Riċetturi Distinttivi li jixbħu Toll Espressjoni tal-ġeni u Rispons Gliali f'Reġjuni tal-Moħħ differenti ta' Scrapie Naturali Parti 3

Aħna investigajna l-korrelazzjonijiet possibbli bejn il-karatteristiċi newropatoloġiċi tal-marda tal-prion u l-espressjoni tal-ġeni TLR f'erba 'reġjuni differenti tal-moħħ ta' nagħaġ infettati b'mod naturali bl-iscrapie. Fl-erba' żoni tal-moħħ, osservajna differenzi sinifikanti f'PrPScdeposition, spongiosis, astrogliosis, u microgliosis fin-nagħaġ infettati b'mod naturali kontra n-nagħaġ tal-kontroll.

Il-marda tal-prion, magħrufa wkoll bħala marda tal-ġust tat-tempju, marda li tiekol ix-xama', eċċ., hija infezzjoni virali akuta kkawżata minn prioni. Il-marda hija trasmessa prinċipalment billi tiekol ikel mhux imsajjar li fih il-prioni. Ladarba jiġi infettat bil-prioni, jista 'jikkawża infjammazzjoni tal-moħħ u ħsara fis-sistema nervuża, u jistgħu jseħħu sintomi bħal uġigħ ta' ras, rimettar u deni.

Madankollu, meta niltaqgħu ma 'sitwazzjoni bħal din, ma nistgħux nitilfu l-fiduċja fil-memorja tagħna minħabba l-eżistenza tal-marda tal-prion. Ħafna nies infettati jistgħu jirkupraw u jirrestawraw il-memorja tagħhom wara t-trattament.

Naturalment, minn perspettiva preventiva, nistgħu nippruvaw nieklu aktar ikel imsajjar biex nevitaw l-infezzjoni tal-prioni. Fl-istess ħin, jekk tħoss xi sintomi, għandek ukoll tara tabib kemm jista 'jkun malajr biex tevita li l-marda tmur għall-agħar.

Fil-ħajja ta 'kuljum, nistgħu nippruvaw xi taħriġ tal-memorja sempliċi, bħal qari, kumpilazzjoni ta' listi, organizzazzjoni ta 'avvenimenti u informazzjoni, eċċ biex intejbu l-memorja tagħna. Dan it-taħriġ ma jeħtieġx ħafna ħin u enerġija, iżda huma importanti ħafna għaż-żamma ta 'moħħ b'saħħtu u funzjoni effettiva tal-memorja.

Fil-qosor, meta niltaqgħu ma 'mard bħall-marda tal-prion, għandna niffaċċjawha b'mod pożittiv, infittxu trattament mediku professjonali u miżuri preventivi, u nagħtu attenzjoni għal eżerċizzji ta' memorja ta 'kuljum biex niżguraw is-saħħa fiżika tagħna u x-xogħol effiċjenti. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja minħabba li jista 'wkoll jirregola l-bilanċ ta' newrotrasmettituri, bħal żieda fil-livelli ta 'acetylcholine u fatturi ta' tkabbir, li huma importanti ħafna għall-memorja u t-tagħlim. Barra minn hekk, Cistanche jista 'wkoll itejjeb il-fluss tad-demm u jippromwovi l-kunsinna tal-ossiġnu, li jista' jiżgura li l-moħħ jikseb biżżejjed nutrizzjoni u enerġija, u b'hekk itejjeb il-vitalità u r-reżistenza tal-moħħ.

Ikklikkja taf modi biex ittejjeb il-funzjoni tal-moħħ

Dawn id-differenzi kienu l-aktar evidenti fil-medulla oblongata, l-aktar caudalarea. B'kuntrast, l-aktar leżjonijiet ħfief kienu osservati fil-kortiċi ta 'quddiem, l-aktar żona rostral. Dan il-mudell sekwenzjali huwa taqbel mar-rotta tan-newroinvażjoni tal-prion u d-disseminazzjoni fis-CNS, li tibda fis-siti tad-dħul fis-sinsla tad-dahar u l-obex u fl-aħħar tilħaq il-kortiċi frontali [1,5,51].

B'mod mhux mistenni, meta wieħed iqis il-prossimità anatomika tagħhom, osservajna tnaqqis drastiku fid-depożizzjoni u l-vakuolizzazzjoni ta 'PrPSc, u tnaqqis sinifikanti fl-astrogliosis, meta nimxu mit-thalamus għall-ippokampus, mhux wara l-progressjoni gradwali caudo-rostral tal-patoloġija.

Mikrogliamorfoloġija speċifika magħrufa bħala virga microglia ġiet osservata fil-viċin ta 'cellneurons piramidali f'CA3 iżda kienet assenti mir-reġjuni newroanatomiċi l-oħra kollha studjati.

L-għarfien tagħna, dan il-profil mikrogliali ma ġiex assoċjat ma 'newroinfjammazzjoni attivata minn prioni sal-lum, għalkemm studju reċenti rrapporta l-preżenza ta' mikroglia f'forma ta 'virga fiċ-ċerebellum ta' pazjenti umani b'CJD [52].

Għalkemm ftit li xejn ġew studjati mill-ewwel deskrizzjonijiet fl-1900s, il-mikroglia tal-vireg ġew irrappurtati reċentement f'mard newroloġiku bħal epilessija, dimenzja tal-ġisem Lewy, marda ta 'Huntington, u AD, speċifikament f'żoni moderatament bil-ħsara tal-kortiċi ċerebrali u l-ippokampus [40,41,53]. L-espressjoni fenotipika u l-funzjonijiet tal-mikroglia tal-virga għadhom mhumiex ċari.

Madankollu, il-fatt li din il-karatteristika morfoloġika tipikament tikkoinċidi mal-preżenza ta 'elementi newronali li huma mħassra jew vulnerabbli għall-ħsara jissuġġerixxi rwol newroprotettiv [42,54,55].

Il-mikroglia tal-virga mhumiex maħsuba li huma assoċjati ma 'leżjonijiet severi, peress li l-progressjoni lejn il-morfoloġija ameboid hija mistennija f'dawn il-kundizzjonijiet [56]. Il-preżenza ta 'rodmicroglia fl-ippokampus ta' nagħaġ infettati bl-iscrapie, iżda mhux f'reġjuni oħra tal-moħħ, tista 'tkun indikattiva ta' ambjent newroprotettiv, bi qbil tajjeb mat-telf newronali limitat osservat f'dan il-qasam.

L-analiżi tagħna tal-espressjoni TLR tiżvela korrelazzjoni diretta bejn is-severità tal-leżjoni u l-espressjoni żejda tal-ġene TLR li tikkoinċidi mal-progressjoni caudo-rostral imsemmija hawn fuq tan-newropatoloġija tal-prion.

Bil-maqlub, TLR4 kien espress iżżejjed b'mod simili fl-oqsma kollha, irrispettivament mis-severità tal-leżjoni. L-espressjoni żejda ta 'TLR4 f'żoni ta' ħsara newronali aktar ħafifa (jiġifieri, l-ippokampus u l-kortiċi frontali) tista 'tirrifletti rwol anewroprotettiv, kif deskritt qabel għal ċelluli fagoċitiċi bħal makrofaġi u mikroglia [23,57]. Ir-regolazzjoni 'l fuq ta' TLR7 ġiet irrappurtata qabel f'mudelli tal-ġrieden ta ' priondise u pazjenti umani [22,26,31].

Aħna osservajna biss ir-regolazzjoni 'l fuq ta' TLR7 fil-medulla oblongata, iż-żona l-aktar bil-ħsara li fiha nstabu l-ogħla livelli ta 'depożizzjoni ta' spongiosis u PrPSc.

Il-mewt newronali permezz tal-apoptożi kienet preċedentement assoċjata mal-istimulazzjoni TLR7 [58,59], u l-espressjoni żejda tagħha fil-medulla oblongata tista 'tkun relatata ma' dan il-mekkaniżmu [60]. Għalkemm ir-rwol ta 'TLR1 f'mard newrodeġenerattiv għadu mhux ċar, l-involviment ta' TLR2 fl-attivazzjoni tal-mikroglia ġie muri dejjem aktar fl-isklerożi laterali amiotrofika, MS, u AD [61,62].

Filwaqt li r-rwol tal-mard tal-prion TLR2in mhux mifhum bis-sħiħ, ġew proposti effetti ta 'benefiċċju: iż-żmien tas-sopravivenza jitnaqqas fil-ġrieden li ma jesprimux TLR2 wara inokulazzjoni intraċerebrali bi scrapie [22].

TLR2 u MyD88 espressjoni żejda tista 'tkun indikattiva wkoll ta' fenotip proinflammatorymicroglia, li jista 'jispjega ż-żieda fit-TNF- u IL-6 li aħna osservat fit-thalamus [8,63].

Interessanti, esperimenti li jużaw ċelluli EOC 13.31, linja taċ-ċelluli tal-ġurdien immortalizzata simili għall-microglia, urew disregolazzjoni tal-passaġġ tar-rispons infjammatorju b'reazzjoni għall-attivazzjoni ta 'TLR2 u ssuġġerew rabta bejn l-espressjoni ta' TLR2 u l-akkumulazzjoni ta 'mikroglia fi stat mhux ottimali għall-fagoċitożi [26] .

Għalhekk, l-espressjoni żejda ta 'TLR2 fil-medulla oblongata u t-thalamus, l-aktar żoni bil-ħsara li fihom instabu wkoll livelli eċċessivi ta' mikroglia fagoċitika, tissuġġerixxi li t-tneħħija mhux funzjonali ta 'PrPSc tista' twassal għal akkumulazzjoni sostnuta ta 'PrPSc u ħsara newronali [9,17].

Is-sejbiet tagħna fl-ippokampus ta 'nagħaġ infettati bl-iscrapie jiżvelaw mudell oppost meta mqabbel ma' żoni oħra tal-moħħ analizzati, bir-regolazzjoni 'l isfel ta' TLR1, TLR2, u MyD88 u l-ebda alterazzjoni taċ-ċitokini.

Dan jista 'jindika li l-mikroglia jirrispondu b'mod differenti fl-ippokampus; tabilħaqq, intwera li d-defiċjenza ta’ TLR2 f’kulturi ta’ ċelluli microgliali primarji, minn ġrieden tat-twelid (0–3 ijiem) u stimulata b’newrotoxicpeptide PrP106-126, tbiddel l-attivazzjoni mikrogliali minn newrotossiku għal fenotip newroprotettiv [63 ].

Madankollu, ir-rilevanza tal-peptide PrP106-126 fil-patoloġija tal-prion ġiet mistoqsija [64]. CD36 huwa tip differenti ta 'riċettur ta' rikonoxximent tal-mudell, kapaċi jagħraf ligandi derivati ​​b'mod endoġenu bħal peptidi li jiffurmaw l-amilojdi, li stabbilixxa rwoli fl-assorbiment endoċitiku ta 'dawk il-komponenti [65,66]. Dan ir-riċettur ġie assoċjat ma' status mikrogliali proinfjammatorju [67].

In vitro, l-istimulazzjoni taċ-ċelluli BV-2, tip ta' ċellula mikrogliali immortalizzata, bi PrP106-126 tirriżulta f'regolazzjoni 'l fuq ta' CD36, żieda ta' ċitokini proinfjammatorji u produzzjoni ta' iNOS u NO [68,69].

Barra minn hekk, ir-rikonoxximent ta '-amyloid peptide minn CD36 jqajjem l-assemblaġġ ta' kumpless eterotrimeriku ġdid CD36-TLR4-TLR6 li jattiva r-rispons immuni intrinsiku [70,71].

Fl-istudju tagħna, ir-reġjuni kollha wrew upregulation sinifikanti ta 'CD36 ħlief l-hippocampus. Ir-regolamentazzjoni 'l fuq ta' CD36, TLR4, u TLR6 fl-aktar żoni bil-ħsara, il-medulla oblongata u l-obex, tissuġġerixxi l-involviment ta 'din it-trijade biex tiskatta status mikrogliali pro-infjammatorju b'rispons għal infezzjoni prion.

Bil-maqlub, in-nuqqas ta 'espressjoni żejda CD36 u TLR6 fl-ippokampus tissuġġerixxi li dan l-eterotrimer mhuwiex iffurmat, indikattiv għal darb'oħra ta' ambjent anewroprotettiv f'dan ir-reġjun tal-moħħ.

Għad irid jiġi spjegat għaliex il-mikroglia jirrispondu b'mod differenti f'dan ir-reġjun tal-moħħ. Filwaqt li t-tropiżmu taċ-ċelluli speċifiċi għar-razza tal-prion jista 'jiddetermina l-mudell ta' mikrogliożi u astrogliożi, sejbiet reċenti jissuġġerixxu li ż-żewġ reazzjonijiet huma influwenzati prinċipalment mir-reġjun tal-moħħ [18,72].

La l-mikroglia u lanqas l-astroglia ma jirrispondu b'mod uniformi fis-CNS, u dan ir-rispons speċifiku għar-reġjun jista 'jirriżulta fil-vulnerabbiltà selettiva ta' xi reġjuni tal-moħħ f'mard prijoniku [16,18].

F'dan ir-rigward, ġie postulat li r-rispons infjammatorju tal-mikroglia għall-infezzjoni tal-prion huwa rregolat mis-sialylation ta 'PrPSc [14,73-75] u li s-sialylation ta' PrPSc hija dipendenti mir-reġjun tal-moħħ [18]. Speċifikament, jinstab livell ogħla ta 'sialylation ta' PrPSc fl-ippocampus u l-kortiċi milli fit-thalamus u l-brainstem, li jissuġġerixxi rwol potenzjali fil-vulnerabbiltà selettiva ta 'dawn ir-reġjuni tal-moħħ [18,73,75].

Il-livell għoli ta 'sialylation PrPSc fl-ippokampus jista' jkun assoċjat ma 'replikazzjoni deceleratedprion, li jwassal għall-attivazzjoni distintiva microglial indotta mill-prion f'dan ir-reġjun, konsistenti mas-suxxettibilità mnaqqsa ta' dan ir-reġjun implikata mis-sejbiet tagħna.

Interessanti, sejbiet preċedenti jissuġġerixxu li l-ippokampus jista 'jiġi protett min-newrotossiċità tal-prion f'infezzjoni naturali ta' CJD [76,77], u studji newropatoloġiċi dettaljati ta 'każijiet ta' CJD irrappurtaw leżjonijiet aktar ħfief fl-ippokampus milli f'reġjuni oħra tal-moħħ [76].

Speċifikament, l-arkikortex, li primarjament jinkludi l-hippocampus, jidher li huwa relattivament meħlus meta mqabbel ma 'reġjuni kortikali oħra f'CJD [77]. Dan l-involviment ħafif ta' l-ippokamp deskritt f'CJD naturali huwa taqbel mas-sejbiet preżenti fin-nagħaġ infettati b'mod naturali bl-iscrapie.

Interessanti, din il-protezzjoni parzjali kontra mill-inqas żewġ mard prion naturali sseħħ fl-ippokampus, li huwa filoġenetikament l-eqdem reġjun tal-kortiċi ċerebrali u jikkonsisti mill-aktar tip bażiku ta 'tessut kortiku.

Se jkunu meħtieġa aktar studji biex jesploraw ir-rilevanza ta’ din il-korrelazzjoni.Fil-qosor, ir-riżultati tagħna jiżvelaw newropatoloġija partikolarment ħafifa fl-ippokampus ta’ nagħaġ infettati bl-iscrapie naturali, ikkaratterizzat minn livelli aktar baxxi ta’ sponġjożi, PrPScdeposition, u astrogliosis milli mistenni minħabba l-kawdal-to. -tixrid rostrali ta 'scrapielesions.

Barra minn hekk, il-preżenza fl-ippokampus ta’ morfoloġija mikrogliali esklussiva, microglia tal-virga, li jista’ jkollha rwol newroprotettiv [54], flimkien ma’ profil ta’ espressjoni tal-ġeni ta’ riċettur distint ta’ rikonoxximent tal-mudell (ġeni TLR u CD36), tiddistingwi aktar dan ir-reġjun tal-moħħ minn dak newroanatomic ieħor. reġjuni fin-nagħaġ naturali infettati bl-iscrapie.

Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu grad ta 'newroprotezzjoni kontra l-infezzjoni tal-prioni naturali fl-ippokampus li jistħoqqlu investigazzjoni ulterjuri. newroinfjammazzjoni.

L-interruzzjoni ta 'dan iċ-ċiklu vizzjuż billi timmira l-attivazzjoni tal-mikroglia bl-użu ta' inibituri speċifiċi ta 'TLR fi stadju speċifiku tal-marda tista' tikkostitwixxi approċċ promettenti biex tillimita aktar newroinfjammazzjoni. Is-sejbiet tagħna jenfasizzaw ir-regolazzjoni baxxa ta 'TLR2 bħala mira potenzjali għal tali approċċ, peress li dan jista' jinduċi bidla fil-mikroglia minn fenotip newrotossiku għal anewroprotettiv [63].

Fl-aħħarnett, filwaqt li sar progress kbir fil-karatterizzazzjoni tad-diversità tal-glialphenotypes bl-użu ta 'mudelli tal-ġrieden ta' mard newrodeġenerattiv, jekk mudelli tal-ġrieden jirriflettux fedelment aspetti ewlenin tal-mard tal-prioni hija kwistjoni ta 'xi dibattitu [78,79].

Ir-riżultati tagħna fil-mudell transġeniku tg338 irriproduċu s-sinjali patoloġiċi komuni ta 'infezzjoni tal-prion, inkluża depożizzjoni mmarkata ta' PrPSc, spongiosis newropil, astrogliosis u mikrogliożi.

Madankollu, ġrieden infettati wrew espressjoni żejda sinifikanti ta 'TLR1 u TLR2 u tendenza lejn espressjoni żejda ta' TLR7. Filwaqt li l-upregulation ta 'dawn il-ġeni ġiet deskritta preċedentement f'mudelli oħra tal-ġrieden infettati bl-iscrapie [22,26], dan il-mudell jikkuntrasta mas-sejbiet tagħna fil-moħħ ovin. B'mod notevoli, fil-moħħ tal-ġurdien, ma osservajna l-ebda alterazzjoni fl-espressjoni ta 'TLR4, il-ġene li għaliha l-akbar espressjoni ta' tibdiliet ġew osservati fil-kampjuni tan-nagħaġ.

Dawn is-sejbiet konfliġġenti jistgħu jkunu konsegwenza tar-rotot differenti ta 'infezzjoni u/jew il-livelli ta' espressjoni tal-proteina prion fil-ġrieden tg338 [80,81]. Madankollu, ir-riżultati tagħna fl-aħħar mill-aħħar jindikaw li l-intracerebralinokulazzjoni ta 'scrapie fil-ġrieden tg338 ta' daqs kbir ma tirriproduċix ir-rispons immuni osservat f'infezzjoni naturali ta 'scrapie.

4. Materjali u Metodi

4.1. Nagħaġ Infettati bl-Iscrapie u Kontroll

Wieħed u għoxrin nagħġa mara Rasa Aragonesa (ta’ bejn 2–6 snin) ġew inklużi fl-istudju preżenti. Kollha ġew ġenotipati għal polimorfiżmi PRNP, kif irrappurtat qabel [82], u nstabu li juru ġenotip ARQ/ARQ. Annimali ta' kontroll (n=8) intgħażlu minn qatgħa li fiha ma kienu rrappurtati l-ebda każijiet ta' scrapie.

Annimali infettati bl-iscrapie (n=13) inkisbu minn qatgħat milquta mill-iscrapie u kienu ġew iddijanjostikati mill-immunoistokimika (IHC) ta' bijopsiji tal-mukoża tar-rektum. L-infezzjoni kienet ikkonfermata permezz ta' immunodetection post-mortem ta' PrPSc fl-obex wara kriterji ppubblikati [83].

L-annimali ġew ewtanizzati b'doża eċċessiva ġol-vini ta' barbiturati u ssangwiment.

Fiż-żmien tal-ewtanasja, in-nagħaġ kollha infettati bl-iscrapie wrew sinjali kliniċi ta’ severità diversa: xi annimali wrew sinjali inċipjenti bħal ħakk tad-dahar u tal-ġnub wara stimulazzjoni diġitali u tnaqqis ħafif tal-kundizzjoni tal-ġisem, filwaqt li oħrajn wrew sinjali kliniċi avvanzati bħal grif spontanju tal-ġisem. għerq tad-denb, żona lumbari, u riġlejn, sinjali newroloġiċi inklużi atassja u rogħda tar-ras, u tħin tas-snien, telf ta 'suf, u telf ta' piż intens [84].

4.2. Infezzjoni ta 'Tg338 Mouse

Biex tevalwa l-espressjonijiet tal-ġeni TLR fil-moħħ ta’ mudell murini ta’ scrapie, ġrieden tg338 ta’ għaxar ġimgħat (n=8) (li jesprimu żżejjed l-ovini VRQ/VRQ PrPC 8- għal 10-darbiet [ 85]) ġew imlaqqma b'ġabra ta' moħħ minn nagħaġ Rasa Aragonesa naturali infettati bl-iscrapie sagrifikati fl-istadju kliniku.

Il-ġrieden ġew imlaqqma b'20 uL tal-inoculum tal-iscrapie (dilwit 2% w/v f'PBS) fl-emisfera ċerebrali tal-lemin taħt anestesija isoflurane. Injezzjonijiet intraċerebrali saru bl-użu ta' siringa ta' 50 µL u labra ta' 25G. Wara t-tilqim, theice ingħataw injezzjoni taħt il-ġilda ta' buprenorphine (0.3 mg/kg) biex tinduċi analġeżija.

Bħala kontrolli, ġrieden tg338 (n=8) ġew mlaqqma b'omoġenat tal-moħħ minn nagħaġ negattiv għall-iscrapie wara l-istess proċedura deskritta hawn fuq. Il-ġrieden ġew immonitorjati għall-iżvilupp ta 'sinjali kliniċi u ewtanizzati permezz ta' dislokazzjoni ċervikali meta dehru sinjali terminali ta 'mard bħal atassja severa u inkapaċità għall-għalf.

Ġrieden infettati bl-inoculum pożittiv għall-iscrapie wrew ħin medju ta' sopravivenza ta' 187 ± 26 dpi.

4.3. Ġbir tat-Tessuti

Inġabru kampjuni mis-CNS u nqasmu saġittament f'żewġ nofsijiet; wieħed kien iffissat f'10% newtra-buffered formalin għal analiżi istopatoloġika u immunoistokimika, u l-ieħor kien iffriżat direttament u miżmum f'-80 ◦C għall-analiżi tal-proteini jew stabbilizzat f'RNAlaterTM Solution (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) għall-estrazzjoni tal-RNA u mbagħad iffriżat u maħżun f'-80 ◦C.

4.4. Sekwenzar tal-PRNP

Id-DNA ġie estratt minn kampjuni tad-demm b'kit tal-Estrazzjoni tad-DNA tat-tessut Speedtools (Biotools, Madrid, Spanja) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-amplifikazzjoni u s-sekwenzjar tal-PCR saru kif deskritt qabel [82].

4.5. Immunoistokimika

Tessuti ffissati bil-formalina ġew ipproċessati skont proċeduri istopatoloġiċi standard. Is-sezzjonijiet tat-tessuti kienu inkorporati fil-paraffin, maqtugħin f'sezzjonijiet ħoxnin ta' 4 µm, u mtebbgħin b'ematoxylin-eosin (HE) għall-evalwazzjoni tal-vakuolazzjoni u l-isponġjożi tan-newropil.

L-IHC għall-iskoperta ta' PrPSc twettqet bl-użu tal-antikorp primarju monoklonali tal-ġurdien L42 fin-nagħaġ (dilwizzjoni 1:500 f'temperatura tal-kamra għal 30 min) (R-Biopharm, Darmstadt, il-Ġermanja) u l-antikorp poliklonali tal-fenek R486 fil-ġrieden (1: 8000 dilwizzjoni, matul il-lejl f'4 ◦C) (R. Jackman, mhux ippubblikat) kif deskritt qabel [86,87].

It-taqsimiet kienu wkoll soġġetti għal immunostaining konvenzjonali għall-proteina aċiduża fibrillari glial tal-markatur tal-astroċiti (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, id-Danimarka), u l-molekula tal-adattatur tal-kalċju jonizzat 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond) , VA, USA), skond il-protokolli ppubblikati [88].L-evalwazzjonijiet istoloġiċi u IHC kollha saru minn żewġ patoloġisti veterinarji blinded għad-dejta klinika.

Il-valutazzjonijiet tal-intensità tat-tbajja’ tal-isponġjożi u tal-PrPSc saru u ġew adattati b’mod semi-kwantitattiv skont il-kriterji deskritti fi studji preċedenti: il-vakuolazzjoni tan-newropil u l-perikarya kienet skurjata minn 0 (assenti) għal 5 (ħafna numerużi u konfluwenti) [51], is-sinjal PrPSc ġie kkwantifikat abbażi tal-firxa ta' immunotikkettjar minn 0 (l-ebda tikkettjar) għal 5 (tikkettjar uniformi intens) kif rappurtat qabel [89], u l-estent tal-immunotikkettjar GFAP u Iba1 ġie skurjat fuq skala li tvarja minn {{ 8}} sa 5 (0=tbajja dgħajfa; 5=immunotikkettar sostanzjali fir-reġjun kollu) kif deskritt [88]. Erba' reġjuni tal-moħħ ġew evalwati: thalamus (Th) tal-kortiċi frontali (Fc), formazzjoni tal-hippocampal (Hc), u medulla oblongata (Mo), u kull żona ġiet analizzata globalment għall-punteġġ u rappreżentata grafikament bħala medja ± żball standard.

4.6. Punent Blot

100 mg ta 'tessut tal-moħħ ta' kull żona tal-moħħ (Fc, Th, Hc, u Mo) minn 13-il nagħaġ infettati bl-iscrapie, 8 b'sinjali kliniċi avvanzati u 5 b'sinjali kliniċi inċipjenti, kienu omoġenizzati f'1 mL ta 'liżi buffer.

Hemiencephalons tat-8 ġrieden infettati u 8 ta' kontroll ġew omoġenizzati f'10% (w/v) f'liżi buffer. Il-kampjuni tat-tessuti kienu tubi tat-tħin omoġenizzati (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bl-użu ta’ omoġenizzatur TeSeEPrecess 48 TM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), u l-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet imkejla bl-użu tal-kit tal-PierceTM BCA Protein Assay (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Għall-analiżi PrPres, ammonti ugwali ta 'proteini minn omoġenati tat-tessut ġew inkubati għal 10 min f'37 ◦C b'soluzzjoni ta' proteinase K, kif deskritt qabel [90].

Il-kampjuni li rriżultaw ġew soġġetti għal elettroforeżi fi 12% CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) u ttrasferiti għal membrani PVDF li ġew imblukkati għal siegħa bi 2% ħalib niexef mingħajr xaħam f'TBST (Tris- buffered saline bi 0.1% Tween20).

Għal immunoblotting, il-membrani ġew inkubati matul il-lejl f'4 ◦C b'antikorp Sha31primary (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Franza) f'konċentrazzjoni ta '1 µg/mL segwita minn 1 siegħa inkubazzjoni f'temperatura tal-kamra (RT) b'horeradish peroxidase- antikorp sekondarju IgG kontra l-ġurdien konjugat (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA).

L-immunoreattività ġiet skoperta bl-użu tas-sottostrat kimiluminixxenti ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, il-Ġermanja). L-espressjoni tal-proteina TLR4 ġiet analizzata mill-omoġenati tat-tessuti mħallta ma '2 × Laemmli Sample buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur .

Erbgħin mikrogramma ta' proteina totali ġew mgħobbija għal kull bir, imħaddma f'7.5%CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), u ttrasferiti għal membrani PVDF, li mbagħad ġew imblukkati għal 2 sigħat b'4% albumina tas-serum bovin. (BSA)(Merck, Darmstadt, il-Ġermanja) f'TBST f'RT. Il-membrani ġew inkubati matul il-lejl f'4 ◦C b'antikorp poliklonali anti-TLR4 tal-fenek (Novus Biological, Minneapolis, MN, USA) f'konċentrazzjoni ta' 0.5 µg/mL, u mbagħad maħsula u inkubati b'IgG antifenek tal-mogħoż ( H + L) Antikorp sekondarju HRP (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) f'1:20,000 għal siegħa f'RT.

Blots ġew viżwalizzati kif deskritt hawn fuq. Sussegwentement, il-membrana ġew imqaxxra b'RestoreTM Western Blot Stripping buffer (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) għal 15-il minuta f'37 ◦C, maħsula, u mblukkata mill-ġdid.

Imbagħad, il-membrani ġew inkubati matul il-lejl f'4 ◦C b'antikorp primarju tal-ġrieden monoklonali -actin (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) f'1:1000, maħsula, u inkubati b'antikorp sekondarju m-IgGкBP-HRP kontra l-ġurdien (Santa Cruz Bijoteknoloġija, Dallas, TX, USA) għal siegħa. Wara l-ħasil, il-blots ġew żviluppati kif deskritt hawn fuq.

Id-densitometriji saru bis-softwer ImageJ u l-valuri ġew normalizzati bl-użu -actin. Il-valuri normalizzati kienu rappreżentati bil-GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, USA).

L-analiżi statistiċi biex jitqabblu l-gruppi infettati u ta' kontroll saru b'test t ta' Student, u l-ugwaljanza tal-varjanzi ġiet iddeterminata minn Levene'stest bl-użu tas-softwer SPSS (SPSS Statistics for Windows, Verżjoni 17.0, Chicago, IL, USA).Id-differenzi bejn il-gruppi tqiesu statistikament sinifikanti f'* p<0.05.

4.7. Estrazzjoni tal-RNA, Sintesi tal-cDNA, u Espressjoni tal-Ġene

L-RNA totali tan-nagħaġ ġie estratt minn 90 mg ta 'kampjuni ta' tessut mill-kortiċi ta 'quddiem, talamus, hippocampus, u medulla oblongata. L-imħuħ tal-ġurdien ġew maqsuma fin-nofs u l-RNA totali ġie estratt minn<90 mg obtained from the thalamic area. 

It-tessuti ġew omoġenizzati bl-użu ta 'TeSeEPrecess 48TM omoġenizzatur (Bio-Rad) b'RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja) flimkien ma' TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, USA) biex titneħħa l-kontaminazzjoni possibbli tad-DNA ġenomika. Il-konċentrazzjoni tal-RNA ġiet iddeterminata spettrofotometrikament bi spettrofotometru NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), u għal kull kampjun, proporzjon 260/280 u 260/230 ġew analizzati biex tivverifika l-purità tal-kampjun.

Mikrogramma waħda ta' DNA komplementari (cDNA) ġiet sintetizzata bl-użu ta' qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Barra minn hekk, l-effettività tat-trattament bid-DNase ġiet ivvalutata f'kampjuni RT-negattivi. Wara traskrizzjoni inversa, l-istess lott ta 'cDNA dilwit ġie soġġett għal qPCR biex jamplifika t-TLRs.

Intgħażlu żewġ ġeni tad-dar (HK) użati b'mod komuni biex tiġi normalizzata l-espressjoni tal-ġeni fil-mira: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) u actin-beta (ACT ) [91]. L-istabbiltà ta 'dan il-ġene HK ġiet ivverifikata taħt il-kundizzjonijiet sperimentali tagħna. L-espressjoni tal-messaġġier RNA (mRNA) ġiet iddeterminata bil-qPCR għal 1 sa 10 ġeni TLR ovini, 1 sa 9 ġeni TLR murini, u l-ġene MyD88 għaż-żewġ speċi.

Żewġ ċitokini proinfjammatorji (TNF- u IL-6) u żewġ ċitokini anti-infjammatorji (IL{-10 u TGF- ) ġew studjati wkoll fit-thalamus u l-ippokampus tan-nagħaġ. Primer sekwenzi u effiċjenzi kienu ġew ippubblikati qabel jew ġew iddisinjati bl-użu tal-għodda Primer3Plus [92](Tabella 2).

Aħna vverifikajna l-effiċjenza ta 'kull ġene li jiġġenera kurva standard billi amplifikajna dilwizzjonijiet serjali 1: 2 ta' cDNA ta 'kontroll u mbagħad ivverifikajna għal-linearità bejn il-valuri tal-konċentrazzjoni inizjali tal-mudell u l-limitu taċ-ċiklu (Ct). Il-ġeni kollha wrew koeffiċjent ta 'korrelazzjoni bejn 0.9 u 0.99, b'valur tal-inklinazzjoni tal-kurvi standard fil-firxiet ta' -3.2 sa -3.5 u effiċjenza qPCR ta '90-110%.

Ir-reazzjonijiet qPCR tmexxew bl-użu ta' Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System, 96-sewwa b'kundizzjonijiet ta' amplifikazzjoni universali: pass inizjali ta' attivazzjoni u denaturazzjoni tal-cDNA ta' 10 min f'95 ◦C, segwit minn 40 ċiklu ta' 3 s f'95 ◦C u 30 sat 60 ◦C.

Biex tidentifika l-preżenza ta 'amplicons PCR mhux speċifiċi jew livelli għoljin ta' primerdimers, wettaqna protokoll ta 'kurva ta' dissoċjazzjoni wara kull reazzjoni qPCR. Kull kampjun ġie analizzat fi tliet kopji f'volum ta' reazzjoni totali ta' 10 µL, li jikkonsisti minn 15 ng ta' cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), u l-ammont meħtieġ ta' quddiem u lura primers (Tabella 2).

Ilma mingħajr nukleażi ġie miżjud ma' volum finali ta' 10 µL. Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni ġew determinati bl-użu tal-metodu Ct komparattiv. Ir-riżultati kienu rappreżentati bħala tibdil ta 'darbiet u d-differenzi tal-espressjoni tal-ġeni relattivi għal-livell medju tal-grupp ta' kontroll skalat għal 1.

4.8. Analiżi tad-Data u Statistika

Id-dejta kwantitattiva kollha miġbura ġiet ittestjata għan-normalità bis-Shapiro-Wilk Wtest. Id-differenzi istoloġiċi u immunoistokimiċi bejn il-gruppi infettati u dawk ta' kontroll ġew evalwati bl-użu tat-test t ta' Student jew tat-test Mann-Whitney U skont id-distribuzzjoni tad-dejta parametrika jew mhux parametrika.

Id-differenzi statistiċi bejn l-erba’ reġjuni differenti tal-moħħ fin-nagħaġ infettati bl-iscrapie ġew determinati bl-użu ta’ analiżi tal-varjanza f’direzzjoni waħda (ANOVA) segwit minn test Bonferroni post hoc jew test Kruskal–Wallis, skont id-distribuzzjoni tad-dejta parametrika jew mhux parametrika. Analiżi statistiċi tad-dejta tal-qPCR saru mill-valuri medji ta' ∆Ct għal kull ġene.

Għat-tqabbil statistiku ta 'gruppi infettati u ta' kontroll, t-test ta' Student jew test Mann–Whitney U sar skont id-distribuzzjoni normali ta 'kull ġene, u l-ugwaljanza tal-varjanzi ġiet iddeterminata minn test ta' Levene. Id-differenzi fl-espressjoni tqiesu li huma sinifikanti f'p < 0.05.

In-notazzjonijiet li ġejjin intużaw biex jindikaw valuri p fil-figuri: * p < 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01; # p < 0.1. Intuża softwer SPSS (SPSS Statistics għall-Windows, Verżjoni 17.0, Chicago, IL, USA) għall-analiżi statistiċi. Il-grafiċi ġew iġġenerati bil-GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, USA) u d-dejta murija fiċ-ċifri tirrappreżenta l-medja u l-iżball standard tal-medja (medja ± SEM).

5. Konklużjonijiet

Sa fejn nafu, l-istudju preżenti huwa l-ewwel wieħed li jiddeskrivi l-livelli ta 'espressjoni ta' TLRgenes f'reġjuni differenti tal-moħħ ta 'nagħaġ naturali infettati bl-iscrapie u ġrieden tg338 ta' daqs eċċessiv infettati b'mod esperimentali bl-iscrapie.

L-istudju tagħna juri biċ-ċar li TLRs, u speċjalment TLR4 fin-nagħaġ u TLR1 u TLR2 fil-ġrieden, huma involuti fil-patoġenesi ta 'scrapie.Barra minn hekk, b'kuntrast mar-reġjuni l-oħra kollha studjati, il-profil distintiv ta' espressjoni tal-ġene TLR, flimkien mal-morfoloġija mikrogliali unika. u newropatoloġija ħafifa osservata fl-ippokampus, tissuġġerixxi rispons immuni speċifiku għar-reġjun tal-moħħ f'infezzjoni naturalscrapie.

Madankollu, se jkunu meħtieġa aktar studji biex jikkaratterizzaw l-espressjoni TLR fil-mikroglia, l-astroglia u n-newroni f'infezzjoni ta 'scrapie biex tifhem il-kontribuzzjoni preċiża ta' kull tip ta 'ċellula għan-newroinfjammazzjoni. Barra minn hekk, għad irid jiġi determinat jekk l-attivazzjoni tat-TLR hijiex rispons dirett għat-tossiċità tal-prioni jew isseħħx sekondarju għal mekkaniżmi infjammatorji oħra.

It-TLRs jikkostitwixxu mira promettenti għal approċċi terapewtiċi għall-mard toprion, u għalhekk se jkun meħtieġ fehim aħjar tar-risponsi newroinfjammatorji regolati minn TLR biex jiġi żgurat aktar avvanzi f'dan il-qasam.

Materjali Supplimentari: Dawn li ġejjin huma disponibbli online fuqhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur: Kunċettwalizzazzjoni, riċerka, u kurazzjoni tad-dejta, MCG u LMC; kitba-preparazzjoni abbozz oriġinali, MG-M., MCG, u LMC; metodoloġija sperimentali, MG-M.;kitba-reviżjoni u editjar, MG-M., MCG, LMC, u AO; metodoloġija in vivo, MB; akkwist ta' fondi, RB, u JJB; metodoloġija molekulari, BS-P.; superviżjoni, MCG, u JJB L-awturi kollha qraw u qablu mal-verżjoni ppubblikata tal-manuskritt.

Finanzjament: Din ir-riċerka kienet iffinanzjata minn "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Gvern ta' Aragona) permezz tal-proġett "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Dikjarazzjoni tal-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali: Il-proċeduri kollha li jinvolvu l-annimali aderixxu mal-linji gwida inklużi fil-Liġi Spanjola għall-Protezzjoni tal-Annimali RD53/2013 u d-Direttiva tal-Unjoni Ewropea 2010/63 dwar il-protezzjoni tal-annimali użati għal skopijiet sperimentali. Il-protokoll ġie approvat mill-Kumitat dwar l-Etika tal-Esperimenti tal-Annimali tal-Università ta’ Zaragoza (Numru tal-Permess: PI38/159 Ottubru 2015 u PI19/14 11 April 2014).

Dikjarazzjoni ta' Kunsens Informat: Mhux applikabbli.

Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Dejta: Id-dejta ppreżentata f'dan l-istudju hija disponibbli fit-test tal-artikolu, iċ-ċifri u l-materjal supplimentari.

Rikonoxximenti: Nirringrazzjaw lil Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) u VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) talli ġentilment ipprovdew il-ġrieden tg338 użati għal dawn l-esperimenti.

Kunflitti ta' Interess: L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess. Il-finanzjaturi ma kellhom l-ebda rwol fit-tfassil tal-istudju; fil-ġbir, analiżi, jew interpretazzjoni tad-data; fil-kitba tal-manuskritt, jew fid-deċiżjoni li jiġu ppubblikati r-riżultati. L-istampi u ċ-ċifri f'dan il-manuskritt huma data oriġinali.

Referenzi

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Akkumulazzjoni bikrija ta' PrP(Sc) f'tessuti limfoid u nervużi assoċjati mal-imsaren ta' nagħaġ suxxettibbli minn merħla Romanov b'naturalscrapie. J. Ġen Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Mard tal-Prion u l-kriżi tal-BSE. Xjenza 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; In-naħal, M. It-tixrid bikri tal-iscrapie mill-passaġġ gastrointestinali għas-sistema nervuża ċentrali jinvolvi fibri awtonomi tan-nervituri splankniċi u vagus.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions u l-vjaġġ letali tagħhom lejn il-moħħ. Nat. Dun Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WE; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc tixrid ta 'mudelli fil-moħħ tan-nagħaġ marbuta ma' tipi differenti ta 'prioni. Vet. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Evidenza għal rispons infjammatorju bikri fis-sistema nervuża ċentrali tal-ġrieden bl-iscrapie. Newroxjenza 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner,S.; Wadsworth, JD; et al. In-newropatoloġija tal-prioni ssegwi l-akkumulazzjoni ta' iżoformi alternattivi tal-proteini tal-prioni wara li t-titer infettiv laħaq il-quċċata. Nat. Komun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Id-Definizzjoni tar-Rispons tal-Mikroglia waqt il-Kors tal-Ħin ta 'Newrodegeneration Kronika. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia fil-mard tal-prion. J. Clin. Investig. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Ir-Rwol tal-Mikroglia fil-Mard tal-Prioni: Paradigma ta 'Diversità Funzjonali.Front. Tixjiħ Neurosci. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Eteroġeneità fid-distribuzzjoni u l-morfoloġija tal-mikroglia fil-moħħ tal-ġurdien adulti normali. Newroxjenza 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Eteroġeneità fil-morfoloġija u l-fiżjoloġija tal-astroċiti. Brain Res. Rev 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com