Cistanche: Produzzjoni ta' Ossidu Nitriku Indott minn Echinacoside fiċ-Ċelloli Endoteljali: Rwoli Ta' Riċettur ta' Androġenu U l-Pathway PI3K-Akt

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU u XIN LIU

Introduzzjoni

CistancheHoffmg. Et Link hija ħaxixa parassita perenni ta' ġeneru tal-familja Orobanchaceae. HerbaCistanche, iz-zokk taCistanche deserticolaY. c. MA uCistanche tubulosa(Schenk) R. Piż, intużaw bħala aġent toniku biex jikkura defiċjenza tal-kliewi, impotenza, leukorrhea morbosi u stitikezza senile (1), li jistgħu jkunu dovuti għall-effett regolatorju tiegħu li jixbaħ lill-androġeni jew ormon sesswali (2).Echinacoside(EcH; c35H46O20;

piż molekulari, 786.73; Fig. 1), huwa wieħed mill-phenylethanoid glycosides (PhGs) iżolati miż-zkuk ta 'HerbaCistanche, u juri proprjetajiet bijoloġiċi multipli, inklużi effetti anti-ossidanti, kontra x-xjuħija, anti-infjammatorji, epatoprotettivi u newroprotettivi (3). Investigazzjonijiet farmakoloġiċi moderni wrew li diversi kostitwenti ta' HerbaCistanche, inklużi EcH, acteoside, kankanose, kankanoside F u cistanoside F, juru attività vasorelaxant (4).

L-endotelju huwa regolatur kritiku tal-vaskulatura, u l-ossidu nitriku (NO) huwa fattur ta 'illaxkar importanti rilaxxat miċ-ċelloli endoteljali. Billi jxerred f'ċelluli tal-muskoli lixxi, NO jattiva guanylate cyclase, iżid il-livelli ta 'cyclic guanosine monophosphate (cGMP), u mbagħad jattiva protein kinases dipendenti fuq cGMP (PKGs) biex jippromwovi rilassament tal-muskoli lixxi (5). Preċedentement intwera li l-EcH f'{2}} µM jaġixxi direttament fuq il-muskolu lixx vaskulari u jinibixxi l-proliferazzjoni indotta mill-ipoksja fiċ-ċelloli tal-muskoli lixxi tal-arterja pulmonari tal-firien (6), filwaqt li 30-300 µM EcH ikkawża vasorelaxation akut fl-endotelju- ċrieki intatti b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni, u produzzjoni mtejba ta 'cGMP fil-muskolu lixx corpus cavernosum ta' ċrieki aortiċi kkuntrattati minn phenylephrine (7). Billi tiftaħ il-kanali NO-cGMP-PKG-BKca fiċ-ċelluli tal-muskoli lixxi, 100 jew 300 µM EcH irażżan il-kontrazzjoni indotta minn noradrenalina fl-arterji pulmonari tal-firien, partikolarment f'ċrieki denuded bl-endotelju (8). Iċ-ċelloli endoteljali huma regolaturi ewlenin tal-funzjoni kardjovaskulari u, f'diversi każijiet, instab li r-rilassament dipendenti fuq l-endotelju kien dovut għal sustanza trasferibbli, bħal NO, rilaxxata mill-endotelju (9). Madankollu, il-mekkaniżmu molekulari upstream tal-produzzjoni NO indotta minn EcH fiċ-ċelloli endoteljali vaskulari jeħtieġ aktar investigazzjoni.

Fl-endotelju vaskulari, il-ġenerazzjoni NO hija primarjament medjata minn endotelju NO synthase (eNOS). Diversi gruppi wrew li l-mogħdija ta' phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) jattiva s-serine threonine protein kinase B (Akt), li tikkawża diretta eNOS phospho- ylation f'serine 1177 (Ser1177) (10). Ir-riċettur tal-androġeni (AR) huwa membru tas-sottofamilja tar-riċetturi nukleari s3, li kanonikament jimmodifika l-espressjoni tal-ġeni. Lokalizzazzjoni AR għall-caveolae fil-membrana taċ-ċelluli hija involuta fiha

ir-regolazzjoni mhux ġenomika tal-funzjoni taċ-ċelluli endoteljali jew l-espressjoni tal-ġeni billi tiskatta l-kaskata c-Src/PI3K/Akt, li fl-aħħar mill-aħħar tirriżulta f'fosforilazzjoni ta' eNOS u produzzjoni ta' NO (11). Fiċ-ċelloli endoteljali aortiċi tal-bniedem, testosterone ġie rrappurtat li jattiva s-sinjalar PI3K/Akt u jinduċi malajr NO produzzjoni minħabba l-interazzjoni diretta ta 'AR u s-subunità p85 ta' PI3K fuq is-sistema kardjovaskulari (12). Ġie rrappurtat li l-EcH jaggrava s-sintomi relatati man-nuqqas tal-ormoni u jeżerċita l-effetti tiegħu bħall-androġeni minħabba rbit kompetittiv mal-AR minflok it-testosterone (2). Għalhekk, l-istudju preżenti ipotesizza li l-mogħdija PI3K/Akt tista 'tkun involuta fil-produzzjoni ta' NO permezz ta 'fosforilazzjoni ta' eNOS dipendenti fuq l-AR indotta minn EcH. L-għan tal-istudju preżenti kien li jevalwa l-effetti li ġejjin ta 'EcH: i) Induzzjoni ta' produzzjoni ta 'NO u fosforilazzjoni ta' eNOS; ii) involviment ta' AR fil-fosforilazzjoni ta' eNOS; u iii) attivazzjoni tal-mogħdija PI3K/Akt fiċ-ċelloli endoteljali tal-vina umbilikali tal-bniedem (HUVEcs), mudell sperimentali magħruf għall-istudju tar-regolazzjoni tal-funzjonijiet taċ-ċelluli endoteljali u l-anġjoġenesi (13).

Materjali u metodi

Kimiċi u reaġenti.EcH (purità, 92.5 fil-mija) inkiseb mill-Istandards Nazzjonali ta 'Referenza tad-droga fl-Istitut Nazzjonali għall-Ikel u l-kontroll tad-droga. Antikorpi kontra p-Akt (Ser473; cat. nru. ab8805), Akt (kat. nru. ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. nru. ab184154) u eNOS (kat. nru. ab76198) inxtraw mingħand Abcam. L-inibituri ta 'nilutamide u IcI 182780 inkisbu minn Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME inxtara minn Adamas-Beta, Ltd., u wortmannin inxtara minn Pribolab.

Ċellula kultura ud-droga trattament.HUVEcs inkisbu minn Sciencell Research Laboratories Inc. u kkultivati ​​f'medju taċ-ċelluli endoteljali (EcM; Sciencell Research Laboratories) b'5 fil-mija (v/v) serum bovin tal-fetu (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) u 1 fil-mija taċ-ċellula endoteljali Suppliment tat-tkabbir (ECGS) f'37˚C (5 fil-mija CO2 u 95 fil-mija umdità) (14). Malli laħqu l-konfluwenza, iċ-ċelloli ġew diġeriti bi trypsin u miksija f'EcM b'1 fil-mija FBS u 1 fil-mija EcGS. Għall-esperimenti kollha, HUVEcs ġew ibbanjati f'konċentrazzjoni ta '1x104/ml u mkabbra sakemm laħqu l-konfluwenza. Qabel it-trattament b'EcH jew stimulaturi oħra, iċ-ċelloli ġew inkubati f'EcM mingħajr fenol aħmar mingħajr FBS u EcGS għal 6 sigħat biex jinduċu

arrest tat-tkabbir. Fl-esperimenti inibitorji, HUVEcs ġew inkubati minn qabel b'diversi antagonisti jew inibituri, inklużi 10 µM nilutamide, 10 µM IcI 182780, 0.5 mM L-NAME jew 5 µM wortmannin, għal 30 min, bi jew mingħajr ECH, f'37˚C. Fil-gruppi kollha, inkluż il-kontroll, dMSO intuża bħala solvent f'konċentrazzjonijiet ugwali ta '0.001 fil-mija.

Kejl ta intraċellulari NOproduzzjoni.

Bidliet relattivi fil-konċentrazzjoni ċitosolika NO f'HUVEcs ġew immonitorjati bl-użu tas-sonda fluworexxenti NO DAF-FM (Cayman Chemical Company), kif irrappurtat qabel (12). Fil-qosor, iċ-ċelluli ġew mgħobbija b'5 µM DAF-FM diaċetat għal 20 min f'37˚C fi pjanċa ta 'mikrotiter iswed u laħlaħ bosta drabi b'PBS (pH 7.4). Il-fluworexxenza ġiet iddeterminata f'tul ta 'mewġ ta' eċitazzjoni u emissjoni ta '495 u 515 nm, rispettivament, bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate fluworexxenti (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) u mikroskopju invertit kompatt (Nikon eclipse Ts2R; Nikon korporazzjoni).

Punent blot analiżi.Kif irrappurtat qabel (15), monosaffi konfluwenti ta 'ċelluli ġew maħsula darbtejn f'PBS kiesaħ bis-silġ u lysed ma buffer RIPA (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). Il-konċentrazzjoni tal-proteina fis-supernatant ġiet imkejla bl-użu tal-metodu tal-analiżi tal-aċidu bicinchoninic (16). Sussegwentement, 30 µg proteina ġew mgħobbija għal kull korsija, separati bl-użu ta 'ġels tal-polyacrylamide 10 fil-mija u trasferiti fuq membrani polyvinylidene difluoride. Il-membrani ġew imblukkati b'5 fil-mija ħalib xkumat għal siegħa f'25˚C. Wara inkubazzjoni b'antikorpi monoklonali kontra Akt (1:1,000 dilwizzjoni), p-Akt (1:500 dilwizzjoni), eNOS (1:2,000 dilwizzjoni), jew p-eNOS (1 :1,000 dilwizzjoni) f'4˚C matul il-lejl, il-membrani ġew maħsula b'TBST (li fih 0.1 fil-mija Tween-20) 4 darbiet għal ~15 min kull ħasla f'25˚C. Sussegwentement, il-membrani ġew inkubati b'antikorpi sekondarji konjugati mal-perossidasi tar-ravanell (1:5, 000 dilwizzjoni; antikorp kontra l-ġrieden, cat. Nru A0216, jew antikorp kontra l-fenek, cat. Nru A0208, Beyotime Institute tal-bijoteknoloġija) għal siegħa f'25˚C, u misjuba bl-użu ta' kit ta' kimiluminixxenza msaħħa (cat. nru. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). L-intensitajiet tal-banda ġew ikkwantifikati bl-użu ta 'softwer ta' analiżi tal-ġel Image J, verżjoni 1.8.0_112 (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa).

Żgħir jinterferixxi (si) RNA preparazzjoni u trasfezzjoni.L-RNAs twal double-stranded ġew sintetizzati mill-mRNA fil-mira tal-AR u r-riċettur tal-estroġenu (ER) b'sekwenzi murija fit-Tabella I. Il-kundizzjonijiet għall-knockdown tas-siRNA kienu jinvolvu t-trasfettazzjoni tal-HUVECs f'70 fil-mija konfluwenza miżmuma f'mhux antimikrobiċi. medja tal-kultura f'platti tal-kultura miksija bil-kollaġen ta' 60 mm. It-trasfezzjoni ta '5 nM AR-siRNA jew 10 nM ER -siRNA b'reaġent Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) saret separatament, skont il-protokolli tal-manifattur. L-effiċjenza tat-trasfezzjoni ġiet evalwata permezz ta' traskrizzjoni inversa kwantitattiva-PcR analiżi (RT-qPcR), kif irrappurtat qabel (17). Il-kundizzjonijiet tat-termo-ċikliżmu kienu kif ġej: 10 min f'95˚C; 40 ċiklu ta' 95˚C għal 5 sek u 60˚C għal 1 min, u kurva tat-tidwib f'95˚C għal 15 sek, 60˚C għal 1 min u 95˚C għal 15 sek; twettqu tliet repliki bijoloġiċi indipendenti għal kull kampjun. L-esperimenti sussegwenti saru 48 siegħa wara t-trasfezzjoni. Primer pari ġew iddisinjati bl-użu ta' softwer Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) bis-sekwenzi li ġejjin: AR quddiem, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' u lura, 5'-GAcTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER quddiem, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' u lura, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; u GAPdH 'il quddiem, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' u lura, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Statistika analiżi.Id-dejta kollha hija ppreżentata bħala l-medja ± devjazzjoni standard. Paraguni statistiċi bejn il-gruppi saru bl-użu tat-test Kruskal-Wallis jew ANOVA f'żewġ direzzjonijiet bit-test post hoc ta 'Tukey għal paraguni multipli. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Riżultati

ECH jinduċi LE produzzjoni u eNOSfosforilazzjoni.Kif muri f'Fig. 2A u B, 1 µM ECH żiedet b'mod sinifikanti l-produzzjoni intraċellulari ta 'NO f'HUVEcs meta mqabbla maċ-ċelloli ta' kontroll negattiv, filwaqt li l-effett stimulatorju ta 'EcH kien attenwat għal-livell ta' kontroll permezz ta 'pretrattament b'L-NAME. Biex tinkiseb l-aħjar konċentrazzjoni, il-fosforilazzjoni ta' eNOS ġiet ittestjata f'60 minuta wara t-trattament b'EcH f'konċentrazzjonijiet

ta' {{0}}, 0.01, 0.1, 1 u 10 µM. Ir-riżultati wrew li EcH f'konċentrazzjonijiet ta '0.01-10 µM jista' jinduċi b'mod sinifikanti fosforilazzjoni ta 'eNOS f'Ser 1177 b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni, bil-fosforilazzjoni massima ta' eNOS osservata f'induzzjoni ta 'EcH 10 µM (Fig. 2c u d). Barra minn hekk, il-fosforilazzjoni ta 'eNOS f'Ser1177 ġiet eżaminata b'analiżi tal-western blot f'0, 5, 15, 30, 60 u 120 min wara inkubazzjoni b'1 µM EcH. Ġie osservat li l-fosforilazzjoni ta 'eNOS ġiet attivata malajr minn EcH f'5 min, u kompliet tiżdied sa 30 min ta' inkubazzjoni (Fig. 2E u F). Sussegwentement, minkejja t-trattament EcH, il-kobor relattiv tal-fosforilazzjoni tal-eNOS baqa' stabbli minn 30 min 'il quddiem; għalhekk, EcH ma affettwax l-espressjoni totali ta 'eNOS (Fig. 2c u E).

AR timmedja Ikkaġunat mill-ECH LE produzzjoni u eNOSeffetti ta 'interferenza ta' AR-siRNA-1 u ER -siRNA-2 kienu l-aktar ta 'suċċess fl-inibizzjoni tal-espressjoni ta' AR u ER f'HUVEcs fl-istudju preżenti (Fig. 3). Sussegwentement, ġew applikati antagonist għall-analiżi tal-inibizzjoni tal-funzjoni tal-AR u siRNA għall-analiżi tat-telf tal-funzjoni tal-AR biex jevalwaw l-involviment tal-AR fl-attivazzjoni tal-eNOS indotta minn EcH u l-produzzjoni tal-NO. Kif muri f'Fig. 4A, 1 µM ECH żiedet b'mod sinifikanti l-produzzjoni NO f'HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH jattiva il PI3K/Akt mogħdija.Fl-istudju preżenti, il-fosforilazzjoni Akt f'Ser473 ġiet ittestjata 60 min wara l-inkubazzjoni ta' EcH f'konċentrazzjonijiet ta' 0, 0.01, 0.1 , 1 u 10 µM. Ir-riżultati indikaw li EcH (0.01-10 µM) jista' jinduċi b'mod sinifikanti fosforilazzjoni Akt. Il-livelli ta 'espressjoni relattiva ta' p-Akt laħqu l-ogħla livell f'1 u 10 µM ta 'trattament EcH (Fig. 5A u B). Barra minn hekk, il-fosforilazzjoni Akt ġiet eżaminata b'analiżi tal-western blot f'0, 5, 15, 30, 60 u 120 min wara ż-żieda ta' 1 µM EcH għal kulturi HUVEc. Kif muri f'Fig. 5c u d, EcH żiedet malajr Akt fosforilazzjoni wara 5 min ta 'inkubazzjoni, u l-livell massimu ta' proteina ta 'p-Akt kien osservat f'60 min. B'kuntrast, EcH ma affettwax l-espressjoni totali Akt (Fig. 5A u c). Barra minn hekk, biex jiġi investigat l-effett potenzjali tal-mogħdija PI3K fuq il-fosforilazzjoni ta 'eNOS, HUVEcs ġew ittrattati minn qabel bl-inibitur PI3K wortmannin qabel l-applikazzjoni ta' EcH. Wortmannin instab li jnaqqas il-produzzjoni ta 'NO indotta minn EcH għal livelli ta' linja bażi (Fig. 5E). Fenomenu simili kien osservat bl-użu ta 'mikroskopija tal-fluworexxenza meta eżaminat il-fluworexxenza DAF-FM indotta minn EcH (Fig. 5F). Barra minn hekk, wortmannin jista 'jkollu l-abbiltà li jabolixxi fosforilazzjoni rapida eNOS f'HUVEcs (Fig. 5G u H). Ir-riżultati msemmija hawn fuq jissuġġerixxu li EcH jista' jattiva l-fosforilazzjoni ta' eNOS u l-produzzjoni ta' NO permezz tal-mogħdija PI3K/Akt.

Diskussjoni

EcH huwa kompost naturali iżolat minn HerbaCistanche, b'diversi proprjetajiet farmakoloġiċi. Preċedentement intwera li EcH eżerċita effett ta 'rilassament vaskulari dipendenti fuq l-endotelju billi fetaħ kanali NO-cGMP-PKG-BKca fiċ-ċelloli tal-muskoli lixxi tal-vini tad-demm (7,8). Is-sejbiet attwali jipprovdu evidenza li l-ECH eżerċita attivazzjoni dipendenti fuq l-AR ta 'eNOS biex jinduċi produzzjoni ta' NO bl-involviment tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K/Akt fiċ-ċelloli endoteljali vaskulari.

Bħala l-aktar saff ta 'ġewwa tal-ħajt tal-bastiment, l-endotelju jista' malajr iħoss u jirrispondi għal bidliet fil-fluss tad-demm, min-naħa tiegħu jirriżulta fi trażmissjoni tas-sinjali għaċ-ċelloli tal-muskoli lixxi sottostanti sabiex jirregola t-ton vaskulari (18). Ġie rrappurtat b’mod wiesa’ li jeżistu komposti vażodilatorji multipli derivati ​​mill-endotelju, bl-aktar sustanza prototipikali NO, iffurmat mill-isoforma endoteljali ta 'eNOS, li tirriżulta fi fosforilazzjoni (19). F'kundizzjonijiet normali, eNOS jibqa' inattiv meta marbut ma' caveolin, u jiġi attivat bis-suċċessjoni ta' avvenimenti li ġejjin fl-endotelju.ċelluli: i) eNOS jiddissoċja minn caveolin-1 u jassoċja ma' ca2 plus /caM; ii) il-proteina ta 'xokk tas-sħana (HSP)90 tippromwovi eNOSdimerizzazzjoni u tiffavorixxi formazzjoni sterika biex tirrekluta Akt; u iii) calcineurin dephosphorylates Thr495 biex isaħħaħ l-istat ta 'attivazzjoni (20). Fl-istudju preżenti, il-produzzjoni NO żdiedet b'mod sinifikanti f'HUVECs ittrattati b'1 µM ECH. Dan il-fenomenu kien simili għal riżultati preċedenti, fejn EcH żied ir-rilaxx ta 'NO u stimula s-sintesi ta' cGMP f'ċrieki aortiċi toraċiċi tal-firien (7). Barra minn hekk, żewġ siti ta 'fosforilazzjoni, Ser1177 u Thr495, jidhru li huma partikolarment importanti għar-regolazzjoni ta' l-attività ta 'eNOS (20), u l-istudju preżenti wera li EcH indotta fosforilazzjoni ta' eNOS akuta f'Ser1177 b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Barra minn hekk, l-istimoli assoċjati mal-effetti fuq il-livelli tal-proteina eNOS jiddeterminaw prinċipalment l-istabbiltà tal-mRNA tal-eNOS, u jekk l-istimolu jinżamm għal perjodu itwal ta 'żmien, it-traskrizzjoni tal-mRNA tal-eNOS sseħħ permezz ta' protein kinase attivat minn mitoġenu u fattur nukleari κB (20). Meħuda flimkien, dawn l-osservazzjonijiet jindikaw li l-attivazzjoni ta 'eNOS f'Ser1177 hija responsabbli għas-sintesi NO indotta minn EcH.

Barra minn hekk, numru dejjem jikber ta’ studji wrew li l-AR hija espressa f’ċelluli endoteljali f’numru ta’ tessuti umani, li jissuġġerixxi rwol potenzjali għall-androġeni u l-analogi tagħhom, li jaġixxu permezz ta’ proċessi medjati mill-AR, fil-modulazzjoni tal-endoteljali tal-bniedem. omeostażi taċ-ċelluli (21). Fil-mogħdija PI3K/Akt mhux klassika, AR jista' jattiva PI3K billi jinteraġixxi direttament mas-subunità regolatorja PI3K p85 (22). L-istudju preżenti wera li antagonist AR jew AR siRNA naqqas il-produzzjoni ta 'NO u fosforilazzjoni ta' eNOS indotta minn EcH f'HUVEcs. Preċedentement ġie rrappurtat li l-estroġeni jinduċu eNOS fosforilazzjoni u jistimulaw il-produzzjoni NO permezz ta 'attivazzjoni ER klassika fiċ-ċelloli endoteljali (23), u l-amministrazzjoni ta' ECH ttejjeb b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'ER fl-utru (24). Madankollu, fl-istudju preżenti, l-effett ta 'AR kien aktar prominenti meta mqabbel ma' dak ta 'ER fuq attivazzjoni eNOS indotta minn EcH u produzzjoni ta' NO. Barra minn hekk, ġie osservat li EcH ikkawża produzzjoni akuta ta 'NO fi ftit minuti permezz ta' attivazzjoni eNOS involuta fl-AR f'HUVEcs, li hija konsistenti man-natura mhux ġenomika tar-rispons fiċ-ċelloli endoteljali. L-AR huwa assoċjat ma 'proteini ta' armar, inklużi HSP90, HSP70 u kinase Src, fiċ-ċitoplasma, u jista 'jiġi trasportat lejn il-membrana mill-kumpless AR fi żmien 5 min ta' trattament ta 'testosterone (23). Ibbażat fuq l-istrateġija ta ''sajd fil-mira', HSP90 ġie identifikat bħala l-mira akkoppjata PhGs, li indikat li EcH jista' jiffaċilita d-dissoċjazzjoni ta 'AR mill-proteini tal-armar (25). Studju ieħor issuġġerixxa li, fl-ipotalamu, EcH jista 'jikkombina mal-but AR fl-aċidi amminiċi Met-894 u Val{-713 u jinibixxi t-trasport ta' AR ċitoplasmika għan-nukleu (26). Madankollu, il-mekkaniżmu sottostanti li permezz tiegħu EchH jimmedja t-traslokazzjoni AR ċitoplasmika għall-membrana teħtieġ aktar investigazzjoni. Għalhekk, hija meħtieġa aktar riċerka biex jiġi eluċidat il-mekkaniżmu li permezz tiegħu EcH jikseb attivazzjoni ta 'eNOS li tiddependi mill-AR u kif tista' tkun assoċjata ma 'l-irbit ma' HSP90 fiċ-ċelloli endoteljali vaskulari.

Il-mogħdija PI3K/Akt hija waħda mill-aktar kaskati ta' sinjalar importanti, li l-attivazzjoni tagħha hija indotta billi tipproduċi phosphatidylinositol-3,4,5-trifosfat biex torbot id-dominju tal-omoloġija tal-pleckstrin N-terminal tas-Ser/ Thr kinase Akt. Dan jiffaċilita r-reklutaġġ ta' Akt għall-membrana tal-plażma (27). Il-mogħdija PI3K/Akt jista' jkollha rwol importanti fil-kontroll tar-rilassament dipendenti fuq l-NO indott minn EcH.

L-istudju preżenti wera li l-produzzjoni ta 'NO indotta minn EcH tnaqqset b'mod sinifikanti meta ċ-ċelloli ġew inkubati bl-inibitur PI3K wortmannin. Rapport preċedenti wera li 15 mg/kg EcH attivat il-mogħdija ta 'sinjalazzjoni PI3K/Akt f'ċelluli tal-mudullun soppressi minn 5-fluorouracil (28). Fl-istudju preżenti, l-inibituri PI3K naqqsu b'mod sinifikanti l-fosforilazzjoni ta 'eNOS indotta minn EcH f'Ser1177. Barra minn hekk, Akt attività kien predominantement regolati minn upstream regola- mogħdijiet, partikolarment PI3K dipendenti fosforilazzjoni fil Ser473 (20). Fl-istudju preżenti, EcH indotta Akt fosforilazzjoni f'Ser473 b'mod dipendenti fuq id-doża; bl-istess mod, studju preċedenti wera li 5, 10 jew 20 µM EcH eżerċitaw effett kardjoprotettiv kontra trattament ta 'anossja/riperfużjoni b'mod dipendenti mid-doża billi potenzjalment irregola p-Akt u SLc8A3 (29). Ir-regolazzjoni tat-traskrizzjoni tal-ġene Akt għadha fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa (30); għalhekk, l-istudju preżenti ffoka fuq l-effetti regolatorji ta 'wara t-traskrizzjoni ta' EcH fuq Akt. Meta wieħed iqis is-sejbiet imsemmija hawn fuq, ġie dedott li l-applikazzjoni ta' EcH għal HUVEcs tista' twassal għall-attivazzjoni tal-mogħdija PI3K/Akt, li fosforila l-eNOS u, sussegwentement, iżid il-produzzjoni ta' NO.

Bħala konklużjoni, EcH huwa prodott naturali li huwa prinċipalment iżolat minn HerbaCistanche.Il-mekkaniżmu potenzjali sottostanti l-produzzjoni ta 'NO indotta minn EcH fiċ-ċelloli endoteljali jista' jinkludi dan li ġej (Fig. 6): i) EcH jaġixxi bħala ligand funzjonali ta 'AR li huwa lokalizzat mal-caveolae fil-membrana taċ-ċellula; ii) PI3K jeħel mad-dominju idrofobiku ta 'Akt f'Ser473 u jiffaċilita r-reklutaġġ ta' Akt mal-membrana taċ-ċellula; iii) ir-reklutaġġ tal-kaskati PI3K/Akt iqanqal fosforilazzjoni ta' eNOS li tiddependi mill-AR; u iv) il-ġenerazzjoni ta 'NO hija medjata minn eNOS fiċ-ċelloli endoteljali. L-osservazzjoni li EcH jinduċi produzzjoni NO permezz tal-fosforilazzjoni ta' eNOS li tiddependi mill-AR bl-involviment tal-mogħdija PI3K/Akt tista' tikkontribwixxi għal fehim ulterjuri tal-effetti vasorelaxanti ta' EcH. Barra minn hekk, l-EcH li jimmira lejn il-mogħdijiet NO derivati ​​mill-endotelju jista 'jkun dovut għal effetti mhux ġenomiċi. Għalhekk, l-istudju preżenti jista 'jgħin jiċċara l-mekkaniżmi li permezz tagħhom EcH jeżerċita l-effetti farmakoloġiċi tiegħu biex jipprevjeni mard kardjovaskulari.

Rikonoxximenti

Ma japplikax.

Finanzjament

L-istudju preżenti kien appoġġjat mill-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza Naturali taċ-Ċina (għotja nru 81503333).

Disponibbiltà ta data u materjali

Is-settijiet tad-dejta ġġenerati u analizzati matul l-istudju preżenti huma disponibbli mill-awtur korrispondenti fuq talba raġonevoli.

tal-awturi kontribuzzjonijiet

LG u XL ikkonċepiw u ddisinjaw l-esperimenti. dL u YZ wettqu l-esperimenti. WZ u JG analizzaw id-dejta. LG abbozza l-manuskritt. XL irreveda u editja l-manuskritt. L-awturi kollha qraw u approvaw il-manuskritt finali.

1202 GUet al: ECHINACOSIDE INDUĊI PRODUZZJONI TA’ NITRIC OXIDE B’AR-DIPENDENT PI3K/AKT PATHWAY

Etika approvazzjoni u kunsens biex tipparteċipa

Ma japplikax.

Pazjent kunsens għal pubblikazzjoni

Ma japplikax.

Jikkompeti interessi

L-awturi jiddikjaraw li m'għandhom l-ebda interessi li jikkompetu.

Referenzi

1. kummissjoni tal-Farmakopea Ċiniża:CistancheHerba. Fi: Farmakopea tar-Repulika tal-Poplu taċ-Ċina 1. chin. Med. Sci. Press, Beijing, pp 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X u Zhang X: Echinacoside uCistanche tubulosa(Schenk)R. wight ittejjeb il-ħsara fit-testikoli u l-isperma indotta mill-bisphenol A fil-firien permezz ta 'enzimi sterojoġeniċi regolati bl-assi tal-gonad. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B u Ma X: Echinacoside, prodott naturali inestimabbli fit-trattament ta 'disturbi newroloġiċi u oħrajn. Molekuli 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S u Muraoka O: Phenylethanoid oligoglycosides u acylated oligosugars b'attività vasorelaxant minnCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S u Murad F: Nitric oxide jattiva guanylate cyclase u jżid il-livelli ta 'guanosine 3':5'-cyclic monophosphate f'diversi preparazzjonijiet tat-tessuti. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y u Ge RL: Effett antiproliferattiv ta 'echinaco-side fuq ċelluli tal-muskoli lixxi tal-arterja pulmonari tal-firien taħt ipoksja. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ u Tu PF: Echinacoside iqajjem rilassament dipendenti fuq l-endotelju f'ċrieki aortiċi tal-firien permezz ta 'mogħdija NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y u Ge RL: Echinacoside jinduċi vasorelaxation tal-arterja pulmonari tal-firien billi jiftaħ in-NO-cGMP-PKG- BKca kanali u tnaqqis intraċellulari ca2 plus livelli. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y u Higashi Y: Valutazzjoni ta 'vasodilatazzjoni indipendenti mill-endotelju: Mill-metodoloġija għal perspettivi kliniċi. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J u derivattiv fuq ċelluli endoteljali tal-vina umbilikali tal-bniedem kontra korriment ikkawżat mill-istress ossidattiv: Involviment ta 'antiossidazzjoni u mogħdijiet ta' sinjalazzjoni PI3k/Akt/eNOS/NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y u Okabe T: Src kinase-mediates attivazzjoni mhux ġenomika dipendenti mir-riċettur ta 'androġeni ta' kaskata ta 'sinjalazzjoni li twassal għal endoteljali nitric oxide synthase . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y u Okabe T: Attivazzjoni dipendenti fuq ir-riċettur ta' androġenu ta' endothelial nitric oxide synthase f'ċelluli endoteljali vaskulari: Rwol ta' phosphatidylinositol {{3} }kinase/Akt pathway.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F u Reno F: Proliferazzjoni dipendenti fuq l-NO u migrazzjoni indotta mill-vitamina d f'HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X u Xu X: L-espressjoni żejda tal-proteina ta 'uncoupling 2 tinibixxi l-apoptosi għolja indotta mill-glukożju taċ-ċelloli endoteljali tal-vina umbilikali tal-bniedem. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z u Bing S: Icariin idewwem is-senescence ċellulari endoteljali indotta mill-omocysteine ​​li tinvolvi l-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar PI3K/AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ u Klenk dc: Kejl tal-proteina bl-użu ta 'aċidu bicinchoninic. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H u Liu X: Il-bijosintesi tat-triterpenojdi u r-rispons tat-traskrizzjoni mqajjem mill-ossidu nitriku fil-fermentazzjoni mgħaddsaGanoderma lucidum. Proċess Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY u Gutterman dd: Iperpolarizzazzjoni derivata mill-endotelju u vażodilatazzjoni koronarja: rwoli diversi u integrati ta 'aċidi epoxyeicosatrienojċi, perossidu ta' l-idroġenu u gap junctions. Mikroċirkolazzjoni 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK u Gutterman dd: il-komunikazzjoni hija essenzjali: Mekkaniżmi ta 'sinjalazzjoni interċellulari fil-vasodilatazzjoni. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B u debret R: Sensing tal-mikroambjent tal-endotelju li jwassal għal vażodilatazzjoni medjata mill-ossidu nitriku: Reviżjoni tas-sinjali nervużi u bijomekkaniċi. Nitric Oxide 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS u Smith GJ: Riċettur ta' androġenu fiċ-ċelloli endoteljali tal-bniedem. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H u Gui YT: Azzjoni mhux ġenomika ta' androġeni hija medjata minn fosforilazzjoni rapida u regolazzjoni tat-traffikar tar-riċetturi ta' androġeni. Cell Physiol Biochem 43: 223-236,2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP u Ghedini Pc: L-attivazzjoni tal-mogħdija PI3K/Akt medjata minn riċetturi tal-estroġenu tikkontjeni għal estrone indott attivazzjoni vaskulari tas-sinjalar cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z u Li P: Attività antiosteoporotika ta 'echinacoside fil-firien ovariectomized. Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y u Tu PF: Identifikazzjoni tal-miri farmakoloġiċi u analiżi tal-effikaċja ta’ phenylethanoid glycosides minnĊistanċiHerba ibbażata fuq strateġija ta' 'sajd fil-mira'. chin Tradit Drogi Veġetali 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM u Zhang X: Echinacoside iżid il-kwantità ta 'l-isperma fil-firien billi jimmira r-riċettur ta' androġenu ipotalamiku. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J u Woodgett JR: Protein kinase B (c-Akt): Medjatur multifunzjonali ta' attivazzjoni ta' phosphatidylinositol 3-kinase. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y u Qian J: Echinacoside itejjeb il-funzjoni ematopojetika fil-ġrieden majelosoppressjoni indotta minn 5-FU. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W u Zhou H: Effetti protettivi ta 'echinacoside kontra korriment ta' anoksja / riperfużjoni fiċ-ċelloli H9c2 permezz ta 'p-AKT u SLc8A3 li jirregolaw. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P u Su Y: Ir-rwol kritiku ta 'Akt fil-funzjoni kardjovaskulari. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.