Individwazzjoni ta' Varjanti MUC1 f'Pazjenti Dijanjostikati Klinikament B'Mard tal-Kliewi Tubulointerstizjali Awtosomali Dominanti

Introduzzjoni

Mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti (ADTKD)-MUC1 huwa prinċipalment ikkawżat minn mutazzjonijiet ta' frameshift minħabba inserzjoni ta' bażi waħda fir-reġjun tan-numru varjabbli tandem repeat (VNTR) f'MUC1. Minħabba l-kumplessità tal-hotspot varjant, l-identifikazzjoni bl-użu ta 'sekwencers ta' qari qasir (SRSs) hija ta 'sfida. Għalkemm studji reċenti wrew l-utilità ta 'sekwencers li jinqraw fit-tul (LRSs), il-prevalenza ta' varjanti MUC1 f'pazjenti b'ADTKD klinikament suspettat għadha mhux magħrufa. Għandna l-għan li niċċaraw din il-prevalenza u l-karatteristiċi ġenetiċi u l-manifestazzjonijiet kliniċi ta 'ADTKD-MUC1 f'popolazzjoni Ġappuniża li tuża SRS u LRS.

Metodi

Minn Jannar 2015 sa Diċembru 2019, saret analiżi ġenetika bl-użu ta’ SRS fi 48 pazjent b’ADTKD klinikament suspettat. Twettqu analiżi addizzjonali bl-użu ta' LRS f'pazjenti b'riżultati SRS negattivi.

Riżultati

Ir-riżultati tas-sekwenzjar fil-qari qasir żvelaw varjanti MUC1 f'pazjent 1 li jospita inserzjoni ta 'ċitosina fit-tieni unità ripetuta tar-reġjun VNTR; madankollu, reġjuni VNTR aktar profondi ma setgħux jinqraw mill-SRS. Għalhekk, għamilna analiżi ta 'sekwenzjar ta' qari fit-tul ta '39 każ u skoprejna varjanti MUC1 VNTR f'8 pazjenti (b'kollox, 9 pazjenti minn familji mhux relatati). Bl-inklużjoni ta 'pazjenti affettwati mill-familja (n ¼ 31), l-età medjana fl-iżvilupp ta' mard tal-kliewi fl-aħħar stadju (ESKD) kienet 45 sena (95 fil-mija CI: 40-40 sena).

Konklużjoni

Fil-Ġappun, ir-rata ta 'skoperta ta' varjanti MUC1 f'pazjenti b'ADTKD klinikament suspettat kienet ta '18.8 fil-mija. Aktar minn 20 fil-mija tal-pazjenti b'riżultati SRS negattivi kellhom varjanti MUC1 misjuba minn LRS.

Kliem ewlieni

ADTKD; ADTKD-MUC1; sekwenzar ta' qari fit-tul; MCKD; NGS; Sekwenzar SMRT.

Ikklikkja hawn biex tiksebCistanche benefiċċji

ADTKD huwa grupp ta' mard tal-kliewi ereditarju kkaratterizzat minn fibrożi tubulointerstizjali progressiva u atrofija tubulari li twassal għal ESKD. ADTKD jista 'jinqasam f'sottotipi bbażati fuq id-difetti ġenetiċi kawżattivi sottostanti, inklużi anormalitajiet f'UMOD, MUC1, REN, HNF1B, u SEC61A1. Minħabba n-nuqqas ta 'speċifiċità tal-karatteristiċi ta' unifikazzjoni komuni ta 'ADTKD, inklużi anormalitajiet b'mod ċar tas-sediment urinarju u proteinurja ħafifa għal negattiva, ADTKD huwa preżunt li huwa sottodijanjostiku ħafna.

MUC1 hija glikoproteina transmembrana espressa ħafna fil-membrana apikali tar-riġlejn axxendenti ħoxna tal-linja ta 'Henle, tubuli konvoluti distali, u kanali tal-ġbir. L-aktar kawża ġenetika komuni ta 'ADTKD-MUC1 hija varjant ta' frameshift ikkawżat mill-inserzjoni ta 'bażi ​​waħda fil-polimorfiżmu VNTR ta' MUC1 (OMIM 158340; 1q22) f'exon 2.5 Din il-mutazzjoni ttemm is-sintesi tal-proteina MUC1 wara r-reġjun VNTR u joħloq proteina mqassra ġdida (MUC1fs) li m'għandhiex dominju C-terminal (Figura 1a). MUC1fs imbagħad jakkumula fiċ-ċitoplasma minħabba trasport anormali ta 'proteini intraċellulari. Ir-reġjun VNTR juri varjazzjoni interindividwali sostanzjali minħabba li huwa magħmul minn 60-unitajiet tan-nukleotidi li jirrepetu 20 sa 125 darba, b'kull allel ikollu ripetizzjonijiet uniċi (Figura 1b). Għalhekk, l-iskoperta ta 'varjanti tal-ġeni bl-użu ta' SRSs kienet ta 'sfida minħabba l-kumplessità tal-hotspot varjant.

Studji preċedenti użaw metodi alternattivi, inklużi l-ispettrometrija tal-massa u l-estensjoni tas-sonda kif jgħid, biex jiskopru varjanti kawżattivi; madankollu, dawn il-metodi huma teknikament eżiġenti. Studji reċenti sabu l-utilità ta 'LRSs, li jużaw metodu ta' sekwenzar ta 'molekula waħda f'ħin reali (SMRT) biex jidentifikaw varjanti MUC1 VNTR. Madankollu, il-varjanti MUC1 VNTR għadhom ma ġewx ikkaratterizzati fil-popolazzjoni Ġappuniża. Barra minn hekk, il-prevalenza ta' varjanti MUC1 f'pazjenti b'ADTKD klinikament suspettat għadha mhux magħrufa. Għalhekk, l-għan ta 'dan l-istudju kien li jiċċara din il-prevalenza, inklużi l-karatteristiċi ġenetiċi u l-manifestazzjonijiet kliniċi, ta' ADTKD-MUC1 fil-popolazzjoni Ġappuniża. Hawnhekk, aħna djanjostikajna 9 pazjenti b'ADTKD-MUC1 li kellhom varjanti VNTR misjuba bl-użu ta' SRS (n ¼ 1) jew LRS (n ¼ 8) fost 48 każ ADTKD klinikament suspettat.

Metodi

1. Parteċipanti

Bejn Jannar 2015 u Diċembru 2019, għamilna analiżi ġenetika fi 48 pazjent b'ADTKD klinikament suspettat. Il-parteċipanti kellhom disfunzjoni renali minn kawżi mhux magħrufa, b'anormalitajiet fl-awrina ħfief għal negattivi. Il-pazjenti kienu klinikament dijanjostikati li kellhom ADTKD jekk kellhom storja familjari pożittiva ta’ mard kroniku tal-kliewi u/jew iperuriċemija jew jekk is-sejbiet patoloġiċi fuq bijopsija tal-kliewi wrew jew mard tal-kliewi ċstiku medullari (it-terminu preċedenti għal ADTKD-MUC1 u ADTKD-UMOD), tubulointerstizjali. nefrite, jew ħsara interstizjali kronika. Eskludejna pazjenti b'malformazzjonijiet renali u/jew sintomi extrarenali. Il-kampjuni tad-DNA ġew analizzati l-ewwel bl-użu ta' SRS. Aktar investigazzjonijiet imbagħad saru f'pazjenti b'riżultati SRS negattivi (n ¼ 39) bl-użu ta' LRS. Il-kampjuni u l-informazzjoni klinika kollha nkisbu minn sptarijiet ta’ referenza Ġappuniżi. Analiżi ġenetiċi saru wara li nkisbet kunsens infurmat bil-miktub mill-pazjenti u/jew il-gwardjani tagħhom jekk il-pazjent kien minorenni. Dan l-istudju ġie approvat mill-Bord ta 'Reviżjoni Istituzzjonali tal-Iskola tal-Mediċina tal-Università ta' Kobe (numru ta 'approvazzjoni 301).

2. Sekwenzar Qari Qasira

Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes using the QuickGene Mini 80 system (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan). For targeted sequencing using an SRS, samples were prepared using HaloPlex (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) according to the manufacturer's instructions. Paired-end sequencing was performed on the MiSeq platform (Illumina, San Diego, CA). HaloPlex was used for targeted sequencing of 128 genes (version 2, Supplementary Table S1), 172 genes (version 4, Supplementary Table S2), 159 genes (version 5, Supplementary Table S3), 164 genes (version 6, Supplementary Table S4), 181 genes (version 7, Supplementary Table S5), and 183 genes (version 8, Supplementary Table S6) associated with congenital anomalies of the kidney and urinary tract, cystic kidneys, ADTKD, and nephronophthisis. The HaloPlex version used for each patient is found in Supplementary Table S7. Reads were aligned to the reference human genome (GRCh37/Hg19) using SureCall 4.0, which is a desktop application combining algorithms for end-to-end next-generation sequencing data analysis from alignment to categorization of mutations (Agilent Technologies). We excluded called variants with minor allele frequencies >1 fil-mija f'databases tal-varjazzjonijiet umani disponibbli pubblikament, bħal dawn li ġejjin: Database tal-Varjazzjoni Ġenetika tal-Bniedem (http://www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/SnpDB/), gnomAD (https://gnomad.broadinstitute .org/), u databases ta’ 1000 Genomes Project (1000G) (https://www. internationalgenome.org/data). Il-varjanti tal-kandidati ġew magħżula bl-użu tas-softwer ta' tbassir komputazzjonali, SIFT (https://sift.bii.astar.edu.sg/), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) , Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/), u CADD (https://cadd.gs.washington.edu/snv), u mbagħad ikklassifikati bħala patoġeniċi, probabbli patoġeniċi, jew sinifikat inċert, skont il- linji gwida tal-Kulleġġ Amerikan tal-Ġenetika Medika u l-Ġenomika.9

3. Preparazzjoni tal-Librerija u Sekwenzar ta' Qari fit-Tul (Sekwenzar SMRT)

L-amplicons ġew miġbura fi proporzjonijiet ekwimolari u ppreparati għal libreriji ta' sekwenza SMRTbell bl-użu ta' SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Sussegwentement, inbena mudell tas-sekwenza billi twaħħlet is-sekwenza primer verżjoni 2 u DNA polymerase mal-adapters fiż-żewġt itruf tal-librerija tas-sekwenza, u l-mudell ġie mgħobbi fuq ċellula SMRT. Is-sekwenzjar SMRT sar bl-użu tas-Sistema PacBio Sequel II b'Sequel II Sequencing Kit 2.0. Id-dejta sekwenzata ġiet analizzata bl-SMRT Link verżjoni 9.0.0, u nkisbu sekwenzi ta' kunsens preċiżi ħafna. Minn hemm 'il quddiem, il-clustering tas-sekwenza sar bl-użu ta' l-għodda ta 'analiżi "pbaa", li hija adattata għall-analiżi ta' sekwenzi ripetittivi. Il-preparazzjoni tal-librerija, is-sekwenzjar, u l-analiżi tal-bijoinformatika tas-sekwenzjar SMRT tmexxew minn Takara Bio (Kusatsu, Shiga, Ġappun). Is-sekwenza tan-nukleotidi, in-numru ta' qari, u l-frekwenza tal-alleli ġew ikkompilati f'fajl Excel għal kull pazjent (dejta mhux żvelata). Għal kull sekwenza identifikata, bnejna manwalment is-sekwenza kull bażi 60 għal kull linja, kif deskritt minn Kirby et al.5 (Figura 1b). Minħabba żbalji potenzjali tal-PCR fis-sekwenza VNTR kumplessa, ġew skoperti sekwenzi multipli f'kull pazjent. Is-sekwenzi korretti ġew identifikati billi tqabbel ir-riżultati LRS ma 'elettroferogrammi tal-amplicons miksuba bl-użu ta' bioanalizzatur (Tabella Supplimentari S8). Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, l-aqwa 2 sekwenzi bl-ogħla numru ta’ qari ġew determinati li huma korretti. F'xi każijiet, madankollu, sekwenzi bit-tielet jew l-aktar numru l-aktar baxx komuni ta' qari ġew determinati li huma korretti jekk id-daqsijiet tagħhom kienu mqabbla mal-qċaċet tal-elettroforeżi misjuba mill-bijoanalizzatur (SC449, SC511, SC534, SC560, SC566, SC593, SC616, u SC639) minħabba l-ineffiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR ta 'alleli twal meta d-daqs tar-reġjun VNTR taż-żewġ alleli kien differenti b'mod sinifikanti.

Trab Cistanche u estratt Cistanche

Diskussjoni

Sa fejn nafu, dan huwa l-ewwel rapport ta 'analiżi ġenetika ta' varjanti MUC1 VNTR misjuba bl-użu ta 'kombinazzjoni ta' SRS u LRS f'koorti Ġappuniża. Aħna identifikajna mutazzjonijiet MUC1 VNTR f'9 pazjenti minn familji mhux relatati. Barra minn hekk, ir-rata ta 'skoperta ta' varjanti MUC1 fost pazjenti b'ADTKD klinikament suspettat kienet ta '18.8 fil-mija.

Minħabba l-kumplessità tal-hotspot varjant, l-iskoperta ta 'varjanti MUC1 VNTR permezz ta' analiżi ġenetika ta 'rutina bl-użu ta' SRS hija ta 'sfida, u metodi oħra, bħall-metodu snapshot jew spettrometrija tal-massa, huma tipikament meħtieġa. Sfortunatament, dawn il-metodi huma teknikament eżiġenti u jitwettqu biss fi ftit laboratorji madwar id-dinja.5,6 Wenzel et al.7 wettqu sekwenzar SMRT u kkonfermaw id-dijanjosi kollha f'parteċipanti Ewropej minn familji 9 b'varjanti MUC1 VNTR misjuba qabel bl-użu tal-metodu snapshot. Wang et al.8 wrew ukoll l-utilità tas-sekwenzjar SMRT għall-iskoperta ta 'mutazzjonijiet MUC1 VNTR f'familja Ċiniża kbira. Madankollu, minħabba d-disinn tal-istudju tagħhom, dawn iż-żewġ studji ma ddeterminawx ir-rata ta' skoperta ta' varjanti MUC1 VNTR f'pazjenti b'ADTKD klinikament suspettat. F'dan l-istudju, aħna ċċaraw li r-rata dijanjostika tal-varjanti MUC1 f'pazjenti b'ADTKD klinikament suspettat kienet ta '18.8 fil-mija, li tista' tiffaċilita probabbiltajiet aktar preċiżi, speċjalment waqt pariri ġenetiċi.

Id-dejta dwar il-prevalenza ta’ ADTKD-MUC1 hija limitata, għalkemm studji preċedenti wrew prevalenza ta’ 0.7 sa 4 għal kull miljun fl-Istati Uniti u l-Irlanda.3,13 Studju fl-Ingilterra żvela prevalenza stmata ta’ ADTKD -UMOD ta' 9 għal kull miljun, li jissuġġerixxi ADTKD-UMOD huwa l-aktar mard tal-kliewi mhux poliċistiku frekwenti. ADTKD.

Minkejja l-kumplessità strutturali tar-reġjun MUC1 VNTR, SRS seta’ jiskopri varjanti fi 3 pazjenti, li kollha kellhom l-istess mutazzjoni: ċitosina mdaħħla f’7 ċitosini konsekuttivi fl-aħħar tal-unità ta’ 60-nukleotide fit-tieni ripetizzjoni ta’ il-VNTR. Kien preżunt li l-varjanti fil-parti baxxa tal-MUC1 VNTR (sat-tielet ripetizzjoni tal-VNTR) ikunu skoperti anki jekk id-DNA kien frammentat (100-200 par bażi għal kull qari) bħala parti mill-preparazzjoni tal-kampjun għall-analiżi SRS. Yamamoto et al.15 identifikaw mutazzjoni frameshift oħra li tinsab qabel ir-reġjun MUC1 VNTR bl-użu ta 'SRS (sekwenza exome sħiħa). Din il-mutazzjoni tiġġenera wkoll proteina maqtugħa b'mod anormali bl-istess mod bħall-mutazzjoni pożizzjonata fi ħdan il-VNTR.15 Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-analiżi SRS tista 'tkun utli biex jinstabu varjanti pożizzjonati qabel jew fir-reġjun baxx tal-VNTR.

Fl-istudju tagħna, 7 mid-9 pazjenti b'varjanti MUC1 VNTR kellhom l-istess 60-sekwenza ta' unità tan-nukleotide li fiha ċ-ċitosina mdaħħla (Tabella 2). Fi studji preċedenti li fihom saret analiżi ġenetika ta’ sekwenzar ta’ qari fit-tul għal MUC1 VNTR, l-istess varjant ġie skopert f’9 familji f’koorti Ewropea7 u familja Ċiniża kbira.8 Barra minn hekk, din il-mutazzjoni ġiet skoperta bl-użu tal-metodu snapshot u kienet definit bħala "27dupC."12 Olinger et al.16 irrapportaw li l-prevalenza tal-varjant 27dupC kienet 93.5 fil-mija f'2 reġistri ta 'ADTKD fl-Ewropa u l-Istati Uniti. Permezz ta 'dawn is-sejbiet, id-dejta tagħna indikat li l-varjant 27dupC kien l-aktar mutazzjoni MUC1 komuni f'koorti Ġappuniża.

Supplimenti ta' Cistanche

In-numru ta 'repetizzjonijiet VNTR ġie rrappurtat li huwa 20 sa 253; madankollu, fl-istudju tagħna, in-numru ta 'repetizzjoni VNTR varja minn 30 sa 82, bi 80 fil-mija tal-alleli li jkollhom 30 sa 36 ripetizzjoni. Studju preċedenti fl-Ewropa rrapporta li l-perċentwal ta 'alleli b'30 sa 36 ripetizzjoni kien ta' 39 fil-mija, li jista 'jkun sostnut mill-omoġeneità etnika tal-popolazzjoni Ġappuniża. L-istudju preżenti wera li l-età medjana fl-iżvilupp ta 'ESKD kienet ta' 45 sena (95 fil-mija CI: 40-50 sena) f'pazjenti b'ADTKD-MUC1, inklużi pazjenti milquta mill-familja f'koorti Ġappuniża (9 familji, n ¼ 31). Studju preċedenti evalwa 147 individwu, inklużi pazjenti b'mutazzjonijiet MUC1 u l-membri tal-familja affettwati tagħhom, u żvela li l-età medja fl-iżvilupp tal-ESKD kienet 44.9 15.4 snin. 104 pazjent b'ADTKD-MUC1 kien ta' 36 sena (medda interkwartili: 30-46 sena), li jista' jiġi spjegat bl-esklużjoni ta' membri tal-familja affettwati li ma għaddewx minn analiżi ġenetika.16 Barra minn hekk, ġew irrappurtati varjazzjonijiet interfamiljari u intrafamiljari f'pazjenti. b'varjanti MUC1,8,17,18 għalkemm l-eżistenza ta 'ġeni modifikaturi jew fatturi oħra għadha mhux magħrufa. Fl-istess perjodu ta 'studju, skoprejna wkoll mutazzjonijiet f'HNF1B, ġene kawżattiv għal ADTKD, f'19-il pazjent. Madankollu, pazjenti b'mutazzjonijiet HNF1B suspettati klinikament ġew esklużi mill-istudju tagħna waqt ir-reġistrazzjoni, minħabba li ħafna minn dawn il-pazjenti kienu klinikament distinti minn dawk b'ADTKD-MUC1 minħabba anormalitajiet morfoloġiċi fis-sistema renali tal-passaġġ urinarju u/jew storja familjari awtosomali dominanti ta' dijabete bikrija u/jew ipomanjeżmija, u qabel irrapurtajna dwar din il-popolazzjoni ta’ pazjenti.19 Tabilħaqq, rapport ta’ kunsens tal-Kidney Disease: Improving Global Outcomes u reviżjoni reċenti ta’ ADTKD issuġġerixxa li t-terminu ADTKD-HNF1B għandu jkun riżervat biss għal dawk il-każijiet f’ liema fibrożi tubulointerstizjali tal-kliewi hija l-manifestazzjoni ewlenija minħabba li ftit każijiet biss preżenti b'mard tubulointerstizjali biss.1,20 Anemija tat-tfulija, pressjoni baxxa ħafifa, u iperkalemija ħafifa huma maħsuba li huma karatteristiċi speċifiċi ta 'ADTKD-REN. Madankollu, studju ta’ koorti internazzjonali reċenti dwar il-karatteristiċi kliniċi ta’ 111-il pazjent ADTKD-REN irrapporta li madwar 70 fil-mija tal-pazjenti ppreżentaw lil istituzzjonijiet mediċi għal mard kroniku tal-kliewi jew gotta.21 Skont dan ir-rapport, l-anemija fit-tfulija kienet preżenti f’75.8 fil-mija tal- pazjenti iżda s-severità tagħha kienet relattivament ħafifa; il-livelli medji tal-emoglobina kienu 9.6, 10.1, u 10.5 g/dl għall-etajiet<10 years, 10 to <15 years, and 15 to <20 years, respectively.21 Although hypotension was not reported in the article, the severity of hyperkalemia was mild and the mean serum potassium level in patients who were not taking fludrocortisone was 4.8 mEq/l.21 Childhood anemia, hypotension, or hyperkalemia may often be overlooked, and they are not always specific to ADRKD-REN; thus, we did not exclude participants with these findings. ADTKD-SEC61A1 is much rare than other ADTKD subtypes, with 6 families reported as of date.22 Patients harboring SEC61A1 mutation present with specific features, such as intrauterine growth retardation, cleft palate, congenital anemia, neutropenia, and immunodeficiency.3,22 Although the clinical manifestations of ADTKD-REN have not been completely clarified owing to the small number of reported cases, patients presenting with these specific features can be clearly distinguished from those with ADTKD-MUC1.

Cistanche tubulosa

Studji riċenti dwar il-mekkaniżmi molekulari u ċellulari ta 'ADTKD-MUC1 wrew li din il-kundizzjoni hija proteinopatija tossika kkawżata mill-akkumulazzjoni intraċellulari ta' proteina MUC1 mitwija ħażin.11,23 Dvela-Levitt et al.24 irrapportaw l-użu ta 'molekula żgħira, BRD4780 , biex tbiddel ir-rotta sekretorja għal liżosomi, li tiżvela li MUC1fs ġew eliminati fil-ġrieden knock-in u organoids tal-pazjent u tenfasizza l-potenzjal terapewtiku ta 'BRD4780. Għaldaqstant, dijanjosi preċiża ta 'varjanti MUC1 tista' tkun kruċjali għall-iżvilupp ta 'aġenti terapewtiċi effettivi. L-istudju tagħna kellu diversi limitazzjonijiet. L-ewwel, il-parteċipanti kollha tal-istudju tagħna kienu Ġappuniżi, u d-daqs tal-kampjun tagħna kien żgħir minħabba t-tul qasir tal-istudju. Minħabba n-natura retrospettiva ta 'dan l-istudju, ma stajna wkoll niksbu informazzjoni klinika lonġitudinali, bħal pronjosi renali. It-tieni, inserzjonijiet ta 'bażi ​​waħda ġew osservati anke f'alleli mingħajr mutazzjonijiet. Minħabba r-rata għolja ta 'żball, kien ta' sfida li jinkiseb assemblaġġ ta 'kwalità għolja biex jinstabu varjanti jew indels b'nukleotide wieħed bl-użu ta' LRS. Kien meħtieġ li tgħaqqad it-teknoloġiji tas-sekwenzjar biex jinstabu t-tipi differenti kollha ta 'varjazzjonijiet ġenetiċi, li jżid l-ispiża u l-kumplessità tal-proġetti. Għalhekk, PacBio fassal sistema ġdida ta 'sekwenzjar, imsejħa sekwenzar ta' kunsens ċirkolari. Is-sekwenzjar ta 'kunsens ċirkolari jipproduċi qari ta' fedeltà għolja b'eżattezza ta '99.8 fil-mija u tul medju ta' 13.5 kilobase, li jnaqqas drastikament ir-rata ta 'żball ta' sekwenzar.25 Dan il-metodu ta 'sekwenzjar kien applikat ukoll fl-istudju tagħna. Għalhekk, meta wieħed iqis it-titjib fl-eżattezza tas-sekwenzjar, inserzjonijiet ta 'bażi ​​waħda kienu possibbilment ikkawżati minn żball tal-PCR. Anki jekk KOD Hot Start DNA polymerase ġiet ottimizzata għall-amplifikazzjoni tal-miri l-aktar diffiċli,26 DNA polymerases oħra, li l-fedeltà tagħhom hija ogħla minn dik tal-KOD (eż., Phusion), jistgħu jikkontribwixxu fit-tnaqqis tar-rata tal-iżball tal-PCR.27 Riċenti studji sabu protokoll mingħajr amplifikazzjoni għal arrikkiment immirat bl-użu tas-sistema ta 'repetizzjonijiet palindromiċi qosra raggruppati regolarment interspazjati/Cas9.28,29 Dan il-metodu ġdid x'aktarx jipprovdi riżultati aħjar. It-tielet, aħna ma vvalidajniex metodu alternattiv li jista 'jiffaċilita dijanjosi, bħal immunostaining ta' kampjuni tal-kliewi jew ċelloli derivati ​​mill-awrina. Kirby et al., 5 li l-ewwel irrappurtaw il-mutazzjoni kawżattiva għal ADTKD-MUC1, wettqu analiżi immunoistokimika ta 'kampjuni tal-kliewi minn pazjenti b'mutazzjonijiet MUC1. Huma rrappurtaw li, għalkemm immunostaining f'kontrolli normali rriżultaw f'tbajja mhux speċifika, pazjenti b'mutazzjonijiet MUC1 esibew mudell speċifiku ta 'tbajja' intraċellulari fil-linja ta' Henle, tubuli distali, u kanali tal-ġbir. 11,13,18,30 Yamamoto et al.15 skoprew proteina MUC1 mutant fl-eżosomi tal-awrina. Għalkemm il-manifestazzjonijiet kliniċi ta 'ADTKD-MUC1 mhumiex speċifiċi, dawn l-analiżi mhux ġenetiċi jistgħu jappoġġjaw id-dijanjosi klinika. Għalhekk, huwa meħtieġ li tivverifika l-utilità ta 'dawn l-analiżi mhux ġenetiċi flimkien mar-riżultati tal-istudju tagħna. Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna jiżvela li l-analiżi ġenetika kombinata ma 'SRS u LRS hija utli għall-iskoperta ta' varjanti MUC1 VNTR f'koorti Ġappuniża u li l-prevalenza ta 'ADTKD-MUC1 tista' tkun għolja f'din il-popolazzjoni. Analiżi ġenetika kombinata bl-użu ta 'SRS u LRS x'aktarx ittejjeb ir-rata ta' dijanjosi ta 'ADTKD-MUC1 u tista' tikkontribwixxi għall-iżvilupp ta 'approċċi ta' trattament ottimali.

REFERENZI

1. Eckardt KU, Alper SL, Antignac C, et al. Mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti: dijanjosi, klassifikazzjoni u ġestjoni - rapport ta 'kunsens KDIGO. Kidney Int. 2015;88:676–683. https://doi.org/10. 1038/ki.2015.28

2. Bolar NA, Golzio C, Zivná M, et al. Mutazzjonijiet eterozigoti ta' telf ta' funzjoni SEC61A1 jikkawżaw mard tal-kliewi tubulo-interstizjali awtosomali dominanti u glomeruloċistiku b'anemija. Am J Hum Genet. 2016;99:174–187. https://doi.org/ 10.1016/j.ajhg.2016.05.028

3. Devuyst O, Olinger E, Weber S, et al. Mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti. Nat Rev Dis Primers. 2019;5: 60. https://doi.org/10.1038/s41572-019-0109-9

4. Patton S, Gendler SJ, Spicer AP. Il-mucin epiteljali, MUC1, tal-ħalib, glandola mammarja u tessuti oħra. Biochim Biophys Acta. 1995;1241:407–423. https://doi.org/10.1016/0304-4157 (95)00014-3

5. Kirby A, Gnirke A, Jaffe DB, et al. Mutazzjonijiet li jikkawżaw mard tal-kliewi ċstiku medullari tat-tip 1 jinsabu f'VNTR kbir f'MUC1 mitlufa minn sekwenzar parallel massiv. Nat Genet. 2013;45: 299–303. https://doi.org/10.1038/ng.2543

6. Ekici AB, Hackenbeck T, Morinière V, et al. Il-fibrożi tal-kliewi hija l-karatteristika komuni tal-mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti ikkawżat minn mutazzjonijiet f'mucin 1 jew uromodulin. Kidney Int. 2014;86:589–599. https://doi.org/10.1038/ki. 2014.72

7. Wenzel A, Altmueller J, Ekici AB, et al. Is-sekwenzjar f'ħin reali ta 'molekula waħda f'ADTKD-MUC1 jippermetti assemblaġġ sħiħ tal-VNTR u pożizzjonament eżatt ta' mutazzjonijiet kawżattivi. Sci Rep 2018;8:4170. https://doi.org/10.1038/s41598-018-22428-0

8. Wang GQ, Rui HL, Dong HR, et al. Is-sekwenzjar SMRT wera li huwa metodu effettiv għad-dijanjosi ADTKD-MUC1 permezz ta 'analiżi ta' segwitu ta 'familja Ċiniża. Sci Rep. 2020;10:8616. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65491-2

9. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards u linji gwida għall-interpretazzjoni ta 'varjanti ta' sekwenza: rakkomandazzjoni ta 'kunsens konġunt tal-Kulleġġ Amerikan tal-Ġenetika u l-Ġenomika Medika u l-Assoċjazzjoni għall-Patoloġija Molekulari. Genet Med. 2015;17:405–424. https://doi.org/10.1038/ gim.2015.30

10. Kanda Y. Investigazzjoni tas-softwer faċli biex jintuża liberament disponibbli "EZR" għall-istatistika medika. Trapjant tal-Mudullun. 2013;48:452–458. https://doi.org/10.1038/bmt.2012.244

11. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Winckler W, et al. Telespettatur tal-ġenomika integrattiva. Nat Biotechnol. 2011;29:24–26. https://doi. org/10.1038/nbt.1754

12. Zivná M, Kidd K, P ristoupilová A, et al. Dijanjosi immunoistokimika mhux invażiva u mutazzjonijiet MUC1 ġodda li jikkawżaw mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti [korrezzjoni ppubblikata tidher f'J Am Soc Nephrol. 2020;31: 892]. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2418–2431. https://doi.org/ 10.1681/ASN.2018020180

13. Cormican S, Connaughton DM, Kennedy C, et al. Mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti (ADTKD) fl-Irlanda. Ren Fail. 2019;41:832–841. https://doi.org/10.1080/ 0886022X.2019.1655452

14. Gast C, Marinaki A, Arenas-Hernandez M, et al. Mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti—UMOD huwa l-aktar mard tal-kliewi ġenetiku mhux poliċistiku frekwenti. BMC Nephrol. 2018;19:301. https://doi.org/10.1186/s12882-018- 1107-y

15. Yamamoto S, Kaimori JY, Yoshimura T, et al. Analiżi ta' familja ADTKD b'mutazzjoni ġdida ta' frameshift f'MUC1 tiżvela karatteristiċi karatteristiċi ta' proteina mutanti MUC1. Nephrol Dial Trapjant. 2017;32:2010–2017. https://doi.org/10. 1093/ndt/gfx083

16. Olinger E, Hofmann P, Kidd K, et al. Spettri kliniċi u ġenetiċi ta 'mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti minħabba mutazzjonijiet f'UMOD u MUC1. Kidney Int. 2020;98:717–731. https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.04.038

17. Bleyer AJ, Kmoch S, Antignac C, et al. Preżentazzjoni klinika varjabbli ta' mutazzjoni MUC1 li tikkawża mard tal-kliewi ċstiku medullari tat-tip 1. Clin J Am Soc Nephrol. 2014;9:527– 535. https://doi.org/10.2215/CJN.06380613

18. Ayasreh N, Bullich G, Miquel R, et al. Mard tal-kliewi tubulointerstizjali awtosomali dominanti: preżentazzjoni klinika ta' pazjenti b'ADTKD-UMOD u ADTKD-MUC1. Am J Kidney Dis. 2018;72:411–418. https://doi.org/10.1053/j.ajkd.2018.03. 019

Eri Okada1,2 , Naoya Morisada1,3 , Tomoko Horinouchi1 , Hideki Fujii4 , Takayuki Tsuji5 , Masayoshi Miura6 , Hideyuki Katori7 , Masashi Kitagawa8 , Kunio Morozumi9 , Takanobu Toriyama10 , Natsuki Natsuki11, Natsuki11, Natsuki11 do1 , Yuya Aoto1 , Shinya Ishiko1 , Rini Rossanti1 , Nana Sakakibara1 , China Nagano1 , Tomohiko Yamamura1 , Shingo Ishimori1 , Joichi Usui2 , Kunihiro Yamagata2 , Kazumoto Iijima13,14, Toshiyuki Imasawa15 u Kandai Nozu1