GRP78 Espressjoni Żejjed Tqajjem ROŻA1-Mitofaġija Neuroprotettiva Medjata mill-IP3R Parti 1

Astratt:

Mudell sperimentali ta 'avulsjoni ta' l-għeruq tas-sinsla (RA) huwa utli għall-istudju ta 'programmi molekulari kawżali li jmexxu n-newrodeġenerazzjoni retrograda wara skonnessjoni tal-mira tan-newroni.

L-avulsjoni ta 'l-għeruq tas-sinsla hija korriment fatali tas-sistema nervuża ċentrali li jista' jkollha impatt sinifikanti fuq il-ħajja ta 'kuljum u l-kapaċità konjittiva tal-pazjent. Fortunatament, madankollu, il-memorja mhix neċessarjament affettwata, u ħafna mill-pazjenti jistgħu jtejbu l-memorja tagħhom permezz ta 'xi metodi effettivi ta' riabilitazzjoni konjittiva.

Diversi studji wrew li l-avulsjoni tal-għeruq tas-sinsla ma taffettwax direttament il-memorja ta 'persuna, iżda taffettwa prinċipalment il-kapaċità konjittiva tal-moħħ tal-pazjent, inklużi l-attenzjoni, il-konjizzjoni u t-tagħlim. Dan ifisser li anke jekk affettwat minn avulżjoni ta 'l-għeruq tas-sinsla, ħafna nies għad għandhom memorja tajba.

Għalhekk, għal dawk affettwati mill-avulsjoni tal-għeruq tas-sinsla, it-titjib tal-kapaċità konjittiva hija ċ-ċavetta biex tittejjeb il-memorja. Ir-rijabilitazzjoni konjittiva hija metodu effettiv li jista’ jgħin lill-pazjenti jerġgħu jibnu l-kapaċità konjittiva tal-moħħ tagħhom u b’hekk itejbu l-memorja tagħhom. Dawn il-metodi jinkludu cloze, operazzjonijiet matematiċi, eċċ., Li jistgħu jgħinu lill-pazjenti jtejbu l-konċentrazzjoni, is-sensittività u l-veloċità tar-reazzjoni tagħhom.

Barra minn hekk, attitudni pożittiva hija wkoll fattur importanti fit-titjib tal-memorja. Pazjenti b'avulżjoni ta 'l-għeruq tas-sinsla, meta jiffaċċjaw sfidi u diffikultajiet, għandhom jippruvaw iżommu attitudni ottimista u b'kuraġġ jiffaċċjaw id-diversi sfidi tal-ħajja biex jiksbu l-aħjar riżultati fil-proċess ta' riabilitazzjoni.

Fil-qosor, il-korriment tal-avulżjoni tal-għerq tas-sinsla tad-dahar ma taffettwax direttament il-memorja ta 'persuna. Ħafna nies jistgħu jtejbu l-memorja tagħhom permezz ta 'metodi effettivi bħar-rijabilitazzjoni konjittiva. Fl-istess ħin, attitudni ottimista hija wkoll iċ-ċavetta biex tittejjeb il-memorja. Matul il-proċess ta’ riabilitazzjoni, għandna nemmnu bis-sħiħ li nistgħu negħlbu d-diffikultajiet u nimxu lejn futur b’saħħtu pass pass. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn ntejbu l-memorja tagħna. Cistanche jista 'jtejjeb il-memorja b'mod sinifikanti minħabba li Cistanche huwa materjal mediċinali tradizzjonali Ċiniż b'ħafna effetti uniċi, li wieħed minnhom huwa li jtejjeb il-memorja. L-effikaċja ta 'Cistanche ġejja mid-diversi ingredjenti attivi tagħha, inkluż aċidu tanniku, polisakkaridi, glikożidi flavonojdi, eċċ Dawn l-ingredjenti jistgħu jippromwovu s-saħħa tal-moħħ f'varjetà ta' modi.

Ikklikkja taf 10 modi biex ittejjeb il-memorja

Dan il-proċess newrodeġenerattiv jaqsam karatteristiċi komuni ma 'proċessi relatati mal-mard newronali bħall-preżenza ta' stress reticulum endoplasmic (ER) u imblukkar tal-fluss awtofaġiku.

Preċedentement sibna li l-espressjoni żejda ta 'GRP78 ippromwoviet in-newroprotezzjoni motonewronali wara RA. Wara dan, weaimed li tiżvela l-mekkaniżmu sottostanti billi twettaq proteomicanalysis imparzjali komparattiva u interventi farmakoloġiċi u ġenetiċi.

B'mod mhux mistenni, il-fatturi mitokondrijali rriżultaw li ġew l-aktar mibdula meta GRP78 kien espress iżżejjed, u l-abbundanza ta 'mitokondrija miġbuda, karatteristika ta' mitofaġija, ġiet osservata wkoll permezz ta 'mikroskopija elettronika f'motonewroni mweġġa' minn RA wara l-espressjoni żejda ta 'GRP78.

Barra minn hekk, l-espressjoni żejda ta 'GRP78 żiedet it-tikkettar tal-mitokondrija LC3-, ippromwoviet it-traslokazzjoni PINK1, u l-induzzjoni tal-mitofaġija, u rkuprat il-funzjoni mitokondrijali f'ċelloli enfasizzati minn ER.

Fl-aħħar nett, sibna li l-mitofaġija favur is-sopravivenza promossa GRP78-kienet medjata minnPINK1 u IP3R fil-mudell in vitro tagħna ta' mewt motonewronali. Din id-dejta tindika relazzjoni ġdida bejn il-chaperone GRP78 u l-mitofaġija, li tiftaħ għażliet terapewtiċi ġodda għad-disinn tal-mediċina biex tinkiseb newroprotezzjoni.

Kliem ewlieni: GRP78/BiP; mitofaġija; motoneuroni; newrodeġenerazzjoni; newroprotezzjoni.

1. Introduzzjoni

L-interruzzjoni tal-konnettività newronali funzjonali hija karatteristika komuni bikrija tal-proċessi newrodeġenerattivi [1]. Id-deġenerazzjoni assonali tiżola newroni li jċedu permezz ta 'proċess ta' disfunzjoni retrograd u progressiv.

Quddiem il-ħsara, in-newroni jirreaġixxu, jattivaw mekkaniżmi endoġeni ta' newroprotezzjoni bħar-rispons tal-proteini mhux mitwija (UPR), ir-rispons ta' xokk tas-sħana, il-mogħdija awtofaġika, is-sistema ubiquitin-proteasome, espressjoni ta' chaperone, makkinarju ta' degradazzjoni assoċjati tar-retikulu endoplasmiku (ER) (ERAD), u d-difiża antiossidanti.

Għalkemm l-attivazzjoni preċiża tagħhom hija effettiva biex tirkupra ċ-ċellula, ħsara eċċessiva, kif ukoll tixjiħ, jistgħu jirriżultaw fil-funzjonament difettuż ta 'wieħed jew aktar minn dawk il-programmi.

Aħna rraġunajna li l-imitar tan-natura u t-tisħiħ ta 'dawn il-mekkaniżmi endoġeni jistgħu jkunu strateġija effiċjenti għan-newroprotezzjoni [2,3]. ]. GRP78orkestra l-UPR, li jiġi attivat wara stress ER, għandu attività ATPase u huwa proteina li torbot Ca2+[5,6].

Jaġixxi wkoll biex jippromwovi t-tiwi kif suppost ta' proteini li għadhom kif ġew sintetizzati jew mitwija ħażin u biex jimmira proteini żarmati għad-degradazzjoni mill-makkinarju ERAD (revedut fi [7]).

L-evidenza tissuġġerixxi wkoll li GRP78 jipparteċipa fl-attivazzjoni tal-makroawtofaġija, li tneħħi kemm forom solubbli kif ukoll aggregati ta 'proteini mhux mitwija u organelli li ma jiffunzjonawx [8-15].

L-espressjoni żejda ta 'GRP78 ġiet ippruvata li hija benewroprotettiva f'diversi mudelli ta' newrodeġenerazzjoni [16-23], u ġie osservat tnaqqis fil-livelli ta 'GRP78 waqt it-tixjiħ u matul il-progressjoni ta' disturbi deġenerattivi [24].

Xi wħud minn dawn l-istudji rrappurtaw li n-newroprotezzjoni kienet medjata mill-inibizzjoni tal-apoptożi; madankollu, l-apoptożi rari hija l-kawża ewlenija tal-mewt taċ-ċelluli newronali waqt proċessi newrodeġenerattivi [20,25-27].

Għalhekk, l-għan ewlieni tagħna huwa li nistabbilixxu l-mekkaniżmi li bihom l-espressjoni żejda ta 'GRP78 twassal għal newroprotezzjoni bl-użu ta' mudelli mhux transġeniċi ta 'newrodeġenerazzjoni.

B'mod partikolari, billi nisfruttaw il-vantaġġi anatomiċi u tekniċi ta 'diversi mudelli ta' assotomija tal-motoneuron spinali (MN), qabel irrappurtajna li l-avulsjoni tal-għerq tan-nervituri (RA) tibda proċess retrograd ta 'newrodeġenerazzjoni bil-mutur (80% tat-telf MN fuq xahar wara l-korriment) ikkaratterizzat minn il-preżenza ta 'stress ER, imblukkar tal-fluss tal-awtofaġija, arrest ta' traffikar ta 'vesikuli u proteini, il-konkorrenza ta' apoptożi / antiapoptożi / anoikisinitiation iżda n-nuqqas ta 'eżekuzzjoni effettiva ta' apoptożi [20,25,28].

Aħna skoprejna li l-espressjoni ta 'GRP78 tintilef madwar 5 ijiem wara RA fi ħdan MNs bil-ħsara u li l-espressjoni żejda sfurzata tagħha tippermetti s-sopravivenza tagħhom wara l-assotomija. Kif iddeskrivejna qabel riżoluzzjoni ta 'awtofaġija korretta żżid is-sopravivenza tan-newroni wara RA [26], aħna nistaqsu jekk huwiex possibbli li niddeċifraw jekk l-awtofaġija selettiva jista' jkollha effett protettiv.

Għalhekk, użajna mudell RA biex niċċaraw il-mekkaniżmi li jimmedjaw in-newroprotezzjoni GRP78 bl-użu ta’ analiżi proteomika imparzjali, u vvalidajna aktar l-ipoteżi li tirriżulta permezz ta’ analiżi tal-fond in vitro bl-użu ta’ trattament ta’ tunicamycin li jqanqal kemm stress ER kif ukoll arrest tat-traffikar tal-proteini, żewġ karatteristiċi ewlenin tal-mudell RA. [26].

2. Materjali u Metodi

2.1. Proċeduri kirurġiċi

Firien nisa Sprague-Dawley ta’ 12-il ġimgħa nżammu taħt kundizzjonijiet standard ta’ dawl u temperatura u ngħataw ikel u ilma ad libitum. Aħna wettaqna proċeduri kirurġiċi taħt anestesija b'cocktail ta 'ketamine/xylazine (0.1 mL/100 g piż) intraperitonealment, essenzjalment kif irrappurtat qabel [26,27].

Biex twettaq avulsjoni extra vertebrali nerveroot tal-għeruq L4-L5, għamilna inċiżjoni tal-ġilda tan-nofs biex nidentifikaw kull naħa tan-nerv xjatiku u applikajna trazzjoni moderata fuq għeruq magħżula 'l bogħod mill-intervertebralforamina, u ksibna n-nervituri spinali mħallta li kien fihom l-għeruq tal-mutur u tas-sensi. ganglia ta 'l-għeruq tad-dahar.

Il-ferita ġiet suturata minn ajruplani u ddiżinfettata b'povidone-jodju, u l-annimali tħallew jirkupraw f'ambjent sħun. Annimali mħaddma b'mod falz intużaw bħala kontrolli.

Il-proċeduri kollha li kienu jinvolvu l-annimali twettqu minn Spanjol (Real Decreto 53/2013) u Ewropej (2010/63/UE), u ġew approvati mid-Department d'Agricultura, Ramaderia, Pesca, Alimentació i MediNatural tal-Gvern Katalan (Generalitat de Catalunya).

2.2. Kostruzzjoni, Purifikazzjoni, u Infezzjoni b'Vetturi Viral

cDNA li jikkodifika GRP78 (ATCC, LGC Promochem, Teddington, UK) ġie kklonat fil-vettur tax-shuttle pAC.CMV. Adenoviruses rikombinanti ġew mibnija permezz ta 'rikombinazzjoni omologa fiċ-ċelloli HEK293.

L-adenovirus ta' kontroll li jesprimi galactosidase batterjali (Ad{0}}gal) kien rigal tip ta' CB Newgard (Duke University, Durham, NC, USA). Il-viruses ġew ippurifikati bl-użu tal-kit Vivapure AdenoPackTM 20 skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Sartorius, Göttingen, il-Ġermanja).

Għall-kostruzzjoni ta 'vettur adeno-assoċjat, il-cDNA GRP78 ġie kklonat f'siti NheI u HindIII bejn id-dominji ITR ta' AAV2 taħt ir-regolamentazzjoni ta 'promotur CMV u l-element li jirrispondu għall-virus woodchuckhepatitis [29].

Il-vettur AAVrh10 ġie ġġenerat kif deskritt qabel [30] permezz ta' trasfezzjoni trippla ta' ċelloli HEK293-AAV (Stratagene, Bellingham, WA, USA) b'polyethyleneimine ramifikata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bil-plasmid li fih l-ITRs ta 'AAV2, il-plasmid helper AAV li fih Rep2 u Capfor rh10 (ġentilment ipprovdut minn JM Wilson, Università ta' Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA), u l-plasmid pXX6 li fih ġeni adenovirali helper [31]. Vettori rikombinanti ġew iċċarati wara trattament benzonase (50 U/mL, Novagen, Madison, WI, USA) u polyethylene glycol (PEG 8000, Sigma-Aldrich) preċipitazzjoni.

Il-vectors ġew ippurifikati b'gradjent ta' jodixanol mill-Unità tal-Produzzjoni tal-Vector f'CBATEG-UAB wara proċeduri operattivi standard. Ġenomi virali għal kull ml (VG/mL) ġew ikkwantifikati bl-użu ta ' PicoGreen (Invitrogen, Waltham, MA, USA).

Immedjatament wara RA, l-annimali ġew injettati b'14 µL ta' virus Ad-GRP78 jew Ad -gal (108 pfu/mL) bl-użu ta' labra ta' 33-gauge u siringa Hamilton fl-ispazju tal-kalkoli fis-sit lumbari.

Alternattivament, amministrazzjoni intratekali ta '10 µL ta' 4 × 10-10 ġenomi virali ta 'virus adeno-assoċjat AAVrh10 biex jesprimu żżejjed GFP jew GRP78 ġiet injettata bil-mod fis-CSF bejn il-vertebri L3 u L4 ta' annimali anestetizzati b'isoflurane tliet ġimgħat qabel RA [32].

Aħna użajna AAVrh10 minħabba li jinfetta speċifikament 30% ta 'spinalmotoneurons [32]. Aċċess xieraq għall-ispazju intrathecal kien ikkonfermat mill-flick denb tal-annimali. Il-labar inżammu f'posthom fis-sit tal-injezzjoni għal minuta, u wara ġew suturati l-muskoli u l-ġilda.

2.3. Preparazzjoni tal-Kampjun u Analiżi Proteomika

Aħna anestetizzajna firien (n=4-5) f'7 dpi u ksibna kampjuni ta 'segmenti tas-sinsla tad-dahar L4-L5 (5-mm tul), li ġew iffriżati snap fin-nitroġenu likwidu. Aħna omoġenizzajna t-tessut f'liżi buffer (20 mM HEPES, pH 7.7, 250 mM sukrożju, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, u cocktail ta 'inibituri tal-protease u phosphatase) b'omoġenizzatur Potter fuq is-silġ.

Wara ċ-ċentrifugazzjoni ta 'lysates f'800 × g għal 20 min f'4 ◦C, aħna ġbarna s-supernatants il-frazzjoni post-nukleari u l-proteina kwantifikata permezz ta' analiżi BCA (Pierce Chemical Co., Dallas, TX, USA).

Għall-analiżi proteomika, aħna solubilizzajna 75 µg ta' kull kampjun f'4% SDS, 8 M urea, 0.1 M HEPES, pH 7.7, 0.1 M DTT, miżjud 0. 05 M iodoacetamide, u diġerit bi trypsin (proporzjon 1:10 ta' enżima: substrat) bl-użu tal-metodu ta' Preparazzjoni tal-Kampjuni Megħjuna bil-Filtru (FASP).

Il-kampjuni kollha ġew ittrattati b'mod parallel. Aħna analizzajna l-kampjuni bl-użu ta' spettrometru tal-massa LTQ-OrbitrapVelos (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) akkoppjat ma' ProxeonEasyLC (Thermo Fisher Scientific). We loaded it-taħlitiet tal-peptidi direttament fuq il-kolonna analitika (2 µL). ·min-1) u peptidi separati permezz ta' kromatografija b'fażi inversa bl-użu ta' kolonna 15-cm b'dijametru intern ta' 100 µm ippakkjat b'partiċelli 5-µm C18 (NikkyoTechnos Co., Tokyo, Ġappun).

Il-gradjenti kromatografiċi bdew b'97% buffer A (0.1% aċidu formiku (FA) fl-ilma), u 3% buffer B (acetonitrile, 0.1% FA) b'rata ta' fluss ta' 500 nl ·min-1, u żdied għal 85% buffer A + 15% buffer B fuq 4 min, u għal 55% buffer A + 45% buffer B fuq 120 min.

Aħna operajna l-istrument fil-modalità ta’ Akkwist Dipendenti tad-Dejta TOP20 bi skan wieħed MS sħiħ fl-Orbitrap b’riżoluzzjoni ta’ 60,000 u firxa ta’ massa ta’ m/z 350–2000 segwita minn spettri MS-MS tal-20 joni l-aktar intensi . Aħna użajna n-nassa tal-jone b'metodu ta 'dissoċjazzjoni indotta minn ħabta biex nipproduċu spettri tal-jone tal-frammenti u użajna enerġija ta' kolliżjoni normalizzata għal 35%. Aħna ksibna d-dejta kollha bis-softwer Xcalibur v2.1.

Aħna użajna l-Proteome Discoverersoftware suite (v1.3.0.339, Thermo Fisher Scientific) u l-magna tat-tiftix Mascot (v2.3.01, Matrix Science50) għall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-peptidi.

Aħna analizzajna d-dejta kontra d-database SwissProt Rat li fiha l-aktar kontaminanti komuni (599 daħla). Aħna użajna tolleranza tal-massa tal-joni prekursur ta' 7 ppm fil-livell MS1 u ppermettejna sa tliet qsim ħażin għat-trypsin.

It-tolleranza tal-massa tal-jone tal-framment ġiet issettjata għal 0.5 Da. L-ossidazzjoni tal-methionine u l-aċetilazzjoni tal-proteina N-terminal ġew stabbiliti bħala modifiki varjabbli, u l-karbamidomethylation taċ-ċisteine ​​ġiet stabbilita bħala modifika fissa.

Aħna ffiltrajna l-peptidi bbażati fuq ir-rata ta 'skoperta falza tagħhom (FDR> 5% mhux ikkunsidrat). Għall-kwantifikazzjoni tal-peptidi, ikkunsidrajna l-quċċata kromatografika tal-peptidi kkalkulata bl-użu tal-ProteomeDiscoverer u nnormalizza medjan iż-żoni permezz ta 'trasformazzjoni log2 bl-użu ta' R 3.0.2. Aħna kkwantifikajna d-dejta bl-użu tal-pakkett R MSstats (v. 2.0.1).

Għal kull proporzjon, aħna kkalkulajna l-valur p aġġustat (p <0.05 għas-sinifikat). Fl-aħħarnett, għamilna Ontoloġija tal-Ġene u analiżi tal-mogħdija għal proteini regolati b'għodod tal-Web ta 'annotazzjoni DAVID (https://david.ncifcrf.gov/ aċċessata fit-28 ta' Mejju 2021) u KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway. html, aċċessat fit-28 ta' Mejju 2021), kif wettaqna qabel (ara aktar dettalji f'[25]).

2.4. Immunoistokimika u Analiżi tal-Immaġni

Wara anestesija profonda bil-pentobarbital, aħna pperfusejna transcardially l-annimali b'soluzzjoni salina li fiha 10 U/mL eparina, segwit minn 4% paraformaldehydein a buffer fosfat 0.1 M, pH 7.2 għall-iffissar tat-tessuti f'7 dpi (n {{7 }} għal kull kundizzjoni), u neħħa s-segmenti L4 u L5 (5-mm tul totali) tas-sinsla tad-dahar, li ġew imwaħħla wara fl-istess fissattiv għal 4 sigħat u krijopreservati fi 30% sukrożju matul il-lejl.

Sezzjonijiet trasversali serjali ({{0}}µm ħxuna) inkisbu fuq slides ġelatinizzati bl-użu ta 'krijotomu (Leica, Wetzlar, il-Ġermanja) u nħażnu f'-20 ◦C sal-analiżi. Għall-immunoistokimika, ikkurajna l-pjastri b'soluzzjoni ta' mblukkar f'salina b'Tris-buffered (TBS) b'0.03% TritonX-100 u 10% serum bovin għal siegħa u inkubati wara b'antikorpi primarji differenti: fenek anti-LC3B (ab51520; Abcam ; 1:200) jew ġrieden anti-COXIV (A21355; LifeTechnologies;1:500).

Wara diversi ħasliet b'TBS, 0.05% Tween-20, is-sezzjonijiet ġew inkubati għal sagħtejn b'antikorpi tal-ħmar kontra l-fniek konjugati Cy-2 jew Cy-3 (JacksonImmunoresearch, West Grove, PA, l-Istati Uniti).

Aħna counterstained-sezzjonijiet ma DAPI (Sigma, St Louis, MO, USA), jew NeuroTrace Fluorescent Nissl Stain (Molecular Probes, Leiden, TheNetherlands) u mmuntati l-flieli b'mezz ta 'immuntar Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA) jew Mowiol magħmul bl-idejn.

It-taqsimiet li għandhom jitqabblu ġew ipproċessati flimkien fuq l-istess slide u l-istess jum.

Immaġini tal-kampjuni tal-korda spinali minn trattamenti u kontrolli differenti ttieħdu taħt l-istess ħin ta 'espożizzjoni, sensittività u riżoluzzjoni għal kull markatur analizzat bl-għajnuna ta' mikroskopju konfokali (Zeiss LSM 700). Aħna analizzajna l-intensità tas-sinjal bis-softwer ImageJ (National Institutes ofHealth; disponibbli fuq http://rsb.info.nih.gov/ij/, aċċessat fit-28 ta’ Mejju 2021).

For more information:1950477648nn@gmail.com