L-espożizzjoni tal-egżost tad-diżil tbiddel l-espressjoni tan-netwerks implikati fin-newrodeġenerazzjoni f'imħuħ taż-żebrafish parti 2

Preparazzjoni tal-kampjun tal-proteina

Biex jiġu ppreparati kampjuni ta' proteini, l-irjus minn 80 sa 100 larva anestetizzata (5 pdf) ġew iżolati bir-reqqa u maħsula bil-PBS qabel ma ġew trasferiti għal lysis buffer li kien jikkonsisti minn 15% TCA/aċetun imkessaħ minn qabel li fih 0.07% beta-mercaptoethanol (ME). ) u cocktail inibitur tal-protease (il-manifattur jeħtieġ) f'volum totali ta '500 ul.

F'dawn l-aħħar snin, kien hemm interess konsiderevoli fl-effetti tal-kampjuni tal-proteini fuq il-memorja. Aktar u aktar nies qed jibdew jirrealizzaw l-importanza tad-dieta għas-saħħa, speċjalment ir-rwol importanti tal-proteina fil-ġisem tal-bniedem.

Il-proteini huma l-materjali bażiċi tal-bini tal-ġisem tal-bniedem u għandhom rwol importanti fil-ġisem tal-bniedem. Minħabba dan, il-kampjuni tal-proteini saru kanal importanti għal ħafna nies fl-insegwiment tagħhom tas-saħħa u s-sbuħija. Minbarra l-bini tal-muskoli u l-iskultura tal-ġisem, il-kampjuni tal-proteini jistgħu wkoll itejbu l-memorja ta 'persuna.

Xi xjenzati studjaw ir-relazzjoni bejn il-proteini u l-memorja. Huma sabu li t-teħid fit-tul ta 'proteina suffiċjenti huwa ta' benefiċċju għall-aspetti kollha tas-saħħa fiżika, speċjalment il-memorja. Hemm evidenza dejjem tikber li t-teħid ta 'proteini fid-dieta għandu impatt importanti fuq il-funzjoni tal-moħħ u l-memorja.

Il-proteina hija komponent importanti tan-newroni fil-moħħ tal-bniedem, għalhekk it-teħid ta 'proteini ta' kuljum għandu impatt importanti fuq il-memorja u l-kapaċità tal-ħsieb tan-nies. It-teħid ta 'proteini fit-tul mhux biss jissodisfa l-ħtiġijiet tal-proteini tal-ġisem iżda jgħin ukoll lill-moħħ jibqa' attiv u b'saħħtu.

Barra minn hekk, il-proteina tista 'wkoll tgħin lill-ġisem iżomm il-bilanċ taz-zokkor fid-demm u jżomm burdata stabbli. Dan huwa importanti ħafna biex jinżammu l-ħiliet tal-memorja u tal-ħsieb. Għalhekk, konsum moderat ta 'proteina jista' jgħin biex itejjeb diversi funzjonijiet konjittivi u stati emozzjonali tal-ġisem tal-bniedem.

B'mod ġenerali, hemm relazzjoni qawwija bejn il-kampjuni tal-proteini u l-memorja. Iż-żieda fil-konsum tal-proteini tiegħek tgħin biex iżżomm il-moħħ u l-ġisem tiegħek b'saħħithom, ittejjeb il-ħiliet tal-ħsieb u l-memorja. Għal nies li għandhom bżonn itejbu l-memorja tagħhom, huwa ferm meħtieġ li jikkunsmaw ammont xieraq ta 'proteina. Għandna nieklu ikel tal-proteini b'mod xieraq u nagħtu attenzjoni għal ikliet raġonevoli biex inżommu ġisem b'saħħtu u moħħ qawwi. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche deserticola jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja, minħabba li Cistanche deserticola għandu effetti antiossidanti, anti-infjammatorji u kontra t-tixjiħ, li jistgħu jgħinu jnaqqsu l-ossidazzjoni u r-reazzjonijiet infjammatorji fil-moħħ, u b'hekk jipproteġu l- saħħa tas-sistema nervuża. Barra minn hekk, Cistanche deserticola tista 'wkoll tippromwovi t-tkabbir u t-tiswija taċ-ċelloli tan-nervituri, u b'hekk ittejjeb il-konnettività u l-funzjoni tan-netwerks newrali. Dawn l-effetti jistgħu jgħinu biex itejbu l-memorja, it-tagħlim u l-veloċità tal-ħsieb, u jistgħu wkoll jipprevjenu l-iżvilupp ta 'disfunzjoni konjittiva u mard newrodeġenerattiv.

Ikklikkja taf supplimenti biex tingħata spinta lill-memorja

Wara omoġenizzazzjoni qasira, il-proteini ġew preċipitati għal 12-il siegħa fi 20 grad, segwiti minn ċentrifugazzjoni fi 12,000 rpm għal 5 min at4 gradi. Is-supernatant tneħħa, u l-proteinepellet inħasel darbtejn b'aċetun kiesaħ (li fih 0.07% ME u cocktails ta' inibitur tal-protease). Il-pellet tal-proteina finali ġie maħlul f'liżi buffer li kien fih 7.0 M urea, u 2.0 M thiourea permezz tas-silġ ivvibrar.

Il-kampjuni tal-proteini solubilizzati ġew ċentrifugati fi 15,000 rpm għal 10 min fi 4 gradi għal partiċelli preċipitati li ma jinħallux, u l-konċentrazzjoni tal-kampjuni tal-proteini finali tkejlet bl-użu tal-metodu Bradford.

Analiżi ta 'proteomika ta' throughput għoli bbażata fuq TMT

Il-kampjuni ġew imnaqqsa, alkylated, u diġeriti biż-żieda sekwenzjali ta 'trypsin u lys-C proteases. Il-peptidi mbagħad ġew ittikkettati bl-użu ta' tikketti isobariċi 10-plexTMT skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Kampjuni ttikkettjati tħalltu u mbagħad frazzjonati fin bl-użu ta' kromatografija b'fażi inversa ta' pH għoli.

Il-frazzjonijiet individwali mbagħad ġew analizzati b'LC–MS/MS bl-użu ta' kromatografija b'fażi inversa onlajn u spettrometrija tal-massa tandem fuq l-ispettrometru tal-massa Thermofsher Fusion Lumos. It-tiftix fil-bażi tad-dejta u l-estrazzjoni tal-informazzjoni tal-joni tar-reporter TMT saru bl-użu tal-pjattaforma tas-softwer MaxQuant (Cox and Mann 2008).

It-tqabbil tad-dejta TMT madwar il-kampjuni sar bl-użu tal-MSStats (Choiet al. 2014). Analiżi traskrittomika Madwar 80-100 ras ġew iżolati minn embrijuni anestetizzati (120 siegħa), maħsula b'PBS, u soġġetti għal estrazzjoni totali tal-RNA bl-użu ta' Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis). , USA) reaġent li jsegwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Il-kwalità u l-kwantità ta’ RNA ġew evalwati bl-użu ta’ spettrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) u aktar minn Agilent 2100 Bioanalyzer biex jiżgura l-konċentrazzjoni minima ta’ 50 ng/ul u n-numru ta’ integrità RNA (RIN) ta’ 8. Il-preparazzjoni tal-librerija mbagħad saret bl-użu ta’ Illumina HiSeq4000 skont il-protokoll: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow withRibo-Zero Gold," u l-kampjuni ġew sekwenzati mill-kundizzjonijiet li ġejjin: "Paired End run,R1=75 cycles (antisense strand), Index=8 cycles, R2=75 ċikli (sense strand)."

Analiżi tad-dejta

Iż-żewġ settijiet ta' dejta għal studji proteomiċi u transcriptomics ttellgħu u ġew analizzati simultanjament bl-użu tal-għodda onlajn Metascape, li tippermetti l-annotazzjoni tal-ġeni għal diversi speċi, inkluż Danio rerio (Zhou et al. 2019). analizzati permezz tal-użu tas-softwer tal-Analiżi tal-Mogħdijiet tal-Inġenju (IPA) (Krämer et al. 2014).

Settijiet tad-dejta li fihom identifikaturi tal-ġeni jew tal-proteini u l-valuri tal-espressjoni korrispondenti ttellgħu fl-applikazzjoni. Kull identifikatur ġie mmappjat mal-oġġett korrispondenti tiegħu fil-bażi tal-għarfien tal-Ingenuity.

Qtugħ ta' alterazzjoni tal-espressjoni ta' 1.3-darbiet ġie stabbilit biex jiġu identifikati molekuli li l-espressjoni tagħhom kienet regolata b'mod differenzjat. L-analiżi funzjonali identifikat il-funzjonijiet bijoloġiċi u/jew il-mard li kienu l-aktar sinifikanti għas-sett tad-dejta. Molekuli mis-sett tad-dejta li laħqu l-limitu u kienu assoċjati ma' funzjonijiet bijoloġiċi ġew ikkunsidrati għall-analiżi. It-test eżatt ta' Right-tailedFisher intuża biex jiġi kkalkulat il-valur p li jiddetermina l-probabbiltà li kull funzjoni bijoloġika u/jew marda assenjata lil dak is-sett tad-dejta hija dovuta għall-kumbinazzjoni biss.

Analiżi tal-mogħdija

Biex tiġi evalwata l-kontribuzzjoni ta' alterazzjonijiet tal-profil tal-proteome jew tat-traskriptome f'mogħdijiet speċifiċi, iż-żewġ settijiet ta' dejta ttellgħu fis-softwer tal-IPA (Krämer et al. 2014). L-ogħla mogħdijiet kanoniċi mibdula sinifikanti mbagħad ġew evalwati u interpretati aktar bl-użu ta 'PCR u western blotting kif deskritt hawn taħt.

Western blotting

Total ta '25 µg ta' proteini ġew mgħobbija fuq 12% NuPAGE (Novex, CA) u ttrasferiti fuq PVDFmembranes (Novex, CA) kif deskritt (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Il-membrani ġew imblukkati b'5% ħalib xkumat fi Tris-bufferedsaline u 0.01% tween 20 (TBST buffer) għal 30 minat temperatura tal-kamra u mbagħad inkubati matul il-lejl f'4 gradi jew bi fenek poliklonali anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) jew ġurdien monoklonali anti-GAPDH ( Abcam, CA), dilwit fil-buffer TBST li fih 1% ħalib xkumat.

Wara l-ħasil f'TBST, il-blots ġew inkubati b'antikorpi sekondarji tal-ħmar kontra l-fenek-HRP (Abcam, CA) jew tal-mogħoż kontra l-ġurdien-HRP (Santa Cruz, CA) għal sagħtejn, segwiti minn żvilupp b'substrat ta' blotting tal-Punent Pierce™ ECL Plus ( Thermo Fisher Xjentifiku, l-Istati Uniti). Il-meded ġew viżwalizzati permezz ta' immaġini bl-użu ta' Skaner LI-COR u analizzati permezz ta' densitometrija (LI _COR Biosciences, NE).

PCR f'ħin reali

L-RNA totali ġie iżolat mill-irjus bl-użu ta 'reaġent TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur u mbagħad imkejjel bl-użu ta' spettrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Ammont ta' 1 ug ta' kull kampjun ta' RNA ġie traskritt b'lura bl-użu ta' supermix ta' traskrizzjoni inversa iScript™ (Bio-Rad, CA), u PCR f'ħin reali twettqet bl-użu ta' SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA), u l-primers huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 1.Il-livelli ta 'espressjoni relattiva ġew ikkalkulati bl-użu tal-metodu 2−ΔΔCT, u t-test T statistiku ntuża biex jevalwa d-differenzi sinifikanti.

riżultati u diskussjoni

Analiżi proteomiċi u traskriptomiċi huma żewġ għodod ewlenin għall-fehim tal-mekkaniżmi molekulari ta 'bażi ​​tal-proċessi tal-mard u r-rispons għal stimuli ambjentali (Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2012) . Hawnhekk, għamilna analiżi profonda tal-espressjoni kemm fil-livelli traskriptomiċi kif ukoll proteomiċi fl-irjus tal-embrijuni tal-fish zebra esposti għal DEPe.

L-irjus, magħmulin l-aktar minn tessut tal-moħħ, ġew iżolati biex jeliminaw il-profili ta 'espressjoni ta' tessuti oħra minħabba li aħna interessati fid-determinazzjoni ta 'mogħdijiet patoloġiċi intrinsiċi tas-CNS.

Il-profil tal-espressjoni tal-irjus tal-embrijuni tal-fish zebra

L-analiżi tal-profil ipproduċiet 11,172 proteina misjuba u 14,748 mira mRNA minn aktar minn 26,000 ġene li jikkodifika (Howe et al. 2013). Fost il-11,172 proteina identifikati mill-kampjuni ttikkettjati bit-TMT (Tabella Supplimentari 2), 141 proteina kienu regolati b'mod sinifikanti, u 607 kienu regolati 'l isfel (Tabella Supplimentari 3 u Fig. 1a). Bl-istess mod, 367 traskrizzjonijiet wereupregulated, u 149 kienu downregulated fost l-14,748 traskrizzjonijiet (Tabella Supplimentari 4) misjuba fl-analiżi RNA-seq (Fig. 1b u Tabella Supplimentari 5).
Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, is-sejbiet mill-analiżi proteomika u transcriptomic upregulated kienu konsistenti. Pereżempju, l-ogħla proteini regolati ħafna jinkludu cytochrome P450 Cyp1a, Cyp1c1, subunità tal-proteina li torbot Guaninenucleotide gamma, Annexin, Plexin B2b isoforma qasira, Dehydrogenase/reductase (familja SDR) membru 13-bħal 1, S-antigen ofretina/glandola pineali (arrestin) b, u Sulfotransferase6B1.

Bl-istess mod, il-ġeni bl-ogħla traskritomicupregulation jinkludu cytochrome P450 (Cyp1a), chemokine (C–C motif) ligand 27a, aril-hydrocarbonreceptor repressor A, cytochrome P450 (Cyp1b), u Rh familja C glikoproteina. mhux dejjem kienu korrelatati ħafna.

Pereżempju, Complexin 2, Spectrin alpha, Cardiac myosin light chain-1, proteina ta' interazzjoni SEC23, subunità tal-membrana ATPsynthase EA, Cytochrome b, u proteina deacetylase dipendenti fuq NAD huma fost l-ogħla proteini regolati ħafna 'l isfel, filwaqt li l-proteina tal-membrana tas-segment retinalouter 1a , solute carrierfamily 5 (trasportatur tal-jodur), FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B, complexin 4c, FOSlike antigen 1a, opsin 1, u v-fos juru l-highestdownregulation tat-traskrizzjoni (Tabelli 1 u 2).

L-antikorpi li jirrikonoxxu l-proteini tal-fish zebra huma limitati, iżda kkonfermajna kampjun ta 'dawn il-bidliet bl-użu tal-analiżi tal-western blot. Il-upregulation ofCyp1A proteina u downregulation ta Complexin 2 (CPLX2) ġew ikkonfermati bl-użu GAPDH bħala loadingcontrol (Fig. 2a). Livelli ogħla ta 'TAT u UGT1B1transcription u livelli aktar baxxi ta' CHNRB u TH2were wkoll ikkonfermati minn qPCR bl-użu ta 'Elf-alpha bħala theinternal kontroll (Fig. 2b).

Annotazzjoni tal-ġeni

Hemm diversi għodod u softwer bijoinformatiċi onlajn li jistgħu jipprovdu informazzjoni utli dwar l-annotazzjoni tal-ġene. Fosthom, Metascape, with thecapability of gene annotation for Danio rerio (Zhouet al. 2019), intuża f'dan ix-xogħol.

Iż-żewġ settijiet ta' dejta għal studji proteomiċi u traskrittomiċi ttellgħu u ġew analizzati fl-istess ħin bl-użu ta' din l-għodda onlajn. Wara li tgħaqqad l-output ta' alterazzjonijiet kemm proteomiċi kif ukoll traskritomiċi fis-softwer, diversi proċessi bħal rispons għal stimolu ksenobijotiku, metaboliżmu ta' ksenobijotiċi permezz ta' ċitokromu P450, u regolazzjoni tal-espressjoni tal-ġeni ċirkadjana. nstabu minħabba trattament DEPe (Fig. 3a).

Din l-analiżi ssuġġeriet ukoll livelli mrażżna ta 'proċessi bijoloġiċi bħal "Perċezzjoni viżwali", "Phototransduction," u "Internalizzazzjoni ta' riċettur akkoppjat mal-proteina G." L-alterazzjonijiet fil-profili tal-espressjoni relatati mal-vista ma kinux mistennija peress li t-trattament DEPe matul l-iżvilupp bikri rriżulta f'għajnejn iżgħar (dejta mhux murija).

Sinjali tal-metaboliżmu xenobijotiku

Xenobijotiċi, li huma komposti naturali jew kimiċi sintetiċi barranin, jistgħu jikkawżaw ir-rispons għall-istress ċellulari, li jwassal għal divrenzjar, proliferazzjoni, apoptożi jew nekrożi. Tabilħaqq, il-ġisem jeħtieġ li jipproteġi lilu nnifsu b'mod attiv kontra ksenobijotiċi, u wkoll komposti endoġeni tossiċi u l-metaboliti tagħhom, permezz tal-espressjoni ta 'enzimi u trasportaturi involuti fl-eliminazzjoni u d-ditossifikazzjoni tagħhom.

Dawn l-enzimi huma kklassifikati fi tliet gruppi: Enżimi Fażi I (CYP, ALDH, FMO) li jintroduċu polarità fil-ksenobijotiċi; Enżimi tal-Fażi II (UGT, GST, SULT) li jintroduċu idrofiliċità permezz ta' konjugazzjoni ta' molekuli idrofiliċi bħal sulfat, aċidu glukuroniku, u glutathione mal-ksenobijotiċi; u enzimi tal-Fażi III (MDR1, OATP2, MRP) li jittrasportaw il-ksenobijotiċi jew konjugati ffurmati matul il-Fażi II għaż-żona extraċellulari.

Dawn l-enzimi huma indotti permezz ta 'kaskati ta' sinjalazzjoni li jinvolvu riċetturi speċifiċi (CAR, PXR, AHR) u attivazzjoni medjata minn MAPK ta 'fatturi ta' traskrizzjoni (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

Fin-nuqqas ta 'attivaturi, ir-riċettur kostituttiv attiv (CAR) jinsab fiċ-ċitoplasma bħala kumpless ma' CCRP u HSP90. Iżda meta attivatur ikun preżenti, CAR jittrasloka fin-nukleu u jorbot ma 'RXR biex jifforma eterodimer u jorbot ulterjorment ma' diversi varjanti tal-motif ripetut, bħal DR3, DR4, ER6, u ER8, u jikkontribwixxi għar-regolamentazzjoni tal-espressjoni tal-ġene (Tabella Supplimentari 2).

L-analiżi tal-proteomika tagħna wriet l-attivazzjoni tal-metaboliżmu ksenobijotiku. Tabilħaqq, ir-regolazzjoni ċara ta’ CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (heme oxygenase 1), CAT (catalase), u CES1 (carboxylesterase 1) turi l-induzzjoni tal-metaboliżmu tal-Fażi I, filwaqt li żieda fl-espressjoni ta’ UGT1A1 (UDP glucuronosyltransferase familja 1 membru A1 () u GSTP1 glutathioneS-transferase pi 1) jindika l-attivazzjoni tal-metaboliżmu tal-Fażi II.

Interessanti, ir-regolazzjoni baxxa tas-sulfotransferase transferases bħal SULT1A1 (sulfotransferasefamily 1A membru 1), SULT1C2 (sulfotransferasefamily 1C membru 2), u SULT2B1 (sulfotransferase family 2B membru 1) tissuġġerixxi li ż-żieda fl-idrofiliċità fil-Fażi II għandu tendenza li jseħħ preferibbilment permezz tal-metaboliżmu gluthcuronic conjuga u gluta. , iżda mhux konjugazzjoni tas-sulfat (Fig. 4).

Ir-riżultati tal-istudju transcriptomic huma pjuttost konsistenti, peress li CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1, u UGT1A1 huma kollha regolati 'l fuq fil-livelli ta' theRNA. Madankollu, SULT2B1 juri regolazzjoni 'l fuq fil-livell tal-RNA (filwaqt li mhux rappreżentat biżżejjed fil-livelli tal-proteini).

Dan jista' jkun minħabba l-involviment ta' mekkaniżmi oħra li jinduċu d-degradazzjoni jew l-inattivazzjoni tal-enzima sulfate transferase wara trattament b'DEPe. Dak li huwa partikolarment sorprendenti huwa li dawn il-bidliet fil-metaboliżmu ksenobijotiku seħħew fl-irjus (preżumibbilment imħuħ) tal-ħut. L-espressjoni ta 'ġeni ksenobijotiċi ġiet deskritta fis-sistema nervuża tal-mammiferi, iżda dan huwa l-ewwel rapport tagħhom f'imħuħ tal-fish zebra(McMillan and Tyndale 2018).

Dawn is-sejbiet huma konsistenti ma 'studju simili li sar minn Shankar u sħabhom li ttestjaw l-effetti ta' gruppi differenti ta 'idrokarburi aromatiċi poliċikliċi ambjentali (PAHs) fuq l-iżvilupp ta' embrijuni u evalwaw aktar l-impatt ta 'kull kors ta' trattament fuq il-profil tat-transcriptome.

Fuq il-ġisem kollu ta 'embrijuni ta' 48 hpost-fertilizzazzjoni (hpf), huma wrew li r-regolazzjoni 'l fuq ta' Cyp1a kemm fil-livelli ta 'traskrizzjoni kif ukoll ta' proteina hija bijomarkatur affidabbli bikri ta 'attivazzjoni AHR ksenobijotika u bidliet transcriptomic downstream (Shankar et al. 2019).

Ir-rispons tal-istress ossidattiv2-medjat mill-NRF

L-istress ossidattiv jista 'jikkawża apoptożi u necrosisand huwa maħsub li huwa involut fin-newrodeġenerazzjoni (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Rispons ewlieni ta' difiża ċellulari għal stress ossidattiv huwa l-induzzjoni ta 'antiossidanti u enżimi ditossiċi.

Fattur nukleari-erythroid 2-fattur 2(Nrf2) relatat ma' elementi ta' rispons antiossidant promotur (ARE) u jattiva t-traskrizzjoni tagħhom. Nrf2 inattiv huwa assoċjat ma' proteinKeap1 li torbot l-actin u jinżamm fiċ-ċitoplasma.

Imqajjem minn stress ossidattiv, Nrf2 huwa fosforilat b'reazzjoni għall-proteina kinase C, phosphatidylinositol 3-kinase, u mogħdijiet MAP kinase. L-Nrf2 fosforilat jista 'mbagħad jittrasloka għan-nukleu u jorbot ARE biex transattiva l-enzimi ditossifikanti u antiossidanti (Tabella Supplimentari 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com