It-Tħassir ta' MiR-29b2/c Iwassal Għal Tixjiħ Aċċellerat U Newroprotezzjoni fil-Ġrieden tal-Marda ta' Parkinson indotti mill-MPTP

Astratt

Studji jiżvelaw rabta bejn il-miR-29s fit-tixjiħ u l-marda ta' Parkinson (PD). Hawnhekk nuru li l-livelli fis-serum ta' miR-29s fil-PD indott minn 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) ġrieden urew bidliet dinamiċi. Ir-rwol ta' miR-29b2/c fit-tixjiħ u l-PD ġie studjat bl-użu ta' ġrieden knockout tal-ġene miR{{-29b2/c (miR{-29b2/c KO). Il-ġrieden miR-29b2/c KO kienu kkaratterizzati minn piż ferm eħfef, kyphosis, dgħjufija fil-muskoli, u mixi anormali meta mqabbla ma 'ġrieden tat-tip selvaġġ (WT). Il-WT żviluppa wkoll tħaxxin apparenti tad-dermis u tnaqqis tat-tessut xaħmi. Madankollu, defiċjenza ta 'miR-29b2/c ttaffi l-ħsarat indotti mill-MPTP tas-sistema dopaminerġika u l-attivazzjoni glial fil-mogħdija nigrostriatal u konsegwentement tejbet il-funzjoni tal-mutur tal-ġrieden KO trattati b'MPTP. Knockout ta' miR-29b2/c inibixxi l-espressjoni ta' fatturi infjammatorji f'kulturi primarji ttrattati b'1-metil{-4-phenyl pyridinium (MPP plus ) ta' glia mħallta, astroċiti primarji, jew ittrattati b'LPS mikroglia primarja. Barra minn hekk, id-defiċjenza ta' miR-29b2/c tejbet l-attività ta' AMPK iżda rrepressa s-sinjalar NF-κB p65 fiċ-ċelloli gliali. Ir-riżultati tagħna juru li l-ġrieden miR-29b2/c KO juru l-fenotip bħal proġerja. Ċelluli gliali inqas attivati ​​u newroinfjammazzjoni ripressa jistgħu jġibu newroprotezzjoni dopaminerġika fil-ġrieden miR- 29b2/c KO. B'mod konklużiv, miR-29b2/c huwa involut fir-regolazzjoni tat-tixjiħ u għandu rwol detrimentali fil-marda ta' Parkinson.

Kliem ewlieni

MiR-29b2/c; newroprotezzjoni; Marda ta' Parkinson indotta minn MPTP;Cistanche benefiċċji.

Ikklikkja hawn biex tiksebx'inhuma l-effetti ta' Cistanche

Introduzzjoni

Il-marda ta 'Parkinson (PD) hija t-tieni marda newrodeġenerattiva l-aktar frekwenti, ikkaratterizzata mit-telf progressiv ta' newroni dopaminerġiċi fil-substance nigra par compacta (SNpc) tal-midbrain, u żieda fl-attivazzjoni glial u newroinflammation [1-3]. MicroRNAs huma molekuli qosra ta 'RNA noncoding li jirregolaw l-espressjoni tal-ġeni fil-livell ta' wara t-traskrizzjoni [4, 5]. MicroRNAs huma involuti fir-regolamentazzjoni tal-iżvilupp tas-sistema nervuża, plastikità newronali, u mard newrodeġenerattiv. Il-familja MicroRNA29 (miR- 29s) huma komposti minn żewġ gruppi ta’ ġeni: miR-29a/b1 u miR-29b2/c, li jinsabu fuq il-kromożomi 6 u l-kromożomi 1, rispettivament, ta’ il-ġenoma tal-ġurdien. miR-29a u miR-29c għandhom differenza waħda tan-nukleotidi biss, filwaqt li miR-29b1 u miR-29b2 huma identiċi fis-sekwenza [6]. miR-29s huma involuti fi proċessi bijoloġiċi multipli. Ħafna ġeni fil-mira miR-29s ġew verifikati b'mod sperimentali, inklużi l-ġeni tas-sopravivenza Procell Bcl-2, Mcl-1, Cdc42, u p85- ; ġeni proapoptotiċi Puma, Bim, Bak, u Bmf; u ċitokini proinfjammatorji IFN- u IL-12. Fis-sistema periferali, studji wrew li l-miR-29s huma involuti fil-fibrożi tat-tessut [7-9], il-metaboliżmu, u r-regolazzjoni immuni [10-13].

Il-miR-29s jesprimu b'mod wiesa' fis-sistema nervuża ċentrali, u t-traskrizzjonijiet tagħhom jeżistu kemm fin-newroni kif ukoll fiċ-ċelloli gliali [14, 15]. L-assoċjazzjoni bejn il-miR-29s u l-mard newroloġiku ġiet illustrata dejjem aktar. miR-29s huma involuti fir-regolamentazzjoni tal-produzzjoni -amyloid, u huma regolati 'l isfel fil-moħħ ta' pazjenti AD [16, 17]; Il-livelli ta' miR-29s jonqsu wkoll f'pazjenti bil-marda ta' Huntington (HD) u ġrieden mudell HD [18, 19], filwaqt li jiżdiedu f'pazjenti bi sklerożi laterali amiotrofika (ALS) u mudelli ta' ġrieden ALS [16, 20]. Kemm il-ġrieden miR-29a/b{-1-defiċjenti kif ukoll il-ġrieden miR-29s regolati 'l isfel juru fenotip bħal Ataxia [6, 21]. Rigward l-effetti tal-espressjoni ta' miR-29s fuq in-newroprotezzjoni u l-promozzjoni tal-mewt newronali f'mudelli ta' annimali gerriema iskemiċi ġew irrappurtati riżultati opposti [22, 23]. Fi studji preċedenti, osservajna li l-livelli ta' miR-29s naqsu b'mod notevoli fis-serum ta' pazjenti PD b'tendenza ta' tnaqqis relatata ma' Parkinsoniżmu aktar sever [24]. Barra minn hekk, il-livelli ta' miR-29s korrelatati mal-prestazzjoni tal-memorja f'pazjenti b'PD [25]. Aħna kkonkludejna li miR-29b2/c huwa marbut mill-qrib mal-PD, iżda l-funzjonijiet fiżjoloġiċi u l-mekkaniżmi patoloġiċi tiegħu involuti fil-PD mhumiex magħrufa.

F'dan l-istudju, il-livelli tas-serum tal-ġrieden ta' miR-29s bi tweġiba għall-amministrazzjoni ta' MPTP tkejlu sa 120 jum wara l-injezzjoni. L-effetti tad-defiċjenzi ta' miR-29b2/c fuq it-tessuti periferali ġew studjati bl-użu ta' ġrieden miR{-29b2/c KO. In-newrotossina dopaminerġika MPTP intużat aktar biex jinduċi mudell tal-ġrieden ta' PD. Ġew investigati mbagħad il-korrimenti tas-sistema dopaminerġika nigrostriatal, il-prestazzjoni tal-imġieba, u l-mekkaniżmi potenzjali. Aħna osservajna li l-livelli ta' miR-29s fis-serum tal-ġurdien urew bidliet dinamiċi wara l-amministrazzjoni tal-MPTP. Il-ġrieden miR- 29b2/c KO wrew tixjiħ aċċellerat, indikat mill-piż tal-ġisem eħfef, tnaqqis fit-tessut xaħmi, kyphosis, tħaxxin tal-ġilda, dgħjufija fil-muskoli, u anormalità tal-mixi. Madankollu, defiċjenza ta' miR-29b2/c wasslet għall-ħsara dopaminerġika mtaffija u l-attivazzjoni gliali, u konsegwentement għal prestazzjoni mtejba fl-imġieba f'mudell ta' annimal bħal PD.

Pilloli Cistanche

Riżultat

1. Il-fenotip bħal proġerja fil-ġrieden miR-29b2/c KO

Ġrieden knockout miR-29b2/c (miR-29b2/c KO) ġew iġġenerati bl-użu tat-teknika CRISPR-Cas9. L-istrateġija tal-immirar tal-ġeni u l-ġenotipi tal-ġrieden mutanti ġew ippreżentati fil-Figura Supplimentari 1. Il-ġrieden miR-29b2/c KO ta 'erba' u 16- xhur kellhom tnaqqis fil-piż tal-ġisem (Figura 1A). Fl-età ta 'tliet xhur, il-karatteristiċi tal-ġrieden miR-29b2/c KO baqgħu mhux mibdula, kif ippruvat permezz ta' skannjar ta 'tomografija mikro-kompjuterizzata tar-raġġi X (mikro-CT) (Figura Supplimentari 2A). Ma kien hemm l-ebda differenzi fid-densità minerali tal-għadam (BMD), trabekulae medja BMD, separazzjoni trabekulari, ħxuna trabekulari, u indiċi tal-mudell strutturali (SMI) bejn il-ġrieden miR-29b2/c KO u l-kontroparti WT tagħhom ta' 13-il xahar ( Figura Supplimentari 2B). Permezz ta 'tbajja' ematossilin u eosin (H&E), sibna li ġrieden 13-miR-29b2/c KO ta' xahar urew dermis mħaxxna bi tikmix miżjuda u approfondita (Figura 1B, 1C). U ċ-ċifosi kienet tidher fil-ġrieden miR-29b2/c KO 16-xhur (Figura 1C). Il-ġrieden miR-29b2/c KO f'età żgħira (3 xhur) kellhom tessuti tax-xaħam normali (Figura Supplimentari 2C, 2D). Madankollu, tessut xaħmi addominali (xaħam taħt il-ġilda u xaħam vixxerali flimkien) u tessut xaħmi kannella tnaqqsu b'mod drammatiku fil-ġrieden miR-29b2/c KO meta mqabbla ma 'ġrieden WT fl-età ta' 16-il xahar (Figura 1D). Barra minn hekk, ġew analizzati l-livelli ta 'traskrizzjoni tal-markaturi tas-senescence p21 u p53 fil-moħħ. Żdiedu b'mod notevoli fl-ippokampus, iżda mhux fil-kortiċi tal-ġrieden miR-29b2/c KO fl-età ta' sitt xhur. Il-livelli ta' proteina p53 u p16 fl-ippokampus defiċjenti ta' miR-29b2/c ma kinux differenti mill-kontrolli WT. Barra minn hekk, l-attività -galactosidase, karatteristika magħrufa tas-senescence ċellulari, ma kinitx differenti bejn l-imħuħ ta 'ġrieden WT ta' tliet xhur u miR-29b2/c KO.

Dgħjufija fil-muskoli u anormalità tal-mixi fil-ġrieden miR- 29b2/c KO

Ġie vvalutat l-imġieba tal-ġrieden defiċjenti ta' miR-29b2/c. Is-saħħa tal-muskoli kienet imkejla bit-testijiet tal-Wire mdendlin u tal-Grid. Il-ġrieden miR-29b2/c KO skorjaw inqas mill-ġrieden tal-kontroll fit-test tal-Wire mdendlin (Figura 2A). U l-latenza biex taqa' kienet drammatikament iqsar fil-ġrieden miR-29b2/c KO meta mqabbla ma' kontropartijiet tat-tip selvaġġ fit-test tal-mdendla tal-Grid (Figura 2B), iżda l-prestazzjoni tat-test Rotarod ta' WT u miR{{10} Il-ġrieden }b2/c KO ma kinux differenti b'mod sinifikanti (Figura 2C). Il-mixja tal-annimali ġiet skoperta mis-sistema tal-analiżi Catwalk XT. B'mod sorprendenti, kemm il-veloċità kif ukoll it-tul tal-LENTI tal-ġrieden miR-29b2/c KO kienu ogħla minn dawk tal-kontropartijiet tagħhom, filwaqt li ċ-ċiklu tal-pass, l-istand, u l-ħin tat-tbandil kienu iqsar, u ċ-ċiklu ta' xogħol imnaqqas, f'miR{ {15}} ġrieden b2/c-defiċjenti (Figura 2D).

Bidliet ta' miR-29s fis-serum tal-ġurdien PD indott mill-MPTP

Il-livelli ta' miR-29s naqsu fis-serum ta' pazjenti bil-PD meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom [24]. F'dan l-istudju, il-livelli ta' miR-29s fis-serum tal-ġrieden PD ġew ikkwantifikati fi 3, 30, u 120 jum wara l-għoti ta' reġimen subakut ta' MPTP. Il-livelli ta' miR-29a u miR-29b naqsu fi 3 ijiem wara l-injezzjoni u rkupraw għal valuri tal-linja bażi fi 30 jum, u reġgħu naqsu fi 120 jum. Madankollu, il-livell miR-29c ma nbidilx b'mod sinifikanti (Figura Supplimentari 5).

Supplimenti ta' Cistanche

Id-defiċjenza ta' miR-29b2/c ittaffi l-korrimenti nigrostriatali kkaġunati mill-MPTP u d-defiċits tal-mutur fil-ġrieden

Il-ġrieden knockout miR-29b2/c u l-littermates WT ġew injettati b'MPTP biex jinduċu l-mudell PD. Il-livelli ta' espressjoni ta' p21, p53, u Pai1 fl-istriatum kemm tal-ġrieden miR-29b2/c KO kif ukoll tal-kontrolli WT ma nbidlux wara l-amministrazzjoni ta' MPTP. L-espożizzjoni għall-MPTP ikkawżat tnaqqis sinifikanti tan-newroni dopaminerġiċi TH-pożittivi fl-SNpc [F(1, 20)=5.441, P{=0.0302], u t-terminali tan-nervituri TH-pożittivi, proteini TH [F(1, 20)=10.5, P{=0.0041] u l-livelli ta 'dopamine, DOPAC u HVA fl-istriatum (Figura 3A-3D). Madankollu, il-korrimenti nigrostriatali fil-ġrieden miR-29b2/c KO ittrattati b'MPTP ġew imtaffija b'mod drammatiku meta mqabbla mal-kontrolli WT trattati b'MPTP bħala n-numri ta 'newroni dopaminerġiċi, id-densitajiet tat-terminali tan-nervituri dopaminerġiċi, u l-livelli tal-proteina TH striatali u konċentrazzjoni ta 'dopamine kienu ogħla b'mod sinifikanti; Barra minn hekk, bidliet fil-proporzjonijiet ta 'DOPAC għal DA u HVA għal DA [F(1, 19)=12.64, P{=0.0021] kienu mtaffija b'mod sinifikanti (Figura 3A-3D). Fil-ġrieden miR-29b2/c KO injettati bis-salina normali, il-konċentrazzjonijiet strijatali ta' 5-HT u l-metabolit tiegħu 5-HIAA żdiedu meta mqabbla mal-kontropartijiet tagħhom WT, u l-konċentrazzjonijiet NE kienu qrib bejn il- ġrieden tat-tip selvaġġ u miR-29b2/c KO (Figura 3D). It-Trobbija u t-testijiet Pol intużaw biex jevalwaw l-attività vertikali spontanja [26, 27] u l-attività lokomotriċi tal-ġrieden [28], rispettivament. Jumejn wara l-aħħar injezzjoni MPTP, il-frekwenza tat-trobbija naqset fil-ġrieden WT matul l-aħħar 2 min meta mqabbla ma 'kontrolli WT normali trattati bis-salina. Esperimenti simili ma żvelawx effett ta 'defiċjenza miR- 29b2/c fuq bidliet indotti minn MPTP fil-frekwenza tat-trobbija (Figura 3E). Bl-istess mod, il-ħin totali mgħoddi biex iduru u jitilgħu 'l isfel żdied fil-ġrieden WT wara l-amministrazzjoni ta' MPTP fit-test Pole, filwaqt li l-ħin totali kien qrib bejn ġrieden miR -29b2/c KO trattati b'salina normali u MPTPtrattati (Figura 3F) .

Id-defiċjenza ta' miR-29b2/c tnaqqas l-attivazzjoni glial indotta mill-MPTP fil-ġrieden

L-attivazzjoni taċ-ċelluli gliali u n-newroinfjammazzjoni medjata miċ-ċelluli gliali huma involuti fil-patoloġija tal-PD [29]. L-astroċiti żdiedu b'mod notevoli fil-mogħdija nigrostriatali tal-ġrieden WT, filwaqt li l-GFAP flimkien mal-astroċiti żdiedu fl-istriatum iżda mhux fl-SNpc [F(1, 8)=5.412, P=0.0484] ta' miR -29ġrieden b2/c KO tlett ijiem wara l-injezzjoni MPTP. Notevolment, id-densitajiet astroċitiċi ma kinux differenti fiż-żewġ reġjuni tal-ġrieden WT u miR-29b2/c KO ittrattati b'MPTP (Figura 4A, 4B). Iba 1 flimkien mal-mikroglia żdied fis-substantia nigra tal-ġrieden WT, u fl-istriatum [F(1, 8)=12.74, P{=0.0073] kemm ta' WT kif ukoll ta' miR{{21} }ġrieden b2/c KO wara amministrazzjoni MPTP. Barra minn hekk, fil-ġrieden miR-29b2/c KO injezzjoni MPTP naqqset id-densitajiet mikrogliali b'mod sinifikanti (Figura 4C, 4D).

2. L-effetti tad-defiċjenza ta' miR-29b2/c fl-astroċiti kkultivati ​​primarji

Ġie utilizzat scratch assay biex jiġi ttestjat jekk defiċjenza ta' miR-29b2/c affettwax il-proliferazzjoni u l-migrazzjoni astroċitika. L-astroċiti primarji miR-29b2/c KO ma wrew l-ebda differenza fil-kapaċità tal-proliferazzjoni u l-migrazzjoni. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli tal-astroċiti WT primarji u miR-29b2/c KO ma wriet l-ebda differenza fil-linja bażi. Wara l-MPP flimkien mal-intossikazzjoni, il-vijabbiltà taċ-ċelluli tal-astroċiti WT kienet ogħla meta mqabbla mal-kontrolli, filwaqt li l-vijabbiltà tal-astroċiti mutanti ma nbidlitx [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. Prodott ROS imtejjeb u assorbiment tal-glukożju ġew osservati fl-astroċiti WT u miR-29b2/c KO ittrattati MPP plus.

Cistanche tubulosa

Ġew imkejla l-livelli ta 'espressjoni ta' fatturi newrotrofiċi, molekuli relatati ma 'infjammazzjoni, tip astroċitiku A1, u ġeni markatur tat-tip A2 f'astroċiti trattati MPP plus. Fi 12-il siegħa wara l-isfida, l-espressjoni ta 'BDNF kienet elevata fl-astroċiti WT u miR-29b2/c KO (Figura 5A). Il-livell ta' espressjoni ta' TGF- 1 kien regolat b'mod sinifikanti 'l fuq fl-astroċiti WT wara l-espożizzjoni għal MPP plus, filwaqt li kien regolat 'l isfel fl-astroċiti miR{- 29b2/c KO meta mqabbel ma' astroċiti tat-tip selvaġġ kemm fil-linja bażi kif ukoll wara l-intossikazzjoni (Figura 5B). Il-livell bażi tat-traskrizzjoni tat-TNF kien aktar baxx fl-astroċiti miR-29b2/c KO meta mqabbel mal-astroċiti WT. Wara trattament ta' 12-il siegħa, il-livelli ta' espressjoni ta' IL-1, IL-6, u COX{-2 żdiedu b'mod sinifikanti fl-astroċiti WT u miR-29b2/c, filwaqt li t-traskrizzjoni tat-TNF kien elevat biss fl-astroċiti WT, u t-traskrizzjonijiet IL-1, TNF, u COX-2 naqsu fiċ-ċelloli astroċitiċi miR{-29b2/c KO meta mqabbla ma 'kontropartijiet tat-tip selvaġġ (Figura 5C) . Il-markatur A1 H2-T23 u l-markatur A2 CD14 kienu notevolment aktar baxxi fl-astroċiti miR- 29b2/c KO trattati b'PBS meta mqabbla mal-kontrolli WT. Wara trattament ta' 12-il siegħa, il-markaturi A1 H2-D1, Ggta1, u C3, u l-markaturi A2 Clcf1 u S100 10 ġew irregolati kemm fl-astroċiti WT u miR{-29b2/c KO; H2-T23 żdied biss fl-astroċiti WT; Gbp2 u CD14 ma nbidlux fiż-żewġ ġenotipi ta 'astroċiti. Barra minn hekk, traskrizzjonijiet ta 'H2-T23, H{2-D1, u CD14 ġew irregolati fl-astroċiti miR{-29b2/c KO meta mqabbla mal-kontrolli WT (Figura 5D, 5E). 12-il siegħa u 24 siegħa wara t-trattament, il-livelli ta' proteini AMPK u proteini AMPK fosforilati ma nbidlux fl-astroċiti WT, filwaqt li, f'24 siegħa wara l-isfida MPP plus, il-livell tal-proteina AMPK naqas f'miR-29b2/ c KO astroċiti, u l-proporzjon ta 'p-AMPK għal AMPK f'astroċiti mutanti żdied meta mqabbel ma' astroċiti WT u astroċiti mutanti ttrattati b'PBS ukoll (Figura 5F). Barra minn hekk, il-mezz ikkundizzjonat minn ċelloli BV2 ittrattati b'PBS jew LPS (imsemmi fil-qosor CM u LCM) intuża biex jistimula astroċiti primarji tal-ġrieden WT u miR-29b2/c KO. Għalkemm l-espressjoni tal-proteina p-AMPK ma nbidlitx wara trattament ta' 12-il siegħa ta' LCM, kienet ogħla b'mod sinifikanti fl-astroċiti miR-29b2/c KO meta mqabbla mal-astroċiti WT. Aħna osservajna li l-proteini pAMPK żdiedu fiż-żewġ ġenotipi ta 'astroċiti wara 24 trattament ta' LCM. L-istimulazzjoni tal-LCM żiedet b'mod notevoli l-espressjoni tal-proteini COX- 2 [F(2, 18)=10.29, P{=0.0010], madankollu, il-livell tal-proteina COX{-2 f'miR-29b2/c astroċiti KO naqsu meta mqabbla ma 'astroċiti WT (Figura 5G). Il-konċentrazzjoni ta' nitriti fl-astroċiti miR-29b2/c KO ttrattati bl-LCM kienet ukoll aktar baxxa b'mod sinifikanti meta mqabbla ma' astroċiti WT ittrattati bl-LCM [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. L-effetti tad-defiċjenza ta' miR-29b2/c fil-mikroglia kkultivata primarja

Biex titkejjel ir-rispons tal-mikroglia defiċjenti ta' miR-29b2/c għal stimuli infjammatorji, intuża LPS. Il-livell ta' espressjoni ta' BDNF kien aktar baxx fil-mikroglia miR-29b2/c KO fil-linja bażi. Erba' u tmien sigħat wara t-trattament bl-LPS, l-ammont ta' traskrizzjonijiet ta' IL-1, IL-6, TNF, u COX-2 ġew regolati 'l fuq, filwaqt li l-espressjoni ta' IGF-1 ġiet regolata 'l isfel f'WT u miR-29b2/c KO ċelluli mikrogliali, l-espressjoni ta 'BDNF naqset biss fil-mikroglia WT [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

Diskussjoni

L-espressjoni tal-membri tal-familja miR-29 hija regolata 'l fuq f'diversi tessuti meta l-individwi qed jixjieħu [30–32]. Xogħlijiet mil-laboratorju tagħna u oħrajn urew rabta bejn il-miR-29s u l-marda ta' Parkinson [33]. Fl-istudju preżenti, ġew studjati r-rwoli ta' miR- 29b2/c fit-tixjiħ u l-marda ta' Parkinson. Il-miR-29s jeżerċitaw effetti favur u kontra t-tixjiħ skont it-tessuti, l-ispeċi, u l-istadji tal-iżvilupp. Sibna li ġrieden miR ta' 3-xhur-29b2/c KO kellhom skeletru normali u tessut xaħmi, u ġrieden ta' 4-xahar miR- 29b2/c KO wrew piż tal-ġisem eħfef meta mqabbel mal-kontroparti WT tagħhom, li jaqbel ma 'studji oħra [11, 34]. Instabu dgħjufija fil-muskoli u mixja instabbli fi ġrieden miR- 29b2/c KO ta' 3-xhur. Il-ġrieden miR-29b2/c KO ta' tlettax-il xahar urew tħaxxin tad-dermis. Madankollu, kellhom l-istruttura fina normali tal-għadam tal-wirk. It-tnaqqis tal-piż tal-ġisem kien jeżisti fi ġrieden miR-29b2/c KO ta' 16-xahar. F'din l-età, il-ġrieden miR-29b2/c KO kellhom inqas xaħam addominali u xaħam kannella u wrew ċifosi apparenti. miR-29s huma involuti fl-arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli p53-medjat [35, 36] u s-senescence ċellulari mmexxija minn p16/Rb [37]. Madankollu, is-senescenza ċellulari ma kinitx evidenti fil-moħħ tal-ġurdien miR-29b2/c KO. Għalhekk, għalkemm miR-29b2/c jikkontribwixxi għar-regolazzjoni tat-tixjiħ, ir-rwoli tiegħu fit-tessuti periferali u l-moħħ jistgħu jkunu differenti.

Il-livelli fis-serum ta' miR-29s kienu rregolati 'l isfel f'pazjenti b'PD meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom [24]. Hawnhekk, sibna li l-espressjoni ta' miR-29s fis-serum tal-ġrieden PD varjat minn 3 għal 120 jum wara l-amministrazzjoni tal-MPTP. miR-29s huma abbundanti fil-moħħ [6, 30]. Billi tgħaddi mill-profil GEO, l-espressjoni ta' miR-29c tinstab li hija rregolata 'l fuq fis-substantia nigra ta' pazjenti b'PD (p=0.0059, bit-test ta' Mann-Whitney), barra minn hekk, miR{{12 }}c espressjoni fil-gyrus frontali superjuri ma kinitx differenti (p=0.47, minn Student-T-test), meta mqabbla mas-suġġetti ta 'kontroll (Figura Supplimentari 10). Hawnhekk, il-ġrieden miR-29b2/c KO ġew ikkontestati b'MPTP biex jinduċu feriti bħal PD. Il-ġrieden mutanti wrew feriti inqas gravi għas-sistema dopaminerġika nigrostriatal u attivazzjoni glial aktar ħafifa, u sussegwentement reżistenza fl-imġieba sa ċertu punt. Għalhekk, miR-29b2/c għandu rwol detrimentali fil-patoloġija tal-PD. Aħna osservajna li fil-mudell PD tal-ġurdien MPTPinduced, il-livelli strijatali tat-traskrizzjonijiet ta 'p21, p53, u Pai1 ma nbidlux, u jissuġġerixxi li s-senescenza ċellulari tista' ma sseħħx. It-tixjiħ huwa meqjus bħala fattur ta 'riskju għoli għall-iżvilupp tal-PD [38], madankollu, bidliet relatati mat-tixjiħ fil-moħħ, speċjalment is-sistema dopaminerġika jistgħu jkunu fattur aktar rilevanti.

Il-glia primarja minn ġrieden WT u miR-29b2/c KO ġew ikkultivati ​​biex jinvestigaw il-mekkaniżmi sottostanti. MPP flimkien ma' trattament żied l-espressjoni ta' GDNF u naqas l-espressjoni ta' IL-1 fil-glia mħallta defiċjenti ta' miR-29b2/c. MPP plus żied ukoll l-espressjoni ta' ġeni proinfjammatorji fl-astroċiti WT iżda mhux fl-astroċiti defiċjenti ta' miR- 29b2/c. Bl-istess mod, astroċiti mutanti pproduċew inqas NO meta mqabbla ma 'astroċiti WT wara li ġew esposti għall-mezz kondizzjonat ta' ċelloli BV2 ittrattati b'LPS. Fil-kultura tal-mikroglia primarja, meta mqabbla mal-kontrolli WT ittrattati bl-LPS, it-traskrizzjonijiet taċ-ċitokini kontra l-infjammazzjoni IL-10 u l-fattur newrotrofiku IGF-1 kienu ferm ogħla, u t-traskrizzjonijiet taċ-ċitokini pro-infjammazzjoni IL{ {15}} naqas fil-mikroglia miR-29b2/c KO trattati b'LPS. L-NO livelli naqsu fil-mikroglia miR-29b2/c KO fil-linja bażi u wara l-intossikazzjoni tal-LPS. Studji wrew li miR-29s u ħafna ġeni fil-mira previsti huma involuti fi proċessi metaboliċi [34, 39–41]. Bħala regolatur essenzjali, AMPK ġie ppruvat li huwa protettiv fil-PD meta jiġi attivat [42]. L-attivazzjoni ta 'AMPK tistimula lil Sirtuin 1 u tinibixxi l-attivazzjoni ta' NF-κB u l-ġeni fil-mira infjammatorji downstream indirettament [43]. Aħna osservajna li l-livell tal-proteina fosforilata-AMPK u l-proporzjon ta 'p-AMPK għal AMPK kienu regolati 'l fuq fl-astroċiti miR- 29b2/c KO ittrattati b'LCM u MPP flimkien ma' miR- 29b2/c KO rispettivament. Il-livell ta' proteina COX-2 naqas f'astroċiti mutanti ttrattati b'LCM meta mqabbel ma' astroċiti WT. Fil-linja bażi, l-attività AMPK kienet elevata fil-mikroglia miR-29b2/c KO. L-ammont ta' proteina COX-2 tnaqqas b'mod sinifikanti fil-mikroglia miR{-29b2/c KO meta mqabbel mal-kontrolli WT wara t-trattament ta' LPS. Taħt trattament LPS, il-proporzjon p-p65 u p65 kien kemmxejn regolat 'l isfel fil-mikroglia mutanti, li jimplika mogħdija ta' sinjalazzjoni NF-κB mitigata. Ir-riżultati tagħna jindikaw li attività mtejba tal-AMPK u rispons infjammatorju mnaqqas fil-glia jipproteġu l-mogħdija nigrostriatal fil-ġrieden miR-29b2/c KO (Figura 6G). B'mod konklużiv, miR-29b2/c għandu rwol importanti fit-tixjiħ u l-ħsara fis-sistema dopaminerġika nigrostriatal.

Referenzi

1. Braak H, Del Tredici K. Artiklu mistieden: Patoloġija tas-sistema nervuża fil-marda ta 'Parkinson sporadika. Newroloġija. 2008; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Neuroinflammation fil-marda ta 'Parkinson u l-potenzjal tagħha bħala mira terapewtika. Transl Neurodegener. 2015; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M, et al. Rwoli ta 'prosurvival u anti-infjammatorji ta' NF-κB c-Rel fil-mudelli tal-marda ta 'Parkinson. Redox Biol. 2020; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MicroRNA- 21 jimmira ġeni li jrażżnu t-tumur f'invażjoni u metastasi. Ċellula Res. 2008; 18:350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. Jiddeċifraw il-funzjoni u r-regolamentazzjoni tal-microRNAs fil-marda ta 'Alzheimer u l-marda ta' Parkinson. ACS Chem Neurosci. 2014; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A, et al. Defiċjenza tar-raggruppament miR-29a/b{-1 twassal għal karatteristiċi atassiċi u alterazzjonijiet ċerebellari fil-ġrieden. Neurobiol Dis. 2015; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. Rwol potenzjali ta 'sinjalazzjoni Hedgehog u microRNA-29 fil-fibrożi tal-fwied ta' ġurdien defiċjenti IKK. J Mol Histol. 2014; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. Is-sinjalar TGF-/Smad3 jippromwovi l-fibrożi renali billi jinibixxi miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 jinibixxi l-fibrożi pulmonari indotta minn bleomicina fil-ġrieden. Mol Ther. 2012; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MicroRNA-29 jirregola l-fatturi ta' traskrizzjoni tat-T-box u l-produzzjoni ta' interferon fiċ-ċelluli T helper. Immunità. 2011; 35: 169–81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B, et al. Il-Familja microRNA-29 Tiddetta l-Bilanċ Bejn l-Immaniġġjar tal-Glukożju Omeostatiku u Patoloġiku fid-Dijabete u l-Obeżità. Dijabete. 2016; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Luster AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B, et al. IL-21 jinduċi mikroRNA-29 antivirali fiċ-ċelluli T CD4 biex jillimitaw l-infezzjoni tal-HIV-1. Nat Commun. 2015; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao X. Il-microRNA miR-29 jikkontrolla risponsi immuni intrinsiċi u adattivi għal infezzjoni batterjali intraċellulari billi timmira interferon- . Nat Immunol. 2011; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. Analiżi ta 'espressjoni komprensiva ta' miRNAs speċifiċi għat-tip taċ-ċelluli newrali jidentifikaw determinanti ġodda tal-ispeċifikazzjoni u l-manutenzjoni tal-fenotipi newronali. J Neurosci. 2013; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. MiR-29a arrikkit bl-astroċiti jimmira lil PUMA u jnaqqas il-vulnerabbiltà newronali għall-iskemija tal-moħħ. Glia. 2013; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. Espressjoni aberranti tal-microRNA fil-imħuħ ta 'mard newrodeġenerattiv: miR-29a mnaqqsa fl-imħuħ tal-marda ta' Alzheimer timmira għan-newron navigator 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. Telf ta' cluster microRNA miR-29a/b-1 b'mod sporadiku Il-marda ta' Alzheimer tikkorrelata ma' żieda fl-espressjoni ta' BACE1/beta-secretase. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, Guest DJ, Cattaneo E, Buckley NJ. Mogħdija ta' disregolazzjoni tal-ġeni bbażata fuq il-mikroRNA fil-marda ta' Huntington. Neurobiol Dis. 2008; 29:438–45.

19. Packer AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. Il-mikroRNA bifunzjonali miR-9/miR-9* jirregola REST u CoREST u huwa regolat 'l isfel fil-marda ta' Huntington. J Neurosci. 2008; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. Żieda fl-espressjoni ta' microRNA-29a fil-ġrieden ALS: analiżi funzjonali tal-inibizzjoni tagħha. J Mol Neurosci. 2014; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. Knockdown speċifiku għall-moħħ ta 'miR-29 jirriżulta f'mewt taċ-ċelluli newronali u atassja fil-ġrieden. RNA. 2014; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. Telf ta' miR-29b wara puplesija iskemika akuta jikkontribwixxi għall-mewt taċ-ċelluli newrali u d-daqs tal-infart. J Cereb Blood Flow Metab. 2013; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. Upregulated miR -29b jippromwovi l-mewt taċ-ċelluli newronali billi jinibixxi Bcl2L2 wara korriment iskemiku fil-moħħ. Exp Brain Res. 2012; 216:225–30.

24. Bai X, Tang Y, Yu M, Wu L, Liu F, Ni J, Wang Z, Wang J, Fei J, Wang W, Huang F, Wang J. Downregulation of blood serum microRNA 29 family f'pazjenti bil-marda ta 'Parkinson . Sci Rep 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Assoċjazzjoni tal-familja tal-mikroRNA tas-serum -29 b'indeboliment konjittiv fil-marda ta 'Parkinson. Tixjiħ (Albany NY). 2020; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. Senescence Ċellulari hija Indotta mill-Paraquat Neurotoxin Ambjentali u tikkontribwixxi għan-Neuropatoloġija Marbuta mal-Marda ta 'Parkinson. Cell Rep 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. Degradazzjoni differenzjali tad-defiċits tal-mutur waqt it-tnaqqis gradwali tad-dopamina b'6-hydroxydopamine fil-ġrieden. Newroxjenza. 2015; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG, et al. Poly(ADP-ribose) imexxi n-newrodeġenerazzjoni patoloġika ta' sinukleina fil-marda ta' Parkinson. Xjenza. 2018; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai X, Li H, Wang Z, Huang Y, Wu Y, Yu M, Huang F. Bidliet Dinatiċi fil-Mogħdija Nigrostriatal fil-Mudell tal-Ġurdien MPTP tal-Marda ta 'Parkinson. Parkinson's Dis. 2017; 2017:9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. Aging, and chronic DNA damage response jattivaw mogħdija regolatorja li tinvolvi miR{{2} } u p53. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Klein JD, Mitch WE, Zhang L, Martinez I, Wang XH. MicroRNA-29 jinduċi senescenza ċellulari fil-muskolu li qed jixjieħ permezz ta' mogħdijiet multipli ta' sinjalazzjoni. Tixjiħ (Albany NY). 2014; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. Żieda fil-microRNA 29b fil-moħħ anzjan tikkorrelata mat-tnaqqis tal-fattur tat-tkabbir qisu l-insulina-1 u l-ligand tal-fractalkine. Neurobiol Tixjiħ. 2013; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c jipproteġi kontra l-infjammazzjoni u l-apoptosi fil-mudell tal-marda ta 'Parkinson in vivo u in vitro billi jimmira lejn SP1. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47:372–82.

34. Caravia XM, Fanjul V, Oliver E, Roiz-Valle D, Morán- Álvarez A, Desdín-Micó G, Mittelbrunn M, Cabo R, Vega JA, Rodríguez F, Fueyo A, Gómez M, LoboGonzález M, et al. L-assi regolatorju microRNA-29/PGC1 huwa kritiku għall-kontroll metaboliku tal-funzjoni kardijaka. PLoS Biol. 2018; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Aging accelerated in mice deficient in Zmpste24 protease hija marbuta mal-attivazzjoni tas-sinjalar p53. Natura. 2005; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNAs jattiva p53 billi jimmiraw p85 alpha u CDC42. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16:23–29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 u miR-30 jirregolaw l-espressjoni B-Myb matul is-senescenza ċellulari. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. Tixjiħ u marda ta' Parkinson: naħat differenti tal-istess munita? Mov Disorder. 2017; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zierath JR, Krook A. Altered miR- 29 Expression in Type 2 Diabetes Influences Glucose and Lipid Metabolism in Skeletal Muskolu. Dijabete. 2017; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. Defiċjenza ta' miR-29a ma timmodifikax il-kors tal-karċinoma aċinar tal-frixa murina. Oncotarget. 2017; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. A Systematic Review of miR-29 in Cancer. Mol Ther Onkolitiċi. 2018; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformin Prevents Dopaminergic Neuron Meath in MPTP/PInduced Mouse Model of Parkinson's Disease permezz ta 'Autophagy u Mitochondrial ROS Clearance. Int J Neuropsychopharmacol. 2016; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. proteina kinase attivata bl-AMP jinibixxi s-sinjalar u l-infjammazzjoni ta 'NF-κB: impatt fuq it-tul tas-saħħa u l-ħajja. J Mol Med (Berl). 2011; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1,2, Xiaoshuang Zhang 1, Rong Fang 1, Jinghui Wang 1, Yuanyuan Ma 1, Zhaolin Liu 1, Hongtian Dong 1, Qing Li 1, Jing Li 1, Jingyu Ge 1, Mei Yu 1, Jian Fei 3,4, Ruilin Sun 4, Fang Huang 1

1. Dipartiment tan-Newroxjenza Translazzjonali, l-Isptar taċ-Ċentru Distrettwali Jing'an ta 'Shanghai, Laboratorju Ewlenin tal-Istat tan-Newrobijoloġija Medika u Ċentru tal-Fruntieri MOE għax-Xjenza tal-Moħħ, Istituti tax-Xjenza tal-Moħħ, Università ta' Fudan, Shanghai 200032, iċ-Ċina

2. Dipartiment tal-Mediċina ta 'Riabilitazzjoni, Isptar tas-Sitt Poplu Affiljat tal-Università ta' Shanghai Jiao Tong, Shanghai 200233, iċ-Ċina

3. Skola tax-Xjenza u t-Teknoloġija tal-Ħajja, Università ta 'Tongji, Shanghai 200092, iċ-Ċina

4. Ċentru ta 'Riċerka ta' l-Inġinerija ta 'Shanghai għal Organiżmi Mudell, Ċentru ta' Organiżmi Mudell ta 'Shanghai, INC, Shanghai 201203, iċ-Ċina