Echinacoside Induċi Mewt Apoptotiku taċ-Ċelloli tal-Kanċer Billi jinibixxi l-Enżima Sanitizzanti MTH1 tan-Nucleotide Pool

L-Ewwel Parti Kif l-echinacoside jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli u jtejjeb il-memorja

Għal aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattja: Ali.ma@wecistanche.com

Astratt:L-inibizzjoni tal-enżima sanitizzanti tal-ġabra ta 'nukleotidi MTH1 tikkawża ħsarat estensivi fid-DNA ossidattiv u apoptożi fiċ-ċelloli tal-kanċer u għalhekk tista' tintuża bħala strateġija kontra l-kanċer. Peress li l-prodotti naturali kienu sors għani ta 'kimiċi mediċinali, fl-istudju preżenti, użajna r-reazzjoni enżimatika katalizzata MTH1- bħala prestazzjoni għolja f'assaġġ ta' screening vitro biex infittxu komposti naturali li kapaċi jinibixxu MTH1.Echinacoside, kompost derivat mill-pjanti mediċinali Cistanche u Echinacea, inibixxi b'mod effettiv l-attività katalitika ta 'MTH1 f'assaġġ in vitro. Trattament ta 'diversi linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-bniedem bilEchinacosideirriżulta f'żieda sinifikanti fil-livell ċellulari ta 'guanine ossidizzat (8-oxoguanine), filwaqt li l-livell ta' speċi ta 'ossiġnu reattiv ċellulari baqa' mhux mibdul, li jindika liEchinacosideinibixxi wkoll l-attività ta 'MTH1 ċellulari. Konsegwentement,Echinacosideit-trattament wassal għal żieda immedjata u drammatika fil-markaturi tal-ħsara fid-DNA u upregulation tal-inibitur G1/S-CDK p21, li kienu segwiti minn mewt taċ-ċelluli apoptotiċi mmarkati u arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli fil-kanċer iżda mhux fiċ-ċelloli mhux tal-kanċer. Meħuda flimkien, dawn l-istudji identifikaw kompost naturali bħala inibitur MTH1 u jissuġġerixxu li l-prodotti naturali jistgħu jkunu sors importanti ta 'aġenti kontra l-kanċer.

Kliem ewlieni:Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, ħsara fid-DNA,apoptożi, arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli.

Ikklikkja biex Cistanche juża għall-memorja

Introduzzjoni

Il-ġabra taċ-ċellulari u mitokondrijali nukleosidi trifosfat (NTP) u deoxynucleoside triphosphate (dNTP) hija mira sinifikanti ta 'diversi speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS).1–3 Minħabba li l-ispeċifiċità tad-DNA polymerases hija inqas minn perfetta, dNTPs ossidizzati jistgħu jiġu inkorporat f'DNA sintetizzat ġdid biex jikkawża aberrazzjonijiet ġenetiċi jekk mhux iffissat.6 Pereżempju, il-bażi ossidizzata ewlenija fil-ġabra tan-nukleotidi, 8-oxoguanine (8-oxoG), tista 'tibbaża par maċ-ċitosina u l-adenina. Meta tiddaħħal f'adenine oppost waqt ir-replikazzjoni tad-DNA, tista' potenzjalment tikkawża trasverżjoni T: A=G: C,7 li hija waħda mill-aktar mutazzjonijiet komuni misjuba fil-kanċer tal-bniedem.8,9 Għalkemm ħafna mid-dNTPs ħielsa ossidizzati. jitneħħew minn enzimi sanitizing pool tan-nukleotidi, studji fil-passat wrew li l-pool tan-nukleotidi għadu sors importanti ta 'bażijiet ossidizzati fil-molekuli tad-DNA u kontributur sinifikanti għall-ħsarat ossidattivi tad-DNA.3,10 Iċ-ċelloli tal-mammiferi huma armati b'mekkaniżmi ta' difiża sofistikati biex jimminimizzaw leżjonijiet ġenomiċi kkaġunati minn ROS. L-enzimi sanitizzanti tal-ġabra ta’ nukleotidi idrolizzaw dNTPs u NTPs ossidizzati, u b’hekk jipprevjenu l-inkorporazzjoni tagħhom f’molekuli ta’ DNA u RNA. dNTPs (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP, u 2-OH-ATP) mill-pools tan-nukleotidi.14 Peress li 8-oxoguanine (8-oxoG) hija l-bażi ossidizzata ewlenija ġewwa ċ-ċelloli, MTH1 hija l-aktar enzima importanti għas-sanitizzazzjoni ta 'pools ta' nukleotidi. inkorporati fid-DNA, u bażijiet fil-molekuli tad-DNA jistgħu wkoll jiġu ossidizzati direttament minn ROS.6 Iċ-ċelluli mbagħad jiddependu fuq strateġiji aktar elaborati li jinvolvu diversi glycosylases tad-DNA, bħal OGG1 u MUTYH, u proċessi ta’ tiswija tad-DNA, inkluż tiswija ta’ qtugħ tal-bażi (BER) u nuqqas ta’ tqabbil tiswija (MMR), biex tiffissa bażijiet problematiċi fil-molekuli tad-DNA.10, 16,17 BER u MMR normalment isewwi bosta bażijiet ossidizzati fid-DNA kuljum u għalhekk għandhom rwoli importanti fil-protezzjoni tal-integrità u l-istabbiltà tal-ġenoma.

F'ċelloli li huma taħt stress ossidattiv elevat, żieda fl-inkorporazzjoni ta 'nukleotidi ossidizzati fid-DNA tista' tegħleb il-kapaċità ta 'tiswija ċellulari u tixpruna rispons għall-ħsara fid-DNA (DDR). jistabbilixxu ostaklu għat-tumuriġenesi.19 Madankollu, għalkemm iċ-ċelluli tal-kanċer juru tensjoni ossidattiva miżjuda ħafna u jiġġeneraw piż potenzjalment letali ta’ nukleotidi ossidizzati,20 jistgħu jgħixu s-senescence jew apoptosis assoċjati mad-DDR.21 Numru kbir ta’ studji wrew li MTH1, billi effettivament tneħħi l-{6}}oxodGTP u 2-OH-dATP perikoluż abbundanti fiċ-ċelloli tat-tumur, għandu rwol ewlieni fl-iżvilupp tal-kanċer.22 MTH1 instab li kien espress iżżejjed f'tipi differenti ta' kanċer,23– 25 u 8-oxoG livelli, u l-firxa tal-leżjonijiet tad-DNA ossidattivi kienet aktar baxxa fit-tumuri milli fit-tessuti normali tal-madwar.26-28 Funzzjonalment, l-espressjoni żejda ta 'MTH1 naqqset b'mod sinifikanti l-numb. er ta’ mutazzjonijiet tad-DNA li dehru f’fibroblasti embrijoniċi tal-ġurdien defiċjenti ta’ MMR10 u ppermettew liċ-ċelloli jegħlbu s-senescence ċellulari prematura u l-apoptosi indotta minn Ras onkoġeniċi;29 filwaqt li s-soppressjoni ta’ MTH1 impedixxa l-iżvilupp ta’ kanċer f’ġrieden defiċjenti OGG1-30 u ppromwoviet ROS -induced DDR u senescence ċellulari f'ċelloli trasformati b'Ras.3,29,31 Għalhekk, għalkemm MTH1 għandu rwol protettiv billi jipprevjeni mutazzjonijiet indotti minn ROS f'ċelloli b'saħħithom, dawn l-istudji sabu li MTH1 huwa partikolarment meħtieġ għall-emerġenza u s-sopravivenza tal-kanċer ċelloli. Studji reċenti pprovdew aktar evidenza biex jappoġġjaw ir-rwol ta 'MTH1 fl-iżvilupp tal-kanċer.31–34 Is-soppressjoni ta' MTH1 minn RNAi jew inibituri ta' molekula żgħira f'diversi linji ta 'ċelluli tal-kanċer irriżultaw f'inkorporazzjoni akbar ta' 8-oxodG fid-DNA ġenomika, li wassal għal ħsarat estensivi fid-DNA, mewt taċ-ċelluli apoptotiċi, u sopravivenza mnaqqsa taċ-ċelluli tal-kanċer. 32,33 Fi studji xenograft tal-ġrieden, l-inibizzjoni ta 'MTH1 trażżan b'mod effiċjenti t-tkabbir ta' esplants tal-kanċer. Importanti, it-trażżin ta 'MTH1 ma kellux impatt fuq it-tkabbir u s-sopravivenza ta' ċelloli normali, probabbilment minħabba li ċ-ċelloli normali għandhom ROS aktar baxxi u għalhekk huma inqas dipendenti fuq MTH1 għas-sopravivenza.32,33 Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-inibizzjoni ta 'MTH1 hija strateġija ġdida promettenti biex tiġġieled il-kanċer. .

Il-prodotti naturali kienu sors għani ta’ komposti mediċinali.35 Ħafna terapewtiċi moderni, inklużi mediċini kontra l-kanċer, ġew derivati ​​minn preparazzjonijiet erbali jew botaniċi.36–39 Madankollu, għadd kbir ta’ ħxejjex aromatiċi tradizzjonali pproponew li jippossjedu diversi proprjetajiet terapewtiċi biex jibqgħu. għandhom jiġu karatterizzati, l-aktar minħabba diffikultajiet fil-kontroll tal-kompożizzjonijiet tagħhom biex jiddefinixxu mingħajr ambigwità l-effikaċja u l-mekkaniżmi ta’ azzjoni tagħhom.40 Huma meħtieġa approċċi ġodda li jippermettu l-iskoperta ta’ komposti attivi u l-analiżi tal-mekkaniżmi molekulari. F'dan ir-rigward, screening in vitro ta' rendiment għoli iggwidat minn mira jista' jkun strumentali biex jinstabu komposti mediċinali definiti b'mod mekkaniku minn riżorsi naturali. Fl-istudju preżenti, użajna r-reazzjoni enżimatika katalizzata MTH1- bħala assaġġ in vitro b'rendiment għoli biex infittxu komposti naturali li jistgħu jinibixxu MTH1. B'mod sorprendenti, l-iskrinjar żvela danEchinacoside, prodott naturali li huwa magħruf l-aktar għall-attività antiossidativa qawwija tiegħu, huwa kapaċi jinibixxi MTH1.

materjali u metodi

Materjali

Il-komposti tal-ħxejjex naturali nxtraw minn Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina. L-isem, in-numru tal-katalgu, in-numru tar-reġistru tal-Chemical Abstracts Service (CAS), u l-purità ta’ kull kompost huma elenkati fit-Tabella S1. Is-soluzzjonijiet tal-ħażniet tal-komposti ġew ippreparati f'100 fil-mija dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), u s-soluzzjonijiet tax-xogħol ġew ippreparati f'assay buffer jew mezz sħiħ tal-kultura taċ-ċelluli. L-istess soluzzjoni mingħajr il-kompost tat-test iżda li fiha l-istess ammont ta 'DMSO intużat bħala kontroll tal-vettura. (S)-crizotinib inxtara minn Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

Screening in vitro

L-assaġġ enżimatiku in vitro użat għall-iskrinjar ta’ komposti veġetali naturali segwa l-proċeduri deskritti minn Gad et al.32 Fil-qosor, dilwizzjonijiet serjali ta’ komposti individwali ġew ippreparati fil-buffer tal-assaġġ li jikkonsisti minn 100 mM Tris- aċetat (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg aċetat, 0.005 fil-mija Tween 20, u 1 mM DTT. Sussegwentement, ġew miżjuda 0.5 nM umani rikombinanti MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), u 0.2 U/mL pirofosfatasi inorganiċi (Thermo Fisher Scientific), u l-pjanċi ġew inkubati fuq plate shaker għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-volum tar-reazzjoni finali kien ta' 100 μL fuq pjanċa ta' 96-bir. Fl-aħħar tar-reazzjoni, il-malakite aħdar (J&K Scientific, Beijing, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina) ġie miżjud,41, u l-pjanċi ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal 15-il minuta oħra. L-assorbiment f'630 nm tkejjel b'qarrej tal-mikroplate BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Il-valuri tal-konċentrazzjoni inibitorja (IC50) ġew determinati b'analiżi ta' rigressjoni mhux lineari bl-użu tas-softwer GraphPad Prism.

Kultura taċ-ċelluli

Osteosarkoma MG-63 tal-bniedem, epatokarċinoma SK-HEP-1, kanċer tas-sider MCF7, kanċer tal-kolorektum SW480, kliewi embrijoniku HEK293, u linji taċ-ċelluli tal-fibroblast tal-ġurdien NIH/3T3 kienu minn American Type Culture Collection, u l-bniedem normali Il-linja taċ-ċelluli tal-fwied L-O2 inxtrat minn KenGen Biotech, Nanjing, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina. Dawn iċ-ċelloli nżammu f'37 grad f'atmosfera umidifikata b'5 fil-mija CO2, wara struzzjonijiet mogħtija mill-fornituri. L-ebda dikjarazzjoni etika ma kienet meħtieġa mill-bord ta 'reviżjoni istituzzjonali għall-użu ta' dawn il-linji taċ-ċelluli.

Kejl ta' 8-oxoG intraċellulari

Il-livelli intraċellulari ta' {{{0}}oxoG ġew imkejla permezz ta' tbajja' b'avidina konjugata Cy{3-.42 Total ta' ċelluli 1 × 104 ġew miżrugħa fuq coverslip tond fi 12-pjanċi ta' bir. L-għada, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, jew 80 μMEchinacosidegħal 5 sigħat, 12-il siegħa jew 24 siegħa u mbagħad ġew iffissati b'metanol kiesaħ fis-silġ għal 20 minuti, segwiti minn inkubazzjoni f'Tris-buffered saline (TBS) b'0.1 fil-mija Triton X -100 (Sigma-Aldrich) għal 15-il minuta. Il-kampjuni ġew imblukkati f'TBS b'0.1 fil-mija Triton X{-100 u 15 fil-mija serum bovin tal-fetu għal siegħa f'temperatura tal-kamra u mbagħad imtebba' b'avidin konjugat Cy3- (0.5 ug/ mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) f'soluzzjoni ta 'imblukkar għal siegħa f'37 grad. Wara l-ħasil f'salina buffered bil-fosfat (PBS) 3 darbiet għal 5 minuti, il-coverslips ġew issiġillati fuq slides tal-ħġieġ f'VECTASHIELD Mounting Medium b'4′,6-diamidino-2-phenylindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA , L-ISTATI UNITI). Ittieħdu immaġini u ġew analizzati b'mikroskopju konfokali Zeiss LCM 510.

Kejl ta' ROS intraċellulari

Il-livelli ta 'ROS intraċellulari tkejlu permezz ta' ċitometrija tal-fluss bl-użu ta 'kit ta' analiżi ROS ibbażat fuq iċ-ċelluli (Beyotime Biotechnology, Haimen, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina). Ċelloli mkabbra fi pjanċi b'sitt reċipjenti ġew ittrattati bi 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, jew 80 μMEchinacosidegħal 5 sigħat, 12-il siegħa, jew 24 siegħa, maħsul darbtejn b'PBS, u inkubat b'10 μM dichlorofluorescein diacetate għal 30 minuta f'37 grad. Iċ-ċelloli mbagħad ġew trypsinizzati u analizzati miċ-ċitometru tal-fluss FACCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Il-livelli ta' ROS intracel-ċellulari ġew espressi bħala l-intensità medja tal-fluworexxenza tad-dichloro di-hydro fluorescein taċ-ċelloli. In-numri murija kienu medji ta 'tliet esperimenti indipendenti.

Tbajja immunofluworexxenti

Ċelloli mkabbra fuq coverslips ġew ittrattati bi 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, jew 80 μMEchinacosidegħal 5 sigħat, 12-il siegħa, jew 24 siegħa u mbagħad maħsul darba b'PBS, iffissat b'4 fil-mija paraformaldehyde f'PBS għal 20 minuti, u mblukkat f'TBS b'0.1 fil-mija Triton X-100 u 15 fil-mija serum bovin fetali għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Ċelloli fissi kienu mtebbgħin għal sagħtejn f'temperatura ambjentali b'antikorp primarju kontra 8-oxoG (ġrieden monoklonali anti{-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (fenek anti{-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery ( Abcam) jew Cy3-mogħoż konjugat anti-fenek (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) antikorp sekondarju għal siegħa f'temperatura ambjentali. Wara l-ħasil fil-PBS 3 darbiet għal 5 minuti, il-coverslips ġew issiġillati fuq slides tal-ħġieġ f'VECTASHIELD Mounting Medium b'DAPI (Vector Laboratories). L-immaġini ttieħdu minn mikroskopju konfokali Zeiss LCM 510.

Assaġġ tal-formazzjoni tal-kolonji

Il-ġurnata ta 'qabel it-trattament, iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi pjanċa b'sitt reċipjenti f'konċentrazzjoni ta' 1 × 104 ċelluli għal kull bir. Imbagħad ġew ittrattati bi 0 μM, 60 μM, jew 80 μM Echinacoside għal 7 ijiem. Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelloli ġew iffissati b'metanol kiesaħ bis-silġ u mtebbgħin b'soluzzjoni vjola kristall (Sigma Aldrich) (0.5 fil-mija f'25 fil-mija metanol). Stampi ġew fotografati wara t-tnixxif tal-pjanċi matul il-lejl. Il-kristalli vjola tal-kristall ġew maħlula biż-żieda ta '70 fil-mija etanol, u l-assorbiment f'595 nm ġiet imkejla minn qarrej tal-mikroplate BioRad 680. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu tas-softwer GraphPad Prism.

Assaġġ MTT

Ġurnata qabel it-trattament, iċ-ċelluli nżergħu fi 96-pjanċi bir-bir f'konċentrazzjoni ta' 1 × 104 ċelluli għal kull bir, segwit minn trattament b'dilwizzjonijiet serjali ta' Echinacoside għal 24 siegħa jew 48 siegħa, jew b'60 μM Echinacoside għal 5 sigħat , 12-il siegħa, jew 24 siegħa. Il-medju tneħħa, u ċ-ċelloli ġew maħsula bil-PBS, u mbagħad, 20 μL ta' 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,

5-Diphenyl tetrazolium bromide (MTT) soluzzjoni (5 mg/mL f'PBS, pH 7.2) (Thermo Fisher Scientific) ġiet miżjuda ma' kull bir. Il-pjanċi ġew inkubati f'37 grad għal 4 sigħat oħra. Fl-aħħar, is-soluzzjoni MTT tneħħiet u 150 μL ta 'DMSO ġew miżjuda ma' kull bir. Il-pjanċi ġew inkubati fuq plate shaker għal 10 minuti, u l-assorbenza f'570 nm ġiet imkejla minn BioRad 680 microplate reader. Kull esperiment sar darbtejn fi tliet kopji. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu tas-softwer GraphPad Prism. Il-valuri IC50 ġew determinati bl-użu ta 'analiżi ta' rigressjoni mhux lineari.

Analiżi taċ-ċiklu taċ-ċelluli

Ċelloli fi pjanċi b'sitt reċipjenti ġew ittrattati bi 0 μM, 6{{10}} μM, jew 80 μM Echinacoside għal 24 siegħa, maħsuda bi trypsin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , maħsul darbtejn b'PBS, u mbagħad iffissat b'etanol kiesaħ bis-silġ (70 fil-mija) għal sagħtejn f'-20 grad. Ċelloli fissi ġew maħsula darbtejn f'PBS kiesaħ u sospiżi mill-ġdid fi 300 μL ta' PBS ippreparat frisk b'0.1 fil-mija Triton X-100, 0.2 mg/mL RNase A mingħajr DNase (Sigma Aldrich), 10 ug/mL jodur tal-propidju (PI). ) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, l-Isvizzera). Wara l-inkubazzjoni f'37 grad fid-dlam għal 20 minuta, iċ-ċelloli ġew iffiltrati permezz ta 'malji tan-najlon Falcon (BD Biosciences), mgħobbija fuq iċ-ċitometru tal-fluss FAC-Calibur, u analizzati bl-użu tas-softwer ModFit (BD Biosciences).

Analiżi tal-frammentazzjoni tad-DNA

Ċelloli mkabbra fi pjanċi ta 'sitt well ġew ittrattati b'0 μM, 60 μM, jew 80 μM Echinacoside għal 24 siegħa u ffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde kiesaħ fis-silġ (Sigma-Aldrich) għal 20 minuta. Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelloli ġew issiġillati f'VECTASHIELD Mounting Medium b'DAPI (Vector Laboratories). Il-morfoloġija nukleari ġiet fotografata b'mikroskopju fluworexxenti Olympus. Biex tiskopri l-frammentazzjoni tad-DNA fuq ġellijiet agarose, id-DNA ġie estratt bl-użu tal-mikro kit tad-DNA QIAamp (Qiagen NV, Venlo, l-Olanda), u l-elettroforesi saret fuq ġels agarose ta '2 fil-mija li fihom 0.1 ug/mL ethidium bromide.

Analiżi tal-apoptożi permezz taċ-ċitometrija tal-fluss

Ċelloli apoptotiċi ġew eżaminati bl-użu ta ' Annexin V-FITC Apoptosis detection kit (Best, Shanghai, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina), wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Iċ-ċelluli mkabbra fi 96-pjanċi tal-bir ġew ittrattati bi 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM, jew 160 μM Echinacoside għal sagħtejn, 5 sigħat, 12-il siegħa jew 24 siegħa, maħsula darbtejn bil-PBS, u mbagħad sospiż mill-ġdid f'buffer li torbot. Sussegwentement, ġew miżjuda 5 μL ta' Annexin V-FITC u 5 μL ta' PI (Roche) b'mod sekwenzjali, u ċ-ċelloli ġew inkubati għal 15-il minuta fid-dlam f'temperatura tal-kamra. Iċ-ċelloli ġew mgħobbija fuq iċ-ċitometru tal-fluss FACSCalibur (BD Biosciences), u d-dejta ġiet analizzata bl-użu tas-softwer Cell Quest (BD Biosciences).

Analiżi Western blot

Ċelloli mkabbra fi pjanċi b'sitt reċipjenti ġew ittrattati b'0 μM, 6{{10}} μM, jew 80 μM Echinacoside għal 5 sigħat, 12-il siegħa, jew 24 siegħa, maħsul darbtejn bil-PBS u mibruxa mill-pjanċa bl-użu ta' 100 μL ta' buffer radjoimmunopreċipitazzjoni (150 mM NaCl, 1.0 fil-mija IGEPAL CA-630, 0.5 fil-mija deoxycholate tas-sodju, 0.1 fil-mija sodium dodecyl sulfate , u 50 mM Tris, pH 8.0) (Sigma-Aldrich) li fih 1 mM phenylmethane sulfonyl fluoride. Il-kampjuni ġew ċentrifugati fi 12,000× g għal 20 minuta f'4 gradi. Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini fis-supernatanti ġew determinati mir-reaġent Bradford (Dingguo, Changchun, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina). Il-kampjuni ġew żnaturati f'95 grad għal 10 minuti u sseparati fuq ġel tal-elettroforesi tal-ġell tal-ġell tal-polyacrylamide dodecyl sulfate 12 fil-mija. Wara l-elettroforeżi, il-proteini ġew trasferiti għal membrani tal-fluworidu tal-poliviniliden (Millipore), segwiti mill-imblukkar f'salina buffered Tris b'Tween 20 (10 mM Tris, pH 7.5; 100 mM NaCl; 0.1 fil-mija Tween 20) li fih 5 fil-mija (w/v) ħalib bla xaħam għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Blots ġew ittestjati b'antikorpi primarji kontra p21 (Abcam), poly (ADP-ribose) polymerase (Bioss), jew caspase attivat-3 (Bioss), segwiti minn antikorpi sekondarji konjugati ma' horseradish peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Sinjali ġew żviluppati bl-użu ta ' kimiluminixxenza mtejba Western blotting detection kit (Trans gen Biotech, Changchun, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina). L-esperimenti ġew ripetuti tliet darbiet.

Kejl tal-mitokondrijali

potenzjal tal-membrana

Il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali tkejjel bl-użu taż-żebgħa JC{{0}} (Bijoteknoloġija), wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Ċelloli mkabbra fi pjanċi ta 'sitt well ġew ittrattati b'0 μM, 60 μM, jew 80 μM Echinacoside għal 5 sigħat, 12-il siegħa jew 24 siegħa, maħsula darbtejn f'PBS u mbagħad inkubati b'JC-1 għal 20 minuta. L-immaġini ttieħdu bl-użu ta’ mikroskopju fluworexxenti Olympus.

Analiżi statistika

Analiżi statistika saret bl-użu GraphPad Prism Software. Is-sinifikat ġie kkalkulat bl-użu ta' analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda, u P0.05 tqieset statistikament sinifikanti. Ir-riżultati ġew espressi bħala medja ± devjazzjoni standard.

Riżultati

Identifikazzjoni ta 'Echinacoside bħala inibitur MTH1

Biex infittxu komposti naturali li kapaċi jinibixxu MTH1, użajna r-reazzjoni enżimatika katalizzata MTH1-bħala prestazzjoni għolja fl-assaġġ ta' screening Vitro. Minbarra nukleotidi purini ossidizzati, MTH1 jista 'wkoll idrolizza deoxyguanosine triphosphate normali biex jiġġenera deoxyguanosine monophosphate u pirofosfat. Fil-preżenza ta 'pirofosfatasi inorganiċi żejda, il-pirofosfati kollha huma kkonvertiti f'fosfati inorganiċi, li jistgħu jiġu kkwantifikati bl-użu ta' assaġġ ta 'assorbiment ibbażat fuq l-aħdar tal-malakite,41 u b'hekk jippermetti kejl indirett ta' attività MTH1. effett ta '(S)-crizotinib, kompost b'potenza ppruvata bħala inibitur MTH1.33 Ir-riżultat wera li (S)-crizotinib tabilħaqq inibixxa b'mod qawwi MTH1 (Figura 1A) b'IC50 ta' 500 nM, li kien seba' darbiet ogħla minn dak irrappurtat minn Huber et al (72 nM).33 Dan x'aktarx kien minħabba d-differenzi fil-metodi ta 'skoperta jew sorsi ta' kimiċi u enzimi. Aħna adottajna approċċ kromoġeniku inqas sensittiv, filwaqt li Huber et al użaw metodu bijoluminixxenti sensittiv ħafna.33 Waqt li nżommu dan f'moħħna, eżaminajna 12-il kompost naturali disponibbli kummerċjalment (Tabella S1), li kull wieħed minnhom huwa ingredjent ewlieni ta 'ħxejjex tradizzjonali b'potenzal kontra t-tumur. attività. Echinacoside, kompost purifikat mill-pjanta mediċinali parassitika Cistanche salsa (Figura 1C), inibixxi b'mod sinifikanti r-reazzjoni (Figura 1B), b'IC50 ta '7.01±2.13 μM (Figura 1D). Iż-żieda ta '50 darba aktar pirofosfatażi ma kellha l-ebda impatt fuq ir-riżultat filwaqt li żżid ħames darbiet aktar proteina MTH1 naqqset b'mod sinifikanti l-grad ta' inibizzjoni, li tissuġġerixxi li Echinacoside inibixxi speċifikament l-attività ta 'MTH1 fl-assaġġ enżimatiku in vitro.

Echinacoside inibixxa MTH1 ċellulari biex iżid 8-oxoG intraċellulari

Sussegwentement, staqsejna jekk Echinacoside jistax jinibixxi l-attività intraċellulari MTH1. L-inibizzjoni ta' MTH1 ċellulari se żżid 8-oxoG intraċellulari. Avidin intwera li jorbot ma' 8-oxoG b'ispeċifiċità għolja;42 għalhekk, użajna tbajja immunofluworexxenti b'avidin konjugat Cy{3- biex inqabblu l-livelli intraċellulari 8-oxoG f'diversi linji taċ-ċelluli tal-kanċer qabel u wara trattament Echinacoside. Osteosarkoma MG-63 tal-bniedem, epatokarċinoma SK-HEP-1, kanċer tas-sider MCF{{1{0}}, u ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum SW480 ġew ittrattati b'0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, jew 80 μM Echinacoside għal 5 sigħat, 12-il siegħa jew 24 siegħa. Tbajja b'Cy3-avidin konjugat żvela li t-trattament b'60 μM Echinacoside għal 24 siegħa żied b'mod ċar u sinifikanti l-livell ta' 8-oxoG ċellulari (sustanza reattiva Cy{3-avidin) f'dawn iċ-ċelloli tal-kanċer ( Figura 2A u B). Konċentrazzjoni ogħla (80 μM) ta 'Echinacoside irriżulta fi tbajja ċellulari 8-oxoG aktar b'saħħitha (Figura 2B), li tissuġġerixxi relazzjoni doża-rispons. Riżultati simili nkisbu permezz ta’ tbajja’ immunofluworexxenti b’antikorp monoklonali tal-ġurdien anti-8-oxoG (Figura S1A).43 Il-konċentrazzjoni ta’ Echinacoside (60 μM) meħtieġa għal żieda sinifikanti fl-8-oxoG ċellulari kienet ħafna ogħla minn l-IC50 (7.01 μM) mill-assaġġ in vitro. Dan x'aktarx kien minħabba d-differenza fis-sensittività taż-żewġ analiżi. Tbajja immunofluworexxenti hija ferm inqas sensittiva mill-assaġġ enżimatiku in vitro; barra minn hekk, in-numru ta 'molekuli inibitur li jistgħu jilħqu u jinteraġixxu ma' MTH1 ċellulari huwa influwenzat minn proċessi bijoloġiċi kumplessi; barra minn hekk, fl-assaġġ in vitro, id-dGTP inqas favorit jintuża bħala s-sottostrat, u għalhekk jista 'jkun aktar faċli (tieħu inqas inibituri) li jinibixxi MTH1, li jirriżulta f'IC50 aktar baxx fl-assaġġ in vitro.

{{0}}oxoG ċellulari huwa ġġenerat minn ROS, li huwa antagonizzat minn antiossidanti. Għalhekk, żieda fl-ROS ċellulari jew soppressjoni tal-attività tal-antiossidanti tirriżulta wkoll f'żieda fil-livell ċellulari 8-oxoG. Echinacoside innifsu huwa antiossidant qawwi44,45 u għalhekk għandu jsaħħaħ aktar milli jrażżan l-attività tal-antiossidanti. Biex teżamina jekk il-livell ta 'ROS ċellulari nbidilx bit-trattament ta' Echinacoside, l-istess ċelluli tal-kanċer ġew ittrattati b'0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, jew 80 μM Echinacoside għal 5 sigħat, 12-il siegħa jew 24 siegħa u mbagħad analizzati bil-fluss ċitometrija wara t-tebgħa bis-sonda fluworexxenti 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate. Ir-riżultati wrew li l-ebda wieħed minn dawn it-trattamenti ma biddlet il-livell ROS ċellulari (Figura 2C u D). Għalhekk, il-livell ta' 8-oxoG ċellulari miżjuda x'aktarx irriżulta mill-inibizzjoni ta' MTH1 minn Echinacoside.

L-echinacoside ikkawża ħsarat estensivi fid-DNA speċifikament fiċ-ċelloli tal-kanċer. u l-lakuni huma ssiġillati b'mekkaniżmi ta' tiswija li jinvolvu l-mili tal-vojt u l-ligazzjoni minn DNA polymerases u ligases.46,47 Madankollu, żidiet mgħaġġla fl-SSB ċellulari jistgħu jissaturaw il-kapaċità ta 'tiswija ċellulari, li jwasslu għall-formazzjoni ta' diversi breaks tad-DNA bi strand doppju (DSB)18 u Sinjali DDR. Biex neżaminaw jekk iż-żieda indotta minn Echinacoside f'8-oxoG ċellulari ikkawżatx ħsarat fid-DNA, eżaminajna wieħed mill-markaturi bikrija tal-ħsara fid-DNA, 53BP1, li jorbot ma' siti ta' DSB bħala l-aktar rispons ċellulari bikri għal DSB.48 L-MG -63, SK-HEP-1, MCF-7, u linji taċ-ċelluli tal-kanċer SW480 u l-linji taċ-ċelluli mhux tal-kanċer fwied normali uman L-O2,49 kliewi embrijoniku uman HEK 293, u fibroblast tal-ġurdien NIH /3T3 ġew ittrattati b'0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, jew 80 μM Echinacoside għal 5 sigħat, 12-il siegħa jew 24 siegħa. L-immunostaining fluworexxenti wera li t-trattament b'60 μM Echinacoside għal 24 siegħa speċifikament żied in-numru ta 'ċelluli b'ħames fokusi nukleari 53BP1 imtebba' b'mod qawwi jew aktar fil-kanċer kollu iżda mhux f'xi waħda mil-linji taċ-ċelluli mhux tal-kanċer (Figura 2E u F). Żieda sinifikanti fin-numru ta 'ċelluli 53BP1 plus dehret sa 5 sigħat wara l-bidu tat-trattament ta' Echinacoside (Figura 2F). Konċentrazzjoni ogħla (80 μM) ta 'Echinacoside jew ħin itwal ta' trattament (12-il siegħa u 24 siegħa) irriżultaw f'żidiet akbar kemm fin-numru ta 'ċelluli 53BP1 flimkien ma' (Figura 2F) kif ukoll fin-numru ta 'fokus ċellulari 53BP1. Flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-inibizzjoni ta 'MTH1 minn Echinacoside ikkawżat 8-akkumulazzjoni ta' oxo u ħsarat estensivi fid-DNA fil-kanċer iżda mhux fiċ-ċelloli mhux tal-kanċer.

Echinacoside irażżan il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer

Fiċ-ċelluli taċ-ċikliżmu, waqfiet tal-fergħat tad-DNA mhux imsewwija se jikkawżaw kollass tal-frieket tar-replikazzjoni tad-DNA, li mbagħad iwassal għal imblukkar tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli bl-induzzjoni ta 'arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli u apoptożi.50 Biex tivverifika l-effetti ta' Echinacoside fuq it-tkabbir u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, aħna l-ewwel. analizzat it-tkabbir taċ-ċelloli tal-kanċer MG-63, SK-HEP-1, MCF-7, u SW480 ittrattati b'Echinacoside permezz ta' analiżi tal-formazzjoni tal-kolonji. Ir-riżultati wrew li ċ-ċelloli tal-kanċer ittrattati b'60 μM jew 80 μM Echinacoside ffurmaw ħafna inqas kolonji, u l-kolonji li ffurmaw kienu ħafna iżgħar (Figura 3A u B), li jindikaw potenzjal ta 'tkabbir imrażżan ħafna. Sussegwentement, analiznajna l-proliferazzjoni ta 'dawn iċ-ċelluli tal-kanċer, flimkien maċ-ċelloli L-O2, HEK 293, u NIH/3T3 mhux tal-kanċer permezz ta' analiżi MTT. Ir-riżultati wrew li Echinacoside inibixxi l-proliferazzjoni tal-kanċer iżda mhux iċ-ċelluli noncancer (Figura 3C). Studju ta 'żmien ta' ċelluli tal-kanċer ittrattati b'60 μM Echinacoside wera li wara 5 sigħat, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti bejn nontreatment u gruppi ta 'trattament, iżda wara 12-il siegħa, il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kanċer kienet inibita b'mod sinifikanti minn 60 μM Echinacoside (Figura 3D).

Echinacoside indotta arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli

Skont l-osservazzjonijiet dwar it-tkabbir u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, l-analiżi Western blot wriet li trattament ta’ 24 siegħa b’60 μM u 80 μM Echinacoside żied b’mod sinifikanti l-livell tal-proteina tal-imblokkatur G1 /S-CDK u l-inibitur tas-sintesi tad-DNA p21Cip/ WAF1 fiċ-ċelloli tal-kanċer MG-63, SK-HEP-1, MCF-7, u SW480 (Figura 4A u B). Barra minn hekk, simili għal 53BP1, żieda sinifikanti fil-livell tal-proteina p21 dehret sa 5 sigħat wara l-bidu tat-trattament Echinacoside (Figura 4B). Analiżi tan-numru ta 'ċelluli fi stadji differenti taċ-ċiklu taċ-ċelluli permezz ta' ċitometrija tal-fluss wriet li t-trattament ta 'Echinacoside naqqas id-doża b'mod dipendenti fuq il-perċentwal ta' ċelluli kemm fil-fażijiet S u G2 / M, filwaqt li l-perċentwal ta 'ċelluli fil-fażi G1 żdied (Figura 4C u D). Wara trattament ta' 80 μM Echinacoside ta' ċelloli MG-63 għal 24 siegħa, iċ-ċelloli fil-fażi G2 / M naqsu minn 15 fil-mija għal kważi żero, u ċ-ċelloli fil-fażi S naqsu minn 37 fil-mija għal 17 fil-mija, filwaqt li ċ-ċelloli fil-G0/ Fażi 1 żdiedet minn 43 fil-mija għal 80 fil-mija (Figura 4E). Dawn ir-riżultati jindikaw li t-trattament b'Echinacoside indotta l-arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli u mblokka ċ-ċelloli tal-kanċer fil-fażi G1.

Echinacoside indotta apoptożi fiċ-ċelloli tal-kanċer

B'konsistenza mal-osservazzjonijiet dwar il-proliferazzjoni taċ-ċelluli, l-analiżi Western blot wriet li t-trattament b'60 μM u 80 μM Echinacoside għal 24 siegħa żied il-livelli ta' caspase attiva-3 u proteini polimerażi poli (ADP-ribose) qasmu f' iċ-ċelloli tal-kanċer (Figura 5A u B), li jissuġġerixxu induzzjoni ta 'apoptożi dipendenti fuq caspase. Imbagħad eżaminajna diversi markaturi ċellulari ta 'apoptożi. L-ewwel, il-morfoloġija nukleari taċ-ċelluli tal-kanċer ittrattati b'Echinacoside ġiet żvelata permezz ta 'tbajja' biż-żebgħa tad-DNA DAPI, li wriet li trattament ta' 24 siegħa b'60 μM u 80 μM Echinacoside żied in-numru ta 'karatteristiċi ta' apoptożi, inklużi pyknosis u kromatin ikkondensat (nuklei aktar qawwi). ) (Figura 5C). It-tieni, id-DNA estratt minn ċelluli tal-kanċer ittrattati bl-istess mod ġie analizzat permezz ta 'elettroforeżi fuq ġel agarose, li żvela mudell ta' sellum apoptotiku tipiku (Figura S1B). Fl-aħħarnett, caspase attiva ċellulari-3 ġiet skoperta permezz ta 'tbajja' immunofluworexxenti, li żvelat sinjali qawwija ta' caspase attivat-3 f'ċelloli tal-kanċer ittrattati b'Echinacoside (Figura S1C). Sussegwentement, il-perċentwal ta 'ċelluli apoptotiċi tkejjel b'Annexin V-FITC u PI double tbajja u ċitometrija tal-fluss. Analiżi ta’ ċelloli ttrattati b’0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM, jew 160 μM Echinacoside għal sagħtejn, 5 sigħat, 12-il siegħa, jew 24 siegħa wriet li 60 μM jew konċentrazzjonijiet ogħla ta’ Echinacoside indott f’apoptożi sinifikanti iċ-ċelloli tal-kanċer MG-63, SK-HEP-1, MCF{-7, u SW480 (Figura 6A), iżda mhux fiċ-ċelloli L-O2, HEK 293, u NIH/3T3 mhux tal-kanċer (Figura S2). Wara t-trattament ta 'ċelloli MG-63 b'60 μM, 80 μM, jew 160 μM Echinacoside għal 24 siegħa, il-perċentwal ta' ċelluli apoptotiċi żdied minn 8.89 fil-mija għal 33.72 fil-mija, 39.01 fil-mija u 48.12 fil-mija, rispettivament (Figura 6A) . L-istudju tal-kors tal-ħin wera li wara 5 sigħat, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti bejn gruppi ta 'nuqqas ta' trattament u ta 'trattament, iżda apoptożi sinifikanti dehret wara t-trattament b'60 μM jew konċentrazzjonijiet ogħla ta' Echinacoside għal 12-il siegħa (Figuri 6B u S3).

Fl-aħħarnett, il-kejl tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali miż-żebgħa fluworexxenti JC-1 wera b'mod ċar telf prominenti tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali wara trattament b'60 μM Echinacoside għal 12-il siegħa (Figura 6C), iżda mhux wara 5 sigħat, li jindika l-attivazzjoni ta ' il-mogħdija tal-apoptosi intrinsika wara l-ħsarat fid-DNA kkawżati minn 8-oxodG elevat.