Karatterizzazzjoni ta 'Proanthocyanidins Naturali U Alkalin-Ossidizzati fl-Estratti tal-Pjanti B'UHPLC-MS/MS ta' Riżoluzzjoni Ultrahigh

Għal aktar informazzjoni. kuntatttina.xiang@wecistanche.com

Astratt: F'dan l-istudju, analizzajna l-kompożizzjoni tal-proanthocyanidin (PA) ta '55 estratt tal-pjanti qabel u wara l-alkalinossidazzjoniminn UHPLC-MS/MS b'riżoluzzjoni ultragħolja. Aħna kkaratterizzajna l-istrutturi naturali tal-PA fid-dettall u studjajna l-bidliet sofistikati fl-istrutturi tal-PA modifikati u l-mudelli u mudelli tipiċi ta 'reazzjonijiet fi ħdan klassijiet PA differenti minħabba l-ossidazzjoni. Il-PAs naturali kienu PCs, PDs, u taħlitiet ta' PC/PD tat-tip A u B. Barra minn hekk, skoprejna PAs galloylated. PCs tat-tip B f'estratti ta 'pjanti differenti kienu pjuttost stabbli u wrew l-ebda modifika jew minuri minħabba l-ossidazzjoni alkalina. Għal xi kampjuni, skoprejna r-reazzjonijiet intramolekulari ta 'PCs li jipproduċu rabtiet ta' etere tat-tip A. PCs tat-tip A kienu wkoll pjuttost stabbli mingħajr modifika jew modifika żgħira, iżda f'xi impjanti, il-formazzjoni ta 'etere addizzjonalirabtietġiet skoperta. PAs li fihom unitajiet PD kienu aktar reattivi. Wara l-ossidazzjoni alkalina, dawn il-PAs jew il-prodotti ta 'ossidazzjoni tagħhom ma ġewx skoperti aktar mill-MS minkejja li tip differenti u/jew ħotba PA mdewma kienet għadha skoperta mill-UV f'280 nm. Il-PAs Galloylated kienu pjuttost stabbli taħt ossidazzjoni alkalina jekk kienu bbażati fuq il-PC, iżda skoprejna l-konverżjoni intramolekulari minn tip B għal tip A. Il-PDs Galloylated kienu aktar reattivi u rreaġixxew b'mod simili għal PDs mhux galloylated.

Kliem ewlieni: spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja; orbitrap;ossidazzjoni; tannini; UHPLC-DAD-MS/MS

Ikklikkja hawn biex titgħallem aktar prodotti

1.Introduzzjoni

Proanthocyanidins(PAs, syn. tannini kondensati) huma oligomeri u polimeri li jikkonsistu f'unitajiet monomeriċi flavan-3-ol (Figura 1). Id-diversità tal-istrutturi PA ġejja prinċipalment mill-mudelli ta 'idrossilazzjoni tagħhom, l-ordni sekwenzjali tal-unitajiet flavan-3-ol, u l-grad ta' polimerizzazzjoni (DP), minbarra d-differenzi fl-isterjokimika f'C2 u C3 u l-varjazzjoni fil-post u l-isterjokimika tal-interflavonojdibonds [1]. L-aktar PAs komuni huma procyanidins (PCs) li jikkonsistu f'unitajiet (epi)catechin u prodelphinidins (PDs) li jikkonsistu f'unitajiet (epi)gallocatechin (Figura 1). L-istrutturi PA ppreżentati fil-figura għandhom ir-rabtiet C4→C8. Madankollu, PAs jistgħu wkoll ikunu marbuta b'bonds C4 → C6, u ma nistgħux nisseparaw dawn iż-żewġ rabtiet minn xulxin permezz ta 'spettrometrija tal-massa.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>multipli 100-kilo tunnellati fis-sena), u huma kimikament u ekonomikament aktar attraenti bħala bijopolimeru [2-5]. Bħalissa, ftit riżorsi biss, bħall-qoxra jew l-imsaġar ta 'wattle, mimosa, quebracho, ballut, qastan, mangrovja, sumach, myrobalans, u tara, huma użati għall-produzzjoni tagħhom u prinċipalment għall-esiġenzi tal-ikkunzar tal-ġilda, inbid, minerali. flotazzjoni, u industriji tat-tħaffir taż-żejt, għall-preparazzjoni tal-adeżivi, minbarra n-nutrizzjoni tal-annimali [4,6,7]. Madankollu, anke skart jew prodotti sekondarji mill-immaniġġjar u l-ipproċessar ta' frott, ħaxix, u riżorsi tal-foresti mill-applikazzjonijiet industrijali elenkati hawn fuq jistgħu jkunu sors potenzjali għall-PAs naturali [8-11]. Il-PAs jistgħu wkoll jiġu modifikati aktar sabiex itejbu l-użabilità u l-bijoattivitajiet tagħhom [12,13].

Il-proprjetajiet kimiċi tal-PAs jistgħu jiġu modifikati permezz ta' reazzjonijiet ta' derivatizzazzjoni [12]. Dawn ir-reazzjonijiet jinkludu, pereżempju, O-aċilazzjoni b'reazzjoni ma 'kloruri ta' l-aċidu jew anidridi jew alkilazzjoni ma 'alkili alkili. Id-derivazzjoni timmodifika l-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-PAs għall-applikazzjonijiet kummerċjali u t-teknoloġiji tal-purifikazzjoni tagħhom. Madankollu, biex verament jifhmu r-reazzjonijiet attwali li qed iseħħu, jeħtieġ li jiġu rregolati diversi parametri, bħar-reaġenti u s-solventi użati, it-temperatura, il-pH, u l-ħin tar-reazzjoni [12]. Mod sempliċi u rapidu biex tittejjeb l-użabilità tal-PAs tal-pjanti huwa li jiġu ossidati biex jinħolqu PAs ġodda bi strutturi molekulari mibdula. Anki jekk il-kundizzjonijiet ta' reazzjoni tal-ossidazzjoni huma magħrufa sew u ġew ssuġġeriti mekkaniżmi ta' reazzjoni differenti, il-bidliet strutturali korrispondenti huma magħrufa prinċipalment għal PAs żgħar individwali [14-18]. Pereżempju, ir-reazzjonijiet ta' ossidazzjoni u riarranġament ta' flavan-3-ols monomeriċi u dimeriċi differenti ġew diskussi b'mod eleganti diġà 30 sena ilu, li juru li l-kimika ta' dawn il-PAs f'pH alkalin hija regolata mill-formazzjoni ta' A-u/jew B-ring quinone-methides bħala intermedji reattivi ħafna li jikkawżaw ir-reazzjonijiet ta' arranġament mill-ġdid u l-konverżjoni ossidattiva ta' PAs tat-tip B għal tip A[15]. Minflok, l-imġieba tat-taħlitiet tal-PA fl-estratti tal-pjanti mhix magħrufa, u dan huwa probabbli ħafna minħabba diffikultajiet fl-analiżi tal-PAs inizjali strutturalment differenti, li huma kkontestati saħansitra aktar wara l-ossidazzjoni. Fl-istudju preċedenti tagħna, aħna ttestjajna jekk tipi differenti ta’ PAs naturali setgħux jiġu modifikati kimikament biex jipproduċu tipi ġodda ta’ PAs u studjajna l-effetti ta’ ossidazzjoni alkalina mhux speċifika li timita l-proċess ta’ estrazzjoni alkalina ta’ spiss użat għall-iskart tal-qoxra [19-23]fuq 102 Estratti tal-pjanti li fihom PA [13]. Ir-riżultati indikaw reattività differenti għal PCs u PDs. Ir-riżultat issuġġerixxa li l-PAs tal-pjanti jistgħu jiġu modifikati f'pH għoli, u l-preżenza ta 'gruppi PD tejbet b'mod sinifikanti l-probabbiltà ta' reazzjonijiet ta 'modifika. Ir-rotta ta 'reazzjoni prinċipali ġiet konkluża li hija intramolekulari, iżda għal PAs b'ħafna PD u gallovlated, kemm reazzjonijiet intra- u intermolekulari kienu indikati [13]. Barra minn hekk, studji oħra wrew li l-ossidazzjoni tal-PAs tinkludi kemm reazzjonijiet intramolekulari kif ukoll intermolekulari [14,15,24,25].

Il-karatterizzazzjoni u l-fehim dettaljati ta 'PAs naturali u ossidizzati huma ta' sfida, iżda avvanzi reċenti fl-istrumentazzjoni spettrometrika tal-massa tandem kromatografika likwida ta 'prestazzjoni ultra-għolja (UHPLC-MS/MS) b'analizzaturi tal-massa b'riżoluzzjoni għolja ppermettew il-karatterizzazzjoni ta' ħafna PA tal-pjanti differenti. [18,26-28]. L-analizzaturi tal-massa popolari għall-karatterizzazzjoni tal-PAs kienu orbitrap [27,28] u quadrupole

time-of-flight(OTOF)[29,30] minħabba l-proprjetajiet ta 'riżoluzzjoni għolja tagħhom, li jippermettu d-determinazzjoni tal-mases eżatti u l-formuli molekulari korrispondenti ta' PAs studjati f'estratti tal-pjanti. Il-PAs misjuba fin-natura normalment ikun fihom taħlita ta' strutturi oligo-u polimeriċi differenti, li jipproduċu joni iċċarġjati b'multiplikazzjoni f'jonizzazzjoni elettrospray, li tespandi l-firxa tal-massa użata [30-32]. Barra minn hekk, il-PAs għandhom mudelli ta’ frammentazzjoni karatteristiċi magħrufa sew, li jistgħu jintużaw għall-identifikazzjoni tagħhom: dawn jinkludu qsim ta’ quinone-methide (QM), fissjoni taċ-ċirku eteroċikliku (HRF), u frammentazzjoni retro-Diels-Alder (RDA) [27, 31-33]. L-istess mudelli ta’ frammentazzjoni huma ġeneralment preżenti kemm għall-PAs tat-tip A kif ukoll għat-tip B, u l-valuri m/z osservati għall-PAs tat-tip A b’rabta waħda tal-etere jvarjaw b’2 Da mill-PAs tat-tip B korrispondenti [26,{{ 19}}].

F'dan l-istudju, użajna l-UHPLC flimkien ma 'spettrometrija tal-massa tandem b'riżoluzzjoni ultragħolja sabiex (a) nistudjaw l-istrutturi PA naturali f'55 kampjun ta' pjanti b'ħafna PA fid-dettall, (b) biex tara l-bidliet sofistikati fl-istrutturi PA modifikati wara l-ossidazzjoni mill-ajru f'kundizzjonijiet alkalini u (c) li jirrikonoxxu l-mudelli u mudelli tipiċi ta 'reazzjonijiet fi klassijiet PA differenti minħabba l-ossidazzjoni.

2. Riżultati u Diskussjoni

Aħna għażilna 55 kampjun ta 'pjanti b'ħafna PA li fihom taħlitiet interessanti iżda kumplessi ta' PAs naturali bbażati fuq l-istudju preċedenti tagħna [13]. Dawn il-kampjuni tal-pjanti kienu ossidizzati bl-istess mod permezz ta 'ossidazzjoni mill-ajru taħt kundizzjonijiet alkalini bħal f'[13] u wara l-ossidazzjoni, PAs kienu saħansitra aktar kumplessi. Dawn il-PAs naturali u modifikati ġew studjati hawn minn UHPLC-DAD konnessi ma 'Q-orbitrap MS/MS b'riżoluzzjoni ultragħolja sabiex jinstabu l-bidliet sofistikati fl-istrutturi tal-PA. Il-PAs ġew identifikati abbażi tal-joni tagħhom iċċarġjati waħedhom u/jew multiplikament bil-mases eżatti u l-formula molekulari korrispondenti tagħhom. L-analiżi twettqu minn LC b'fażi inversa, u għalhekk, PAs oligomeriċi u polimeriċi kienu prinċipalment preżenti bħala humps mhux solvuti fil-kromatogrammi UV f'280 nm, ara l-estratt tal-weraq ta 'Ruprechtia salicifolia fil-Figura 2A bħala eżempju. Fil-kromatogramma tal-jone totali, l-jonizzazzjoni ta 'komposti fenoliċi oħra kienet aktar intensiva minn dik tal-PAs, u għalhekk, il-ħotba PA ma kinitx daqshekk evidenti (Figura 2B). Madankollu, l-eżattezza ta 'orbitrap tagħmel l-interpretazzjoni tar-riżultati MS aktar faċli peress li l-mudelli iżotopiċi ta' joni iċċarġjati multipli huma definiti b'mod ċar, u l-koinċidenza possibbli tal-qċaċet tista 'tiġi skoperta, u b'hekk tippermetti d-determinazzjoni tal-mases eżatti u l-formuli molekulari ta' oligo- differenti. u PAs polimeriċi. Pereżempju, galloylated(epi)catechin f'm/z 441, galloylated dimeric PCat m/z729, u galloylated trimeric PC f'm/z 1017 juru qċaċet separati sew fil-kromatogrammi tal-joni estratti (EICs) fil-Figura 2C-E, u huma jistgħu jiġu skoperti faċilment abbażi tal-UV u l-ispettri tal-massa tagħhom, inklużi l-mases eżatti u l-formula molekulari korrispondenti. Ir-riżultati miksuba hawn kienu konsistenti ma 'riżultati preċedenti miksuba minn MS/MS, li juru li l-weraq ta' Ruprechtia salicifolia kien fihom 24 mg/g ta 'PAs, li minnhom 3 fil-mija biss kienu PAs li fihom PD, xi wħud minnhom kienu galloylated, u l-mDP instab li jkun 7 [13].

2.1.PCs tat-Tip B fl-Estratti Inizjali tal-Pjanti Mhux Ossidati

Il-PCs tat-tip B fl-estratti tal-pjanti ġew skoperti abbażi tal-joni molekulari ċċarġjati waħedhom u b'mod multiplikat flimkien mal-mudelli ta 'frammentazzjoni karatteristiċi. Pereżempju, PCs f'Begonia bower huma estratt "Nigra" urew serje distinta ta 'joni [MH] separati b'288 Da minn m/z289 sa m/z 1729 li jikkorrispondu għal PCs tat-tip B minn monomeru għal hexamer u ta' [M{{ 6}}H]' joni separati minn 144 Da minn m/z 1008 sa m/z 1296 korrispondenti għal PCs tat-tip B minn heptamers għal nonamers (Tabella S1). L-ispettri tal-massa tal-PCs monomeriċi, jiġifieri, flavan-3-ols catechin u epicatechin, urew jone framment karatteristiku f'm/z 245 kif irrappurtat qabel [3132,36].

B'mod ġenerali, l-MS / MS ta 'dimeri PC tat-tip B wrew il-mudelli ta' frammentazzjoni karatteristiċi li jagħtu joni f'm / z 287 u 289 (qasma QM), m / z 425, u 407 (frammentazzjoni RDA u l-eliminazzjoni sekwenzjali tal-ilma) u m /z 451 (HRF; Figura 3). Il-frammentazzjoni RDA hija meqjusa bħala l-mudell ta 'frammentazzjoni l-aktar importanti għall-karatterizzazzjoni ta' dimeri PC tat-tip B u l-frammentazzjoni fuq l-unità ta 'estensjoni ġiet maħsuba li hija enerġetikament aktar favorevoli peress li tipproduċi jonji frammentati b'sistema π-πiperkonjugata akbar mill- Frammentazzjoni RDA fuq l-unità terminali [31-33].

2.2.PCs tat-Tip A fl-Estratti Inizjali tal-Pjanti Mhux Ossidati

Il-preżenza ta 'PAs tat-tip A fl-estratti inizjali tal-pjanti ġiet ikkonfermata mill-mudelli ta' frammentazzjoni karatteristiċi tagħhom simili għal PAs tat-tip B. Bħala eżempji, il-mogħdijiet ta 'frammentazzjoni karatteristika u d-dejta MS/MS ta' dimer u trimer tal-PC tat-tip A li għandhom rabta waħda tat-tip A huma murija u diskussi fid-dettall (Figuri 4 u 5). Il-frammentazzjoni tad-dimer tal-PC tat-tip A pproduċiet erba 'joni tal-frammenti (Figura 4). Il-frammentazzjoni RDA tal-unità terminali pproduċiet jone f'm / z 423, li tikkonferma l-preżenza ta 'rabta tat-tip A [26,34,35]. Barra minn hekk, nissuġġerixxu li l-frammentazzjoni RDA tal-unità tal-estensjoni u t-telf sekwenzjali tal-ilma jistgħu jipproduċu l-jone f'm/z 407. Il-jone f'm/z 449 huwa l-produzzjoni HRF, jiġifieri, ir-riżultat tat-telf ta ' l-unità tal-phloroglucinol [26]. Il-jonji f'm/z 285 u 289 jikkorrispondu għal qsim QM. Bl-istess mod, it-trimer tal-PC tat-tip A wera jone molekulari f'm/z 863 u jonji framment karatteristiċi f'MS/MS f'm/z 711.693.573.559,451,411 u 289 kif irrappurtat qabel minn Sui et al.(2016) )[26]. Il-frammentazzjoni RDA tat-trimer tal-PC tat-tip A pproduċiet jone f'm/z 711, li għal darb'oħra tikkonferma l-preżenza ta 'rabta tat-tip A skont l-istudju preċedenti [26] u tagħti ħjiel li r-rabta tat-tip A tista' tkun bejn żewġ estensjonijiet unitajiet. Nissuġġerixxu li l-jone f'm / z 693 jikkorrispondi għat-telf sekwenzjali ta 'ilma u jappoġġja l-pożizzjoni ta' rabta tat-tip A, kif muri fil-Figura 5. Barra minn hekk, nissuġġerixxu li l-RDA addizzjonali taċ-ċirku C eteroċikliku tal- terminali flavan-3-l-unità turi l-jone f'm/z559. Dan il-jone kien minuri fl-istudji tagħna. Il-jonji f'm/z573 u 289 ikkorrispondiet mal-qsim QM tal-bond inter flavanoid t'isfel [26]. Aħna skoprejna wkoll joni f'm/z 575 u 287. Nipproponu li l-joni f'm/z 451 u 411 jistgħu jikkorrispondu għall-HRF taċ-ċirku C eteroċikliku tal-unità tan-nofs flavan-3-ol li tappoġġja l-post ta ' Konnessjoni tat-tip A bejn l-unitajiet ta’ estensjoni skont il-Figura 5.

2.3.Modifiki ta 'PCs tat-Tip B fl-Estratti tal-Pjanti Minħabba l-Ossidazzjoni Alkalina

Wara l-ossidazzjoni, PCs tat-tip B f'estratti ta 'pjanti differenti ġew modifikati b'mod differenti. Xi wħud mill-kampjuni ma wrew l-ebda modifika jew modifika żgħira; ara l-Figura 6A, B, pereżempju, għal oligomeri PC iqsar tat-tip B fl-estratt tal-weraq ta 'Begonia bower huma "Nigra" qabel u wara l-ossidazzjoni. Meta dawn it-tipi ta 'estratti tal-pjanti ġew ossidizzati, l-ispettri tal-massa totali tal-estratti tal-pjanti inizjali u ossidizzati kienu simili. Madankollu, ġew skoperti differenzi żgħar fid-dejta spettrometrika tal-massa dettaljata. Pereżempju, id-dimer tal-PC f'm/z 577 kien akkumpanjat ma 'm/z575, u t-trimer tal-PC f'm/z865 b'm/z 863, rispettivament. Meta l-ammonti ta 'PCs kienu baxxi qabel l-ossidazzjoni, wara l-ossidazzjoni s-sinjali tagħhom kważi sparixxew mill-ispettri tal-massa, u jagħtu ħjiel li kienu kkonvertiw għal mhux identifikabbli jew degradati minħabba l-ossidazzjoni. Dan il-fenomenu ġie osservat, pereżempju, għall-estratti tal-weraq ta’ Combretum Indicum u Euphorbia characias li fihom ammonti baxxi ta’ ftit oligomeri qosra tal-PC u appoġġjat mid-dejta preċedenti tal-MS/MS li wriet li l-kontenut ta’ PA naqas minn 4 mg/mL għal 1 mg /mL u 7 mg/mL sa 1 mg/mL, rispettivament, minħabba l-ossidazzjoni [13]. Dan il-fenomenu jista 'jkun relatat mal-kundizzjonijiet sperimentali użati, li jfisser li kienu aktar severi meta l-kontenut inizjali ta' PA kienu baxxi. F'xi kampjuni, parti mill-PCs tat-tip B ġiet modifikata aktar, ara l-Figura 6C, D, pereżempju, għal PColigomeri tat-tip B iqsar fl-estratt tal-fuljett ta 'Cyperus owoaii qabel u wara l-ossidazzjoni. Meta dawn it-tipi ta 'estratti tal-pjanti ġew ossidizzati, ġew skoperti differenzi viżibbli fl-ispettri tal-massa totali li juru d-differenza tal-massa ta' 2 Da meta mqabbla mal-PCs inizjali (Figura 6C, D, Tabella S2).

Huwa magħruf sew li l-ossidazzjoni tal-polifenoli o-dihydroxy, jiġifieri, iċ-ċirku B tal-catechol tal-PCs, tipikament tagħti o-quinones b'differenza fil-massa ta '2 Da. Fil-fatt, aħna ndunajna li dan it-tip ta 'ossidazzjoni jista' jseħħ ukoll fl-analiżi spettrometriċi tal-massa. Jista 'jkun hemm sinjali minuri fl-ispettri tal-massa li għandhom il-valuri m/z 2 Da iżgħar mill-valuri m/z tal-PCs li jikkorrispondu għall-ossidazzjoni jew il-formazzjoni possibbli ta' forom quinone ta 'PCs matul l-jonizzazzjoni (dejta mhux ippubblikata). Huwa fattibbli li hawn fl-ossidazzjoni alkalina, o-dihydroxy polyphenols jiffurmaw l-ewwel o-quinones. Madankollu, il-0-forom tal-quinone ffurmati huma instabbli u x'aktarx malajr jirreaġixxu aktar. Riżultat possibbli wieħed jista 'jkun il-konverżjoni ossidattiva ta' PCs tat-tip B għal PCs tat-tip A, kif irrappurtat qabel fil-letteratura [15]. It-trasformazzjoni ta 'PCs tat-tip B għal PCs tat-tip A tinvolvi t-tneħħija ossidattiva tal-jone tal-idrur f'C2 taċ-ċirku C bħala pass inizjali: il-kundizzjonijiet bażiċi prevalenti jinduċu l-ossidazzjoni tal-funzjonalità o-dihydroxy taċ-ċirku B. għal o-quinone, li sussegwentement iservi bħala anossidantgħall-konverżjoni tad-dimer tal-procyanidin tat-tip B għal wieħed tat-tip A [15](Figura 7). Dan il-mekkaniżmu quinone methide ġie evidenzjat ukoll f'temperaturi, pH, u kundizzjonijiet katalitiċi differenti [37], permezz ta' ossidazzjoni radikali bl-użu ta' radikali 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl taħt kundizzjonijiet newtrali [38] u b'laccase ( EC1.10.3.2) [39].

Meta studjajna l-PCs modifikati bid-differenza tal-massa ta '2 Da fl-estratti ossidizzati u l-produzzjonijiet tagħhom miksuba minn MS/MS, ġew konklużi li huma simili għal PCs tat-tip A u l-joni tal-frammenti tagħhom (kif diskuss hawn fuq fit-Taqsima 2.2), li juru l-mudelli ta 'frammentazzjoni karatteristika li jipproduċu joni f'm/z 285 u 289 (qasma QM), m/z 423 (frammentazzjoni RDA) u m/z449 (HRF). Bħala eżempju, nuru l-konverżjoni tad-dimeri tal-PC tat-tip B tal-estratt tal-fuljett tal-Microgramma Mauritania għal dimeri tal-PC tat-tip A fil-Figura 8. Fil-mhux ossidizzatestratt, skoprejna erba 'dimeri PC tat-tip B b'valuri m/z 577 (Figura 8A) iżda l-ebda dimeri PC tat-tip A b'valuri m/z 575 (Figura 8B). Il-quċċati ċkejkna fl-EIC f'm/z575 preżumibbilment jikkorrispondu għall-ossidazzjoni ta 'PCs tat-tip B fis-sors tal-jone peress li l-ħinijiet ta' żamma huma eżattament l-istess bħal għal PCs tat-tip B. Fl-estratt ossidizzat, skoprejna biss traċċi tal-PCs tat-tip B inizjali f'm / z 577 (Figura 8C), iżda minflok, skoprejna qċaċet intensivi f'ħinijiet ta 'żamma aktar tard li jikkorrispondu għal PCs tat-tip A f'm / z 575 (Figura 8). 8D).Il-quċċati ċkejkna fl-EIC f'm/z577 li kellhom l-istess ħinijiet ta' żamma ikkorrispondiet mas-sinjali iżotopiċi tal-m/z 575. Għandu jiġi nnutat li dan l-istudju kien kwalitattiv, li jfisser li l-abbundenzi tal-jonji ma jistgħux ikunu meta mqabbla bħala tali. Barra minn hekk, għandu jiġi nnutat li l-konverżjoni ta 'PC tat-tip B għal PC tat-tip A mhux dejjem kienet kompluta bħal f'dan l-eżempju u li l-PC tat-tip B kollha ma ġewx konvertiti għal PCs tat-tip A; bejn wieħed u ieħor stmat li l-abbundenzi tal-joni tal-oligomeri tal-PC tat-tip A u tat-tip B kienu ugwali. Min-naħa l-oħra, f'xi kampjuni, skoprejna aktar differenzi ta '2 Da; pereżempju, il-PC heptamer f'm/z 2017 jista 'jkun akkumpanjat ma' joni f'm/z2015 u 2013, li jagħti ħjiel għall-formazzjoni ta 'konnessjonijiet tat-tip A waħda u żewġ, rispettivament.

Anki jekk il-konverżjoni ta 'PCs tat-tip B għal tip A dehret li kienet il-mekkaniżmu ta' reazzjoni prinċipali, ma nistgħux neskludu bis-sħiħ reazzjonijiet oħra ta 'modifika. Il-PAs kienu preżenti bħala taħlitiet kumplessi fl-estratti inizjali mhux ossidizzati, u dawn it-taħlitiet kienu saħansitra aktar kumplessi wara l-ossidazzjoni alkalina li pproduċiet ammont enormi ta 'data MS. Pereżempju, studji preċedenti dwar ossidazzjoni katalizzata mill-bażi u reazzjonijiet ta 'riarranġament ta' PAs urew li d-dimeri tal-PC jistgħu jikkonversaw fi prodotti differenti ta 'isomerizzazzjoni taċ-ċirku C, inklużi tetrahydroxypyranochromenes, magħrufa wkoll bħala phlorotannins [15]. Dawn il-prodotti juru valuri m/z simili ħafna f'577 iżda ħinijiet ta' żamma differenti f'LCu mudelli ta' frammentazzjoni differenti fl-SM. Ibbażat fuq l-EICs f'm/z 577, ma sibniex arranġamenti mill-ġdid ta 'dan it-tip fil-kundizzjonijiet ta' reazzjoni użati. Ir-riarranġamenti u l-ftuħ taċ-ċirku C eteroċikliku jistgħu wkoll jipproduċu prodotti oħra permezz ta' reġjo-isomerizzazzjoni, epimerizzazzjoni, jew 13-aryl migration [15]. L-epimerizzazzjoni kienet prinċipalment relatata mal-proċessi tal-manifattura u, pereżempju, it-temperaturi għoljin relatati mal-inkaljar tal-kawkaw iwasslu għal telf ta' flavan-3-ol, iżda wkoll għall-epimerizzazzjoni ta' monomeri tal-flavan-3-ol, dimeri , u trimers [40]. Barra minn hekk, ġie rrappurtat li polyphenol oxidase fil-laħam tal-frott tal-banana kkawża l-epimerizzazzjoni ta’ (-)-epigallocatechin għal (-)-gallocatechin[41]. Ħarsa lejn l-epimerizzazzjoni possibbli ta' flavan-3-ols bl-użu ta' EICs f'm/z289, u b'mod ġenerali, ma sibniex epimerizzazzjoni sinifikanti kkawżata mill-ossidazzjoni alkalina użata. Madankollu, ma nistgħux neskludu bis-sħiħ l-epimerizzazzjoni peress li skoprejna ammonti ogħla ta '( plus )-catechin fir-rigward ta' (-)-epicatechin fl-estratt ossidizzat tal-fjuri tal-pastard Pavonia milli fl-estratt inizjali mhux ossidizzat (Figura S1). Għandu jiġi nnutat ukoll li l-estratti ossidizzati ġew newtralizzati qabel l-UHPLC-MS/MS, li setgħu kkawżaw reazzjonijiet redox. Fil-forom ossidizzati, il-quinones huma elettrofili li jistgħu jirreaġixxu ma 'l-ilma nukleofiliku preżenti, u dan jista' sempliċement jirriżulta fir-reazzjoni ta 'tnaqqis li tagħti PCs tat-tip B, li jista' wkoll jispjega għaliex xi wħud mill-PCs tat-tip B dehru li ma kinux affettwati.

2.4.Modifiki tal-PCs tat-Tip A fl-Estratti tal-Pjanti minħabba l-Ossidazzjoni Alkalina

PCs tat-tip A f'estratti ta 'pjanti differenti rreaġixxew b'mod differenti minħabba l-ossidazzjoni alkalina. Xi wħud mill-kampjuni ma wrew l-ebda modifika jew modifika żgħira. Meta dawn it-tipi ta 'estratti tal-pjanti kienu soġġetti għal ossidazzjoni alkalina, ma nstabu l-ebda differenzi sinifikanti fl-ispettri tal-massa totali (per eżempju, ara Tabella S3 għall-joni ewlenin osservati fl-estratt tal-weraq ta' Aglaonema commutatum var. maculatum qabel u wara l-ossidazzjoni). Madankollu, differenzi żgħar jistgħu jiġu skoperti fid-dejta spettrometrika tal-massa dettaljata li għandha d-differenza tal-massa ta '2 Da u tagħti ħjiel li jistgħu jiġu ffurmati rabtiet ta' etere tat-tip A addizzjonali. Dan il-fenomenu kien aktar evidenti għal xi wħud mill-kampjuni b'PCs tat-tip A; dawn il-PCs tat-tip A ġew innutati li jiffurmaw rabtiet addizzjonali tal-etere tat-tip A minħabba l-ossidazzjoni alkalina (Figura 9). Meta dawn it-tipi ta 'estratti tal-pjanti ġew ossidizzati, ġew skoperti differenzi distinti fl-ispettri tal-massa totali li juru d-differenza tal-massa ta' 2 Da meta mqabbla mal-PCs inizjali tat-tip A. Il-jone [MH] f'm/z 863 jikkorrispondi għal trimer tal-PC li għandu rabta waħda tal-etere tat-tip A u l-jone f'm/z 861 għal trimer tal-PC li għandu żewġ rabtiet tal-etere (Figura 9A ). Bl-istess mod, PCs tetrameric li għandhom konnessjonijiet etere wieħed, tnejn, u tlieta ġew skoperti mill-joni [M -H] f'm / z 1151, 1149, u 1147, rispettivament (Figura 9B).Fi proporzjon, PCs pentameric u hexameric li għandhom wieħed , żewġ, u tliet bonds etere ġew skoperti mill-joni [M -H]- f'm/z 1439, 1437, u 1435 u f'm/z 1727,1725, u 1723, rispettivament (Figura 9C, D; madankollu, il- [M -2H]2-jone f'm/z 861 ta 'hexamer PC kien espliċitament aktar abbundanti mill-jone [MH] f'm/z 1723 u għalhekk, muri fil- figura).

Il-formazzjoni ta 'rabtiet addizzjonali tat-tip A affettwat ukoll il-ħinijiet ta' żamma ta 'dawn l-oligomeri. In-numru ta 'konnessjonijiet ta' etere addizzjonali deher sa ċertu punt li jiżdied hekk kif żdiedu l-gradi ta 'polimerizzazzjoni tal-PCs, li huwa mistenni peress li hemm aktar pożizzjonijiet għall-bonds addizzjonali. Madankollu, għandu jiġi nnotat ukoll li jista 'jkun hemm sinjali minuri bid-differenza tal-massa ta' 2 Da li tikkorrispondi għall-ossidazzjoni jew il-formazzjoni possibbli ta 'forom ta' quinone ta 'PCs matul l-jonizzazzjoni, kif diskuss hawn fuq. Dawn il-qċaċet huma wkoll viżibbli fl-ispettri tal-massa fil-Figura 9 qabel il-qċaċet prinċipali li jikkorrispondu għal PCs tat-tip A. L-abbundenzi tal-jonji, il-forom tal-mudelli iżotopiċi, u l-jonji tal-frammenti karatteristiċi miksuba minn MS/MS ikkonfermaw l-osservazzjoni ta 'konnessjonijiet ta' etere tat-tip A addizzjonali. Huwa wkoll importanti li wieħed jinnota li dawn ir-reazzjonijiet intramolekulari osservati ma dehrux li jaffettwaw il-grad medju ta 'polimerizzazzjoni peress li l-oligomeri jew polimeri PA ogħla ma ġewx skoperti fl-estratti ossidizzati meta mqabbla ma' estratti mhux ossidizzati. L-osservazzjoni hija appoġġjata minn Mouls u Fulcrand (2012) [14].

2.5.Estratti tal-Pjanti b'PAs Li għandhom Kemm Subunitajiet PC u PD u l-Modifiki Tagħhom Minħabba l-Ossidazzjoni Akalina

Ħafna mill-kampjuni kien fihom PAs b'unitajiet kemm (epi)catechin kif ukoll (epi)gallocatechin, jiġifieri, il-PAs kienu taħlitiet ta' PC/PD. Id-destin ta 'dawn it-taħlitiet PC/PD minħabba l-modifika permezz ta' ossidazzjoni alkalina kien differenti meta mqabbel mal-PCs. Taħlitiet ta 'PC/PD ġew skoperti b'mod ċar fl-estratti tal-pjanti qabel l-ossidazzjoni kemm bl-UV kif ukoll bl-MS; ara, pereżempju, l-oligomeri żgħar PA fl-estratt inizjali tal-weraq ta 'Podocarpus macrophyllus (Figura 10A u Tabella S4). Wara l-ossidazzjoni, il-PAs modifikati xorta ġew skoperti mill-UVat 280 nm bħala tip differenti u/jew ħotba mdewma (Figura S2), iżda ma ġewx skoperti aktar minn MS, ara, pereżempju, l-oligomeri PA neqsin fil-werqa ossidizzata estratt ta' Podocarpus microphallus (Figura 10B u Tabella S4). Aħna la skoprejna xi sinjali oħra li jistgħu jikkorrispondu mat-taħlitiet modifikati ta 'PC/PD u lanqas mal-prodotti ta' degradazzjoni possibbli tagħhom. Pereżempju, għad-dimer PC f'm/z 577, nistgħu niskopru d-dimer PC tat-tip A korrispondenti f'm/z 575 fl-estratt ossidizzat, iżda osservazzjonijiet distinti simili ma setgħux isiru għal dimeri jew trimeri PC/PD (Figura 10B). Ir-raġuni għat-telf ta' oligomeri PC/PD li jistgħu jinstabu fl-ESI-MS jistgħu jkunu, pereżempju, reazzjonijiet intermolekulari bejn PAs [13-15,24,25]. Ir-reazzjonijiet intermolekulari huma magħrufa li jirriżultaw fil-formazzjoni ta 'PAs modifikati bil-konnessjoni ta' żewġ ktajjen oligomeriċi distinti, u tipikament, iwasslu għal żieda fil-grad medju ta 'polimerizzazzjoni [14]. Pereżempju, Vernhet et al. (2014) innutaw permezz ta’ esperimenti ta’ tifrix tar-raġġi X b’angolu żgħir li jekk il-PAs jiġu ossidizzati f’soluzzjonijiet ikkonċentrati, il-PAs modifikati huma polimeri għoljin b’ktajjen twal lineari jew ramifikati [25]. Ossidazzjoni ulterjuri tista 'twassal ukoll għal ċiklizzazzjoni bejn ċrieki A u B ta' PAs differenti [24]. Barra minn hekk, ġie nnutat li dawn ir-rabtiet u l-istrutturi ġodda huma reżistenti għall-qsim ikkatalizzat bl-aċidu, u għalhekk, iż-żieda fil-grad medju ta 'polimerizzazzjoni tista' tiġi stmata biss b'metodi mhux depolimerizzanti [14,24. Madankollu, ir-riżultati tagħna wrew li dawn il-PAs modifikati lanqas ma jiġu skoperti taħt il-kundizzjonijiet ESI-MS standard użati għall-PAs (Figura 10). Fl-istudju preċedenti tagħna, użajna metodu bbażat fuq monitoraġġ ta’ reazzjoni magħżula minn triple quadrupole biex niskopru l-PAs f’kampjuni mhux ossidizzati u ossidizzati u ndunajna li l-kompożizzjoni tas-subunità nbidlet minħabba l-ossidazzjoni alkalina u għalhekk il-metodu ma kienx aktar kapaċi jiskopri. il-PAs modifikati [13]. Ir-riżultati preżenti tal-MS b'riżoluzzjoni għolja jappoġġaw l-osservazzjonijiet preċedenti tagħna permezz ta' triple quadrupole li l-PAs modifikati fl-estratti ossidizzati huma ħafna aktar kumplessi mill-PAs inizjali fl-estratti mhux ossidizzati u li ma jiġux skoperti taħt kundizzjonijiet UPLC-MS/MS simili. [13].

Il-metodi użati għall-ossidazzjoni tal-PAs fil-letteratura huma pjuttost differenti mill-metodu tagħna, u għalhekk, ir-riżultati jistgħu ma jkunux komparabbli direttament [14,24,25]. Fi studji preċedenti, l-ossidazzjoni saret f'ilma aċidifikat b'aċidu trifluoroacetic f'pH 3.5 sabiex jimita l-pH tal-inbid, u l-ossidazzjoni attwali nkisbet billi tħawwad il-kampjun fil-preżenza tal-arja għal diversi jiem [14,24, 25]. Aħna użajna ossidazzjoni alkalina permezz ta 'buffer karbonat f'pH 10 għal siegħa biss.

Il-biċċa l-kbira tal-estratti tal-pjanti kienu jinvolvu PAs kemm b'PC kif ukoll PDsubunits, u f'żewġ kampjuni biss, il-PAs setgħu jitqiesu kważi PD puri. Dawn iż-żewġ kampjuni kienu l-estratti ta' Callisia gentlei varelegans u Pellaea ooata. Il-PDs tat-tip B ġew misjuba fil-var gentle Callisia. Elegans estratt qabel l-ossidazzjoni; ara, pereżempju, l-oligomeri żgħar tal-PD fit-Tabella S5, iżda wara l-ossidazzjoni, dawn il-PDs ma ġewx skoperti aktar mill-MS. La skoprejna xi sinjali oħra li jistgħu jikkorrispondu mal-PDs modifikati u lanqas mal-prodotti ta 'degradazzjoni possibbli tagħhom. Madankollu, xi wħud mill-PAs modifikati xorta ġew skoperti mill-UV f'280 nm bħala ħotba aktar baxxa u mdewma (Figura S3). Interessanti, qabel l-ossidazzjoni, PDs trimeriċi tat-tip A ġew skoperti fl-estratt tad-dejta Pellaea, u wara l-ossidazzjoni, dawn is-sinjali kienu għadhom preżenti, iżda l-intensitajiet tagħhom kienu sostanzjalment aktar baxxi

minn MS u, barra minn hekk, valuri m/z li jikkorrispondu għall-formazzjoni ta 'konnessjonijiet addizzjonali tat-tip A fi trimeri PD ġew skoperti b'mod simili għal PCs tat-tip A (Tabella S6). Dan jista 'jindika li minbarra reazzjonijiet intermolekulari osservati għal PDs omo-u eteroġeni tat-tip B, il-PDs tat-tip A jista' jkollhom ukoll reazzjonijiet intramolekulari simili li ġew skoperti għal PCs tat-tip A.

2.6. PAs Galloulated fl-Estratti tal-Pjanti u l-Modifiki Tagħhom Minħabba l-Ossidazzjoni Alkalina

Xi wħud mill-pjanti kien fihom PAs galloylated. Il-preżenza ta 'PCs, PDs, u PC/PDs allokati fl-estratti tal-pjanti ġiet ikkonfermata mill-mudelli ta' frammentazzjoni karatteristiċi tagħhom. B'mod ġenerali, il-frammentazzjoni tal-PAs gallovlated fl-analiżi tal-MS seħħet b'mod simili permezz ta' mekkaniżmi RDA., HRF, u QM kif diskuss hawn fuq [31-33]. Bħala eżempju, il-mogħdija tal-frammentazzjoni karatteristika u d-dejta MS/MS ta 'dimer PC galloylated fl-estratt tal-weraq ta' Ruprechtia salicifolia huma murija u diskussi fid-dettall (Figura 11). Il-pożizzjoni tal-grupp galloyl hija biss indikattiva, u tista 'tiġi mwaħħla ma' kwalunkwe grupp idroksil ħieles ieħor fl-unità terminali. Il-jone f'm/z603 huwa l-produzzjoni HRF. Il-jonji f'm/z 287 u 441 jikkorrispondu għal qsim QM. Barra minn hekk, skoprejna l-qsim tal-grupp galloyl li jirriżulta fil-jone li jikkorrispondi għal PC dimer f'm/z577 u l-frammentazzjoni RDA sussegwenti b'jone f'm/z425 u l-qsim ulterjuri tal-ilma b'jone f'm/z 407. L-HRF ta 'm/z 577 ipproduċa l-jone tal-framment f'm/z 451. Barra minn hekk, skoprejna joni tal-framment żgħir f'm/z 109,123, u 125, li jikkorrispondu għaċ-ċrieki aromatiċi. Il-PAs galloylated jista' jkun fihom diversi gruppi galloyl fl-istrutturi tagħhom (Tabella S7).

Il-PAs galloylated differenti ġabu ruħhom b'mod differenti matul l-ossidazzjoni mill-ajru taħt kundizzjonijiet alkalini. Il-PCs Galloylated kienu pjuttost stabbli u rreaġixxew b'mod simili għal PCs mhux galloylated. Pereżempju, ma nstabu l-ebda tibdil notevoli għall-PCs galloylated li għandhom grupp wieħed galloyl fl-istrutturi tagħhom fl-estratt tal-weraq ossidizzat ta 'Nepenthes maxima (Tabella S7). Madankollu, għandu jiġi nnutat li l-intensitajiet tal-jonji għall-PCs galloylated li għandhom żewġ gruppi galloyl jew aktar kienu aktar baxxi fl-estratt ossidizzat ta 'Nepenthes maxima u, pereżempju, il-pentamers PC galloylated b'diversi gruppi tal-kċina ma kinux għadhom jinstabu (Tabella S7). Il-valuri integer m/z għal xi PCs galloylated huma simili għall-valuri m/z għal PC/PDs u, għalhekk, l-MS b'riżoluzzjoni ultrahigh hija meħtieġa. Per eżempju, m/z 881 jikkorrispondi għal PA trimeriku li jikkonsisti f'żewġ PC u unità waħda PD (C4sH3; O19, mkalkulat 882.20074) u għal PC dimer galloylated li għandu żewġ gruppi galloyl (C44H34O20, mkalkulat, xi kampjuni, 882.16435,). bħal fl-estratt tal-weraq ossidizzat ta 'Coccoloba uvifera, PCs galloylated ġew konvertiti għal PCs galloylated tat-tip A minħabba l-ossidazzjoni, anke jekk il-PAs galloylated fl-estratt inizjali dehru li kienu simili għal dawk f'Nepenthes maxima. Pereżempju, id-dimer PC allokat li għandu galloylgroup wieħed u li juri jone m/z 729 (Tabella S7) kien stabbli matul l-ossidazzjoni alkalina fl-estratt tal-weraq ta 'Nepenthes maxima iżda parzjalment modifikat fl-estratt tal-weraq ta' Coccoloba ugifera li juri joni kemm f'm /z 727 u 729. Il-jone ta 'qabel jikkorrispondi għal PCdimer tat-tip A galloylated (m/z727.13148, C37H2O16) u wera frammenti MS/MS karatteristiċi li jsostnu l-konnessjoni tat-tip A: m/z601 (prodott HRF ta' m/z 727),575(PCdimer tat-tip A), 557 (qsim ta 'ilma minn m/z575),449 (HRF ta' m/z575, ara Figura 4),423(RDA ta' m/z 575, ara Figura 4),285 (QM ta 'm/z575, ara Figura 4), 169 (aċidu galliku), 125 (ara Figura 11) u 109 (ara Figura 11). Raġuni waħda għal dawn id-differenzi f'PAs simili bejn estratti tal-pjanti jistgħu jkunu l-komposti l-oħra preżenti fl-estratti u li jaffettwaw ir-reazzjonijiet tal-PAs.

It-taħlitiet u l-PDs tal-PC/PD galloylated kienu reattivi u modifikati b'mod simili għat-taħlitiet u l-PDs tal-PC/PD mhux galloylated. Wara l-ossidazzjoni, dawn il-PAs ma ġewx skoperti mill-MS minkejja li kienu għadhom viżibbli f'UV f'280 nm. La skoprejna xi sinjali oħra li jistgħu jikkorrispondu għal dawn il-PAs modifikati u lanqas mal-prodotti ta' degradazzjoni possibbli tagħhom. F'kampjun wieħed, jiġifieri fil-weraq tal-karroo tal-Acacia, il-PDs galloylated u nongalloylated modifikati lanqas ma ġew skoperti mill-UV f'280 nm.

Fl-istudju preċedenti tagħna [13], fejn PAs f'estratti mhux ossidizzati u ossidizzati ġew analizzati b'metodi magħżula ta 'monitoraġġ tar-reazzjoni, aħna ndunajna li nstabet ħotba ta' galloyl ċara bil-metodu MS/MS speċifiku tal-galloyl fil-kampjuni ossidizzati, iżda l-forma tal-ħoba kienet inbidlet u mċaqlaq kif xieraq għall-ħoba osservata fil-kromatogramma UV. Il-PAs gallovlated oriġinali kienu ġew modifikati b'tali mod li l-galloylgroup xorta seta' jiġi skopert bil-metodu ta' monitoraġġ tar-reazzjoni magħżul [13]. Studji preċedenti dwar (-)-epigallocatechin gallate u (-)-epigallocatechin urew li t-trihydroxyphenyl B-ring huwa s-sit prinċipali ta 'azzjoni għall-ossidazzjoni u li m'hemm l-ebda prodotti li jistgħu jinstabu li jirriżultaw mill-ossidazzjoni tal-parti tal-galloyl [42]. Madankollu, il-kundizzjonijiet ta' reazzjoni użati u l-prodotti ta' ossidazzjoni miksuba kienu pjuttost differenti meta mqabbla mal-istudju tagħna peress li l-ossidazzjoni twettqet b'radikali peroxyl iġġenerati mit-termoliżi tal-inizjatur ażo 2,2'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) [42].

Minbarra l-PAs galloylated, żewġ kampjuni, jiġifieri Cephalotaxus harringtomia subsp. fuljetti drupaceous u weraq ta 'Laurus nobilis dehru li fihom PCs glikosilati li għandhom unità waħda taz-zokkor imwaħħla ma' struttura waħda ta 'PC. Xi wħud minn dawn il-PCs tat-tip B glikosilati ġew innutati li jikkonvertu għal PCs tat-tip A glikosilati matul l-ossidazzjoni alkalina mingħajr il-qsim tal-unità taz-zokkor. Barra minn hekk, ġiet skoperta l-formazzjoni ta 'rabtiet ta' etere addizzjonali għal PCs tat-tip A.

3. Materjali u Metodi

Il-ġbir ta' materjali tal-pjanti, l-ipproċessar tagħhom, u l-estrazzjoni, minbarra l-ossidazzjoni f'pH 1{{10}}, twettqu kif irrappurtat qabel [13]. L-istudju inizjali kien fih 102 kampjun, li minnhom analizzajna b'kollox 55 kampjun ieħor (Tabella S8). Għall-ossidazzjoni mill-ajru, 20μLof kull estratt ġie ossidizzat bi 18{{40}}uL ta' pH 1{{60}}buffer għal siegħa f'temperatura tal-kamra. L-ossidazzjoni twaqqaf billi żżid 100 uL ta '0.6 fil-mija HCOOH milwiema. Barra minn hekk, 280 μLof ilma ġie miżjud ma '20 μL tal-bidu mhux ossidizzat qabel l-analiżi sabiex tikseb il-volum finali ta' 300 uL kemm għal kampjuni mhux ossidizzati kif ukoll ossidizzati. L-analiżi spettrometrika tal-massa b'riżoluzzjoni ultragħolja twettqet minn UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS. L-istrument kien jikkonsisti f'sistema Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) flimkien ma' spettrometru tal-massa quadrupole-Orbitrap (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, il-Ġermanja). Il-kolonna użata kienet kolonna Acquity UPLC BEH Phenyl (2.1 × 100 mm, 1.7 um, Waters Corp., Wexford, l-Irlanda). L-eluwenti kienu A= aċetonitrile u B=0.1 fil-mija HCOOH. Intużat rata ta' fluss ta' 0.5 mLmin-1, u l-profil ta' elużjoni kien kif ġej:0-0. 5 min,0.1 fil-mija A f'B(iżokratiku);0.5-5 min,0.1-30 fil-mija A f'B(gradjent lineari);5-6min,30 fil-mija {{44} } fil-mija A f'B(gradjent lineari);6-6.1 min, 35-90 fil-mija A f'B(gradjent lineari); 6.1-9.5 min, ħasil tal-kolonna u ekwilibrazzjoni mill-ġdid. Il-volum tal-injezzjoni kien 5μL. Id-dejta tal-UV （λ=190-500nm） u tal-MS ġew irreġistrati matul l-analiżi. Ionizzazzjoni negattiva ntużat f'sors ESI imsaħħan b'vultaġġ ta 'sprej ta' -3.0 kV, rata tal-fluss tal-gass għant (N2) ta '60, rata tal-fluss tal-gass awżiljarju (N2) ta' 20, rata tal-fluss tal-gass tal-knis ta '0, it-temperatura kapillari ta 'plus 380 grad u dissoċjazzjoni indotta minn ħabta fis-sors (CID) ta' 30 eV. Għal skennjar sħiħ MS, il-firxa tal-massa tal-orbitrap kienet m/z150-2250, ir-riżoluzzjoni 35,000, u l-kontroll awtomatiku tal-gwadann3×10*. Għal analiżi MS/MS, jiġifieri dd-MS2(TopN), il-parametri kienu dawn li ġejjin: TopN 3; l-enerġiji tal-ħabta normalizzati stepped 20, 50, u 80 eV, ir-riżoluzzjoni 17,500, u l-kontroll awtomatiku tal-gwadann 1 × 105. Il-kalibrazzjoni saret minn Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA). Id-dejta ġiet ipproċessata bis-softwer Thermo Xcalibur Oral Browser (Verżjoni 3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Peress li l-kampjuni ossidizzati nkisbu bl-użu ta 'buffer tal-karbonat tas-sodju (pH 10), is-sodju ffurmat joni ta' cluster b'aċidu formiku matul l-analiżi UHPLC-MS/MS. Għalhekk, fil-bidu ta 'kull kromatogramma tal-jone totali ta' kampjuni ossidizzati, instabet quċċata qawwija ta 'clusters ta' format tas-sodju (Tabella S9). Il-mudell ġie skopert faċilment u ma affettwax l-analiżi tal-PAs. MS/MS framment jonji ta 'oligomeri PA żgħar huma ppreżentati fit-Tabella S10.

4. Konklużjonijiet

F'dan l-istudju, aħna analizzat il-kompożizzjoni PA ta 'estratti tal-pjanti 55 qabel u wara l-ossidazzjoni alkalina permezz ta' UHPLC-MS/MS b'riżoluzzjoni ultrahigh (Tabella S8). L-istrutturi tal-PA naturali kien fihom PCs, PDs, u taħlitiet ta 'PC/PD tat-tip A u B minbarra dawk allokati. Il-kompożizzjonijiet PA kienu kumplessi, u l-MS b'riżoluzzjoni ultrahigh kienet meħtieġa biex tkejjel il-mases eżatti u l-formuli molekulari korrispondenti ta 'PAs diversi. PCs tat-tip B f'estratti ta 'pjanti differenti kienu pjuttost stabbli u ma wrew l-ebda modifika jew modifika minuri minħabba l-ossidazzjoni alkalina. Għal xi kampjuni, skoprejna r-reazzjonijiet intramolekulari ta 'PCs li jipproduċu rabtiet ta' etere tat-tip A. PCs tat-tip A kienu wkoll pjuttost stabbli bl-ebda modifika jew minuri, iżda, f'xi impjanti, il-formazzjoni ta 'rabtiet ta' etere addizzjonali ġiet skoperta. Estratti tal-pjanti li fihom unitajiet PD f'PAs (jew PDs puri jew taħlitiet PC/PD) kienu aktar reattivi. Wara l-ossidazzjoni alkalina, dawn il-PAs jew il-prodotti ta 'ossidazzjoni tagħhom ma ġewx skoperti aktar minn MSeven jekk tip differenti u/jew ħotba PA mdewma kienet għadha skoperta mill-UV f'280nm. Ir-reazzjonijiet intermolekulari bejn il-PAs probabbilment immodifikaw dawn il-PAs sabiex ma ġewx skoperti taħt il-kundizzjonijiet standard ESI-MS. Studji preċedenti wrew li dawn il-PAs modifikati ma jistgħux jiġu studjati lanqas b'metodi ta' degradazzjoni. Għalhekk, ikun meħtieġ metodu analitiku ġdid għall-identifikazzjoni u l-karatterizzazzjoni tagħhom. Il-PAs Galloylated kienu relattivament stabbli taħt ossidazzjoni alkalina jekk kienu bbażati fuq il-PC, iżda ġew iffurmati rabtiet ta 'etere addizzjonali li jappoġġjaw il-konverżjoni ta' PAs galloylated tat-tip B għal PAs galloylated tat-tip A. PAs li fihom żewġ gruppi galloyl jew aktar kienu aktar reattivi minn dawk li fihom grupp wieħed biss. Gallovlated PC/PD taħlitiet u PDs kienu aktar reattivi u rreaġixxew b'mod simili għal dawk mhux galloylated. Madankollu, għandu jiġi nnutat li r-reazzjonijiet intra- u intermolekulari ma kinux esklużivi, u dawn ir-reazzjonijiet jistgħu jseħħu fl-istess ħin. Barra minn hekk, il-matriċi tal-pjanti u komposti oħra preżenti affettwaw dawn l-interazzjonijiet.