Kronotossiċità Renali Differenti Ta Bromobenzene U Metaboliti Intermedji tiegħu fil-ġrieden

Bromobenzene (BB) huwa magħruf li joħloq theddida serja għas-saħħa tal-bniedem. Preċedentement urejna li BB wera kronotossiċità, jiġifieri varjazzjonijiet ta 'kuljum fis-severità tal-epatotossiċità indotta fil-ġrieden. Għalkemm BB wera nefrotossiċità ħafifa, ma ġietx osservata ċaqliq ta' kuljum f'din it-tossiċità. Dan jista’ jiġi attribwit għall-fatt li l-kronotossiċità indotta mill-BB hija osservata biss fil-fwied u mhux fil-kliewiu li l-ħsara kkawżata minn BB hija prominenti fil-fwied, u taħbi l-varjazzjoni ta 'kuljum fin-nefrotossiċità. Biex nikkonfermaw dawn iż-żewġ possibbiltajiet, eżaminajna l-varjazzjonijiet ta’ kuljum fin-nefrotossiċità minħabba metaboliti intermedji BB li jimmiraw lejn il-kliewi: 3-bromophenol, bromohydroquinone, u 4-bromocatechol. Ġrieden ġew injettati bi 3-bromophenol, bromohydroquinone, jew 4-bromocatechol intraperitonealment f'sitt punti ta 'ħin differenti f'ġurnata (ħin ta' zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18, jew ZT22). Il-mortalità ġiet immonitorjata għal 7 d wara l-injezzjoni. Il-ġrieden kienu aktar sensittivi għat-tossiċità akuta ta' dawn il-metaboliti madwar l-espożizzjoni ta' ZT14 (fażi skura) milli madwar espożizzjoni ta' ZT2 (fażi ħafifa). Barra minn hekk, ġrieden li ngħataw b'doża mhux letali ta' 4-bromokatekol urew żidiet sinifikanti fil-livelli ta' nitroġenu urea fid-demm fil-plażma urenalimalondialdehyde f'espożizzjoni ZT14. Barra minn hekk, glutathione peroxidase-4, indikatur tal-ferroptosi, kien attenwat f'espożizzjoni ZT14. Dawn ir-riżultati jindikaw li t-tossiċità tal-metaboliti BB kienet ogħla matul l-espożizzjoni tal-fażi skura, u juru r-raġuni għaliex il-varjazzjoni ta 'nefrotossiċità ta' matul il-ġurnata minn BB ma ġietx osservata fir-rapport preċedenti tagħna hija lirenaliħsarakien mgħotti minħabba ħsara severa fil-fwied.

Ikklikkja għal Cistanche tubulosa Pilloli għall-mard tal-kliewi

Kliem ewlieni bromobenzene; varjazzjoni matul il-ġurnata; ritmu ċirkadjan; kronotossiċità;kliewi

INTRODUZZJONI

Bromobenzene (BB) huwa reaġent industrijali ġenerali li normalment jintuża bħala materja prima għas-sintesi ta 'farmaċewtiċi, żebgħa, u pestiċidi.1,2) BB huwa tniġġis organiku li jagħmel ħsara lill-ambjent naturali u joħloq theddida serja għas-saħħa tal-bniedem . Studju wieħed jiddikjara li BB jinduċi epatotossiċità severa u ħafifarenalitossiċità fil-ġrieden.3) Għalkemm BB innifsu, forma mhux metabolita, jippossjedi tossiċità baxxa, il-metaboliti intermedji tiegħu għandhom effetti tossiċi fuq il-fwied ukliewi. Is-CYP450s epatiċi, bħal CYP1A2, CYP1B1, u CYP2E1, jimmetabolizzaw BB għal erba' metaboliti: 3-bromophenol (3-BrP), bromohydroquinone (BrHQ), 4-bromocatechol (4- BrC), u BB-3,4-ossidu. BB-3,4-ossidu juri epatotossiċità għolja u l-metaboliti l-oħra juru nefrotossiċità,4–6) li jindika li dawn il-metaboliti għandhom organi fil-mira differenti.

F'dan l-istudju, immirajna "kronotossikoloġija" peress li qabel issuġġerajna r-relazzjoni bejn iż-żmien tal-amministrazzjoni u s-severità tat-tossiċità tal-kimiċi.7-9) L-istudju preċedenti tagħna wera varjazzjonijiet notevoli ta 'kuljum fis-severità tar-risponsi tossiċi għal BB fil-ġrieden, jiġifieri , il-ġrieden kienu aktar tolleranti għal korriment epatiku kkaġunat minn BB waqt l-espożizzjoni tal-fażi skura (2:00) milli matul l-espożizzjoni tal-fażi ħafifa (14:00).8) Għalkemm BB wera nefrotossiċità ħafifa , kronotossiċità ma ġietx osservata fil-kliewi. Għalhekk, il-kronotossiċità indotta minn BB kienet possibbilment osservata biss fil-fwied u mhux fil-kliewi. Fl-istudju preċedenti tagħna, streptomycin, antibijotiku magħruf li jinduċi nefrotossiċità definita, wera varjazzjoni ċara fil-ġurnata fin-nefrotossiċità indotta fil-ġrieden. ilkliewi, u b'hekk jaħbu l-kronotossiċità fl-organu tal-aħħar. Il-metaboliti tal-BB iġġenerati permezz ta' diversi mogħdijiet metaboliċi jseħħu f'konċentrazzjonijiet baxxi u għalhekk jistgħu jikkontribwixxu għal ħsara renali negliġibbli; minħabba dan, in-nefrotossiċità kkaġunata mill-metaboliti BB ma tistax tiġi stmata klinikament. F'dan l-istudju, eżaminajna l-varjazzjoni ta' matul il-ġurnata fin-nefrotossiċità tal-metaboliti intermedji BB: 3- BrP, BrHQ, u 4- BrC (Fig. 1).

MATERJALI U METODI

Trattament għall-Annimali

Ġrieden ICR maskili nxtraw minn Japan SLC Inc. (Shizuoka, Ġappun) u nżammu taħt kundizzjonijiet standard ta' temperatura kkontrollata (24 ± 1 grad), umdità (55± 5 fil-mija) u dawl (12: 12-h). ċikli tad-dawl/dlam, id-dwal mixgħula fi 08: 00), b'aċċess ħieles għall-ilma u l-ikel. It-trattamenti sperimentali saru bl-użu ta' annimali ta' 7-ġimgħat. Wara t-tlestija tal-esperimenti, il-ġrieden li baqgħu ħajjin ġew sagrifikati bl-użu tal-pentobarbital. L-esperimenti kollha ġew approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura tal-Annimali u l-Esperiment tal-Università Kinjo Gakuin.

Protokoll Sperimentali

Għall-assaġġ tal-mortalità, ġrieden ICR maskili ta' {{{0}}ġimgħat ta' żmien irċevew injezzjoni waħda intraperitoneali (ip) ta' 5{00 mg/kg ta' 3-BrP, 180 mg/kg ta' BrHQ, jew 220 mg/kg ta' 4-BrC (f'volum ta' 0.1 mL/10 g ta' piż tal-ġisem; Tokyo Kasei Corp, Tokyo, Ġappun). Din id-doża tiġi deċiża skont il-valur LD50 fl-iskedi tad-dejta tas-sigurtà għal kull kimika. Għall-injezzjoni ta 'kull metabolit, ġrieden ġew assenjati għal sitt gruppi ta' ħames annimali kull wieħed. Il-metaboliti BB ġew amministrati f'sitt punti ta' ħin differenti (ħin tal-arloġġ: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02: {{21 }}, u 06: 00), deskritti bħala zeitgeber times (ZTs): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18, u ZT22, rispettivament. Ġrieden ta 'kontroll irċevew l-istess volum ta' salina. Il-mortalità ġiet immonitorjata għal 7 d wara l-injezzjoni.

Għall-analiżi tal-varjazzjonijiet ċirkadjani firenalikorriment, 7-ġrieden ICR maskili ta' ġimgħa (5-9 ġrieden) ingħataw injezzjoni ip ta' 165 mg/kg ta' 4-BrC f'ZT2 jew ZT14. Ġrieden ta 'kontroll irċevew l-istess volum ta' salina kif deskritt hawn fuq. L-annimali ġew ewtanizzati bl-użu ta' pentobarbital, u l-kampjuni tal-plażma tagħhom inġabru 24 siegħa wara l-injezzjoni. Il-kampjuni tal-plażma miksuba ġew maħżuna f'-80 grad. Il-kliewital-annimali kollha ġew maħsuda u maħżuna f'-80 grad.

Livelli ta' Nitroġenu tal-Urea tad-Demm tal-Plażma (BUN), Aspartate Aminotransferase (AST), u Renal Malondialdehyde (MDA)

Il-livelli ta' BUN u AST fil-plażma ġew determinati bl-użu tat-test BUN Wako u tat-test transaminase CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Ġappun), skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.8) TotalrenaliIl-livelli ta' MDA tkejlu permezz ta' analiżi kolorimetrika tal-mikroplate (Oxford Biomedical Research, MI, USA), skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.8)

Analiżi Western Blot

Kampjuni ta' proteini (50 µg) estratti mill-kliewiġew separati permezz ta '10 fil-mija sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.10) L-antikorpi primarji użati kienu kif ġej (kollha dilwita 1: 1500): proteina ta' interazzjoni mar-riċettur tal-ġurdien (RIP) 1 antikorp monoklonali, antikorp monoklonali tal-ġurdien RIP3, u glutathione tal-ġurdien peroxidase 4 (GPX4) antikorp monoklonali (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); antikorp poliklonali tal-caspase-3 tal-fenek (Cell Signaling Technology); u antikorp monoklonali tal-ġurdien -actin (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japan).

Analiżi Statistika

Twettqu paraguni multipli bl-użu tat-test post-hoc Tukey–Kramer. L-analiżi statistiċi kollha twettqu bl-użu tas-softwer SPSS 25.0 (Chicago, IL, USA). Riżultati b'p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

RIŻULTATI U DISKUSSJONI

F'dan l-istudju, qabbilna l-kronotossiċità ta' tliet metaboliti intermedji BB (3-BrP, BrHQ, u 4-BrC) li huma magħrufa li jinduċurenalitossiċità. Aħna l-ewwel investigajna l-effett tal-ħin tal-injezzjoni fuq il-mortalità kkaġunata mill-metaboliti intermedji BB. Il-Figura 2 turi n-numru ta 'annimali superstiti u l-ħin medju ta' sopravivenza (MST) 7 d wara l-injezzjoni. Meta 3-BrP ġie amministrat f'ZT10 u ZT14, il-ġrieden kollha mietu (0 fil-mija) fi żmien 4 sigħat (Fig. 2A). B'kuntrast, meta 3-BrP ġie amministrat f'ZT6 u ZT22, tliet ġrieden (60 fil-mija) baqgħu ħajjin; meta ingħata f'ZT2 u ZT18, in-numru ta 'ġrieden superstiti kien wieħed u tnejn (20 u 40 fil-mija), rispettivament. Wara l-għoti ta' BrHQ, il-mewt tal-ġrieden kienet osservata biss fi żmien 4 sigħat wara l-għoti fil-gruppi ZT kollha. F'7 d wara l-amministrazzjoni, l-ebda ġrieden ma baqgħu ħajjin fil-gruppi ZT14 u ZT18 u tlieta (60 fil-mija) baqgħu ħajjin fil-gruppi ZT2 u ZT6. Fil-gruppi ZT10 u ZT 22, in-numru ta 'ġrieden superstiti kien tnejn u wieħed (40 u 20 fil-mija), rispettivament (Fig. 2B). Wara l-amministrazzjoni 4-BrC, il-ġrieden kollha mietu fi żmien 3 d meta ddożati f'ZT14 jew ZT18 (0 fil-mija) u wieħed jew tnejn biss (20 jew 40 fil-mija) baqgħu ħajjin fi gruppi ZT oħra (Fig. 2C). MST kien kważi konsistenti man-numru ta 'ġrieden superstiti fil-gruppi kollha (Figuri. 2D-F). Dawn ir-riżultati jindikaw il-kronotossiċità letali tat-tliet metaboliti intermedji BB. Wara l-għoti f'ZT14 (fażi skura), it-tliet metaboliti kollha wrew tossiċità għolja. Interessanti, il-mudelli ta 'kronotossiċità ta' dawn il-metaboliti BB huma differenti minn dawk ta 'BB innifsu, jiġifieri, ġrieden esposti għal BB fil-fażi mudlama kellhom sensittività aktar baxxa għat-tossiċità. esponiment fil-fażi skura u inqas tossiku wara espożizzjoni fil-fażi ħafifa.9) Dawn is-sejbiet tal-istudji preċedenti ma jikkontradixxux dawk tal-istudju preżenti, li jissuġġerixxu li d-differenzi fit-tossiċità tal-BB u t-tliet metaboliti intermedji tal-BB huma attribwiti lill-organi fil-mira tagħhom . BB jimmira l-fwied, filwaqt li l-metaboliti intermedji tiegħu jimmiraw il-kliewi.

Wara eżaminajna l-effett tal-ħin tal-injezzjoni fuq is-severità tat-tossiċità tal-organi bl-użu ta' doża mhux letali ta' 4-BrC (165 mg/kg). Peress li mewta bikrija fi żmien 4 sigħat ġiet osservata b'injezzjonijiet 3-BrP u BrHQ, deskritti kif hawn fuq, għażilna biss 4-BrC għall-esperimenti sussegwenti. Għal konvenjenza sperimentali, għażilna ZT2 u ZT14 bħala ħinijiet ta 'injezzjoni. Fil-grupp ZT2, il-livell ta' BUN fil-plażma, indikatur ta' nefrotossiċità, ma żdiedx wara espożizzjoni għal 4-BrC; madankollu, il-livell BUN żdied b'mod notevoli fil-grupp ZT14 (Fig. 3A). B'mod parallel ma 'BUN, aħna kejlu l-livell AST fil-plażma, indikatur ta' epatotossiċità. Aħna sibna li 4-l-amministrazzjoni ta' BrC ma affettwax il-livelli ta' AST fil-plażma kemm f'ZT2 kif ukoll f'ZT14 (Fig. 3B), li tissuġġerixxi li 4-BrC kien tossiku biss għall-kliewi. Barra minn hekk, aħna stmat il-livelli ta 'MDA bħala indikatur ta' stress ossidattiv fil-kliewi. L-amministrazzjoni ta' 4-BrC żiedet b'mod sinifikanti l-livell ta' MDA renali fil-gruppi ZT14 u ZT2. Madankollu, il-livell ta 'MDA fil-grupp ta' injezzjoni ZT2 kien b'mod sinifikanti aktar baxx minn dak fil-grupp ZT14 (Fig. 3C).

Sal-lum, ġew irrappurtati diversi mogħdijiet ta' mewt taċ-ċelluli bħal apoptożi, nekroptożi u ferroptożi.11) Barra minn hekk, ġie rrappurtat li l-mewt taċ-ċelluli kkawżata minn 4-BrC hija medjata prinċipalment permezz ta' nekrożi.6) Biex tiġi investigata l- tip ta 'mewt taċ-ċelluli indotta minn 4-BrC, aħna analizzajna l-livelli ta' proteini relatati mal-mewt taċ-ċelluli: caspase cleaved-3 għall-apoptożi, RIP1/RIP3 għan-nekroptosi, u GPX4 għal ferroptosi. Ma ġew osservati l-ebda bidliet ovvji fil-livelli ta' caspase -3, RIP1, u RIP3 maqsuma fi kwalunkwe grupp, li jissuġġerixxi li l-apoptożi u n-nekroptosi mhumiex indotti minn 4-BrC (Fig. 4). B'kuntrast, kien osservat tnaqqis fil-livell GPX4 wara li ngħata 4-BrC f'ZT14 (Fig. 4). Aħna ma osservajnax in-nekrożi renali indotta minn 4-BrC b'analiżi istopatoloġika (dejta mhux murija). Dan issuġġerixxa li l-konċentrazzjoni 4-BrC użata f'dan l-istudju kkawżat ħsara ħafifa fil-kliewi u ma wasslitx għal nekrożi. Minn dawn ir-riżultati, jista' jiġi ssuġġerit li 4-BrC jikkawża ferroptosi, li turi varjazzjoni ta' matul il-ġurnata.

F'dan l-istudju, urejna metaboliti intermedji BB indotti kronotossiċità fil-kliewi. B'kuntrast, ir-riżultat preċedenti tagħna wera nefrotossiċità indotta minn BB. Madankollu, il-kronotossiċità tal-kliewi ma nbidlitx bejn il-fażi ħafifa u l-fażi skura.8) Għalkemm ir-raġuni kritika għad-differenza bejn ir-riċerka preċedenti u attwali għadha mhix ċara, naħsbu li seħħ li jaħbu l-kronotossiċità renali billi jinduċu epatika severa. korriment. Fl-esperiment futur, irridu nkejlu l-ammonti akkumulati ta 'kull metabolit intermedju BB peress li dawn l-ammonti jistgħu jinbidlu minn CYP u/jew livelli ta' korriment.

Ħafna fatturi bijoloġiċi juru ritmu ċirkadjan fil-livelli ta 'espressjoni tagħhom. Per eżempju, Xu et al. irrappurtaw varjazzjoni matul il-ġurnata fl-espressjoni tal-ġeni antiossidanti epatiċi fil-ġrieden.12) Glutathione (GSH) huwa antiossidant li huwa kritiku għaż-żamma tas-saħħa u l-protezzjoni kontra l-komposti tossiċi. Kemm 4-BrC kif ukoll 3-BrP ġew irrappurtati li jnaqqsu l-livell tal-GSH renali.4,13) Ferroptosis ġiet proposta fl-2012 bħala l-forma ta 'mewt taċ-ċelluli indotta mill-elastin, li jinibixxi l-importazzjoni ta' cysteine, wassal għal tnaqqis ta' GSH u inattivazzjoni ta' GPX4.14) Ir-riżultati tagħna wrew li GPX4 kien imrażżan biss f'ZT14 minn 4-BrC. Għalhekk, proteini jew ġeni relatati ma 'GSH jistgħu jkunu assoċjati ma' kronotossiċità.

Biex nikkonkludu, l-istudju preżenti tagħna juri li BB jinduċi ħsara renali kif ukoll ħsara epatika permezz tal-metaboliti tiegħu, bħal 3-BrP, BrHQ, u 4-BrC. Ir-raġuni għaliex il-varjazzjoni ta 'nefrotossiċità ta' matul il-ġurnata minn BB ma ġietx osservata fir-rapport preċedenti tagħna hija li l-ħsara renali kienet moħbija minħabba ħsara qawwija fil-fwied.

REFERENZI

1) Lau SS, Monks TJ. Il-kontribut ta 'bromobenzene għall-fehim attwali tagħna ta' tossiċitajiet indotti kimikament. Life Sci., 42, 1259–1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Effetti Hepatoprotective ta 'l-Għasel ta' Apis cerana Fabricius fuq ħsara fil-fwied indotta minn bromobenzene fil-ġrieden. J. Food Sci., 83, 509–516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. Valutazzjoni tal-potenzjal epatoprotettiv u nefroprotettiv ta 'withaferin A fuq korriment indott minn bromobenzene fi ġrieden albini Żvizzeri: involviment possibbli ta' disfunzjoni mitokondrijali u infjammazzjoni. Cell Biol. Toxicol., 32, 373–390 (2016).

4) Dankovic DA, Billings RE. Ir-rwol ta' 4-bromophenol u 4-bromocatechol fit-twaħħil kovalenti tal-bromobenzene u t-tossiċità f'epatoċiti iżolati tal-firien. Tossikol. Appl. Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS, Monks TJ, Gillette JR. Identifikazzjoni ta' 2-bromohydroquinone bħala metabolit ta' bromobenzene u o-bromophenol: implikazzjonijiet għan-nefrotossiċità indotta minn bromobenzene. J. Pharmacol. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) Rush GF, Newton JF, Maita K, Kuo CH, Hook JB. Nefrotossiċità tal-metaboliti tal-bromobenzene fenoliċi fil-ġurdien. Tossikoloġija, 30, 259-272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, ​​Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Analiżi multidirezzjonali ta 'kronotossiċità epatika indotta mill-kadmju u fil-ġrieden. J. Toxicol. Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, ​​Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Chronotoxicity ta 'korriment epatiku indott minn bromobenzene fil-ġrieden. J. Toxicol. Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, ​​Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Kronotossiċità ta 'ħsara renali indotta minn streptomycin fil-ġrieden. Biol. Pharm. Bull., 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, ​​Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Effett ta 'potenzjal ta' epatotossiċità indotta minn acetaminophen u tetrachloride tal-karbonju huwa medjat mill-attivazzjoni ta 'proteina ta' interazzjoni tar-riċetturi fil-ġrieden. Tossikol. Mech. Metodi, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Necrosis Programmed and Disease: Aħna ninterrompu l-ipprogrammar regolari tiegħek biex iġibulek inflfjammazzjoni tan-nekro. Cell Death Differ., 26, 25–40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Varjazzjoni ta' kuljum tal-espressjoni tal-ġeni antiossidanti tal-fwied fil-ġrieden. PLOS WIEĦED, 7, e44237 (2012).

13) Monks TJ, Hinson JA, Gillette JR. Tossiċità ta 'bromobenzene u p-bromophenol u rabta kovalenti in vivo. Life Sci., 30, 841–848 (1982).

14) Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptożi: forma dipendenti fuq il-ħadid ta 'mewt taċ-ċelluli nonapoptotic. Cell, 149, 1060–1072 (2012).

Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, Yasuro Shinohara, Makoto Nakao, Masae Yoshikawa, Tohru Maeda,*, a u Nobuhiko Miura*,c

Kulleġġ tal-Ispiżerija, l-Università ta’ Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Ġappun: b Ċentru għar-Riċerka Craniofacial, Iċ-Ċentru tax-Xjenza tas-Saħħa tal-Università ta 'Texas fi Houston, Skola tad-Dentistrija; 1941 East Road, Houston, TX 77054, USA: u cDepartment of Health Science, Yokohoma University of Pharmacy; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, il-Ġappun. Irċieva fit-30 ta’ Awwissu, 2020; aċċettat fil-25 ta’ Ottubru 2020

għal aktar informazzjoni: Ali.ma@wecistanche.com