Sejbien U Karatterizzazzjoni ta 'Nanopartiċelli Mineralo-organiċi fil-Kliewi Umani

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Il-kalċifikazzjoni ektopika hija assoċjata ma 'diversi mard uman, inkluż l-aterosklerożi, il-kanċer,kronikakliewimard, udijabetemellitus. Għalkemm nanopartiċelli minerali ġew skoperti fil-vini tad-demm kalċifikati, in-natura u r-rwol ta 'dawn il-partiċelli fil-ġisem tal-bniedem għadhom mhux ċari. Hawnhekk nuru għall-ewwel darba dak il-bniedemkliewitessuti miksuba mill-istadju finalikronikakliewimardjew pazjenti bil-kanċer tal-kliewi fihom partiċelli minerali tondi u multilamellari ta' 50 sa 1,500 nm, filwaqt li l-ebda partiċelli ma huma osservati f'kontrolli b'saħħithom. Il-partiċelli minerali jinstabu prinċipalment fil-matriċi extraċellulari li jdawwar it-tubuli konvoluti, li jiġbru katusi u ħoloq ta 'Henle kif ukoll fi ħdan iċ-ċitoplasma ta' ċelluli li jiddelinejaw it-tubuli, u jikkonsistu f'fosfat tal-kalċju polikristallin simili għall-minerali misjub fl-għadam u kalċifikazzjonijiet ektopiċi. Il-kliewinanopartiċelli minerali fihom diversi proteini tas-serum li jinibixxu l-kalċifikazzjoni ektopika fil-fluwidi tal-ġisem, inklużi l-albumina, fetuin-A, u apolipoprotein A1. Peress li n-nanopartiċelli minerali organiċi jinstabu mhux biss f'depożiti kalċifikati iżda wkoll f'żoni nieqsa minn kalċifikazzjoni mikroskopika, l-osservazzjonijiet tagħna jindikaw li n-nanopartiċelli jistgħu jirrappreżentaw prekursuri ta 'kalċifikazzjoni u ġebel fil-kliewi fil-bnedmin.

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kalċifikazzjoni ektopika hija assoċjata ma 'aterosklerożi, kanċer,kronikakliewimard, u dijabete mellitus1-3. Studji riċenti jindikaw li l-aterosklerożi ukronikakliewimardpazjenti b'sinjali ta 'kalċifikazzjoni vaskulari juru riskji akbar ta' morbidità u mortalità, li jissuġġerixxu li l-kalċifikazzjoni ektopika hija ta 'detriment għas-saħħa tal-bniedem1,3. Kalċifikazzjoni mhux mixtieqa hija osservata wkoll f'individwi li qed jixjieħu u ħafna nies li għandhom aktar minn 60 sena juru sinjali ta 'kalċifikazzjoni vaskulari4. Għal dawn ir-raġunijiet, id-deċifrar tal-fatturi li jinduċu kalċifikazzjoni ektopika u l-iżvilupp ta 'trattament effettiv jirrappreżentaw għanijiet importanti.

Kalċifikazzjoni ektopika tista 'tiġi definita bħala żbilanċ bejn inibituri u indutturi tal-kalċifikazzjoni fil-ġisem. L-inibituri tal-kalċifikazzjoni jinkludu proteini tas-serum bħal albumina, fetuin-A, osteopontin, u proteina GLA tal-matriċi kif ukoll komposti żgħar bħall-pirofosfat, filwaqt li l-iperfosfatemja u l-infjammazzjoni jirrappreżentaw indutturi ewlenin tal-kalċifikazzjoni5-7. Studji reċenti jindikaw li l-indutturi tal-kalċifikazzjoni jattivaw proċess ċellulari simili għall-formazzjoni tal-għadam waqt il-kalċifikazzjoni vaskulari7,8. Vesicles matriċi simili għal dawk li jinduċu mineralizzazzjoni fl-għadam li qed jiżviluppa nstabu wkoll f'tessuti rotob kalċifikati7-9. Dawn il-vesikoli matriċi huma probabbilment rilaxxati minn ċelluli vaskulari tal-muskoli lixxi li jiddifferenzjaw f'ċelluli bħal osteoblasti, li jinduċu kalċifikazzjoni7.

Nanopartiċelli minerali (NPs) ġew skoperti f'tessuti rotob li juru sinjali ta 'kalċifikazzjoni ektopika. Price et al. sabet li s-serum tal-firien ittrattati jew bil-bisphosphonate etidronate jew bil-vitamina D port minerali-proteini kumplessi li fihom l-inibituri tal-kalċifikazzjoni fetuin-A u matrix GLA protein10,11. Bl-istess mod, Jahnen-Dechent et al. osserva li kumplessi minerali li fihom fetuin-A, li kienu jissejħu partiċelli calciprotein (CPPs), setgħu jiġu skoperti fil-fluwidu ascitic ta 'pazjenti b'peritonite kalċifikanti12. Studju reċenti minn Bertazzo et al. wera l-preżenza ta 'NPs minerali fil-valvi aortiċi u l-arterji koronarji kemm ta' pazjenti aterosklerożi kif ukoll bid-deni rewmatiku13. Filwaqt li studji dwar il-formazzjoni ta 'partiċelli minerali ġeneralment iffokaw fuq is-sistema kardjovaskulari tal-bniedem, għadu mhux ċar jekk il-partiċelli jistgħux jinstabu f'tessuti oħra u jekk dawn l-entitajiet għandhomx rwol fis-saħħa jew fil-mard.

Aħna osservajna qabel li l-NPS minerali organiċi jiffurmaw spontanjament fil-fluwidi tal-ġisem tal-bniedem u tal-annimali14-28. Dawn l-NPs minerali kienu inizjalment deskritti bħala nanobatterji (NB) u kienu maħsubin li mhux biss huma l-iżgħar ċelluli fid-dinja29, iżda wkoll kawża possibbli trażmissibbli ta’ bosta mard, inkluż il-marda ta’ Alzheimer, aterosklerożi, kanċer,kliewiġebelformazzjoni, poliċistikukliewimard, u prostatite30-32. Madankollu, ir-riżultati tagħna wrew li NB huwa fil-fatt NPs minerali mhux ħajjin li jimitaw batterji komuni f'termini tal-morfoloġija, it-tkabbir, il-proliferazzjoni u s-sottokultura tagħhom15,18,22. Għad trid tiġi eżaminata l-possibbiltà li partiċelli minerali simili għall-hekk imsejjaħ NB jistgħu jinstabu fit-tessuti tal-bniedem u jekk dawn il-partiċelli għandhomx rwol fil-mard.

Fl-istudju preżenti, żviluppajna approċċ nanomaterjali biex niskopru u janalizzaw NPs minerali-organiċi fil-bniedem morda.kliewitessuti. Aħna nuru li t-tessuti tal-kliewi minn mard kroniku tal-kliewi fl-aħħar stadju u pazjenti bil-kanċer tal-kliewi fihom NPs minerali multilamellari simili għall-partiċelli minerali bijomimetiċi li spontanjament jippreċipitaw fil-fluwidi tal-ġisem in vitro. Ir-riżultati tagħna jiżvelaw għarfien kritiku dwar il-kompożizzjoni bijokimika, il-mekkaniżmu ta 'formazzjoni, u l-funzjoni bijoloġika ta' dawn il-partiċelli minerali-organiċi u jitfgħu dawl fuq mekkaniżmi ta 'kalċifikazzjoni ektopika u bidu ta' mard fil-ġisem tal-bniedem.

Riżultati

Aħna eżaminajna tessuti tal-kliewi mneħħija kirurġikament minn pazjenti umani jew b'mard kroniku tal-kliewi fl-aħħar stadju (n=2) jew kanċer tal-kliewi (n=18; ara Tabella 1; għal kampjuni tal-kanċer tal-kliewi, iffukajna fuq il- -parti kanċeroġena tat-tessut). Bħala kontrolli b'saħħithom, aħna studjaw bijopsiji tal-kliewi miksuba minn pazjenti jew bi trawma jew ematoma iżda li qabel ma kellhom l-ebda funzjoni anormali tal-kliewi (n=2; Tabella 1).

Tessuti tal-kliewi minn individwi b'saħħithom wrew karatteristiċi istoloġiċi normali, u l-ebda kalċifikazzjoni ektopika ma ġiet osservata wara t-tebgħa ta 'von Kossa (Fig. 1A, B). Min-naħa l-oħra, tessuti tal-kliewi miksuba minn individwi morda u mtebbgħin b'ematossilina u eosina (H&E) wrew evidenza ta 'ħsara fit-tessuti (Fig. 2A-C, indikata minn vleġeġ), u 80 fil-mija tat-tessuti morda eżaminati wrew depożiti mineralizzati kif żvelat. permezz ta 'tbajja' von Kossa (Fig. 1C–T, Fig. 2E, F, il-kalċifikazzjoni hija viżibbli bħala materjal iswed indikat minn vleġeġ suwed; ara wkoll Tabella 1). Id-depożiti kalċifikati ġew innutati fil-kortiċi u l-medulla, inkluż l-ispazju extraċellulari li jdawwar it-tubuli konvoluti distali, it-tubuli konvoluti prossimali, il-kanali tal-ġbir u l-linji ta 'Henle kif ukoll iċ-ċitoplasma ta' ċelluli li jiddelinejaw it-tubuli u l-kanali (Fig. 1C-T u Fig. . 2E, F). L-ebda kalċifikazzjoni ma nstabet fil-korpuscle renali (Fig. 2D).

Biex neżaminaw in-natura tal-preċipitati minerali, ħejjejna sezzjonijiet tal-kliewi ultra-rqaq għall-osservazzjoni permezz ta 'mikroskopija elettronika ta' trasmissjoni (TEM). F'kampjuni li fihom depożiti minerali mikroskopiċi, partiċelli jew granuli minerali ġew skoperti fiċ-ċitoplasma taċ-ċelluli epiteljali renali, fil-matriċi extraċellulari taħt il-membrana tal-kantina, u fil-lumen ta 'tubuli konvoluti prossimali u distali (Fig. 3A, B, partiċelli huma mkabbra. fil-pannelli A1–A4 u B1–B4). NPs minerali ġew osservati wkoll fi ħdan iċ-ċelloli li jgħattu l-linji ta 'Henle u l-katusi tal-ġbir (Fig. 3C, D, imkabbra f'pannelli C1, C2, u D1). Xi partiċelli nstabu fi ħdan vesikuli intraċellulari fiċ-ċelloli renali (Fig. 3A, pannelli A1 u A2). L-approċċ tal-mikroskopija elettronika użat hawnhekk ippermetta wkoll li nħarsu l-interjuri tal-partiċelli minerali; xi partiċelli kellhom ċrieki densi ta 'elettroni li jalternaw ma' saffi ħfief u ċari ta 'elettroni (Fig. 3A, pannelli A3 u A4, Fig. 3C, panel C1). Diversi vini tad-demm, bħall-kirjiet vasa recta (l-arterji dritti tal-kliewi), aħna mdawra minn għadd kbir ta 'NPs minerali (Fig. 3D, panel D1). B'hekk instabu NPs minerali f'diversi postijiet fit-tessuti kollha tal-kliewi umani li juru sinjali ta' kalċifikazzjoni ektopika, filwaqt li ma nstabet l-ebda partiċelli fil-kontrolli b'saħħithom eżaminati.

Il-partiċelli minerali misjuba fit-tessuti tal-kliewi jidhru li huma simili ħafna għall-NPs mineralo-organiċi deskritti li jiffurmaw spontanjament fil-fluwidi tal-ġisem fl-istudji preċedenti tagħna15,17 (u li semmejna bions24). Biex tivverifika din il-possibbiltà, ħejjejna NPs organiċi minerali (jew bions) bl-użu ta 'metodu ta' preċipitazzjoni kif iddeskrivejna qabel15. Dan il-metodu jikkonsisti fiż-żieda ta' joni preċipitanti bħall-kalċju u l-fosfat f'medju ta' kultura taċ-ċelluli (Dulbecco's modifikat Eagle's medium jew DMEM) li jkun fih fluwidu tal-ġisem bħal serum uman (HS), segwit minn inkubazzjoni f'kundizzjonijiet ta' kultura taċ-ċelluli (ara Metodi). Il-partiċelli prodotti b'dan il-mod (HS-NPS) kienu jew sferiċi jew ellissojdi u wrew wiċċ minerali lixx jew kristallin (Fig. 4A-E), simili għall-partiċelli deskritti qabel fil-fluwidi tal-ġisem22,23 kif ukoll fl-axxite umana12 u arterji kalċifikati13. Il-partiċelli minerali kienu simili ħafna għall-NPs minerali jew granuli osservati fit-tessuti tal-kliewi f'termini tal-morfoloġija ġenerali tagħhom, l-istruttura b'ħafna saffi, u l-karatteristiċi tal-wiċċ (Fig. 4F-J). Id-daqs tal-partiċelli derivati ​​mill-HS u l-granuli tal-kliewi kienu wkoll komparabbli, li jvarjaw minn 50 sa 1,500 nm fid-dijametru (Fig. 4A-E, F-J). Kif innutat hawn fuq, xi granuli tal-kliewi kienu mdawra b'membrana tal-lipidi, possibilment tirrappreżenta vesicles tal-merkanzija intraċellulari jew vesicles tal-membrana extraċellulari (Fig. 4H, I, membrani huma indikati bi vleġeġ); strutturi tal-membrana bħal dawn kienu nieqsa f'kampjuni HS-NP ippreparati in vitro (Fig. 4A-E). Dawn l-osservazzjonijiet jissuġġerixxu li l-granuli tal-kliewi huma simili għall-NPs mineralo-organiċi immuntati fis-serum.

Bl-użu ta 'analiżi tad-diffrazzjoni tal-elettroni taż-żona magħżula, osservajna li l-fażi minerali ta' HS-NPs ippreparati in vitro kienet tikkonsisti f'nanomaterjal polikristallin (Fig. 4E, daħla; innota ċ-ċrieki konċentriċi debboli). Riżultati simili nkisbu għall-granuli tal-kliewi (Fig. 4J, daħla) u għall-għadam u l-kalċifikazzjonijiet ektopiċi kif deskritt fi studji preċedenti33,35.

Studjajna l-kompożizzjoni kimika ta 'HS-NPs u granuli tal-kliewi bl-użu ta' spettroskopija tar-raġġi-X li jxerred l-enerġija (EDX). HS-NPs wrew qċaċet ewlenin ta 'karbonju (C), kalċju (Ca), ossiġnu (O), u fosfru (P) (Fig. 4K), konsistenti mal-preżenza ta' minerali tal-fosfat tal-kalċju. A quċċata baxxa ta 'silikon (Si) kien innutat ukoll fl-HS-NPs (Fig. 4K), possibilment tirrappreżenta kostitwent partiċelli minuri. Granuli tal-kliewi wrew ukoll qċaċet ta 'karbonju, kalċju, ossiġnu u fosfru, indikattivi ta' minerali tal-fosfat tal-kalċju, flimkien ma 'qċaċet addizzjonali ta' silikon u ħadid (Fe) (Fig. 4L). Il-qċaċet tal-uranju (U) ġew attribwiti lill-uranyl acetate użat bħala reaġent kontrastanti waqt il-preparazzjoni tal-kampjun (il-preżenza tal-uranju f'xi kampjuni ta 'partiċelli minerali bħal granuli tal-kliewi u n-nuqqas tiegħu fit-tessut ta' kontroll f'Fig. 4M jistgħu jiġu attribwiti għall-għoli. affinità tal-uranju għall-fosfat, kif irrappurtat qabel35). Spettri ta 'kontroll EDX tat-tessut tal-kliewi madwar il-partiċelli wrew qċaċet ta' karbonju u ossiġnu (Fig. 4M), li jissuġġerixxi li l-kalċju u l-fosfru nstabu prinċipalment fil-partiċelli minerali.

Il-proporzjonijiet tal-kalċju: fosfru (Ca:P) ta 'HS-NPs u granuli tal-kliewi varjaw minn 0.65 sa 1.18. Dawn il-proporzjonijiet huma differenti mill-valur teoretiku ta' 1.67 osservat għall-idroksijapatit stojkjometriku iżda għadhom fil-medda li dehru qabel għall-kristalli tal-fosfat tal-kalċju u tal-apatite osservati fi gradi varji ta' kristallizzazzjoni15. Flimkien, dawn is-sejbiet jikkonfermaw li l-granuli tal-kliewi jikkonsistu minn NPs tal-fosfat tal-kalċju.

Diversi proteini nstabu li jinibixxu l-kalċifikazzjoni ektopika b'mod sistemiku fil-ġisem36,37. Barra minn hekk, il-korona tal-proteina misjuba fuq il-wiċċ ta 'NPs sintetiċi hija maħsuba li tiddetermina l-bijodistribuzzjoni u l-effetti tal-partiċelli fuq iċ-ċelloli in vivo38,39. Min-naħa l-oħra, il-kompożizzjoni tal-proteini ta 'NPs mineralo-organiċi misjuba fit-tessuti tal-kliewi tal-bniedem tibqa' mifhuma kompletament. Preċedentement sibna li l-albumina, fetuin-A, u apolipoprotein-A1 (apo-A1) jirrappreżentaw il-proteini ewlenin li jinteraġixxu ma 'NPs mineralo-organiċi ffurmati fil-fluwidi tal-ġisem17,20. Hawnhekk użajna tikkettjar immunogold biex neżaminaw il-preżenza u l-post ultrastrutturali ta 'dawn il-proteini fi ħdan granuli tal-kliewi.

Aħna użajna antikorpi poliklonali kontra albumina tas-serum uman (HSA), fetuin-A tas-serum uman (HSF), apo-1A uman, u HS sħiħ biex neżaminaw il-preżenza ta 'proteini tas-serum f'HS-NPs u granuli tal-kliewi. L-ispeċifiċità ta 'l-antikorpi poliklonali (ppreparati kif deskritt qabel25) ġiet ivverifikata bl-użu Western blotting (Fig. 5). Kull wieħed mill-antikorpi poliklonali rreaġixxa b'mod pożittiv mal-HS-NPs ippreparati in vitro kif ukoll mal-granuli minerali misjuba fit-tessuti tal-kliewi umani (Fig. 6A, B, pannelli A1-A3 u B1-B3; tikek suwed). L-antikorpi rreaġixxew prinċipalment bis-saffi densi ta 'l-elettroni jew il-qalba skura ta' HS-NPs u granuli tal-kliewi (Fig. 6A, B), li jindika li dawn iż-żoni skuri jista 'jkun fihom livelli ogħla ta' proteini meta mqabbla ma 'żoni ċari ta' l-elettroni. Kontrolli negattivi mwettqa mingħajr antikorp primarju ma pproduċew l-ebda reazzjoni (Fig. 6A, B, pannelli A4 u B4, kontroll). Aħna kkonkludejna li l-granuli tal-kliewi jirrappreżentaw NPs mineralo-organiċi simili għal HS-NPs ibbażati mhux biss fuq il-morfoloġija u l-kompożizzjoni minerali tagħhom iżda wkoll fuq l-irbit tagħhom mal-inibituri ewlenin tal-kalċifikazzjoni preżenti fis-serum.

Il-mikroskopija tal-immunofluworexxenza ntużat wara biex tikkonferma l-preżenza ta 'granuli minerali li fihom HSA u HSF fil-kliewi umani morda. Bl-użu ta 'din it-teknika, tessuti tal-kliewi umani wrew

tbajja pożittiva għaż-żewġ proteini f'diversi oqsma, inkluż l-interstizju madwar it-tubuli renali kif ukoll iċ-ċitoplasma ta 'ċelluli li jiddelinejaw it-tubuli (Fig. 7A, pannelli A1 u A2). Aggregati tal-proteini li fihom kemm albumina kif ukoll fetuin-A ġew innutati wkoll f'dawn l-oqsma, għalkemm f'ammonti aktar baxxi meta mqabbla mal-tbajja 'tal-proteini waħda (Fig. 7A u panel A3, tbajja magħquda fl-isfar). Notevolment, aħna ndunat li t-tbajja 'proteina misjuba mill-immunofluworexxenza jikkoinċidu mill-qrib mal-mudell ta' kalċifikazzjoni ektopika osservata bl-użu ta 'tbajja' von Kossa (Fig. 7A, B, kalċifikazzjoni hija viżibbli bħala materjal iswed indikat mill-vleġeġ f'B). Dawn ir-riżultati jipprovdu appoġġ ulterjuri għall-preżenza ta 'partiċelli mineralo-organiċi fit-tessuti tal-kliewi umani eżaminati.

Diskussjoni

Filwaqt li saru avvanzi fil-fehim tagħna tal-interazzjonijiet bejn NPs sintetiċi u ċelluli umani, nafu konsiderevolment inqas dwar l-effetti ta 'NPs mineralo-organiċi li jiffurmaw spontanjament fil-fluwidi tal-ġisem. L-istudji preċedenti tagħna wrew li dawn il-partiċelli jiffurmaw fil-fluwidi bijoloġiċi meta l-konċentrazzjonijiet ta 'kalċju u fosfat jaqbżu s-saturazzjoni15,16. Osservajna wkoll li dawn il-partiċelli huma internalizzati minn ċelluli immuni iżda li partiċelli kbar biss jinduċu reazzjonijiet immuni pro-infjammatorji23. Madankollu, id-distribuzzjoni ta 'dawn il-partiċelli fit-tessuti umani u jekk għandhomx xi rwoli fiżjoloġiċi jew patoloġiċi fil-ġisem ma kinux ġew eżaminati s'issa.

Fl-istudju preżenti, skoprejna għall-ewwel darba NPs mineralo-organiċi fil-kliewi ta 'pazjenti umani li jbatu minn mard tal-kliewi fl-aħħar stadju jew kanċer tal-kliewi. L-NPs mineralo-organiċi misjuba fihom fosfat tal-kalċju kristallizzat ħażin simili għall-minerali tal-għadam, kif ukoll albumina, fetuin-A, u apo-A1 li jaġixxu bħala inibituri sistemiċi tal-kalċifikazzjoni fil-fluwidi tal-ġisem. Ir-riżultati tagħna jaqblu ma 'rapporti preċedenti li ddeskrivew il-preżenza ta' kumplessi minerali-proteini fit-tessuti vaskulari u l-fluwidi tal-ġisem12,13,34,40. Peress li l-partiċelli li osservajna nstabu f'żoni li ma fihom l-ebda kalċifikazzjoni mikroskopika, l-osservazzjonijiet tagħna jissuġġerixxu li l-partiċelli jistgħu jirrappreżentaw prekursuri ta 'kalċifikazzjoni ektopika fit-tessuti tal-bniedem. Minħabba l-possibbiltà li NPs mineralo-organiċi jistgħu jikbru gradwalment fid-daqs u jgħaddu minn konverżjoni ta 'partiċelli għal film taħt kundizzjonijiet favorevoli kif deskritt fl-istudji preċedenti tagħna15,18, l-osservazzjonijiet ippreżentati hawn jissuġġerixxu li l-prekursuri minerali jistgħu jwasslu għall-formazzjoni ta' ikbar. depożiti minerali in vivo, bħall-plakka ta 'Randall u ġebel fil-kliewi.

L-osservazzjonijiet tagħna li kalċifikazzjonijiet ektopiċi minerali u NPs mineralo-organiċi jinstabu f'diversi strutturi anatomiċi tal-kliewi huma konsistenti ma 'sejbiet preċedenti ta' kalċifikazzjonijiet ektopiċi f'dan l-organu41. L-osservazzjonijiet ta 'Evan et al. indikaw li l-mineralizzazzjoni fil-kliewi ta' pazjenti b'nefrolitiasi tista 'tibda u sseħħ b'mod predominanti fit-tessut interstizjali tal-linji ta' Henle40,42. Dawn l-awturi osservaw li depożiti minerali li jiffurmaw f'din iż-żona jistgħu joħorġu 'l barra min-naħa bażali tal-urotelju u jwasslu għall-formazzjoni ta' ġebel fil-kliewi. L-osservazzjonijiet tagħna jissuġġerixxu li, minbarra l-linji ta 'Henle, żoni oħra tal-kliewi jista' jkun fihom NPs minerali li eventwalment jistgħu jevolvu biex jiffurmaw depożiti minerali kbar fil-kliewi umani. Qed ninvestigaw ukoll il-possibbiltà li NPs minerali li jiffurmaw fiċ-ċirkolazzjoni tad-demm jistgħu jittraslokaw fit-tessuti tal-kliewi u jinduċu kalċifikazzjoni ektopika u formazzjoni ta 'ġebel fil-kliewi.

Diversi granuli tal-kliewi misjuba fl-istudju preżenti jinstabu fi ħdan vesicles intraċellulari jew extraċellulari (Fig. 4H, I) u dawn huma simili għall-vesicles matriċi murija li jinduċu kalċifikazzjoni fl-għadam u snien7,8. Riċentement osservajna li l-vesikuli iżolati mis-serum tal-bniedem u tal-annimali jinduċu l-formazzjoni ta 'NPs minerali u preċipitati mikroskopiċi in vitro25. Schlieper et al.34 osservaw ukoll li partiċelli minerali misjuba fl-arterji huma assoċjati ma 'strutturi tal-membrana u pproponew li vesicles matriċi jew korpi apoptotiċi jistgħu jirrappreżentaw nucleators ta' partiċelli minerali f'dawn it-tessuti. Bl-istess mod, Khan et al. irrapporta li d-depożiti tal-fosfat tal-kalċju misjuba fil-kliewi ta 'pazjenti umani b'ġebel fil-kliewi idjopatiċi huma assoċjati ma' fibri tal-kollaġen u vesicles matriċi9. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-NPs mineralo-organiċi misjuba fit-tessuti tal-kliewi jistgħu jiffurmaw permezz ta 'mekkaniżmu li jinvolvi vesicles tal-membrana, sitwazzjoni analoga għal dak li jidher fl-arterji aterosklerotiċi7,8. Min-naħa l-oħra, studju reċenti wera li l-kalċifikazzjoni ektopika misjuba fl-arterji tas-sider tan-nisa ma kinitx assoċjata ma 'markers ta' ċelluli osteoġeniċi jew apoptotiċi43, li jissuġġerixxi li l-mekkaniżmu ta 'kalċifikazzjoni jista' jkun speċifiku għall-organu jew il-kuntest bijoloġiku involut. Barra minn hekk, NPs mineralo-organiċi bħal dawk deskritti hawnhekk it-tessuti tal-kliewi tal-bniedem jistgħu jiffurmaw ukoll minħabba nuqqas li jinżammu konċentrazzjonijiet fiżjoloġiċi ta 'jonji (eż., kalċju u fosfat) u inibituri tal-kalċifikazzjoni (eż., albumina, fetuin-A, u apo). -A1) fil-fluwidi tal-ġisem tal-bniedem.

Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li s-saff ta 'l-elettroni u l-qalba ta' NPs organiċi-minerali jista 'jkun fihom livelli ogħla ta' proteini u molekuli organiċi meta mqabbla maż-żoni ta 'l-elettron-lucent tal-partiċelli (Fig. 6A, B). Dawn is-saffi densi ta 'elettroni jidhru li huma mineralizzati kif jidher min-natura kristallina ta' dan il-materjal taħt TEM (ara Fig. 4A-J). Awturi oħra, inklużi Ryall41 u Evan et al.44, ipproponew li s-saff ta 'elettron-lucent jista' jirrappreżenta minerali filwaqt li saffi densi ta 'elettroni jistgħu jikkorrispondu għal molekuli organiċi. Dawn l-interpretazzjonijiet jistgħu jkunu dovuti għall-inqas parzjalment għall-mod li bih il-kampjuni ġew ipproċessati u eżaminati f'kull studju kif ukoll in-natura tat-tessuti tal-bidu użati.

Minbarra li għandhom rwol fil-kalċifikazzjoni ektopika, partiċelli minerali-organiċi jistgħu jinduċu infjammazzjoni fit-tessuti tal-kliewi. Riċentement urejna li filwaqt li NPs mineralo-organiċi jonqsu milli jinduċu s-sekrezzjoni ta' interleukin pro-infjammatorju-1 mill-makrofaġi umani, aggregati minerali akbar minn 1 μm huma kapaċi jagħmlu dan23. Ir-rilaxx ta 'interleukin-1 b'reazzjoni għal materjali kristallini intwera li jiddependi fuq l-attivazzjoni ta' kumplessi molekulari intraċellulari msejħa inflammasomes45–47. Barra minn hekk, il-partiċelli minerali nstabu fil-kliewi li fihom tumuri u l-assoċjazzjoni bejn il-kanċer u l-infjammazzjoni issa hija rikonoxxuta sew48. Il-possibbiltà li partiċelli minerali aggregati jistgħu jattivaw inflammasome u jikkontribwixxu għall-iżvilupp ta 'infjammazzjoni u kanċer fil-kliewi jew tessuti oħra għad trid tiġi investigata.

Minbarra l-kalċifikazzjoni ektopika, il-granuli minerali deskritti hawn jistgħu jipparteċipaw fi proċessi oħra ta 'mard. Pereżempju, ipproponejna qabel li NPs minerali jistgħu jorbtu ma 'diversi proteini fil-fluwidi tal-ġisem u jnaqqsu dawn il-molekuli organiċi mill-fluwidi tal-ġisem20,26. Min-naħa l-oħra, il-ġisem tal-bniedem jista 'jipprevjeni l-formazzjoni u l-akkumulazzjoni ta' NPs minerali f'ċirkostanzi normali billi jiddependi fuq il-preżenza ta 'inibituri tal-kalċifikazzjoni u s-sistema reticuloendoteljali (jiġifieri, makrofaġi). L-NPs minerali jistgħu għalhekk jakkumulaw biss ladarba l-omeostażi tal-kalċju sistemika jew lokali tkun imfixkla u meta l-mekkaniżmi protettivi jkunu fallew fil-ġisem tal-bniedem.

Nipproponu li l-approċċ nanomaterjali żviluppat hawn jista 'jintuża biex tistudja l-formazzjoni ta' NPs mineralo-organiċi fit-tessuti tal-annimali u tal-bniedem. Per eżempju, antikorpi mqajma kontra proteini inibitur tal-kalċifikazzjoni bħal albumina, fetuin-A, u apo-A1 jistgħu jintużaw flimkien ma 'analiżi minerali biex jiskopru u jikkaratterizzaw il-formazzjoni ta' NPs mineralo-organiċi fit-tessuti ta 'mudelli ta' annimali. Ir-riżultati miksuba bl-użu ta 'dan l-approċċ jistgħu jiġu applikati għal kejl kliniku magħmul fuq fluwidi tal-ġisem tal-bniedem sabiex jiġu identifikati parametri bijoloġiċi li jirriflettu l-istat tal-formazzjoni ta' partiċelli minerali u kalċifikazzjoni ektopika fil-ġisem. Nistennew li dan l-għarfien jista 'jwassal għall-iżvilupp ta' strateġiji terapewtiċi ġodda biex jipprevjenu u jittrattaw mard uman u kundizzjonijiet assoċjati ma 'kalċifikazzjoni ektopika.

Metodi

Tessuti tal-kliewi.L-użu ta 'tessuti umani u l-esperimenti mwettqa f'dan l-istudju ġew approvati mill-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali tal-Isptar Chang Gung Memorial; il-metodi u l-esperimenti twettqu skont il-linji gwida approvati. Inkiseb kunsens infurmat bil-miktub mill-pazjenti. Tessuti tal-kliewi b'saħħithom ta' kontroll inkisbu minn bijopsiji ta' pazjenti b'trawma u ematoma mingħajr storja ta' mard tal-kliewi (n=2); Tessuti tal-kliewi nkisbu wkoll minn pazjenti bil-kanċer tal-kliewi (n=20) u minn pazjenti tal-mard tal-kliewi fl-aħħar stadju (n=2) li l-kliewi tagħhom tneħħew jew ġew bijopsijati waqt kirurġija tat-trapjant (Tabella 1). Għat-tessuti tal-kanċer tal-kliewi, il-parti mhux kanċeroġena tat-tessut ġiet dissected u analizzata fl-istudju preżenti.

Analiżi istoloġika.It-tessuti tal-kliewi ġew immuntati fuq blokki tal-paraffin. Il-blokki tqassmu u slices tat-tessuti ġew imsaħħna fuq hot plate f'70 grad għal 30min biex titneħħa l-paraffin. Is-sezzjonijiet ġew mgħaddsa f'soluzzjoni friska ta 'xylene tliet darbiet għal 15-il minuta biex tneħħi kompletament il-paraffin li kien fadal. Is-sezzjonijiet ġew reidratati b'95 fil-mija, 80 fil-mija, u 70 fil-mija etanol għal 5 minuti kull darba. Kampjuni reidratati ġew maħsula b'ilma distillat doppju (ddH2O) għal 5min. In-nuklei taċ-ċelluli kienu mtebbgħin b'ematossilin għal 8min. Iż-żebgħa tneħħiet mill-kampjuni b'ilma sħun għal 10min. Il-kampjuni tal-kliewi tlaħlaħ f'ddH2O u ġew dipped 10 darbiet f'95 fil-mija etanol. Il-kampjuni ttrattati bl-etanol kienu kontro-mtebbgħin b'eosin Y għal 1min. Il-kampjuni ġew deidrati b'95 fil-mija u 100 fil-mija etanol għal 10min kull darba, segwiti minn pass ta 'deidrazzjoni fil-xylene għal 10min. Il-kampjuni finali tal-kliewi deidrati ġew immuntati fuq slides tal-ħġieġ b'50 fil-mija gliċerol u osservati taħt mikroskopju ħafif mgħammar b'kamera diġitali.

Eżemplari de-paraffinizzati u reidratati ġew ippreparati kif deskritt għat-tbajja 'H&E. Sezzjonijiet reidratati kienu mtebbgħin b'nitrat tal-fidda (5 fil-mija), segwiti minn espożizzjoni għal dawl UV għal 20min. Is-soluzzjoni ġiet maħsula b'ddH2O għal 15-il minuta. Is-sezzjonijiet ġew imtebba 'b'sodium thiosulfate (5 fil-mija) għal 5min, segwit minn ħasil b'ddH2O għal 15min. Is-sezzjonijiet kienu mtebbgħin bl-aħmar veloċi nukleari (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) għal 5min. Eżemplari mtebbgħin ġew deidrati suċċessivament b'95 fil-mija u 100 fil-mija etanol għal 10min kull wieħed, qabel id-deidrazzjoni fil-xylene għal 10min. Kampjuni tal-kliewi ġew immuntati fuq slides tal-ħġieġ u eżaminati kif deskritt hawn fuq.

Mikroskopija elettronika u analiżi EDX.Kampjuni tal-kliewi inqatgħu f'biċċiet żgħar ta 'inqas minn 1 mm ħxuna bl-użu ta' mikroskopju ta 'dissezzjoni LGPS (Olympus, Tokyo, Ġappun). It-tessuti ġew iffissati b'2.5 fil-mija glutaraldehyde u 1 fil-mija paraformaldehyde f'0.1 M cacodylate buffer f'4 gradi matul il-lejl. Kampjuni fissi ġew maħsula tliet darbiet b'0.1 M cacodylate buffer fi 8 fil-mija sukrożju (pH 7.2) fuq is-silġ għal 10min. Tessuti maħsula ġew inkubati f'salina buffered bil-fosfat (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) li kien fih 1 fil-mija tetrossidu tal-osmju u 1.5 fil-mija ferrocyanide tal-potassju għal 2h fuq is-silġ. It-tessuti ġew maħsula b'ddH2O fuq silġ 10min tliet darbiet. It-tessuti maħsula kienu mtebbgħin fuq is-silġ b'1 fil-mija uranyl acetate f'ddH2O għal siegħa, qabel ma jinħaslu tliet darbiet b'ddH2O fuq is-silġ. It-tessuti tal-kliewi ġew deidrati bi 30, 50, 70, 80, u 90 fil-mija etanol għal 10min kull darba, ħlief meta l-etanol laħaq 70 fil-mija, f'liema każ il-kampjuni nħażnu f'4 gradi matul il-lejl. It-tessuti kienu mtebbgħin b'1 fil-mija aċidu fosfotungstiku f'95 fil-mija etanol għal 15min, qabel id-deidrazzjoni b'95 fil-mija etanol għal 5min. Il-kampjuni ġew mgħaddsa f'ossidu tal-propilene f'40, 57, 67, u 100 fil-mija fl-etanol għal 10min kull darba, segwit minn immersjoni oħra f'ossidu tal-propilene 100 fil-mija għal 5min. It-tessuti tal-kliewi ġew infiltrati b'50, 70, u 100 fil-mija Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) għal 1h kull darba. Eponate 812-kampjuni tal-kliewi inkorporati ġew ippreparati billi inkubaw darbtejn f'100 fil-mija Eponate. Kampjuni inkorporati ġew inkubati f'forn f'60 grad matul il-lejl biex jippermettu l-polimerizzazzjoni tar-reżina.

Il-gerbub HS-NP maħsula miksuba kif hawn fuq ġew iffissati b'glutaraldehyde (2.5 fil-mija) u paraformaldehyde (1 fil-mija) f'ddH2O għal 4h f'4 gradi. Pritkuni fissi ġew maħsula b'ddH2O tliet darbiet għal 10min kull darba. Il-gerbub ġew deidratati b'inkubazzjonijiet suċċessivi fi 30, 50, 70, 80, 90, 95, u 100 fil-mija etanol, għal 10min kull darba, ħlief meta l-etanol laħaq 70 fil-mija, li fih il-gerbub kienu maħżuna f'4 gradi matul il-lejl. Soluzzjonijiet oħra ta' etanol tpoġġew biss f'kuntatt mal-gerbub għal 10min. Pritkuni deidrati ġew infiltrati b'mezz ta 'inkorporazzjoni abjad LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) bl-użu ta' proporzjonijiet differenti ta 'etanol u medju LR (3:1, 1:1, u 1:3) għal 30min kull wieħed. Il-gerbub ġew infiltrati b'medja LR friska (100 fil-mija) matul il-lejl qabel il-polimerizzazzjoni. Pellets infiltrati b'medja LR ġew inkubati f'forn f'60 grad għal jumejn biex jippermettu l-polimerizzazzjoni tar-reżina. Blokki tal-kliewi u HS-NPs ġew sezzjoni biex jipproduċu flieli bi ħxuna ta '70-100 nm bl-użu ta' mikrotomu Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, il-Ġermanja). Is-sezzjonijiet tat-tessuti kienu mtebbgħin b'4 fil-mija uranyl acetate qabel il-viżwalizzazzjoni taħt mikroskopju elettroniku ta 'trasmissjoni JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Ġappun) operat f'100 kV. Il-mudelli tad-diffrazzjoni tal-elettroni nkisbu bl-użu tal-istess sistema. Intużaw grilji tan-nikil bħala appoġġ.

Għall-analiżi EDX, sezzjonijiet irqaq ta 'tessuti tal-kliewi ġew imtebba' b'uranyl acetate u maħsula b'ddH2O bħal hawn fuq, segwiti minn tnixxif f'kabinett tad-dessikatur elettroniku. Il-kampjuni ġew osservati taħt mikroskopju elettroniku tat-trażmissjoni JEM 2100 b'riżoluzzjoni għolja (JEOL) operat f'120 kV. L-ispettri EDX inkisbu fi tliet kopji bl-użu ta 'sistema INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Sezzjonijiet irqaq ta 'HS-NPs ġew osservati mingħajr tbajja'.

Preparazzjoni ta' NPs mineralo-organiċi.Is-soluzzjonijiet tal-bidu kollha ġew aġġustati għal pH 7.4 u sterilizzati permezz ta 'filtrazzjoni permezz ta' membrani 0.2μm qabel l-użu. HS inkiseb minn voluntiera umani b'saħħithom bl-użu ta' teknika konvenzjonali ta' titqib tal-vini. L-użu ta 'fluwidi bijoloġiċi umani f'dan l-istudju ġie approvat mill-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali tal-Isptar Linko Chang Gung Memorial u nkiseb kunsens infurmat bil-miktub mill-voluntiera. HS-NPs ġew ippreparati billi żżid 3 mM CaCl2 u Na2HPO4 kull wieħed f'DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) li kien fih 10 fil-mija HS, segwit minn inkubazzjoni għal ġimgħa f'kundizzjonijiet ta 'kultura taċ-ċelluli (37 grad, 5 fil-mija CO2, arja umidifikata). Il-partiċelli ġew imqassma permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'16,000 × g għal 15min fi 4 gradi u maħsula darbtejn b'HEPES buffer (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) bl-użu tal-istess proċedura ta' ċentrifugazzjoni.

SDS-PAGE u Western blotting.L-analiżi SDS-PAGE u Western blot twettqet essenzjalment bħal qabel15. Fil-qosor, 0.2 ug (Fig. 5A,D) jew 1.2 ug (Fig. 5B,C) ta' proteini HS, 47 ug (Fig. 5A,B,D) jew 590ug ta' proteini HS-NP (Fig. 5C), 0.1ug ta' HSA (Fig. 5A–D), u 0.6ug (Fig. 5A, C, D) jew {{23} }.15ug ta 'HSF (Fig. 5B) ġew maħlula f'5× "loading buffer" (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 fil-mija SDS, 0.05 fil-mija bromophenol blu, 50 fil-mija glycerol, 12.5 fil-mija - mercaptoethanol) għal konċentrazzjoni finali ta '1 × , qabel it-tisħin f'95 grad għal 5min u separazzjoni taħt denaturazzjoni u kundizzjonijiet ta' tnaqqis fuq 10 fil-mija SDS-PAGE bl-użu ta 'sistema mini-ġel (Hoefer, Holliston, MA). Il-kontroll NP (użat fil-korsija 1 ta 'Fig. 5A-D) kien jikkonsisti minn NPs minerali ppreparati billi żżid 3 mM CaCl2 u Na2HPO4 kull wieħed f'DMEM (volum finali ta' 1ml), segwit minn inkubazzjoni għal ġurnata waħda f'kundizzjonijiet ta 'kultura taċ-ċelluli; il-partiċelli ġew imqassma permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'16,000 × g għal 15min, maħsula darbtejn bil-buffer HEPES, u sospiżi mill-ġdid f'50ul ta' buffer HEPES. Alikwot ta' 20ul ta' partiċelli sospiżi mill-ġdid ġie pproċessat għal SDS-PAGE kif hawn fuq. Il-membrani PVDF ġew imblukkati għal 1h f'5 fil-mija (w/v) ħalib bla xaħam f'temperatura tal-kamra. L-antikorpi primarji ġġenerati internament kif deskritt qabel25 intużaw f'dilwizzjoni ta' 1:1,000 (-apo-A1 u -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) , jew 1:6,000 ( -HSA). L-antikorp sekondarju konjugat mal-perossidażi tal-mogħoż kontra l-fenek intuża abbażi tal-istruzzjonijiet ipprovduti mill-manifattur (Millipore, Billerica, MA). Il-blots ġew żvelati bl-użu ta 'kimiluminixxenza msaħħa (Amersham Biosciences, Amersham, UK) u films awtoradjografiċi.

Tikkettar Immunogold.Ġew ippreparati kampjuni għall-osservazzjoni tat-TEM. Il-blokki HS-NP kienu maqsuma fi biċċiet ta' inqas minn 70 nm ħoxnin. Is-sezzjonijiet tal-kampjuni fuq il-gradilja ġew imblukkati b'1 fil-mija tal-ġelatina tal-ħut (Sigma) f'0.1 M HEPES buffer (pH 8.0) għal 25min. Il-grids ġew inkubati bl-antikorpi primarji li ġejjin: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Il-kontroll negattiv ma kien fih l-ebda antikorp primarju (1 fil-mija ġelatina tal-ħut fil-buffer HEPES). Is-sezzjonijiet inkubati ġew laħlaħ bil-buffer HEPES għal 15-il minuta. Is-sezzjonijiet laħlaħ ġew imblukkati b'1 fil-mija tal-ġelatina tal-ħut fil-buffer HEPES għal 20min. Il-kampjuni ġew ittrattati bl-IgG sekondarja 5-nm-gold-konjugate tal-mogħoż kontra l-fenek għal 1h. Il-kampjuni ġew maħsula bil-buffer HEPES għal 10min, qabel ma jinħaslu b'ddH2O għal 10min. L-osservazzjonijiet TEM saru kif hawn fuq.

Mikroskopija tal-fluworexxenza.Slajds istoloġiċi tat-tessut tal-kliewi ppreparati kif hawn fuq ġew imblukkati b'1 fil-mija albumina tas-serum bovin għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-pjastri ġew inkubati b'antikorpi poliklonali primarji f'dilwizzjoni ta' 1:4,000. Wara l-passi tal-ħasil, il-kampjuni ġew inkubati bl-antikorpi sekondarji mogħoż anti-fenek-FITC (492/520nm) u mogħoż anti-fenek-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) f'1:100 għal 1h. Il-kumplessi ġew maħsula bil-PBST għal 15-il minuta. It-tebgħa fluworexxenti 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) intużat f'10 ug/ml għal 15-il minuta. Il-kampjuni mtebbgħin bid-DAPI ġew deidrati b'95 u 100 fil-mija etanol għal 10min kull wieħed, segwit minn deidrazzjoni fil-xylene għal 10min oħra. Kampjuni tal-kliewi deidratati ġew immuntati b'mezz ta' muntaġġ Vectashield fluworexxenza H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) u ġew osservati taħt mikroskopju konfokali (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Ġermanja) mgħammra b'kamera Spot Flex.

Cistanche tubulosa jipprevjeni mard tal-kliewi, ikklikkja hawn biex tikseb il-kampjun

Referenzi

1. Giachelli, CM Kalċifikazzjoni ektopika: ġbir ta 'fatti iebsa dwar mineralizzazzjoni tat-tessut artab. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Kalċifikazzjoni vaskulari: mekkaniżmi u ramifikazzjonijiet kliniċi. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalċifikazzjoni fl-aterosklerożi. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Disinji u fatturi ta 'riskju għal aterosklerożi kalċifikata sistemika. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331-336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Nuqqasijiet ta 'proteini li jirregolaw il-kalċju f'pazjenti bid-dijalisi: kunċett ġdid ta' kalċifikazzjoni kardjovaskulari fl-uremija. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Targeting kalċifikazzjoni vaskulari: trattib-up mira iebsa. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Regolazzjoni tal-kalċju ta 'vesicles matriċi derivati ​​minn ċelluli vaskulari tal-muskoli lixxi. Xejriet Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Kalċifikazzjoni fl-aterosklerożi: bijoloġija tal-għadam u infjammazzjoni kronika f'salib it-toroq arterjali. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Assoċjazzjoni tal-plakki ta 'Randall b'fibri tal-kollaġen u vesikuli tal-membrana. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Karatterizzazzjoni bijokimika tal-kumpless fetuin-minerali tas-serum. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Il-livelli tas-serum tal-kumpless fetuin-minerali jikkorrelataw mal-kalċifikazzjoni tal-arterja fil-far. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Rwol ġerarkiku ta 'fetuin-A u proteini tas-serum aċidużi fil-formazzjoni u l-istabbilizzazzjoni tal-partiċelli tal-fosfat tal-kalċju. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Il-mikroskopija elettronika nano-analitika tiżvela għarfien fundamentali dwar il-kalċifikazzjoni tat-tessut kardjovaskulari tal-bniedem. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Nanobatterji allegati fid-demm tal-bniedem bħala nanopartiċelli tal-karbonat tal-kalċju. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Nanobatterji putattivi jirrappreżentaw fdalijiet fiżjoloġiċi u prodotti sekondarji tal-kultura tal-omeostasi normali tal-kalċju. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Karatterizzazzjoni ta 'granulazzjonijiet ta' kalċju u apatite fis-serum bħala kumplessi mineralo-proteini pleomorfiċi u bħala prekursuri ta 'nanobatterji putattivi. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD kumplessi Fetuin-A/albumina-minerali li jixbħu granuli tal-kalċju fis-serum u nanobatterji putattivi: dimostrazzjoni ta 'kunċett doppju ta' inibizzjoni-żerriegħa. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Iż-żieda u l-waqgħa tan-nanobatterji. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Evalwazzjoni kritika ta 'serum irradjat b'gama użat bħala alimentatriċi fil-kultura u dimostrazzjoni ta' nanobatterji putattivi u nanopartiċelli kalċifikanti. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Analiżi proteomika komprensiva ta 'nanopartiċelli minerali derivati ​​minn fluwidi tal-ġisem tal-bniedem u analizzati permezz ta' kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa tandem. Anal Biochem 418, 111–125 (2011).