazzjoni ta 'GSK3 mill-fosforilazzjoni ta' Ser389 hija essenzjali biex tipprevjeni stat infjammatorju toniku fil-moħħ iżda tikkontribwixxi għal infjammazzjoni akuta tal-moħħ b'reazzjoni għal stimuli bħal LPS.
Tabella 1. Differenzi fl-effetti LPS bejn ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI. Il-valuri jirrappreżentaw in-numru taċ-ċelluli wara t-trattament LPS f'kull ġenotip u huma espressi bħala żieda fir-rigward tal-kontrolli ttrattati bil-vettura (medja ± SEM). L-asterisks jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn l-effetti ta 'LPS fl-annimali WT u GSK3 Ser389 KI. WT, tat-tip selvaġġ; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysaccharide. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
Figura 3. Ċelloli newroimmuni minn ġrieden GSK3 Ser389 KI jonqsu milli jirrispondu għal LPS. Ġrieden adulti WT u GSK3 Ser389 KI ġew injettati intraperitonealment b'LPS (0.5 mg/kg). Tlett ijiem wara, popolazzjonijiet tal-moħħ ta' (a) CD11b++CD45high activated microglia/macrophages, (b) CD11b+CD45low standing microglia, (c) ACSA-2+ astrocytes, (d) Ly6G+ newtrophils, u ( e) CD11b− limfoċiti ġew evalwati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. L-istogrammi juru effetti LPS fuq in-numru taċ-ċelluli fiż-żewġ ġenotipi. Id-dejta hija ppreżentata bħala perċentwali ta' ċelluli CD45− (astroċiti) jew ċelluli CD45+ (il-popolazzjonijiet l-oħra kollha), u l-valuri jikkorrispondu għall-medja ± SEM (n=7–9). Student t-test ġie applikat biex jevalwa s-sinifikat tal-bidliet indotti minn LPS f'kull ġenotip. ** p < 0.01. WT, tat-tip selvaġġ; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysaccharide.
Sussegwentement, eżaminajna l-influwenza possibbli tal-fosforilazzjoni tal-ippocampal GSK3 Ser389 fuq l-attivazzjoni glial bażali u r-rispons glial għal stimuli infjammatorji. Għal dan il-għan, it-tikkettar Iba-1 ġie evalwat bil-mikroskopija fil-ġirbu dentat (Figura 4a). L-ewwel, ġrieden WT ġew evalwati. Mikrografiji jiżvelaw attivazzjoni glial bażali baxxa, iżda żieda qawwija fl-immunoreattività glial b'reazzjoni għal injezzjoni ta 'LPS (0.5 mg/kg, 3 ijiem) (Figura 4b). Il-kwantifikazzjoni tad-densità integrata għall-immunostaining Iba-1 wriet valuri li kienu 53% ogħla fil-ġrieden WT wara t-trattament (Figura 4d). Dawn il-bidliet kienu statistikament sinifikanti u huma konsistenti mal-ipertrofija ċellulari prominenti kkawżata minn LPS fl-ippokampus tal-ġrieden irrappurtati qabel [43,44].
Figura 4. Gliosis bi tweġiba għal LPS hija mibdula fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI. Ġrieden adulti WT u GSK3 Ser389 KI ġew injettati intraperitonealment b'LPS jew vettura (C). Wara 3 ijiem, l-imħuħ ġew ipproċessati għal mikroskopija fluworexxenti. (a) Sezzjoni tal-ippokampus koronali adattata mill-atlas tal-moħħ tal-ġurdien [45] tindika l-lokalizzazzjoni tal-immaġini, li jinkludu l-gyrus dentate. (b) It-taqsimiet tal-moħħ kienu immunolatikkettjati għall-markaturi tal-mikroglia/makrofagi Iba-1. Grafiċi juru d-densità integrata tal-immunoreattività Iba-1, li hija kejl tar-reattività glial li tirrifletti kemm l-intensità kif ukoll l-estensjoni tat-tbajja glial. (c) Tqabbil ta' annimali ta' kontroll WT u KI. (d) Rispons LPS f'kull ġenotip tal-ġrieden. Il-valuri kollha huma espressi b'rispett akbar għall-kontrolli WT ittrattati bil-vettura (medja ± SEM, n=4–5). Ġie applikat it-test tal-istudenti. *, p < 0.05. Skala bar, 100 µm. WT, tat-tip selvaġġ; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, vettura; LPS, lipopolysaccharide.
L-analiżi tal-hippocampus tal-ġrieden Ser389 KI wriet differenzi fl-attivazzjoni tal-mikroglia bażali fir-rigward tal-ġrieden WT. Għalhekk, għalkemm spezzjoni viżwali tal-mikrografi uriet attivazzjoni glial moderata f'annimali mutanti (Figura 4b), kejl integrat tad-densità indika li ż-żieda fl-immunoreattività glial kienet statistikament sinifikanti (Figura 4c). Interessanti, il-ġrieden Ser389 KI ma wrew l-ebda sinjali ta 'attivazzjoni ulterjuri wara t-trattament LPS (Figura 4b), u analiżi kwantitattiva kkonfermat li LPS ma kienx kapaċi jżid l-immunostaining Iba-1 fl-ippokampus (Figura 4d), li jissuġġerixxi li l-attivazzjoni taċ-ċelluli gliali permezz LPS huwa indebolit fin-nuqqas ta 'fosforilazzjoni GSK3 Ser389.
benefiċċji tas-supplimenti ta' cistanche—Anti-infjammatorji
2.5. Rispons Immuni Periferali għal LPS Ma Kienx Affettwat fil-Ġrieden GSK3 Ser389 KI
L-esperimenti preċedenti tagħna jiżvelaw il-konsegwenzi profondi tal-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 fuq ir-rispons tal-moħħ għal LPS. Sussegwentement, indirizzajna jekk effetti simili humiex preżenti fl-immunità sistemika. Peress li l-LPS huwa magħruf li jikkawża l-attivazzjoni taċ-ċelloli immuni intrinsiċi tal-milsa [46], il-popolazzjonijiet taċ-ċelloli tal-milsa kemm mill-ġrieden WT kif ukoll GSK3 Ser389 KI ġew evalwati 3 ijiem wara l-injezzjoni ta 'LPS (0.5 mg/kg). in-numru ta' newtrofili Ly6G+ (Figura 5a) u CD38++CD11b++Ly6G− monoċiti/makrofaġi (Figura 5b) żdied b'mod sinifikanti fil-ġrieden WT b'reazzjoni għat-trattament LPS. Dawn l-effetti LPS, mistennija fil-ġrieden WT, ġew osservati wkoll fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 5a, b). L-ebda differenzi bejn il-ġenotipi ma nkisbu lanqas meta popolazzjonijiet ta' limfoċiti mill-milsa ġew analizzati, peress li l-perċentwali taċ-ċelluli CD4+ tal-milsa (Figura 5c) u CD8+ (Figura 5d) tnaqqsu b'LPS ukoll f' iż-żewġ fergħat tal-ġrieden (it-tnaqqis fil-ġrieden mutanti kien statistikament sinifikanti biss għaċ-ċelloli CD4+); u ċ-ċelluli B220+ B ma kinux affettwati minn LPS indipendentement mill-ġenotip (Figura 5e). Dawn l-osservazzjonijiet huma f'kuntrast mal-effetti differenzjali tal-LPS misjuba fl-imħuħ taż-żewġ ġenotipi. Għalhekk, filwaqt li l-ġrieden GSK3 Ser389 KI huma reżistenti għan-newroinfjammazzjoni attivata minn LPS, dawn il-ġrieden mhumiex desensibilizzati sistemiċi għal LPS. Għalhekk, l-effetti tal-fosforilazzjoni GSK3 Ser389 jidhru li huma selettivi għall-moħħ.
Figura 5. Rispons immuni periferali simili għal LPS fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI u WT. Ġrieden adulti WT u GSK3 Ser389 KI ġew injettati ip b'LPS. Wara 3 ijiem, iċ-ċelloli tal-milsa ġew estratti u pproċessati biex jevalwaw, permezz ta' ċitometrija tal-fluss, in-numru ta' (a) newtrofili Ly6G+, (b) CD38+CD11b+ monoċiti/makrofaġi, (c) CD8+, (d) CD4+, u (e) ċelluli B220+. L-istogrammi juru l-effetti tal-LPS fuq in-numru taċ-ċelluli, inklużi l-ġrieden WT u KI. Student t-test ġie applikat biex jevalwa s-sinifikat tal-bidliet indotti minn LPS f'kull ġenotip. Il-medja ± SEM hija murija (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0.01. WT, tat-tip selvaġġ; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneali; C, vettura; LPS, lipopolysaccharide.
2.6. L-attivazzjoni tal-mogħdija NF-κB Indotta mill-LPS fl-Ippokampus hija abolita fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI
NF-κB huwa fattur traskrizzjoni essenzjali għal LPS biex jinduċi infjammazzjoni [47]. Barra minn hekk, intwera li NF-κB huwa regolat minn GSK3 fil-moħħ [2,19,23]. Aħna, għalhekk, eżaminajna l-attivazzjoni ta 'NF-κB fil-moħħ bi tweġiba għal LPS bl-analiżi tal-fosforilazzjoni IKK, pass bikri fil-mogħdija ta' attivazzjoni NF-kB. Ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI ġew ip amministrati b'LPS (0.5 mg/kg) u wara 4 sigħat, inħasad l-ippokampus. Intużaw estratti ta 'ċelluli sħaħ biex jeżaminaw il-fosfo-IKK / u l-IKK totali / permezz ta' Western blotting. Kif mistenni, LPS żied il-fosforilazzjoni IKK fl-ippokampus fil-ġrieden WT (Figura 6a, b). B'kuntrast, LPS naqas milli jinduċi fosforilazzjoni IKK fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI (Figura 6a, b). L-attivazzjoni ta 'STAT3 ġiet assoċjata wkoll ma' infjammazzjoni indotta minn LPS [48]. Aħna għalhekk eżaminajna l-fosforilazzjoni ta 'STAT3 permezz ta' analiżi Western blot. B'kuntrast mal-attivazzjoni ta 'NF-kB, il-fosforilazzjoni ta' STAT3 kienet indotta b'mod qawwi fl-ippokampus kemm tal-ġrieden WT kif ukoll GSK3 Ser389 KI b'reazzjoni għal LPS (Figura 6a, c). Għalhekk, il-prevenzjoni tal-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 tfixkel b'mod selettiv is-sinjalar NF-κB, li huwa konsistenti ma 'rwol għal GSK3 bħala regolatur upstream tal-mogħdija NF-κB fl-ippokampus. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-mogħdija GSK3 tinfluwenza n-newroinfjammazzjoni billi tikkontrolla medjaturi infjammatorji ewlenin, bħal NF-κB.
Figura 6. Nuqqas ta 'inattivazzjoni ta' GSK3 permezz ta 'fosforilazzjoni ta' Ser389 taffettwa b'mod differenti s-sinjalar ta 'NF-κB u STAT3 fi ġrieden ittrattati b'LPS. L-attivazzjoni tal-mogħdijiet NF-κB u STAT3 ġew eżaminati f'lisati taċ-ċelluli sħaħ mill-ippokampus 4 sigħat wara injezzjoni ip ta 'LPS ({{10}}.5 mg/kg) jew vettura (C) fit-tnejn. Ġrieden WT u GSK3 Ser389 KI. Blots juru l-analiżi Western blot ta 'fosfor-IKK / , IKK totali / , fosfor-STAT3, u STAT3 totali. (a) l-iskoperta tat-tubulina kienet inkluża bħala kontroll tat-tagħbija. Graffs assoċjati jikkorrispondu għal (b) phospho-IKK / /IKK / u (c) phospho-STAT3/STAT3 proporzjonijiet, miksuba mill-analiżi densitometrika tal-meded Western blot. Student t-test ġie applikat biex iqabbel kontrolli mhux ittrattati (C) u annimali ttrattati b'LPS f'kull ġenotip (medja ± SEM, n=5-6). *, p < 0.05; ***, p < 0.001. Id-dejta hija rappreżentattiva ta' erba' esperimenti indipendenti għal pIKK/IKK u tliet esperimenti indipendenti għal pSTAT3/STAT3. WT, tat-tip selvaġġ; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneali; C, vettura; LPS, lipopolysaccharide.
3. Diskussjoni
Fil-moħħ, id-disregolazzjoni tal-attività GSK3 hija marbuta ma 'newropatoloġiji multipli li fihom l-infjammazzjoni kronika hija karatteristika komuni [25]. Peress li letteratura kbira tappoġġja li l-inibizzjoni ta 'GSK3 mill-fosforilazzjoni ta' Ser9 tirregola 'l fuq medjaturi anti-infjammatorji u tirregola 'l isfel ċitokini pro-infjammatorji [23,28,30], il-mekkaniżmu komunement propost biex jispjega inattivazzjoni difettuża ta' GSK3 f'patoloġiji newroinfjammatorji huwa l- nuqqas ta' fosforilazzjoni ta' Ser9 [3]. Madankollu, livelli għolja mhux tas-soltu ta 'phospho-Ser389 GSK3 ġew skoperti fil-moħħ [4], li jissuġġerixxi li din il-mogħdija alternattiva għall-inattivazzjoni GSK3 jista' wkoll ikollu rwol prominenti fil-moħħ. L-esperimenti ppreżentati hawn jikxfu l-implikazzjoni tal-fosforilazzjoni GSK3 Ser389 fin-newroinfjammazzjoni, li żżid ma 'evidenza preċedenti li tissuġġerixxi l-involviment ta' din il-mogħdija fit-tiswija tad-DNA tal-moħħ u s-sopravivenza newronali [6,7]. Waħda mis-sejbiet ewlenin fix-xogħol preżenti hija li l-moħħ tal-ġrieden GSK3 Ser389 KI juri glijożi sostnuta u żieda fl-infiltrazzjoni taċ-ċelluli immuni, li hija konsistenti mal-kunċett li l-prevenzjoni tal-inattivazzjoni ta 'GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta' Ser389 twassal għal newroinfjammazzjoni. Id-dejta mill-esperimenti tagħna taċ-ċitometrija tal-fluss jindikaw b'mod ċar għal żieda fin-newroinfjammazzjoni f'dawn l-annimali, peress li n-numru ta 'mikroglia/makrofaġi attivati, astroċiti ACSA 2+, u newtrofili infiltrati fil-moħħ tal-ġrieden Ser389 GSK3 KI kienu ogħla b'mod sinifikanti. Madankollu, minkejja li l-mikro-astrogliosis ġiet osservata b'mod ċar permezz ta 'ċitometrija tal-fluss, analiżi ta' mikrografi tal-hippocampus minn sezzjonijiet tal-moħħ tal-ġrieden Ser389 GSK3 KI wriet li l-ipertrofija tal-mikroglia/makrofaġi kienet ħafifa biss. Riżultati simili ġew osservati meta żoni oħra tal-moħħ ġew analizzati biex jevalwaw il-firxa u l-intensità tal-gliożi (mhux murija). Għalhekk, nikkonkludu li, fin-nuqqas ta 'stimoli pro-infjammatorji, in-nuqqas ta' fosforilazzjoni ta 'GSK3 Ser389 iwassal għal grad ta' newroinfjammazzjoni li għandu jiġi kklassifikat bħala ta 'grad baxx. Bosta studji jappoġġjaw l-assoċjazzjoni bejn l-iperattività GSK3 u n-newrodeġenerazzjoni f'disturbi newroloġiċi [25]. F'dan il-kuntest, ir-rispons infjammatorju li osservajna fil-ġrieden Ser389 GSK3 KI jista 'jkun il-konsegwenza ta' newrodeġenerazzjoni, peress li studji preċedenti sabu mewt newronali fil-kortiċi u l-ippokampus ta 'dawn l-annimali [6]. Dan huwa skont l-osservazzjoni li l-ħsara fid-DNA tinattiva GSK3 permezz tal-fosforilazzjoni ta 'Ser389 bħala mekkaniżmu biex jipprevjeni l-mewt taċ-ċelluli u jippromwovi t-tiswija tad-DSB [7,8]. B'konsegwenza ta' dan, il-moħħ tal-ġrieden KI, li fihom il-fosforilazzjoni ta' Ser389 hija evitata, mhuwiex protett kontra l-mewt newronali kkaġunata minn DSB. Ir-rabta bejn l-espressjoni tal-fosfor-Ser389 GSK3 u s-sopravivenza taċ-ċelluli ġiet proposta għall-ewwel darba fil-limfoċiti, bħala mekkaniżmu implikat fir-rispons immuni adattiv. Għalhekk, in-nuqqas ta 'fosforilazzjoni GSK3 Ser389 fil-ġrieden KI instab li jinduċi necroptosis fiċ-ċelloli B matul il-maturazzjoni tard tagħha, li hija tip infjammatorju ħafna ta' mewt taċ-ċelluli relatata ma 'bosta patoloġiji [9]. Huwa wkoll interessanti li wieħed jinnota li mhux biss il-fosforilazzjoni ta 'Ser389 iżda wkoll il-fosforilazzjoni ta' Ser9 jistgħu jiġu attivati biex jinattivaw GSK3 bi tweġiba għal ħsara fid-DNA. Madankollu, il-ġrieden Ser389 GSK3 KI jippreżentaw fenotip newrodeġenerattiv [6] mhux preżenti fil-ġrieden Ser9 GSK3 KI [49,50], li jindika li l-fosforilazzjoni Ser389 għandha rwoli speċifiċi fil-kontroll tal-attività GSK3 u li hemm xenarji li fihom il-fosforilazzjoni Ser9 ma tistax tikkumpensa. għat-telf ta' fosforilazzjoni ta' Ser389. Għaldaqstant, ir-rabta intriganti bejn Ser389 GSK3 deregolamentazzjoni, newroinfjammazzjoni, u newrodeġenerazzjoni żvelata hawn jeħtieġ li tiġi esplorata aktar biex jiġi ċċarat jekk fosforilazzjoni GSK3 mibdula f'Ser389 tistax tkun fattur ewlieni fin-newropatoloġiji li fihom l-infjammazzjoni kronika hija distintiva, bħall-marda ta 'Alzheimer. Barra minn hekk, l-attivazzjoni ħafifa iżda persistenti taċ-ċelluli newroimmuni osservata fil-ġrieden GSK3 Ser389 KI hija konsistenti mal-ipoteżi li n-nuqqas ta 'fosforilazzjoni ta' Ser389 jista 'jkun assoċjat ma' immunosenescence. Dan huwa proċess relatat mal-età kkaratterizzat minn tnaqqis fil-funzjonijiet immuni flimkien ma 'żieda fl-espressjoni ta' medjaturi proinfjammatorji; li jwassal għal infjammazzjoni kronika ta 'grad baxx [1,51]. Diversi awturi indikaw l-involviment tad-deregolamentazzjoni GSK3 fl-infjammazzjoni relatata mal-età [1,52]. Ġie propost ukoll li l-funzjoni anormali tal-mikroglia osservata fil-kuntest tal-immunosenescence tal-moħħ tista 'eventwalment tikkawża newrodeġenerazzjoni [53]. Għalhekk, immunosenescence aċċellerata fil-ġrieden Ser389 GSK3 KI tista 'tikkontribwixxi għat-telf ta' newroni rrappurtati qabel f'dawn l-annimali [6]. LPS intuża b'mod estensiv biex jinduċi infjammazzjoni kemm f'mudelli "in vivo" kif ukoll "in vitro". Madankollu, hemm evidenza li d-doża ta 'LPS amministrata tiddetermina fil-biċċa l-kbira t-tip ta' rispons infjammatorju indott [54-56]. Dożi għoljin ta 'LPS jipproduċu risponsi xokk settiċi; filwaqt li dożi moderati ta 'LPS jikkawżaw infjammazzjoni persistenti ta' grad baxx eqreb għal dik osservata f'ħafna mard kroniku [42]. F'dan il-kuntest, huwa importanti li jiġi enfasizzat li d-doża LPS magħżula għall-esperimenti tagħna (0.5 mg/kg, ip) hija moderata u hija 'l bogħod mill-LD50 irrappurtat għal LPS fil-ġrieden (10-25 mg/kg) [57,58 ]. Bi qbil mar-rapporti preċedenti [40,59], sibna li doża ta 'LPS bħal din mhix letali u hija biżżejjed biex iżżid il-gliożi u l-infiltrazzjoni tal-moħħ ta' newtrofili f'annimali WT, filwaqt li l-infiltrazzjoni tal-limfoċiti mhix affettwata. B'mod notevoli, tali rispons LPS moderat (iżda sinifikanti) ġie abolit fil-moħħ tal-ġrieden KI b'inattivazzjoni indebolita ta 'GSK3 permezz ta' fosforilazzjoni ta 'Ser389. Skont din l-osservazzjoni, l-iperattivazzjoni estiża ta 'GSK3 fil-moħħ tista' eventwalment tirregola s-sensittività għal insulti pro-infjammatorji. Ta 'min jinnota li r-rispons difettuż għal LPS fil-ġrieden mutanti huwa kompatibbli mal-mekkaniżmu ta' immunotolleranza jew reżistenza, proċess komuni fis-CNS immirat li jnaqqas l-attivazzjoni taċ-ċelluli gliali u jillimita l-ħsara fil-moħħ minn infjammazzjoni eċċessiva [60,61]. Bi qbil ma 'din l-idea, studju preċedenti wera li l-attivazzjoni ta' GSK3 fil-ġrieden tista 'tinduċi immunotolleranza u trażżan risponsi LPS [62].
Benefiċċji ta' cistanche tubulosa-ssaħħaħ is-sistema immuni
Huwa wkoll interessanti li wieħed jikkunsidra li l-effetti tal-moħħ deskritti f'dan l-istudju juru speċifiċità għolja. Għalhekk, kuntrarjament għall-moħħ, il-biċċa l-kbira tal-popolazzjonijiet taċ-ċelluli tal-milsa evalwati f'annimali WT u Ser389 GSK3 KI ppreżentaw l-istess profil f'kundizzjonijiet mhux stimulati, kif ukoll rispons simili għal LPS. Dan jissuġġerixxi li l-mogħdija ta 'inattivazzjoni GSK3 dipendenti fuq il-fosforilazzjoni ta' Ser389 għandha rwoli speċifiċi fir-regolazzjoni tan-newroinfjammazzjoni. Bi qbil ma 'din l-ipoteżi, iċ-ċelloli tal-moħħ juru espressjoni għolja ta' fosfo-Ser389 GSK3 meta mqabbla ma 'tessuti oħra, u din l-espressjoni hija regolata sewwa waqt l-iżvilupp tal-moħħ [5]. Fl-aħħarnett, skont is-sejbiet tagħna, ir-regolamentazzjoni ta 'GSK3 permezz ta' fosforilazzjoni f'Ser389 hija medjata speċifikament mill-mogħdija ta 'sinjalazzjoni NF-kB, peress li l-attivazzjoni ta' STAT3 ma kinitx affettwata f'Ser389 GSK3 KI. Ħafna medjaturi infjammatorji downstream huma regolati mill-attivazzjoni NF-kB, inklużi ċitokini, riċetturi, fatturi ta 'traskrizzjoni, u enzimi. L-identifikazzjoni ta 'liema minn dawn il-miri NF-kB huma influwenzati mill-fosforilazzjoni ta' Ser389 GSK3 hija lil hinn mill-ambitu tax-xogħol tagħna, iżda se tkun għan eċċitanti għal studji futuri li jimmiraw li jiċċaraw il-mekkaniżmi ta 'newroinfjammazzjoni.
4. Materjali u Metodi
4.1. Annimali
Ġrieden C57BL/6J Wild-type (WT) inxtraw minn Jackson Laboratories. Ġrieden C57BL/6 GSK3 Ser389 KI, li fihom ir-residwu Ser389 ta 'GSK3 ġie sostitwit b'Ala biex jipprevjeni l-fosforilazzjoni, ġew iġġenerati kif deskritt qabel [8]. Il-ġrieden kollha kienu miżmuma fil-faċilità tal-annimali assoċjata mal-Iskola Medika ta' Albacete taħt ċiklu ta' 12-dawl/dlam. L-ikel u l-ilma ġew ipprovduti ad libitum. Ġrieden adulti ta 'erba' sa sitt xhur intużaw għall-esperimenti.
4.2. Amministrazzjoni LPS
Biex jinduċu rispons infjammatorju, il-ġrieden irċevew injezzjoni waħda intraperitoneali (ip) ta' {{0}}.5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (serotype typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Spanja) ġiet maħlula f'melħ sterili, ħieles mill-endotossini 0.9% f'10 mg/mL. Tlett ijiem wara t-trattament, il-ġrieden ġew ewtanizzati, u l-moħħ u l-milsa tneħħew għall-immunoistokimika jew analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss taċ-ċelluli glial u ċ-ċelloli immuni infiltrati. Għall-analiżi Western blotting, l-annimali ġew ewtanizzati 4 sigħat wara injezzjoni ip ta '0.5 mg / kg LPS, peress li LPS qabel kien irrappurtat li jirregola proteini infjammatorji fl-imħuħ tal-ġrieden u tal-firien 2-4 sigħat wara l-amministrazzjoni ip [63,64].
4.3. Ċitometrija tal-Fluss
Għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss tat-tessut tal-moħħ u ċ-ċelloli tal-milsa, l-annimali ġew anestetizzati b'injezzjoni ip ta 'tribromoethanol, li ġiet rakkomandata għal studji terminali akuti. Id-doża baxxa ta 'tribromoethanol użata (200 mg/kg) tipprovdi anestesija ħafifa mingħajr effetti avversi serji jew influwenza fuq l-espressjoni ta' ċitokini infjammatorji [65]. Twettqu proċeduri ta 'l-annimali wara li vverifikaw in-nuqqas ta' riflessi.
4.3.1. Id-dissoċjazzjoni tat-tessut tal-moħħ u l-Iżolament tal-Gradjent Percoll taċ-Ċelloli Newrali
Il-ġrieden kienu mxerrda intrakardijakament b'50 mL ta' 0.9% NaCl qabel il-ġbir tat-tessuti biex jitneħħew iċ-ċelloli li jiċċirkolaw mill-vini tad-demm tal-moħħ. Wara l-perfużjoni, l-imħuħ tneħħew, il-meninges u l-plexus tal-korojde ġew separati bir-reqqa, u ċ-ċerebellum u l-bozoz tax-xamm ġew mormija. It-tessut li jifdal tpoġġa f'Soluzzjoni Balanced Salt Hank kiesħa, li hija ħielsa mill-klorur tal-kalċju u mill-klorur tal-manjeżju (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Spanja, 14175). Il-kampjuni tat-tessuti mbagħad ġew imqatta 'b'mod fin bi skalpell qabel id-diġestjoni. Tessut imqatta 'mbagħad tqiegħed f'tubi MACS C (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Spanja, 130-093-237) f'volum totali ta' 5 mL, u pproċessat b'dissoċjatur mekkaniku f'6 rpm għal 30 min. Id-dissoċjazzjoni enżimatika twettqet skont il-protokoll tagħna stess [31] bl-użu ta’ papain (100 U; Worthington, LK003178) u dispase II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanja, D4963) f’Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2) /[+]MgSO4;Gibco, Madrid, Spanja, 24010). DNAse I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanja, DN25) ġie miżjud mas-soluzzjoni biex jitneħħa l-mukus tad-DNA li jaffettwa ħażin il-vijabbiltà taċ-ċelluli [66]. Qabel l-użu, papain ġie attivat għal 30 min f'37 ◦C f'5% CO2. Biex titwaqqaf id-diġestjoni, il-kampjuni ġew dilwiti b'HBSS kiesaħ u mqiegħda fuq is-silġ. Din is-soluzzjoni mbagħad ġiet ippattjata 10 darbiet bl-użu ta' pipetti ta' 5 mL u ffiltrata permezz ta' passatur taċ-ċelluli ta' 70 µm (BD, 352350). Is-sospensjoni ta 'ċellula waħda li tirriżulta kienet ċentrifugata fi 300 × g għal 10 min f'RT. Intuża gradjent ta' 30% PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Spanja, 17-0891-01) biex titneħħa l-majelina u jarrikkixxi l-omoġenat f'ċelluli gliali vijabbli. Għal dan il-għan, ġiet ippreparata soluzzjoni ta’ stokk ta’ Percoll iżotoniku (SIP) (9:1 Percoll f’10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185), u gerbub taċ-ċelluli ġew sospiżi mill-ġdid fi 30% (v/ v) SIP (f'1× HBSS). Il-gradjent Percoll ta '30% twettaq billi żżid 3 mL ta' SIP ma '7 mL ta' 1 × HBSS li kien fih is-sospensjoni taċ-ċelluli f'tubu tal-polypropylene ta '14 mL. Kull gradjent ġie ċentrifugat mingħajr brejk f'300 × g għal 30 min f'18 ◦C. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, iċ-ċelluli mis-saff tal-qiegħ inġabru, inħaslu b'1 × HBSS, ġew ċentrifugati għal 10 min f'300 × g, u ġew sospiżi mill-ġdid f'10 mL ta '1 × buffer tal-liżi taċ-ċelluli ħomor tad-demm f'4 ◦C. Wara l-liżi, is-sospensjoni taċ-ċelluli ġiet ċentrifugata fi 300 × g għal 10 min, u l-pellet taċ-ċelluli li rriżulta finalment ġie sospiż mill-ġdid f'50 µL ta 'buffer imblukkar qabel it-tbajja' għaċ-ċitometrija tal-fluss.
4.3.2. Dissocjazzjoni taċ-Ċelloli tal-milsa
Il-milsa tqiegħdet fuq dixx Petri li kien fih RPMI 1640 u maqtugħ f'biċċiet żgħar. It-tessut li rriżulta ġie mgħoddi ġo passatur taċ-ċelluli ta' 70 µm (BD, 352350) u maqsum f'moviment ċirkolari bil-parti ta' fuq irrigat tal-planġer tas-siringa. RPMI 1640 imbagħad ġie mgħoddi mill-passatur. It-tessut diżintegrat ġie trasferit għal tubi ta '50 mL (Sarstedt, Barċellona, Spanja, 62.547.254) u ċentrifugat f'100 g għal 10 min. Is-supernatant li kien fih is-sospensjoni taċ-ċelluli mbagħad inġabar u ġie ċentrifugat mill-ġdid fi 300 g għal 10 min. Is-supernatant li jirriżulta tneħħa, u l-pellet ġie sospiż mill-ġdid f'10 mL phosphate-buffered saline (PBS) b'1% FBS biex jingħaddu n-numru ta 'ċelluli taħt il-mikroskopju, u wara reġa' ġie ċentrifugat fi 300 g għal 5 min. Intużaw biss 500,000 ċellula għal kull kampjun. Kull kampjun imbagħad ġie sospiż mill-ġdid f'50 µL ta' buffer imblukkar qabel ma tbajja' għaċ-ċitometrija tal-fluss.
4.3.3. Tbajja ta' Ċitometrija tal-Fluss Extraċellulari
Tabella 2. Antikorpi u reaġenti użati għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss.
4.4. Immunoistokimika
Ġrieden kienu anestetizzati profondament u mxerrda intrakardijakament b'salina {{0}}.9% (w/v). Imħuħ tagħhom inġabru u ġew iffissati wara b'4% paraformaldehyde għal 24 siegħa. Wara l-fissazzjoni ta 'wara, ġew krijoprotetti b'30% sukrożju u ffriżati f'-20 ◦C sakemm jinqatgħu. Sezzjonijiet tat-tessuti (20 µm) inqatgħu bl-użu ta 'kriostat (ThermoFisher, Microm™ HM550), jinħall immuntat fuq slides Superfrost Plus (ThermoFisher, J1800AMNZ) u finalment maħżuna f'-20 ◦C sakemm tbajja. Tbajja immunoistokimika tas-sezzjonijiet tat-tessuti twettqet kif deskritt qabel [67]. Soluzzjonijiet ta 'antikorpi primarji u sekondarji ġew dilwiti f'1 × PBS b'1% BSA. Is-sezzjonijiet ġew inkubati bl-antikorp primarju kontra l-fenek Iba-1 (dilwizzjoni 1:500; Wako Chemicals, Barċellona, Spanja, 019-19741). Alexa Fluor 488-IgG konjugat tal-mogħoż kontra l-fenek (dilwizzjoni 1:2000; ThermoFisher, Madrid, Spanja, A11031) intuża bħala l-antikorp sekondarju. Ġie inkluż tessut ta' kontroll pożittiv xieraq, kif ukoll kontrolli negattivi primarji u sekondarji. Immaġini ta' tikkettjar fluworexxenti ġew akkwistati bl-użu ta' ZEISS Apotome. 2 mikroskopju b'kamera diġitali mono axiom 503 u s-softwer tal-kontroll Zen Blue verżjoni 2.3 (Carl Zeiss). Għan 10× (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0.45, AIR) intuża biex jivviżwalizza l-hippocampus. Id-densità integrata fir-reġjuni ta 'interess ġiet ikkalkulata bis-softwer ImageJ. Dan il-parametru jikkorrispondi għas-somma tal-valuri tal-intensità għal kull pixel fir-reġjun magħżul. Għalhekk, huwa użat għall-kwantifikazzjoni tan-numru ta 'ċelluli mtebbgħin flimkien mal-intensità tat-tebgħa ta' kull ċellula.
cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni
4.5. Analiżi Western Blot
Imħuħ tal-ġrieden tneħħew malajr, u l-ippocampi ġew imqassma u ffriżati immedjatament. It-tessut ġie ppreparat bl-użu ta' buffer ta' liżi ipertoniku li kien fih inibituri tal-protease kif deskritt qabel [68]. L-antikorpi primarji użati kienu anti-fenek fosfor-IKK / (dilwizzjoni 1:1000; Cell Signaling, Alcobendas, Spanja, 2861), anti-fenek IKK / (dilwizzjoni 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Ġermanja, sc{{ 9}}), anti-fenek fosfor-STAT3 (dilwizzjoni 1:1000; Sinjali taċ-Ċelloli, 9145) u STAT3 kontra l-ġurdien (dilwizzjoni 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-ġurdien -tubulina (1:2000 dilwizzjoni; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) intuża bħala kontroll tat-tagħbija. HRP kontra l-fniek (dilwizzjoni 1:5000; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA, 111-035-144) u HRP kontra l-ġrieden (dilwizzjoni 1:5000; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003) intużaw bħala antikorpi sekondarji . Il-kwantifikazzjoni tal-faxxa tal-proteini twettqet permezz ta 'analiżi tad-densitometrija tal-faxxa bis-Software NIH ImageJ (Verżjoni 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, aċċessata fl-1 ta' Marzu 2022). Biex tkun żgurata tagħbijiet ugwali, id-densità integrata miksuba għal kull faxxa ġiet espressa bħala valur relattiv fir-rigward tal-kontroll xieraq tat-tagħbija tal-manutenzjoni.
4.6. Analiżi Statistika
Ir-riżultati ġew analizzati statistikament bis-softwer GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± żball standard tal-medja (SEM) ta' ġeneralment erba' esperimenti indipendenti (n {{0}}–9). Wara li kkonfermat id-distribuzzjoni normali tad-dejta bit-test Shapiro-Wilk, is-sinifikat statistiku bejn iż-żewġ gruppi ġie ddeterminat mit-test t Student għal dejta parametrika. Id-differenzi tqiesu statistikament sinifikanti meta l-valuri tal-probabbiltà (p) kienu inqas minn 0.05 (*), 0.01 (**), jew 0.001 (***). Iċ-ċifri juru esperimenti rappreżentattivi.
5. Konklużjonijiet
Fil-qosor, is-sejbiet tagħna jindikaw li n-nuqqas ta 'inattivazzjoni ta' GSK3 mill-fosforilazzjoni ta 'Ser389 iwassal għal infjammazzjoni kronika u tolleranza ta' endotossini u li l-inibizzjoni ta 'GSK3 minn fosforilazzjoni ta' Ser9 u Ser389 għandha rwoli komplementari u mhux żejda fir-rispons newroimmuni. Għalhekk, il-konsegwenzi speċifiċi tal-fosforilazzjoni GSK3 Ser389 għan-newropatoloġija u t-tixjiħ tal-moħħ għandhom jiġu investigati.
Referenzi
1. Souder, DC; Anderson, RM Netwerk GSK3 li qed jespandi: Implikazzjonijiet għar-riċerka dwar ix-xjuħija. Geroscience 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Rekwiżit għal glycogen synthase kinase-3 fis-sopravivenza taċ-ċelluli u l-attivazzjoni ta' NF-κB. Natura 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Il-faxxinu u d-dija tal-glycogen synthase kinase-3. Xejriet Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Injam, CD; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; et al. Fosforilazzjoni minn p38 MAPK bħala mogħdija alternattiva għall-inattivazzjoni ta 'GSK3beta. Xjenza 2008, 320, 667–670. [CrossRef]
5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Regolament ta 'GSK3 minn Ser 389 Fosforilazzjoni Waqt l-Iżvilupp Neural. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Liebru, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Nuqqas ta' Inattivazzjoni tal-GSK3 Nukleari minn Ser 389-Fosforilazzjoni Twassal għal Mewt Neuronali Fokali u Rispons ta' Biża' Mtawwal. Neuropsychopharmacology 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]
7. Liebru, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; King, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Ġimagħtejn ta 'stress varjabbli iżidu l-livelli gamma-H2AX fin-nukleu tas-sodda tal-ġurdien tal-istria terminalis. Newroxjenza 2018, 373, 137–144. [CrossRef]
8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. L-inattivazzjoni ta 'GSK3beta nukleari permezz ta' fosforilazzjoni ta 'Ser (389) tippromwovi l-idoneità tal-limfoċiti waqt ir-rispons tal-waqfa ta' linji doppji tad-DNA. Nat. Komun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]
9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Necroptosis u r-rwol tagħha fl-infjammazzjoni. Natura 2015, 517, 311–320. [CrossRef]
10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Stressed u Infjammat, Jista' GSK3 Jitwaħħal? Xejriet Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]
11. Beutler, B.; Rietschel, ET Sensing immuni innat, u l-għeruq tiegħu: L-istorja ta 'endotossina. Nat. Dun Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Modulazzjoni dinamika tar-rispons immuni intrinsiku permezz ta 'dożaġġi li jvarjaw ta' lipopolysaccharide (LPS) f'ċelloli monoċitiċi umani. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]
13. Lu, YC; Yeh, WC; Ohashi, mogħdija tat-trasduzzjoni tas-sinjal PS LPS/TLR4. Cytokine 2008, 42, 145–151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, peptide inibitur SY GSK3 jipproteġi l-ġrieden minn xokk ta 'endotossini indott minn LPS. Immune Netw. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Reviżjoni tar-Rwol ta 'GSK3, Modulatur ta' Immunità Innata, f'Mijosite tal-Korp ta 'Inklużjoni Idjopatika. Cells 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Dwieli, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Rwol anti-infjammatorju ġdid għal glycogen synthase kinase-3beta fl-inibizzjoni tal-espressjoni tal-ġeni infjammatorji indotti minn tumur necrosis factor-alpha- u interleukin-1beta. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: A Kinase Ibbilanċjar Promozzjoni u Riżoluzzjoni ta 'Infjammazzjoni. Cells 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, E.; Jope, il-produzzjoni ta' interleukin-6 indotta minn RS Lipopolysaccharide hija kkontrollata minn glycogen synthase kinase-3 u STAT3 fil-moħħ. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]
19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. L-inattivazzjoni tal-Glycogen synthase kinase-3 tinibixxi l-produzzjoni tal-fattur tan-nekrożi tat-tumur fil-mikroglia billi timmodula l-kaskati tas-sinjalar tal-fattur nukleari κB u MLK3/JNK. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]
20. Priego, N.; Valiente, M. Il-potenzjal tal-astroċiti bħala modulaturi immuni fit-tumuri tal-moħħ. Quddiem. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]
21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Microglia u l-involviment tal-astroċiti fin-newrodeġenerazzjoni u l-kanċer tal-moħħ. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Tiġieġa, R.; Avila, J. Tnaqqis ta' beta-catenin nukleari, tau hyperphosphory lation, u newrodeġenerazzjoni fil-ġrieden transġeniċi kondizzjonali GSK-3beta. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; et al. L-inibizzjoni ta 'Gsk3b Inaqqas is-Sinjali ta' Nfkb1 u ssalva l-Attività Sinaptika biex Ittejjeb il-Fenotip tas-Sindrome Rett fil-Ġrieden Knockout Mecp 2-. Ċellula. Rep 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Il-produzzjoni taċ-ċitokini medjata mir-riċettur bħal Toll hija regolata b'mod differenzjat minn glycogen synthase kinase. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [CrossRef]
25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mekkaniżmi u implikazzjonijiet terapewtiċi ta 'GSK-3 fit-trattament tan-newrodeġenerazzjoni. Ċelluli 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Il-kinase Akt1 tikkontrolla r-rispons tal-makrofagi għal-lipopolysaccharide billi tirregola microRNAs. Immunità 2009, 31, 220–231. [CrossRef]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL-13 orkestra r-riżoluzzjoni ta 'infjammazzjoni intestinali kronika permezz ta' fosforilazzjoni ta 'glycogen synthase kinase-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]
28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glycogen synthase kinase-3beta hija assoċjata mal-marda ta' Parkinson. Newrosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]
29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. Parametri GSK-3 fil-limfoċiti ta 'pazjenti skizofreniċi. Psikjatrija Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): Infjammazzjoni, mard, u terapewtiċi. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]
31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernández, M.; Tranque, P. Dissocjazzjoni tal-moħħ tal-ġrieden tat-twelid u adulti għal analiżi simultanja ta 'mikroglia, astroċiti u limfoċiti infiltranti permezz ta' ċitometrija tal-fluss. IBRO Rep 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. Metodu ottimizzat biex jipproċessa s-CNS tal-ġurdien biex janalizza simultanjament ċelluli newrali u lewkoċiti permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. J. Neurosci. Metodi 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG Metodu bbażat fuq l-immunoaffinità għall-iżolament ta' astroċiti adulti ultrapuri bbażat fuq l-immirar ta' ATP1B2 mill-antikorp ACSA-2. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP L-użu taċ-ċitometrija tal-fluss biex tevalwa bidliet temporali fiċ-ċelloli infjammatorji wara iskemija ċerebrali fokali fil-ġrieden. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovic, J.; et al. Anti-ACSA-2 jiddefinixxi antikorp monoklonali ġdid għall-iżolament prospettiv ta' astroċiti ħajjin tat-twelid u adulti. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Analiżi tal-espressjoni tal-ġeni tas-sinjalar tal-endokannabinojdi tal-astroċiti u l-mikroglia waqt id-demjelinazzjoni awtoimmuni. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh maturi u Ly6Gint newtrofili immaturi jikkontribwixxu għall-eradikazzjoni ta 'S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Tomgħod, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; et al. Il-punteġġ immunoistokimiku ta' CD38 fil-mikroambjent tat-tumur ibassar ir-rispons għall-immunoterapija anti-PD-1/PD-L1 fil-karċinoma epatoċellulari. J. Immunother. Kanċer 2020, 8, e000987. [CrossRef]
39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B irażżan l-infjammazzjoni indotta minn lipopolysaccharide (LPS) fil-moħħ tal-ġurdien. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; et al. Rwol tan-newroinfjammazzjoni fil-patoloġija tal-amilojde tal-moħħ ikkaġunata mill-ipertensjoni. Neurobiol. Tixjiħ 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]
41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS jattiva mogħdijiet newroinfjammatorji biex jinduċu depressjoni f'kundizzjoni bħal marda ta 'Parkinson. Quddiem. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Reazzjonijiet newrali u komportamentali għal infjammazzjoni ta 'grad baxx. Imġiba. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolysaccharide jinduċi attivazzjoni newroglia u attivazzjoni NF-κB fil-kortiċi ċerebrali ta 'ġrieden adulti. Lab. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]
44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Il-litju jtejjeb in-newrotossiċità indotta minn lipopolysaccharide fil-kortiċi u l-ippokampus tal-moħħ tal-firien adulti. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Paxinos, G.; Franklin, KB Mouse Brain f'Koordinati Stereotaxic. 2001. Disponibbli onlajn: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (aċċessat fl-1 ta' Marzu 2022).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Il-milsa fir-regolamentazzjoni lokali u sistemika tal-immunità. Immunità 2013, 39, 806–818. [CrossRef]
47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-κB sinjalazzjoni fl-infjammazzjoni. Transduct tas-Sinjal. Mira. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balic, JJ; Albarġija, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. Il-fosforilazzjoni tas-serina STAT3 hija meħtieġa għar-riprogrammazzjoni metabolika ta' TLR4 u l-espressjoni ta' IL-1. Nat. Komun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Il-ġabra Wnt ta 'glycogen synthase kinase 3beta hija kritika għall-mewt newronali kkaġunata minn deprivazzjoni trofika. Mol. Ċellula. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]
50. Eom, T.; Jope, RS Serine-fosforilazzjoni inibitorja imblukkata ta' glycogen synthase kinase-3 / tfixkel il-proliferazzjoni taċ-ċelluli prekursuri newrali in vivo. Biol. Psikjatrija 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Infjammazzjoni kronika (infjammazzjoni) u l-kontribut potenzjali tagħha għal mard assoċjat ma 'l-età. J. Gerontol. Ser. A Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]
52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA Rwol għal ċelluli majelojdi immaturi fis-senescence immuni. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Y.; Le, W. Rwoli differenzjali tal-mikroglia M1 u M2 f'mard newrodeġenerattiv. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Infjammazzjoni sistemika u attivazzjoni mikrogliali: Reviżjoni sistematika ta 'esperimenti fuq l-annimali. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Eteroġeneità dipendenti mir-Reġjun tal-Moħħ u Differenza li tiddependi mid-doża fiż-Żieda Transitorja tal-Popolazzjoni tal-Mikroglia waqt Infjammazzjoni Indotta minn Lipopolysaccharide. Sci. Rep 2018, 8, 2203. [CrossRef]
56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Attivazzjoni mikrogliali u astroċitika speċifika għar-reġjun tal-moħħ b'reazzjoni għal espożizzjoni sistemika għal lipopolisakkaridi. Quddiem. Tixjiħ Neurosci. 2022, 14, 910988. [CrossRef]
57. Radulovic, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injezzjonijiet ta 'lipopolysaccharide fil-ġrieden biex jimitaw id-dħul ta' prodotti derivati mill-mikrobi wara ksur tal-barriera intestinali. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]
58. Fink, MP Mudelli ta' annimali ta' sepsis. Virulence 2014, 5, 143–153. [CrossRef]
59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Rwol ta 'TLR4 endoteljali għar-reklutaġġ ta' newtrofili f'microvessels tas-sistema nervuża ċentrali f'infjammazzjoni sistemika. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]
60. Beurel, E. HDAC6 jirregola t-tolleranza LPS fl-astroċiti. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]
61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Effetti protettivi ta 'tolleranza ta' endotossini fuq newroinflammation indotta minn lipopolysaccharide periferali u korriment newronali dopaminerġiku. Immunofarmakol. Immunotossikol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Fattur tan-nekrożi tat-tumur jinduċi tolleranza inkroċjata medjata minn GSK3 kinase għal endotossina fil-makrofaġi. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Proteina katalitikament inattiva relatata mal-Phospholipase C tirregola l-infjammazzjoni ipotalamika indotta minn lipopolysaccharide anoreksja medjata fil-ġrieden. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin jistimula l-passaġġ ta 'sinjalazzjoni SIRT 1/Nrf2 li jikkontrobattu l-istress ossidattiv indott minn lipopolysaccharide (LPS) biex isalva l-moħħ tal-firien wara t-twelid. CNS Neurosci. Ther. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetika ta 'ċitokini proinfjammatorji wara injezzjoni intraperitoneali ta' tribromoethanol u taħlita ta 'tribromoethanol/xylazine fil-ġrieden ICR. Lab. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Moller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Iżolament u Analiżi Ċitometrika tal-Fluss taċ-Ċelloli Immuni mill-Moħħ Iskemiku tal-Ġurdien. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Rispons tal-fattur ta 'traskrizzjoni NFATc3 għal insulti eċċitotossiċi u trawmatiċi tal-moħħ: Identifikazzjoni ta' sottopopolazzjoni ta 'astroċiti reattivi. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]
68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Espressjoni ta 'Selenoprotein S f'astroċiti reattivi wara korriment fil-moħħ. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]
