Effetti tal-flavonojdi fuq il-ġilda skond il-karatteristiċi strutturali tagħhom: reviżjoni

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Astratt:Sfond: Matul l-infart mijokardijaku (MI), jintilfu biljuni ta 'kardjomijoċiti. L-aħjar terapija għandha tissostitwixxi b'mod effettiv il-kardjomijoċiti bil-ħsara, possibbilment b'ċelloli staminali kapaċi li jilqgħu u jiddifferenzjaw f'kardjomijoċiti funzjonali adulti. Bħala tali, ċelloli staminali tal-appendiċi atrijali tal-qalb (CASCs) huma kandidati adattati. Madankollu, il-preżenza ta 'livelli elevati ta' prodotti finali ta 'glikazzjoni avvanzata (AGEs) f'reġjuni kardijaċi fejn il-CASCs huma trapjantati tista' taffettwa l-potenzjal riġenerattiv tagħhom. F'dan l-istudju, aħna neżaminaw jekk u kif l-AGEs jibdlu l-proprjetajiet CASCs in vitro. Metodi u Riżultati: CASCs fil-kultura kienu esposti għal konċentrazzjonijiet AGEs li jvarjaw (50 ug/mL sa 400 ug/mL). Is-sopravivenza, il-proliferazzjoni u l-kapaċità tal-migrazzjoni tal-CASCs naqsu b'mod sinifikanti wara 72 siegħa ta 'espożizzjoni tal-AGEs. L-apoptożi żdiedet b'mod sinifikanti b'żieda fil-konċentrazzjoni tal-AGEs. L-effetti ta 'ħsara ta' dawn l-AGEs tnaqqsu parzjalment minn qabel l-inkubazzjoni b'riċettur għal inibitur ta 'AGEs （RAGE） (25μM FPS-ZM1), li jindika l-involviment ta' RAGE fl-effetti negattivi osservati. Konklużjoni: L-AGEs għandhom effett negattiv dipendenti fuq iż-żmien u l-konċentrazzjoni fuq is-sopravivenza, il-proliferazzjoni, il-migrazzjoni u l-apoptożi tal-CASCs in vitro, medjati parzjalment permezz tal-attivazzjoni tar-RAGE. Jekk it-terapiji kontra l-AGE humiex trattament effettiv fl-ambjent tat-terapija taċ-ċelloli staminali wara l-MI jeħtieġx eżaminazzjoni ulterjuri.

Kliem ewlieni:ċelloli staminali; aldehyde dehydrogenase; CASCs; proteini glikatjati; prodotti aħħarija avvanzati tal-glikazzjoni; proliferazzjoni; apoptożi; il-migrazzjoni; inibizzjoni RAGE

1. Introduzzjoni

Il-mard tal-qalb koronarju (CHD) jibqa’ l-kawża ewlenija ta’ mortalità u morbidità madwar id-dinja, bl-infart mijokardijaku (MI) huwa l-aktar forma komuni ta’ CHD [1].MI jirriżulta minn okklużjoni sħiħa jew parzjali ta’ arterja koronarja. Fiż-żona iskemika, l-ossiġnu u n-nutrijenti huma ristretti, li jirriżultaw f'mewt taċ-ċelluli mijokardijaċi. Id-daqs tal-infart jiddependi fuq fatturi multipli, bħad-daqs taż-żona iskemika f'riskju, il-post u t-tul tal-okklużjoni koronarja, u l-ammont ta 'fluss tad-demm kollaterali residwu[1,2]. Peress li l-kardjomijoċiti adulti għandhom proprjetajiet riġenerattivi minimi, it-tiswija intrinsika tat-tessut bil-ħsara tibqa elużiva. Is-sejba ta 'approċċ terapewtiku li jissostitwixxi b'mod effettiv iċ-ċikatriċi mijokardijaka b'tessut kontrattili funzjonali hija l-unika għażla biex tirkupra tessut kardijaku mitluf.kemm cistanche tieħuSar ħafna sforz ta 'riċerka biex jinkixfu l-potenzjal terapewtiku u l-mekkaniżmi tat-terapija taċ-ċelluli biċ-ċelloli tal-mudullun (BMCs). Il-mudullun fih ċelloli staminali ematopojetiċi (HSCs), ċelloli proġenitriċi endoteljali (EPCs), u ċelloli staminali mesenkimali (MSCs)[3]. Provi kliniċi b'BMCs u MSCs mononukleari naqsu milli jwasslu titjib sinifikanti fil-funzjoni kardijaka ta' wara l-MI. Peress li l-BMCs u l-MSCs mononukleari ma jiddifferenzjawx f'kardjomijoċiti, it-titjib limitat osservat x'aktarx li jiġi attribwit għal mekkaniżmi parakrini[4,5]. Biex tittejjeb b'mod sinifikanti l-funzjoni kardijaka ta' wara l-MI, il-fokus tar-riċerka nbidel lejn iċ-ċelloli staminali tal-qalb residenti (CSCs) bħal c-kit plus , Sca-1 plus , Isl-1 plus -cells, u kardjosferi, li x'aktarx ikunu pprogrammati minn qabel biex isiru kardjomijoċiti. Madankollu, is-suċċess tagħhom fir-riġenerazzjoni kardijaka huwa fqir [6].

jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Fl-aħħar snin, il-grupp ta’ riċerka tagħna skopra tip ġdid ta’ ċelloli staminali tal-qalb bl-isem ta’ ‘ċelluli staminali atrijali tal-qalb’ (CASCs). B'kuntrast ma 'ċelloli staminali oħra, il-CASCs juru proprjetajiet ta' differenzjazzjoni kardjomijoġenika straordinarja, li jagħmluhom kandidat promettenti għar-riġenerazzjoni kardijaka [4]. L-iżolament ta' din il-popolazzjoni taċ-ċelloli staminali mill-appendiċi atrijali hija bbażata fuq attività għolja ta' aldehyde dehydrogenase (ALDH). Attività għolja ta' ALDH kienet irrappurtata wkoll f'tipi oħra ta' ċelloli staminali, bħal MSCs, HSCs, u ċelloli staminali newrali u tal-kanċer fost oħrajn[7-9]. Peress li ALDH wera li huwa kardjoprotettiv u jippromwovi s-sopravivenza taċ-ċelluli f'kundizzjonijiet ta 'stress, l-użu ta' ALDH flimkien ma 'popolazzjoni ta' ċelloli staminali f'kundizzjonijiet iskemiċi jista 'jkun, f'dan il-kuntest, ta' benefiċċju [4,10]. Il-CASCs jistgħu jiġu estiżi sa numri klinikament rilevanti, mingħajr ma jintilfu karatteristiċi fundamentali, bħall-attività ALDH, il-profil tal-antiġen tal-wiċċ, u l-kapaċità ta 'differenzjazzjoni kardjomijoġenika [11]. Dan mogħti huwa kruċjali għat-traduzzjoni ta 'dan l-approċċ terapewtiku għall-klinika. Barra minn hekk, urejna li t-trapjant awtologu ta’ CASCs jirriżulta f’funzjoni ventrikulari tax-xellug imtejba, li tirriżulta minn trapjant adegwat ta’ ċelluli staminali u aktar differenzjazzjoni ta’ CASCs [4,12].

F'pazjenti MI, il-livelli ta 'prodotti finali avvanzati ta' glycation (AGEs) huma miżjuda [13]AGEs huma proteini u/jew lipidi li huma mħassra b'mod irriversibbli minn glycation, proċess li fih iz-zokkor li jnaqqas jirreaġixxi b'mod mhux enżimatiku ma' gruppi amino fil-lipidi jew proteini . Minbarra glycation, stress ossidattiv iwassal ukoll għall-formazzjoni ta 'AGEs permezz tal-ossidazzjoni ta' proteini u/jew lipidi [14]. L-AGEs huma ffurmati b'mod endoġenu u jakkumulaw b'mod naturali fil-ġisem b'senescence jew f'sitwazzjonijiet patoloġiċi bħal MI meta l-livelli ta' stress ossidattiv jiżdiedu [15-17].x'inhu cistancheBarra minn hekk, riċerka preċedenti wriet li l-AGEs jaffettwaw tipi differenti ta' ċelloli staminali in vitro [18-20]. Il-kapaċità taċ-ċelloli staminali li jipproliferaw hija mnaqqsa mill-AGEs, u r-rata apoptotika tiżdied mal-applikazzjoni tal-AGEs. Dawn l-effetti jistgħu jiġu esegwiti permezz ta 'diversi mekkaniżmi, inkluża l-attivazzjoni tal-mogħdija apoptotika, RAGE, jew formazzjoni eċċessiva ta' ROS [20]. Jekk l-AGEs jaffettwawx ukoll il-proprjetajiet CASCs għadu mhux magħruf. Dawn is-sejbiet iqajmu l-mistoqsija dwar jekk AGEs jistgħux jinfluwenzaw b'mod negattiv l-effikaċja terapewtika tal-CASCs, li jintużaw bħala trattament għall-MI. L-għan ta' dan l-istudju huwa għalhekk li jeżamina l-effetti in vitro ta' AGEs u l-attivazzjoni potenzjali tar-RAGE tar-riċettur tiegħu fuq il-proliferazzjoni, is-sopravivenza u l-migrazzjoni ta' CASCS.

2.Materjali u Metodi

2.1. Esperimenti fuq l-Annimali

Twettqu studji fuq l-annimali skont id-Direttiva tal-UE 2010/63/UE għal esperimenti fuq l-annimali u approvati mill-Kumitat Etiku Lokali għall-Esperimentazzjoni tal-Annimali (UHasselt, Belġju, Diepenbeek; ID 201919K). L-annimali kollha nżammu f'ambjent ikkontrollat ​​b'temperatura (21 grad, 60 fil-mija umdità) b'ċiklu ta' 12-il siegħa -12siegħa dawl-dlam. Huma ġew mitmugħa dieta standard ta 'pellets b'ilma disponibbli ad libitum. B'kollox, intużaw 62 firien Sprague-Dawley mara (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Franza).

2.2.Rat CASCs Iżolament u Espansjoni

Il-CASCs inħasdu mill-appendiċi atrijali tal-lemin, kif deskritt qabel [4]Fil-qosor, il-firien ġew injettati b'eparina (1000 unità/kg, intraperitonealment (ip) u ġew ewtanizzati b'doża eċċessiva ta' sodium pentobarbital (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip).Qlub ġew maħsuda, imxerrda b'soluzzjoni normali ta' Tyrode (137mMNaCl,5.4mMKCl,0.5mMMgClz,1mMCaClz,11.8mMCaClz,11.8mCHaClz,11.8mHEPurim,MMNa0mH10mn10mn12-MNaCl, 5.4mMKCl ,pH7.4),u l-appendiċi atrijali tal-lemin ġew miġbura.It-tessut estratt tal-appendiċi atrijali tal-lemin kien ikkapuljat f'biċċiet ta '~1 mm³, maħsul b'salina buffered bil-fosfat (PBS), u dissoċjat b'mod enżimatiku għal 30 min f'Soluzzjoni Balanced Salt Hank's li fih 0.6 WU/mL collagenase NB 4 (Serva, Heidelberg, il-Ġermanja) u 20 mM Carly.bijoflavonojdiIċ-ċelloli ALDHt kienu mtebbgħin skont il-kit Aldefluor (STEMCELL Technologies, Evergem, il-Belġju). Iċ-ċelloli ALDHt ġew definiti bħala CASCs u ġew magħżula bil-fluss (BD FACS Aria) f'midja X-VIVO 15 (Lonza, Basel, Iżvizzera) supplimentati b'20 fil-mija serum tal-għoġol tal-fetu (FCS) u 2 fil-mija penicillin/streptomycin (P/S) . CASCs iżolati ġew miżrugħa fi 6-pjanċi tal-bir f'densità ta' 60,000 ċelluli għal kull bir u inkubati f'37 grad f'inkubatur umidifikat b'atmosfera ta' 5 fil-mija CO2. Il-mezz kien mibdul kull jumejn sa 3 ijiem. Meta CASCs laħqu 80 fil-mija konfluwenza, inħasdu bl-użu ta 'trypsin. Għall-esperimenti kollha, intużaw is-silta 1 CASCs.

Cistanche jista 'anti-aging

Preparazzjoni 2.3.AGEs

L-AGEs ġew ippreparati kif deskritt qabel [21]. Fil-qosor, albumina tas-serum bovin (BSA; 7 mg/mL) ġiet inkubata b'dimeri ta 'glycolaldehyde (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, il-Belġju) f'PBS sterili (pH7.4) għal 5 ijiem f'37 grad. Din is-soluzzjoni ġiet dijalizzata kontra PBS, darbtejn għal 2h u matul il-lejl f'4 gradi biex tneħħi glycolaldehyde mhux irreaġit (cut-off 3.4 kDa. AGEs ġew iffiltrati (filtru 0.2 um, Sarstedt, Antwerp, Belġju). BSA inkubat f'PBS (7mg/mL). ) intuża bħala soluzzjoni ta' kontroll.

2.4.Assaġġ ta' Proliferazzjoni u Sopravivenza

Ġew eżegwiti assaġġi ta 'proliferazzjoni u sopravivenza, b'assaġġ tal-jodur tal-propidju (PI) kif deskritt qabel minn Gervois et al. u Lo Monaco et al.[22,23]. Fil-qosor, il-CASCs ġew miżrugħa fi 96-platt tajjeb f'medja X-VIVO b'10 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S. Għall-analiżi tal-proliferazzjoni, inżergħu 5000 ċellula għal kull bir. Għall-analiżi tas-sopravivenza, ġew miżrugħa 100 ċellula għal kull bir. Wara 24 siegħa, ġew miżjuda ħames kundizzjonijiet differenti mal-mezz: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL, u 400 ug/mL AGEs. Biex titkejjel il-proliferazzjoni, BSA jew AGEs ġew miżjuda mal-medja X-VIVO b'2 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S.jixtru cistancheBiex titkejjel is-sopravivenza BSA jew AGEs ġew miżjuda mal-medja X-VIVO b'0 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S. Wara tliet punti ta' ħin differenti (24,48, u 72 siegħa), il-mezz ġie sostitwit b'Lysis buffer A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, il-Ġermanja), segwit minn ammont ugwali ta' stabilizzazzjoni buffer B (ChemoMetec) supplimentat b'PI (10 ug/). mL, Sigma). Wara perjodu ta 'inkubazzjoni ta' 15-il minuta fid-dlam, il-fluworexxenza ġiet imkejla bl-użu tal-qarrej tal-pjanċa Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, il-Ġermanja) f'eċitazzjoni ta '540 nm, wavelength ta' emissjoni ta '612 nm, u qligħ ta' 2000. Saru esperimenti fi tliet kopji. Id-dejta ġiet normalizzata għal dejta miksuba b'400 ug/mL BSA.

2.5.Assaġġ tal-Migrazzjoni

Il-CASCs ġew miżrugħa fi pjanċa ta' {{0}}bir b'densità ta' 5000 ċelluli għal kull bir f'medja X-VIVO b'10 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S. Ħames kundizzjonijiet ġew miżjuda mal-medju: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL, u 400 ug/mL AGEs. Wara perjodu ta 'inkubazzjoni ta' 72 siegħa, il-CASCs ikkundizzjonati nħasdu bl-użu ta 'trypsin u ntużaw għal analiżi ta' migrazzjoni transwell. Fil-ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, il-Belġju) b'membrana poruża ta 'daqs tal-pori ta' 8 um, 100,000 ċellula għal kull kundizzjoni ġew miżrugħa f'medja X-VIVO b'0 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S. ThinCerts tpoġġew fuq 24-pjanċi tal-bir li fihom medju X-VIVO b'2 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S.Wara 24 siegħa ta' migrazzjoni, il-ThinCerts ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde (PFA) għal 15-il minuta u inkubati b'0.1 vjola tal-kristall fil-mija għal 30min. Iċ-ċelloli li ma emigrawx tneħħew fin-naħa ta 'fuq tal-ThinCerts, u wara l-ammont ta' CASCs trasmigrati ġie kkwantifikat bis-softwer AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Zaventem, il-Belġju). Id-dejta ġiet normalizzata għal dejta miksuba b'400 ug/mL BSA.

2.6.Assaġġ tal-Apoptożi

Il-CASCs ġew miżrugħa fi 96-platt ta' bir f'densità ta' 10,00 ċelluli għal kull bir f'medja X-VIVO b'2 fil-mija FCS u 2 fil-mija P/S. Biex tistudja l-apoptożi, sar analiżi tal-caspase bl-użu tar-Reaġent tal-Assay tal-Apoptosis IncuCyte8 Caspase-3/7 Green (dilwit 1/100, Sartorius, Schaarbeek, il-Belġju). Ħames kundizzjonijiet ġew miżjuda mal-medju: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL, u 400 ug/mL AGEs.CASCs ikkultivati ​​f'medja X-VIVO mingħajr FCS u 2 fil-mija P/ S intużaw bħala kontroll pożittiv. L-esperimenti saru fi tliet kopji. L-immaġini ttieħdu wara 24,48, u 72 siegħa ta 'inkubazzjoni bl-użu tas-Sistema ta' Analiżi IncuCyte@S3Live-Cell (Sartorius, Schaarbeek, il-Belġju). Analiżi taż-żona okkupata minn ċelluli apoptotiċi saret bl-użu tas-Sistema ta 'Analiżi taċ-Ċelloli Live IncuCyte* SX1 (Sartorius, Schaarbeek, il-Belġju). Id-dejta ġiet normalizzata għall-kontroll pożittiv ( plus , medju X-VIVO mingħajr FCS).

2.7.Inibizzjoni RAGE In Vitro

RAGE ġie inibit biex jevalwa l-kontribut ta 'attivazzjoni RAGE fil-proliferazzjoni, sopravivenza, u migrazzjoni ta' CASCs. Fil-qosor, CASCs ġew inkubati minn qabel f'37 grad f'inkubatur ta '5 fil-mija CO2 bl-antagonist RAGE FPS-ZM1 (10 u 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, il-Belġju). Wara 2 h' qabel l-inkubazzjoni, ġew miżjuda 400 ug/mL AGEs.cistanche AwstraljaWara 24 48, u 72 siegħa, il-proliferazzjoni u s-sopravivenza ġew evalwati kif deskritt hawn fuq. Wara 72 siegħa ta 'inkubazzjoni, CASCs pre-kundizzjonati ġew maħsuda u użati għal analiżi ta' migrazzjoni transwell kif deskritt hawn fuq.

2.8.Statistika

Analiżi statistiċi saru bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 9.0.0.cistanchId-distribuzzjoni normali tad-dejta ġiet ivvalutata bit-test Shapiro-Wilk. Id-dejta mqassma normalment kienet soġġetta għal test ANOVA one-way b'kejl ripetut, segwit mit-test ta' Paragun Multiplu ta' Holm-Sidak. Meta d-dejta ma kinitx imqassma b'mod normali, intuża t-test ta' Friedman mhux parametriku segwit mit-test ta' Paragun Multipli ta' Dunn. Id-dejta kollha hija espressa bħala medja ± żball standard tal-medja (SEM).Valur ta' p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Riżultati

3.1. L-Espożizzjoni tal-AGEs Taffettwa b'mod Negattiv il-Proliferazzjoni u s-Sopravivenza tal-CASCs

Kif muri fil-Figura 1, l-AGEs naqsu b'mod sinifikanti u gradwali l-proliferazzjoni tal-CASC maż-żmien. L-impatt negattiv tal-AGEs fuq il-proliferazzjoni tal-CASCs kien jiddependi wkoll mill-konċentrazzjoni. Wara 72 siegħa, konċentrazzjonijiet ta '100 ug/mL, 200 ug/mL, u 400 ug/mL AGEs sig naqqsu b'mod sinifikanti l-proliferazzjoni ta' CASCs meta mqabbla mal-BSA (Figura 1C; 80 fil-mija ± 7n100ug/mL, 74 fil-mija ± 3in 200 ug/mL, u 65 fil-mija ± 4in 400 ug/mL AGEs）.L-applikazzjoni ta 'BSA waħedha ma affettwatx il-kapaċità proliferattiva ta' CASCs (Figura Sl f'Materjali Supplimentari). Kif muri fil-Figura 2, konċentrazzjonijiet li qed jogħlew ta 'AGEs affettwaw b'mod negattiv is-sopravivenza ta' CASC fil-ħin. Effetti sinifikanti ta 'AGEs ġew osservati wara 48 (Figura 2B) u 72 h (Figura 2C; 85 fil-mija ±3 f'100 ug/mL, 73 fil-mija ±3 f'200 ug/mL, u 64 fil-mija ±4in 400 ug/mL AGEs) .L-applikazzjoni ta 'BSA waħedha ma affettwatx il-kapaċità ta' sopravivenza ta 'CASCs (Figura S1).

3.2.Żieda fil-Konċentrazzjonijiet tal-AGEs Żieda l-Apoptosi tal-CASCs

Biex jiġi eluċidat l-effett ta 'konċentrazzjonijiet differenti ta' AGEs (50,100,20, u 400 ug/mL) fuq l-apoptosi tal-CASCs, sar assay ta 'caspase. Il-perċentwal ta 'ċelluli li jesprimu caspase 3/7 tkejjel f'punti ta' ħin differenti: 24 (Figura 3A), 48 (Figura 3B), u 72 (Figura 3C) h. Ir-rata apoptotika żdiedet gradwalment maż-żmien b'konċentrazzjonijiet miżjuda ta 'AGEs (Figura 3C, 72h; 77 fil-mija ± 17 f'400 ug / mL AGEs vs.18 fil-mija ± 3in BSA).

3.3. L-Espożizzjoni tal-AGEs Tnaqqas il-Kapaċità tal-Migrazzjoni tal-CASCs

Il-kapaċità ta' migrazzjoni ta' CASCs ġiet evalwata b'assaġġ ta' migrazzjoni transwell wara 72h ta' inkubazzjoni b'konċentrazzjonijiet differenti ta' AGEs. Fil-Figura 4-E, huma ppreżentati eżempji rappreżentattivi ta' migrazzjoni ta' CASCs wara inkubazzjoni b'BSA u konċentrazzjonijiet differenti ta' AGEs (50,100, 200, u 400 ug/mL). Il-kwantifikazzjoni tal-migrazzjoni tidher fil-Figura 4F. Meta mqabbel ma 'BSA, kien osservat tnaqqis sinifikanti fil-migrazzjoni meta CASCs ġew inkubati b'400 ug/mL AGEs (Figura 4E, F; 75 fil-mija ± 5in 400 ug/mL AGEs).

3.4.Effetti ta 'ħsara ta' AGEs f'CASCs huma medjati minn Attivazzjoni ta 'RAGE

Biex tiġi evalwata l-kontribuzzjoni tal-attivazzjoni ta 'RAGE fl-effetti ta' ħsara osservati ta 'AGEs, il-proliferazzjoni, is-sopravivenza u l-migrazzjoni ta' CASCs ġew evalwati wara l-inkubazzjoni bl-antagonist ta 'RAGE FPS-ZM1. Qabel l-espożizzjoni għal 400 ug/mL AGEs, il-CASCs ġew inkubati minn qabel għal 2h b'10 jew 25 uM FPS-ZM1. L-applikazzjoni ta 'FPS-ZMl waħedha (10 u 25 uM) ma affettwatx il-kapaċità proliferattiva u lanqas is-sopravivenza ta' CASCs (Figura S2). Il-proliferazzjoni tal-CASCs (Figura 5A-C) ġiet evalwata wara 24 (A), 48 (B), u 72 (C) h. Kif muri fil-Figura 1, l-impatt negattiv fuq il-proliferazzjoni tal-CASCs mill-AGEs huwa ċċarat b'mod sinifikanti wara pre-inkubazzjoni b'25 uM FPS-ZM1 (Figura 5A-C). Tabilħaqq, wara 24 u 48 siegħa, il-proliferazzjoni CASCs tjiebet b'mod sinifikanti, b'espożizzjoni ta '400 ug/mL AGEs （24h, Figura 5A;104 fil-mija 士8 f'25 μM FPS-ZM1 vs.79 fil-mija ±5 f'400 ug/mL AGEs; 48h, Figura5B;95 fil-mija ±5in 25 μM FPS-ZM1 vs.70 fil-mija ±4in 400 ug/mL AGEs）. Wara 72h, ġiet osservata l-istess tendenza. Il-proliferazzjoni kellha t-tendenza li titjieb meta RAGE ġie inibit (Figura;80 fil-mija ±8in25μMFPS-ZM1 vs.67 fil-mija ±5in 400 ug/mL AGEs,p=0.06）). Is-sopravivenza (Figura 6A-C) ġiet evalwata wara 24 (A), 48 (B), u 72 (C) h. L-impatt negattiv fuq is-sopravivenza CASCs minn AGEs (Figura 2) huwa mtejjeb b'mod sinifikanti wara l-inkubazzjoni minn qabel b'25 uM FPS-ZM1 (Figura 6A-C). Wara 24h, is-sopravivenza tjiebet b'mod sinifikanti (Figura 6A; ZM1 vs 91 fil-mija ±4 f'400 ug/mL AGEs) Din it-tendenza kienet osservata wkoll wara 48 h (Figura 6B;91 fil-mija ±5 f'25 μM FPS-ZM1 vs.81 fil-mija ±5in 400 ug/mL AGES, p =0.07). Eżempji rappreżentattivi tal-migrazzjoni CASCs wara 72 h inkubazzjoni b'400 ug/mL AGEs u FPS-ZMl huma ppreżentati fil-Figura u kkwantifikati fil-Figura.CASCs qabel l-inkubazzjoni b'25 uM FPS-ZMI tista 'tipprevjeni t-tnaqqis tal-kapaċità ta' migrazzjoni CASCs osservata bl-espożizzjoni AGEs ( Figura 7B;98 fil-mija ±6 f'25 uM FPS-ZM1 vs.7 fil-mija ±8in 400ug/mL AGEs,p=0.07）.

4. Diskussjoni

L-istudju tagħna huwa l-ewwel li juri li l-AGEs jaffettwaw il-proprjetajiet CASCs, jiġifieri s-sopravivenza, il-proliferazzjoni, il-migrazzjoni u l-apoptosi in vitro. Id-dejta tagħna turi li dawn l-effetti huma parzjalment medjati permezz tal-attivazzjoni ta 'RAGE b'mod dipendenti mid-doża.

4.1.L-Irwol tal-AGEs fl-MI

Il-livelli ta 'AGEs ċirkolatorji huma elevati b'mod sinifikanti f'pazjenti b'MI akut [24,25] Madankollu, kif huma involuti fil-patofiżjoloġija tal-MI għadu mhux ċar. Speċijiet ta 'ossiġnu reattiv (ROS) huma l-kontributuri ewlenin involuti fis-sintesi ta' AGEs. L-istress ossidattiv jista 'jikkaġuna l-formazzjoni ta' komposti reattivi tal-karbonil u glycoxidation ta 'prodotti Amadori fir-reazzjoni Maillard. Bħala tali, l-AGEs huma ffurmati u akkumulati b'mod irriversibbli fil-qalb wara l-MI u huma maħsuba li potenzjalment ikomplu jaggravaw il-fenotip kardijaku avvers [26,27]. Barra minn hekk, in-newtrofili u l-makrofaġi attivati, involuti fil-proċess infjammatorju fl-MI, huma kontributuri ewlenin għas-sintesi tal-AGEs[28,29]. Dawn iċ-ċelloli immuni inixxu AGEs u huma rrappurtati bħala indutturi ewlenin tal-formazzjoni ta 'AGEs fl-MI. 4.2.Rilevanza Fiżjoloġika tal-Konċentrazzjonijiet tal-AGEs

Fl-istudju tagħna, aħna ttestjajna firxa wiesgħa ta 'konċentrazzjonijiet AGEs (50 sa 400 ug/mL) Il-konċentrazzjoni AGEs użata fi studji in vitro oħra li jinvestigaw l-effett ta' AGEs fuq ċelloli staminali, tvarja minn 15 sa 500 ug/mL 【20】. Hemm varjabbiltà sinifikanti ta 'konċentrazzjonijiet użati, iżda livelli ogħla ta' AGEs ġeneralment jirriflettu l-livelli fiżjoloġiċi fil-plażma misjuba f'pazjenti li jbatu minn mard multipli. Tabilħaqq, il-konċentrazzjoni AGEs-albumina f'pazjenti dijabetiċi intweriet li tvarja minn 50 sa 400 ug/mL[30]. Il-livelli tal-AGEs jistgħu jogħlew għal konċentrazzjonijiet sa 200 ug/mL f'pazjenti li jbatu minn mard kardjovaskulari [31,32]. F'pazjenti bil-marda ta 'Alzheimer fi stadju bikri, konċentrazzjonijiet aktar baxxi ta' AGEs fil-medda nanoskala, huma wkoll irrappurtati [33]. Madankollu, minħabba l-metodi analitiċi differenti użati għall-kejl ta 'AGEs, u l-eteroġeneità ta' tipi differenti ta 'AGEs, stima ta' konċentrazzjonijiet affidabbli ta 'AGEs in vivo tibqa' teknikament ta' sfida u probabbilment hija sottovalutazzjoni [34].

4.3. L-AGEs għandhom Impatt Negattiv fuq il-Proprjetajiet CASCs

Anki jekk it-trapjant CASC juri potenzjal promettenti għar-riġenerazzjoni kardijaka wara l-MI, is-sopravivenza u l-kapaċità riġenerattiva taċ-ċelloli jibqgħu kwistjoni. Iż-żoni iskemiċi huma magħrufa li huma ambjent ostili b'livelli miżjuda ta 'stress ossidattiv, infjammazzjoni u fibrożi flimkien ma' livelli miżjuda tat-tessuti AGEs. Jekk l-AGEs jaffettwawx il-kapaċità riġenerattiva tal-CASCs ma kienx magħruf iżda jista 'jkun għarfien importanti fil-kuntest tar-riġenerazzjoni kardijaka u l-kapaċitajiet riġenerattivi promettenti tal-CASCs[12]. Fl-istudju tagħna, nuru li l-AGEs ifixklu s-sopravivenza, il-proliferazzjoni u l-migrazzjoni tal-CASCs in vitro, b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni u l-ħin. Barra minn hekk, l-espożizzjoni għall-AGEs twassal għal żieda gradwali fl-apoptosi tal-CASCs. Id-dejta tagħna hija konformi ma 'studji li jeżaminaw l-effett tal-AGEs fuq tipi multipli ta' ċelloli staminali oħra, li fihom il-kapaċità proliferattiva tinbidel u tiżdied l-apoptosi [20]. Tabilħaqq, Zhu et al. urew tnaqqis sinifikanti fil-proliferazzjoni tal-EPCs wara espożizzjoni għal konċentrazzjonijiet differenti ta' AGEs[16]. L-istess effett ġie evalwat minn Sun et al. ukoll fl-EPCs, fejn żieda fir-rata apoptotika kienet medjata mill-attivazzjoni tal-mogħdija p38 MAPK [35]. NSCs esposti għal AGEs irriżultaw fi tnaqqis dipendenti fuq id-doża tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli staminali, medjat permezz tal-mogħdija PPARy [36]. Fiċ-ċelloli staminali derivati ​​mit-tessut xaħmi (ADSCs), żieda fl-attivazzjoni tal-caspase 3 twassal għal rata apoptotika miżjuda [37]. Yang et al. irrapporta kapaċitajiet aktar baxxi ta' proliferazzjoni u migrazzjoni fl-MSCs, b'mod li jiddependi mill-konċentrazzjoni tal-AGEs. Dan l-effett kien medjat permezz ta’ produzzjoni eċċessiva ta’ ROS[18]. Għad irid jiġi determinat jekk l-effetti ta 'ħsara fuq CASCs, popolazzjoni ta' ċelluli staminali differenti ħafna ta 'oriġini kardijaka, humiex medjati wkoll permezz ta' produzzjoni eċċessiva ta 'ROS.

Intwera li l-mekkaniżmi sottostanti li fihom l-AGEs jeżegwixxu l-effetti negattivi tagħhom fuq il-funzjoni tal-organi huma dipendenti u/jew indipendenti mill-attivazzjoni tar-riċettur RAGE [15]. Studji f'ħafna tipi ta 'ċelloli staminali juru li l-AGEs jimmedjaw l-effetti tagħhom prinċipalment permezz tal-attivazzjoni ta' RAGE jew mogħdijiet apoptotiċi oħra[20]. L-attivazzjoni ta 'RAGE minn AGEs tikkawża attivazzjoni ta' MAPK, li twassal għal fosforilazzjoni ta 'JNK u p38] Dawn il-proteini fosforilati jżidu t-traskrizzjoni ta' fatturi ta 'traskrizzjoni pro-apoptotiċi differenti fin-nukleu, li jwasslu għal żieda fl-apoptożi. Barra minn hekk, il-mogħdijiet tal-caspase jistgħu jiġu attivati, li jikkawżaw apoptożi indotta mill-AGEs[39]. Studji ta' segwitu jibqgħu meħtieġa biex jinkixfu l-mekkaniżmi molekulari li bihom l-effetti downstream tal-AGEs jiġu indotti f'CASCs. Madankollu, urejna li fuq l-imblukkar ta 'RAGE minn FPS-ZM1, l-effetti osservati ta' AGEs fuq CASCs tnaqqsu. Għalhekk, id-dejta tagħna tindika bil-qawwa li l-AGEs jimmedjaw l-effetti tagħhom fuq CASCs probabbli permezz ta 'rbit u attivazzjoni ta' RAGE. Jekk il-Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, produzzjoni eċċessiva ta 'ROS, jew mogħdijiet oħra ta' sinjalazzjoni humiex involuti, għad irid jiġi identifikat aktar. Id-dejta tagħna hija wkoll konformi max-xogħol deskritt minn Zhang et al., Fejn FPS-ZMl biddel ukoll l-effetti negattivi tal-AGEs fl-ADSCs billi jimblokka RAGE, u kkonferma aktar ir-rwol importanti tal-attivazzjoni tar-RAGE bħala medjatur tal-effetti ħżiena kkawżati minn AGEs[40].

4.4. Perspettivi Futuri għal Terapiji Kontra l-AGEs għal Mard Kardjovaskulari u Limitazzjonijiet kurrenti

Konferma in vivo dwar l-użu ta’ terapiji kontra l-AGEs u l-valur miżjud potenzjali tagħhom għat-trapjant ta’ ċelloli staminali wara l-MI jeħtieġ li tiġi kkonfermata f’mudell ta’ annimal qabel ma dan ikun jista’ jiġi tradott fil-klinika. Intwera f'diversi studji in vitro li l-inibitur PPARy rosiglitazone [41,42], l-inibituri MAPK [18,35,43], jew l-antiossidanti [4] jistgħu jtaffu l-effetti medjati mill-AGEs fuq iċ-ċelloli staminali. Madankollu, l-influwenza tagħhom in vivo bħala intervent terapewtiku flimkien mat-trapjant taċ-ċelloli staminali qatt ma ġiet indirizzata s'issa. Hemm strateġiji multipli biex ibaxxu l-livelli ta 'AGEs fil-ġisem. Pyridoxamine (PM) huwa inibitur tal-formazzjoni ta 'AGEs billi jnaqqas il-konverżjoni ta' Amadori-to-AGEs u jneħħi l-komposti tal-karbonil. L-effikaċja, kif ukoll is-sigurtà tat-trattament bil-PM, intwerew fi provi kliniċi b'pazjenti dijabetiċi [45]. Madankollu, prova klinika ta 'NephroGenex fl-2014, li tittestja Pyridorin [(jiġifieri, PM) bħala terapija kontra d-dijabete, twaqqaf minħabba kwistjonijiet finanzjarji [46]. L-ebda provi kliniċi oħra bħalissa ma qed jinvestigaw il-PM bħala terapija. Madankollu, l-inibizzjoni tal-formazzjoni ta 'AGEs bil-PM tista' tkun strateġija biex ittejjeb il-potenzjal taċ-ċelloli staminali għal skopijiet riġenerattivi kardijaċi. Barra minn hekk, inibituri oħra tal-formazzjoni ta 'AGEs, bħal aminoguanidine, jistgħu jintużaw fil-futur biex ibaxxu l-livelli ta' AGEs wara MI. Il-prova klinika ACTION II wriet l-effikaċja ta' aminoguanidine f'pazjenti dijabetiċi. Filwaqt li aminoguanidine naqas milli jnaqqas b'mod sinifikanti l-endpoint primarju li jirduppja l-ħin biex jintlaħqu l-livelli massimi ta' kreatinina fis-serum f'dawn il-pazjenti, intwerew effetti klinikament importanti oħra fuq il-kumplikazzjonijiet tad-dijabete, bħal tnaqqis fil-proteinurja u l-konċentrazzjonijiet tal-lipidi ċirkolatorji. Madankollu, minħabba effetti avversi riversibbli bħall-induzzjoni ta 'awtoantikorpi, sintomi simili għall-influwenza, u anemija, din il-prova ġiet mitmuma u t-traduzzjoni fil-klinika għadha limitata [47,48]. Barra minn hekk, l-użu ta 'antiossidanti bħal N-acetyl-L-cysteine ​​(NAC) jew glutathione bħala suppliment għad-dieta tagħna jista' jipprovdi xi riżultati ta 'benefiċċju għat-terapija taċ-ċelloli staminali, peress li jżidu l-istabbiltà ġenomika, itejbu l-adeżjoni, u jistimulaw il-proliferazzjoni taċ-ċelloli staminali. 49]. Madankollu, azzjonijiet speċifiċi għaċ-ċelluli jvarjaw bejn it-tipi ta 'ċelluli staminali, u provi kliniċi ta' rispons għad-doża huma meħtieġa biex jevalwaw l-effikaċja terapewtika tagħhom meta jintużaw flimkien ma 'trapjant ta' ċelluli staminali. Għażla oħra hija li tkisser l-AGEs bit-terapija ALT-71. ALT-711 huwa kapaċi jaqsam il-limiti tal-karbonju-karbonju bejn il-karbonili, u b'hekk jikser il-cross-links fil-molekuli AGEs. Madankollu, diversi provi kliniċi ma setgħux jikkonfermaw l-effetti ta' benefiċċju ta' ALT-711 osservati fi studji fuq l-annimali. Barra minn hekk, inibituri ta 'RAGE (bħal FPS-ZM1) jew inibituri ta' molekuli downstream fil-mogħdija RAGE jistgħu jinterferixxu fl-assi tas-sinjalar taċ-ċelluli AGEs/RAGE, u b'hekk jimblukkaw l-effetti medjati minn AGEs fiċ-ċelloli staminali. L-effikaċja ta 'tipi differenti ta' molekuli żgħar u inibituri biex jimblukkaw AGEs fiċ-ċelloli staminali intweriet f'esperimenti multipli in vitro [18,35,44] iżda qatt ma ġiet ittestjata qabel f'mudelli ta 'annimali. Għalhekk, nistgħu biss ipoteżi li dawn l-inibituri huma effiċjenti fl-imblukkar ta 'AGEs f'sitwazzjoni in vivo, iżda huma meħtieġa esperimenti ta' kunċett ta 'prova. Fl-aħħarnett, għażla oħra għall-imblukkar tal-AGEs flimkien mat-terapija taċ-ċelloli staminali hija li timmodifika ġenetikament iċ-ċelloli staminali nfushom. L-espressjoni żejda ta 'sRAGE hija magħrufa li ttejjeb it-tneħħija ta' AGEs (u ligandi oħra ta 'RAGE bħal amyloid-) biex ittejjeb l-effettività tat-terapija taċ-ċelluli. Dan intwera f'MSCs li jxerrdu sRAGE bħala terapija għall-marda ta' Alzheimer[50,51], artrite [52], u marda ta' Parkinson [53]. L-MSCs li jnixxu sRAGE baqgħu ħajjin għal żmien itwal, kellhom kapaċità ta 'migrazzjoni mtejba, kienu protetti aħjar kontra l-apoptosi, u kellhom proprjetajiet anti-infjammatorji. Ukoll, ir-regolazzjoni 'l isfel ta' RAGE, u b'hekk tiddisensibilizza ċ-ċelloli staminali għall-AGEs, tista 'tkun għażla fit-titjib tal-funzjonalità taċ-ċelloli. Jekk dawn l-istrateġiji jistgħux ikunu applikabbli wkoll fl-issettjar ta 'MI u tiswija kardijaka għad irid jiġi investigat. Fil-qosor, dawn l-istrateġiji kollha għandhom l-għan li jindirizzaw l-AGEs biex itejbu l-funzjonalità u ż-żamma taċ-ċelloli staminali. Madankollu, dawn l-għażliet terapewtiċi jibqgħu ipotetiċi u jeħtieġ li jiġu investigati in vivo flimkien mat-terapija CASC qabel ma jkunu jistgħu jiġu tradotti fl-ambjent kliniku. 5. Konklużjonijiet

Sibna li l-AGEs kellhom effett gradwali dipendenti fuq iż-żmien u l-konċentrazzjoni fuq il-proprjetajiet tal-CASCs, billi żiedu l-apoptosi u billi naqqsu s-sopravivenza, il-proliferazzjoni u l-migrazzjoni in vitro. Il-mekkaniżmi ta 'ħidma wara dawn l-effetti għad iridu jiġu investigati aktar, għalkemm urejna li l-attivazzjoni ta' RAGE hija kontributur importanti għal dawn l-effetti negattivi relatati mal-AGEs. Jekk l-AGEs fil-mira in vivo tistax ittejjeb il-kapaċità terapewtika tal-CASCs wara l-MI, għad irid jiġi investigat aktar.

Dan l-artikolu huwa estratt minn J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm