Klonazzjoni, Identifikazzjoni Funzjonali U Analiżi ta' Espressjoni Ta' Chalcone Synthase Minn Cistanche Tubulosa

Astratt: Għan

Biex tistudja l-funzjoni tachalcone synthase minn Cistanche tubulosau l-mudell tal-espressjoni tal-ġene CtCHS fi fjuri bojod, ħomor u vjola.

MetodiIl-ġene CtCHS ġie kklonat permezz ta 'RT-PCR u twettqet analiżi bijoinformatika. Il-plażmid tal-pET-28a-CtCHS ġie trasferit fl-Escherichia coli biex jinduċi l-espressjoni tal-proteini permezz tal-IPTG. Il-proteina rikombinanti CtCHS ġiet inkubata bis-sottostrati p-coumaroyl CoA u malonyl CoA, u l-prodotti ġew skoperti minn HPLC u MS. Il-plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ġie trasferit fil-protoplast ta' Arabidopsis thaliana biex josserva l-lokalizzazzjoni subċellulari tal-proteina CtCHS. Il-mudell ta 'espressjoni tal-ġene CtCHS fil-fjuri ta' C. tubulosa bi tliet kuluri ġie skopert bil-qRT-PCR.

RiżultatiĠene CtCHS ġie kklonat. It-tul tal-qafas tal-qari miftuħ (ORF) kien 1173 bp, li jikkodifika 390 aċidu amminiku, u l-piż molekulari tal-proteina kien 42 8000.

ESTRAT TA' CISTANCHE ORGANIKU B'30% ECHINACOSIDE U 12% ACTEOSIDE

CtCHS kien fih ir-residwi katalitiċi Cys164, His303, Asn336, li kienu kkonservati f'chalcone synthase. Il-proteina CtCHS ġiet espressa f'E. coli u purifikata biex tinkiseb il-proteina rikombinanti. Il-proteina CtCHS tista' tikkatalizza p-coumaroyl CoA u malonyl CoA biex tipproduċi naringenin chalcone. Il-proteina CtCHS kienet lokalizzata prinċipalment fiċ-ċitoplasma. Il-ġene CtCHS kien espress ħafna fi fjuri vjola u ħomor, u l-livelli ta 'espressjoni relattivi kienu 8.44 u 3.21 darbiet ogħla minn dak fil-fjuri w hite, rispettivament.

Konklużjoni Ġene CtCHS ġie kklonat mill-fjura ta 'C. tubulosa u proteina ġiet espressa. Il-proteina CtCHS għandha funzjoni chalcone synthase, u l-espressjoni tal-ġene CtCHS hija ogħla fi fjuri jiskuraw, li jindika li l-ġene CtCHS jista 'jirregola l-kulur tal-fjura ta' C. tubulosa, li jistabbilixxi pedament għal aktar riċerka dwar il-mekkaniżmu ta 'regolazzjoni tal-kulur tal-fjura ta' C. . tubulosa.

Kliem ewlieni: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; Chalcone synthase; Analiżi tal-attività tal-enżimi; lokalizzazzjoni subċellulari; analiżi tal-espressjoni

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT hija l-pjanta tal-ġeneru Pyreal, li hija mqassma b'mod naturali fin-Nofsinhar ta 'Xinjiang [1] fiż-żona ta' Hetian ta 'Xinjiang [2]. Il-fjuri tal-pajpijiet huma għoljin fil-valur mediċinali. Iz-zkuk tal-laħam tiegħu huma wieħed mis-sorsi tal-verżjoni 2020 ta '"Farmakopea Ċiniża". [3] Ir-riċerka dwar il-pajp flowers cordonus laħam zkuk żdiedet, iżda hemm relattivament ftit riċerka bijoloġika fuq il-fjuri tagħha. Il-perjodu tal-fjoritura tal-pajp fjuri huwa minn April sa Mejju [4], prinċipalment Hemm tliet kuluri ta 'abjad , aħmar, u vjola Il-fjuri tal-pajpijiet huma sinjuri fil-kulur, iżda l-mekkaniżmu ta 'regolazzjoni tal-kulur tal-fjuri tagħhom ma ġiex irrappurtat Il-klassijiet huma relatati mat-tip, il-kontenut, il-kontenut u d-distribuzzjoni tal-istruttura tat-tessut tal-petali, il-pigment u r-regolamentazzjoni tal-fatturi ambjentali. u fatturi ġenetiċi [5] Il-pigment fil-fjuri tal-pjanti jinkludi prinċipalment tliet kategoriji: flavonoids, karotên, u beetine Kulur, l-aktar firxa ta 'kulur kbir [7]. bħala t-tliet varjetajiet ta 'Paeonia Lactiflora Pall.

Jidher bħala abjad, u l-kulur prinċipali tal-kulur fih il-kulur tal-kompetenza aħmar u sabiħ jagħmel il-fjuri preżenti bħala vjola - aħmar [8]. Il-kulur tal-fjuri huwa karatteristika importanti ta 'ħafna pjanti ornamentali, u huwa wkoll il-fattur ewlieni li jattira l-insetti roża [9]. Studji wrew li huwa mgħoddi L-ogħla frekwenza ta 'żjarat insetti hija l-pjanta cistanche vjola sfond [10]. Għal riċerka bijoloġika dwar ir-riċerka ġenetika sintetika ta 'cistanoids fil-fjuri tat-tubu tal-fjura cistanosaurus, huwa li jwassal biex tiċċara l-mekkaniżmu ta' kontroll tal-kulur tal-kordon tal-fjura tat-tubu, tipprovdi bażi teoretika għat-titjib tal-kulur tat-teknoloġija tal-inġinerija ġenetika, tippromwovi l-kuluri aktar sinjuri tagħha, iżid il-wiri, tespandi l-ambitu tal-applikazzjonijiet.

Il-mogħdija bijosintetika taflavonojdijibda bil-mogħdija tal-fenilpropanoid. Phenylalanine huwa l-ewwel konvertit f'aċidu cinnamic taħt l-azzjoni ta 'phenylalanine ammonialyase (PAL), u l-aċidu cinnamic huwa 4-hydroxylated mill-aċidu cinnamic. L-enzima (ċinnamic acid-4-hydroxylase, C4H) u 4-coumarate coenzyme A ligase ({4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL) jikkatalizzaw ir-reazzjoni biex jiġġeneraw 4-coumaroyl-CoA [11]. Molekula waħda ta' 4-coumaroyl-CoA u tliet molekuli ta' malonyl-CoA huma kkatalizzati minn chalcone synthase (CHS) biex jiġġeneraw naringenin chalcone, li għandukomposti flavonojdi.L-iskeletru bażiku ta' chalcone isomerase, flavanone-3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reductase, eċċ. jiġġenera varjetà ta' flavonoids bħal isoflavones, flavonols, anthocyanins, eċċ. [12]. Bħala enzima ewlenija fil-mogħdija bijosintetika tal-flavonojdi, is-CHS jirregola l-kontenut tal-flavonojdi fil-pjanti u għandu wkoll rwol importanti fir-regolazzjoni tal-kulur tal-fjuri tal-pjanti [13]. Pereżempju, is-sajlenser tal-ġeni ta 'wara t-traskrizzjoni ta' Gentiana scabra Bunge CHS jista 'jinibixxi l-bijosintesi ta' anthocyanins u jikkawża jbajdu speċifiku tal-lobi tal-korolla [14]. Is-sajlenser tal-ġene CHS ta' Actinidia eriantha Benth. Is-CHS inaqqas il-kontenut ta' anthocyanin fil-petali u jikkawża Il-kulur tal-petali ħomor isir eħfef [15]. Għalhekk, f'dan l-istudju, ġene CtCHS ġie kklonat minn fjuri Cistanche deserticola, u analiżi tal-bijoinformatika, espressjoni u purifikazzjoni prokarjotika, analiżi tal-attività tal-enżimi, analiżi tal-lokalizzazzjoni subċellulari u analiżi tal-espressjoni fi tliet kuluri ta 'fjuri saru fuqha biex tesplora Il-funzjoni ta' CtCHS proteina u l-mudell ta 'espressjoni tal-ġene CtCHS intużaw biex jesploraw b'mod preliminari r-relazzjoni bejn CtCHS u l-kulur tal-fjura ta' Cistanche deserticola, li stabbilixxa l-pedament għall-istudju tal-mekkaniżmu regolatorju tal-kulur tal-fjura ta 'Cistanche deserticola.

1 Materjali u strumenti

1.1 Materjali

Fjuri ta 'Cistanche tuberosa inġabru mill-Kontea ta' Yutian, Prefettura ta 'Hotan, Xinjiang f'Mejju 2018. Il-prinċipju każwali ġie segwit waqt it-teħid ta' kampjuni, u ġew magħżula fjuri ta 'Cistanche tuberosa bi status fiżjoloġiku tajjeb u għoli konsistenti tal-pjanti. Tliet razez ta 'Cistanche deserticola bi tliet kuluri tal-fjuri ta' abjad, aħmar u vjola ttieħdu u ġew identifikati bħala Cistanche tubulosa (Schenk) Wight mill-Professur Tu Pengfei ta 'Peking University School of Pharmacy. Ġew iffriżati malajr fin-nitroġenu likwidu, maħżuna fuq silġ niexef, u ttrasportati lejn Beijing. Ċelloli E. coli DH5 kimikament kompetenti nxtraw minn Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., u E. coli BL21 (DE3) ċelluli kimikament kompetenti nxtraw minn Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Il-vettur inxtara minn Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA inxtara minn Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -chalcone nxtraw minn Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., u naringenin inxtara minn Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Strumenti

Spettrofotometru Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, USA); strument PCR gradjent (Eppendorf Company, il-Ġermanja); Strument PCR kwantitattiv tal-fluworexxenza CFX 96, immaġni tal-ġel UVP, strument tal-elettroforeżi tal-ġel, strument tal-elettroforeżi tal-proteini (BioRad Company, USA); EnSpire

Microplate reader (PerkinElmer Company, l-Istati Uniti); inkubatur ta 'temperatura kostanti (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oxxillatur ta 'temperatura sħiħa ta' kapaċità kbira DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ -82Oxxillatur tat-temperatura kostanti tal-banju tal-ilma (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-clean workbench (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); sterilizzatur bil-fwar bi pressjoni għolja (TOMY Company, il-Ġappun); Strument tal-ilma pur Milli Q (Millipore, l-Istati Uniti); LC-20Kromatografu tal-Fażi likwida b'effiċjenza għolja (Kumpanija Shimadzu, Ġappun); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (Thermo Fisher Company, USA); Mikroskopju konfokali tal-lejżer FV1200 (Olympus Company, Ġappun).

2 Metodi sperimentali

2.1 Estrazzjoni ta 'RNA u sinteżi ta' cDNA. Il-fjuri ta 'Cistanche deserticola ġew mitħun fin-nitroġenu likwidu u mbagħad ġew soġġetti għal analiżi ta' estrazzjoni ta 'RNA.

L-RNA totali ġie estratt bl-użu ta 'kit (Norgen, Cat 17200), il-konċentrazzjoni u l-kwalità tal-RNA ġew skoperti minn NanoDrop 2000C, u kampjuni ta' RNA bi proporzjon A260/A280 bejn 1.8 u 2.1 intgħażlu għal sintesi ta 'traskrizzjoni inversa ta' cDNA. M-MLV reverse transcriptase (Promega, M170B) intuża biex reverse-trascribe l-RNA totali kwalifikat f'cDNA. L-operazzjonijiet sperimentali saru skond l-istruzzjonijiet.

2.2 Klonazzjoni tal-ġene CtCHS

Ibbażat fuq id-dejta tat-traskriptome tal-fjuri Cistanche deserticola tal-grupp ta 'riċerka tagħna [16], CtCHS b'qafas ta' qari miftuħ sħiħ ġie skrinjat, u s-softwer SnapGene intuża biex jiddisinja primers speċifiċi bbażati fuq is-sekwenza tal-ġeni (Tabella 1). L-amplifikazzjoni tal-PCR saret bl-użu ta 'cDNA tal-fjura ta' Cistanche deserticola bħala mudell. Is-sistema ta' amplifikazzjoni kienet 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, primers upstream u downstream (10 μmol/L) 2 μL kull wieħed, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Il-kundizzjonijiet tar-reazzjoni kienu: pre-denaturazzjoni f'95 grad għal 3 min; 25 ċiklu ta 'denaturazzjoni f'95 grad għal 15 s, ittemprar f'55 grad għal 15 s, u estensjoni f'72 grad għal 1 min; u estensjoni tar-reazzjoni f'72 grad għal 5 min. Il-prodott tal-PCR ġie skopert b'elettroforeżi tal-ġell tal-agarose 1%, u l-kit tal-purifikazzjoni tad-DNA (Novizan, Cat DC301-01) intuża għall-irkupru tal-ġel, u mbagħad id-DNA rkuprat ġie ppurifikat b'kit ta' klonazzjoni rapida (Novizan, Cat C601-01). Il-framment tad-DNA ġie mgħaqqad bil-vettur pCE2 TA/Blunt-Zero, ittrasformat f'ċelluli kompetenti ta 'Escherichia coli DH5, u wara l-kultivazzjoni matul il-lejl f'37 grad, intgħażlu razez ta' klonu wieħed u ntbagħtu lill-kumpanija għas-sekwenzjar.

Tabella 1 Sekwenzi Primer

2.3 Analiżi tal-bijoinformatika

Uża softwer onlajn ProtParam biex tanalizza l-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tal-proteini; uża l-għodda onlajn Prot Scale biex tanalizza l-idrofiliċità/idrofobiċità tal-proteini; uża l-għodda onlajn SOPMA biex tbassar l-istruttura sekondarja tal-proteini; tuża softwer ta 'analiżi onlajn SWISS-MODEL biex tbassar l-istruttura terzjarja tal-proteini; uża softwer onlajn TMHMM Tbassar l-istruttura transmembrana tal-proteina; uża softwer DNAMAN biex tqabbel l-omoloġija ta 'CtCHS mas-sekwenzi ta' aċidi amminiċi CHS ta 'speċi oħra; uża softwer MEGA-X biex tibni siġra filoġenetika, bl-użu ta 'neigh-joining (NJ) u korrezzjoni ta' Poisson Id-distanza evoluttiva hija kkalkulata bl-użu tal-metodu Bootstrap, u n-numru ta 'repetizzjonijiet Bootstrap huwa 1000 darba.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS intuża għal aktar skoperta. Il-kundizzjonijiet tal-fażi likwida kienu kolonna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), temperatura tal-kolonna 40 grad, naringenin , chalcone u naringenin. Il-volum tat-tagħbija tas-sustanza ta 'kontroll huwa 4 μL, u l-volum tat-tagħbija tal-prodott ta' reazzjoni tal-enżima huwa 7 μL. L-ilma (A)-acetonitrile (B) jintuża bħala l-fażi mobbli. Il-gradjent ta 'eluzzjoni huwa: 0 sa 5 min, 30% B; 5 sa 15-il minuta. , 30% ~ 60% B; 15 ~ 20 min, 60% ~ 100% B; 20 ~ 25 min, 100% B; 25 ~ 31 min, 100% ~ 30% B. Ir-rata tal-fluss volumetrika hija 0.3 mL/min. Il-kundizzjonijiet tal-ispettrometrija tal-massa huma sors tal-jone tal-elettrospray, nitroġenu bħala gass trasportatur, pressjoni tal-gass għant 3.5 MPa, pressjoni tal-gass awżiljarju 1.0 MPa, pressjoni tal-isprej 3500 V, temperatura kapillari 350 grad, temperatura awżiljarja tat-tisħin tal-gass 200 grad, modi tal-jone pożittiv u negattiv, skanjar Il-firxa tal-joni m/z hija 100-1500, ir-riżoluzzjoni sħiħa tal-MS hija 35 000, ir-riżoluzzjoni dd-MS2 hija 17 500, (N)

CE / stepped nce stabbilit għal 35, 60.

2.6 Lokalizzazzjoni subċellulari tal-proteina CtCHS

Ibbażat fuq is-sekwenza CtCHS u l-prinċipju ta 'klonazzjoni mingħajr saldatura, ġew iddisinjati primers b'siti ta' qtugħ ta 'enżimi Kpn Ⅰ u BamH Ⅰ, u l-frammenti fil-mira korrispondenti ġew amplifikati permezz tal-PCR. Il-plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP ġie diġerit b'endonucleases ta' restrizzjoni Kpn Ⅰ u BamH Ⅰ, u l-framment fil-mira u l-vettur ġew imqabbda permezz tal-kit ta' klonazzjoni mingħajr saldatura (Novizan, Cat C115-01), u mbagħad trasferiti f'ċelluli kompetenti E. coli DH5. , agħżel razez ta 'klonu wieħed għas-sekwenzjar, u estratt plasmidi mir-razez korretti. Il-plażmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS u pCAMBIA 1300-35S-GFP ġew trasformati fi protoplasti Arabidopsis thaliana bl-użu ta 'PEG4000, u kkultivati ​​taħt dawl baxx għal 8 sa 10 sigħat. Il-lokalizzazzjoni subċellulari tal-proteina CtCHS kienet osservata taħt mikroskopju konfokali tal-lejżer.

2.7 Analiżi tal-mudell tal-espressjoni CtCHS

Ibbażat fuq is-sekwenza CtCHS, DNAMAN intuża biex jiddisinja primers kwantitattivi ta 'fluworexxenza f'ħin reali, b'kaxxa F bħala l-ġene ta' referenza interna. Is-sekwenzi tal-primer huma murija fit-Tabella 1. L-espressjoni relattiva ta 'CtCHS fil-fjuri ta' Cistanche deserticola ta 'kuluri differenti ġiet skoperta minn PCR kwantitattiv ta' fluworexxenza f'ħin reali. Uża TransStart Green qPCR SuperMix (deheb sħiħ, AQ101-02) biex tkejjel bil-metodu taż-żebgħa fluworexxenti SYBR Green, sistema ta' reazzjoni: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, primers upstream u downstream (10

μmol/L) {{0}}.2 μL kull wieħed, cDNA template 0.5 μL, ilma mingħajr nukleotidase 4.1 μL, metodu f'żewġ stadji intuża għar-reazzjoni, u l-proċedura ta 'reazzjoni kienet ibbażata fuq il-metodu ta' Dong Xianjuan et al. [18]. Kull kampjun kien fih 3 repliki bijoloġiċi, u l-esperiment ġie ripetut tliet darbiet. Id-dejta sperimentali ġiet analizzata bl-użu ta’ Excel sa 2

L-espressjoni relattiva ta 'CtCHS ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu -ΔΔCt, u GraphPad Prism 8 intuża biex twettaq analiżi tas-sinifikat u tfassal istogrammi.