Kunsinna Medjata minn CAR-newtrofili ta 'Nanodrogi li Jirrispondu għall-Mikroambjent tat-Tumur Għall-Kemo-immunoterapija tal-Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) hija waħda mill-aktar tumuri solidi aggressivi u letali fil-bnedmin. Filwaqt li terapewtiċi effikaċi, bħaċ-ċelloli emerġenti tar-riċettur tal-antiġenu chimeric (CAR)-T u l-kimoterapewtiċi, ġew żviluppati biex jikkuraw diversi kanċers, l-effettività tagħhom fit-trattament tal-GBM ġiet imfixkla fil-biċċa l-kbira mill-barriera tad-demm-moħħ u mill-ostakli tad-demm-moħħ-tumur. In-newtrofili umani jaqsmu b'mod effettiv l-ostakli fiżjoloġiċi u juru immunità effetur kontra patoġeni iżda l-ħajja qasira u r-reżistenza għall-editjar tal-ġenoma tan-newtrofili primarji llimitaw l-applikazzjoni wiesgħa tagħhom fl-immunoterapija. Hawnhekk inġiebu ġenetikament ċelluli staminali pluripotenti umani b'knock-in tal-ġeni medjat minn CRISPR/Cas9- biex nesprimu diversi kostrutti CAR anti-GBM b'dominji ta' sinjalazzjoni speċifiċi għal T-CD3ζ jew speċifiċi għan-newtrofili. In-newtrofili CAR bl-aħjar attività kontra t-tumur huma prodotti biex iwasslu u jirrilaxxaw b'mod speċifiku u mhux invażiv nano drogi li jirrispondu għall-mikroambjent tat-tumur biex jimmiraw lejn GBM mingħajr il-ħtieġa li jinduċu infjammazzjoni addizzjonali fis-siti tat-tumur. Din il-kimo-immunoterapija kombinatorja turi attivitajiet superjuri u speċifiċi kontra l-GBM, tnaqqas it-twassil tal-mediċina mhux fil-mira, u ttawwal il-ħajja fi ġrieden nisa li jġorru t-tumur. Flimkien, din is-sistema bijomimetika tal-kunsinna tad-droga CAR-newtrofili hija pjattaforma sigura, qawwija u versatili għat-trattament tal-GBM u possibbilment mard devastanti ieħor.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

Glioblastoma (GBM) hija kkaratterizzata minn rata għolja ta 'mortalità, ħajja qasira, u pronjosi ħażina b'tendenza għolja ta' rikorrenza1,2. L-effikaċitajiet terapewtiċi kemm tal-kirurġija kif ukoll tal-kimo-drogi huma primarjament imfixkla mill-istruttura fina tal-moħħ u l-barriera fiżjoloġika tad-demm-moħħ (BBB) ​​jew il-barriera tad-demm-moħħ-tumur (BBTB)3-5. B'mod partikolari, il-kunsinna tad-droga lis-sistema nervuża ċentrali (CNS) għat-trattament tat-tumuri tal-moħħ hija ta 'sfida kbira:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

L-immunità u l-plastiċità intrinsika tan-newtrofili kontra diversi kanċers12–16, inkluż GBM, ġew anqas esplorati mill-applikazzjoni tagħhom bħala trasportaturi taċ-ċelluli fit-twassil tad-droga8–10. Newtrofili li jiċċirkolaw fid-demm dar għall-mikroambjent tat-tumur iposiku (TME), fejn isiru newtrofili eteroġeni assoċjati mat-tumur (TANs), komponent essenzjali ta 'TME immunosoppressiv li jikkontribwixxi għall-progressjoni tal-kanċer u reżistenza terapewtika12,17. Simili għall-makrofaġi, nstabu fenotipi anti-tumur N1 u pro-tumur N2 ta 'TANs fi ħdan it-TME18-21 iposiku. Ġew żviluppati diversi strateġiji terapewtiċi biex jimmiraw direttament in-newtrofili b'fokus fuq it-tnaqqis jew l-inibizzjoni tan-newtrofili12,22, li wasslu għal diversi provi kliniċi (eż., inibitur CCR5 Maraviroc f'NCT03274804). Għalhekk, l-applikazzjoni diretta ta 'newtrofili mhux ittrattati bħala nanocarrier tista' toħloq riskju addizzjonali għal pazjenti bil-kanċer li fihom in-newtrofili tat-traffikar tad-droga jistgħu jiġu pprogrammati mill-ġdid għall-fenotip N2 immunosoppressiv pro-tumur fi ħdan TME wara homing għal siti tat-tumur13,23. Barra minn hekk, l-attivitajiet intrinsiċi ta 'kontra t-tumur ta' newtrofili naïve għandhom jiġu esplorati u msaħħa biex tinkiseb effikaċja terapewtika ottimizzata meta jintuża bħala trasportatur tad-droga flimkien ma 'kimoterapewtiċi.

Benefiċċji ta' cistanche tubulosa-ssaħħaħ is-sistema immuni

Il-modifika tar-riċettur tal-antiġenu kimeriku (CAR) tejbet b'mod sinifikanti l-attivitajiet kontra t-tumur taċ-ċelluli T immuni jew naturali killer (NK)24–27. Madankollu, l-effikaċja tagħhom fit-tumuri solidi għadha limitata minħabba parzjalment it-traffikar relattivament baxx tagħhom u l-kapaċità ta 'penetrazzjoni tat-tumur. Il-preżenza ta 'BBB fiżjoloġiċi u BBTB tkompli tfixkel l-effikaċja ta' dawn it-terapewtiċi emerġenti kontra GBM fil-moħħ. Aħna spekulajna li l-kombinazzjoni ta 'inġinerija CAR u newtrofili mobbli ħafna tista' ssostni l-fenotip N1 kontra t-tumur tagħhom u tagħti effikaċja terapewtika eċċellenti fit-trattament tal-GBM. In-newtrofili primarji għandhom ħajja qasira u reżistenti għall-editjar tal-ġenoma28, u jillimitaw l-applikazzjoni tagħhom fl-immunoterapija diretta mir-CAR. Iċ-ċelloli staminali pluripotenti umani (hPSCs), li huma aktar aċċessibbli għall-editjar tal-ġeni u kapaċi jiddifferenzjaw f’newtrofili b’mod massiv, jistgħu jipprovdu sors illimitat ta’ newtrofili CAR ta’ kwalità għolja għal immunoterapija mmirata taħt kundizzjonijiet definiti kimikament u ħielsa mill-kseno29. In-newtrofili wkoll preferenzjali phagocytose patoġeni mikrobjali b'uċuħ mhux maħduma jew twal, bħal S. aureus u E. coli30, li għandhom jitqiesu għad-disinn tan-nanopartiċelli fil-kunsinna tad-droga medjata minn newtrofili. Tabilħaqq, Safari et al. reċentement irrapporta l-fagoċitożi preferuta ta 'partiċelli tawwalija mogħtija ġol-vini, mingħajr modifika tal-wiċċ ikkumplikata, billi jiċċirkolaw newtrofili30. Disinn faċli u bijoispirat bħal dan f'nanopartiċelli mgħobbija bid-droga jista' jimmassimizza t-tagħbija tad-droga fin-newtrofili u jippermetti livelli terapewtiċi ta' twassil tad-droga f'siti mmirati.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% tan-nanodrogi amministrati huma kkunsinnati lil tumuri tal-moħħ minn newtrofili CAR meta mqabbla ma' 1% minn nanodrogi ħielsa. Fil-qosor, is-sistema bijomimetika tagħna ta 'konsenja tad-droga CAR-newtrophil hija pjattaforma sigura, qawwija u versatili għat-trattament tal-GBM u mard devastanti ieħor.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

Riżultati

Screening ta' strutturi CAR speċifiċi għan-newtrofili għal attivitajiet imtejba kontra t-tumur

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, u l-maġġoranza tal-kloni mmirati huma eterozigoti (Figura Supplimentari 1a–d). L-espressjoni CAR fuq hPSCs inġinerija ġiet ikkonfermata aktar minn RT-PCR u analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss ta 'CLTX-IgG4 (Figura Supplimentari 1e-g). Kif mistenni, l-hPSCs li jesprimu CAR żammew livelli ta 'espressjoni għolja ta' markaturi pluripotenti, inklużi OCT4, SSEA4 u SOX2 (Fig. 1f Supplimentari).

Biex tipproduċi newtrofili CAR de novo, hPSCs li jesprimu CAR kienu l-ewwel differenzjati fi proġenituri ematopojetiċi multipotetiċi u mbagħad majelojdi bi trattament ta 'ċitokini speċifiċi għall-istadju35 (Fig. 2c). Impjieg sussegwenti ta 'G-CSF u agonist ta' l-aċidu retinojku AM580 ippromwova produzzjoni robusta ta 'newtrofili36. Simili għall-kontropartijiet tagħhom fid-demm periferali (PB), newtrofili CLTX-CAR derivati ​​minn hPSC ippreżentaw morfoloġija tipika tan-newtrofili u markaturi tal-wiċċ CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b u CD18 (Figura 2 Supplimentari). Sussegwentement iddeterminajna l-effetti tal-espressjoni CAR fuq iċ-ċitotossiċità kontra t-tumur ta 'newtrofili derivati ​​minn hPSC billi nikkultivawhom flimkien ma' ċelluli U87MG tal-glioblastoma (GBM) in vitro. Kif mistenni, newtrofili CLTX-CAR derivati ​​minn hPSC ippreżentaw kapaċità mtejba ta 'qtil tat-tumur meta mqabbla man-newtrofili PB (Fig. 2d), konsistenti ma' osservazzjonijiet preċedenti fiċ-ċelloli CLTX CAR-T27. Fost dawn il-CARs differenti, CAR #1 medjat attivitajiet superjuri tal-qtil tat-tumur fin-newtrofili hPSC. Notevolment, CAR #4 ibbażata fuq il-katina hija l-inqas effettiva biex tiskatta l-qtil tat-tumur medjat minn newtrofili, li jista 'jkun dovut għall-kopja aktar baxxa ta' ITAM f'mill-subunità ζ u espressjoni aktar baxxa ta 'CAS li jġorru fuq il-wiċċ taċ-ċellula28. In-newtrofili jirrilaxxaw speċi ta 'ossiġnu reattiv ċitotossiku (ROS) u fattur tan-nekrożi tat-tumur- (TNF-) biex joqtlu ċ-ċelloli fil-mira. Il-produzzjoni ta 'ROS u TNF- (Fig. 2e, f) minn newtrofili differenti ikkoinċidiet sew maċ-ċitolisi miżjuda tagħhom. Kif mistenni, il-produzzjoni ta 'ROS u TNF- minn newtrofili differenti wara l-kokultura b'ċelloli glial normali SVG p12 baqgħet baxxa daqs il-grupp ta' kontroll negattiv (Figura Supplimentari 3a, b). Barra minn hekk, ċitotossiċità mtejba kontra t-tumur ta 'CAR-newtrofili kienet osservata biss f'ko-inkubazzjoni ma' ċelluli GBM, inklużi U87MG, ċelluli adulti primarji GBM43, u ċelluli SJ-GBM2 pedjatriċi (Fig. Supplimentari 3c), li turi l-ispeċifiċità għolja tal-CLTX tagħna. -KAROZZA. Notevolment, in-newtrofili CAR urew bijokompatibilità għolja ma 'ċelluli glial normali SVG p12, hPSCs, u ċelluli derivati ​​minn hPSC (Figura Supplimentari 3d), konsistenti ma' osservazzjoni preċedenti li newtrofili primarji inattivati ​​ma joqtlux ċelluli b'saħħithom16. B'mod kollettiv, in-newtrofili CAR derivati ​​minn hPSC, partikolarment in-newtrofili CAR li jġorru CD3ζ, ippreżentaw ċitotossiċità mtejba kontra t-tumur u pproduċew aktar ROS u TNF- in vitro, u enfasizzaw il-potenzjal tagħhom f'immunoterapija mmirata.

Fig. 1|Skematika ta 'effikaċja mtejba kontra l-glioblastoma bl-użu ta' immunoterapija kombinatorja ta 'CAR-newtrofili u nano-drogi li jirrispondu għall-mikroambjent tat-tumur. Iċ-ċelloli staminali pluripotenti tal-bniedem ġew maħduma b'CAS u ddifferenzjati f'newtrofili CAR li huma mgħobbija b'nanopartiċelli tas-silika mhux maħduma (SiO2 NPs) li fihom tirapazamine li jimmiraw l-ipoksja (TPZ) jew mediċini oħra, bħala immunokemoterapija doppja. b CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs amministrati b'mod sistemiku l-ewwel jattakkaw ċelluli esterni normoxic tat-tumur billi jiffurmaw sinapsi immunoloġiċi u joqtlu ċelluli tat-tumur permezz tal-fagoċitosi. Wara l-apoptożi, in-newtrofili CAR jistgħu mbagħad jirrilaxxaw R-SiO2-TPZ NPs, li jinqabżu miċ-ċelloli tat-tumur. Wara, in-nano-prodrogi jirrispondu għall-mikroambjent tat-tumur iposiku u joqtlu b'mod effettiv iċ-ċelloli tat-tumur. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl)propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.

In-newtrofili CAR sostnew attivitajiet superjuri kontra t-tumur taħt mikroambjenti tat-tumur immunosoppressivi

Simili għall-makrofaġi, nstabu fenotipi anti-tumur N1 u pro-tumur N2 ta 'newtrofili assoċjati mat-tumur fil-mikroambjent tat-tumur immunosoppressiv17. In-newtrofili N2 pro-tumur għandhom rwoli kritiċi fl-anġjoġenesi tat-tumur, metastasi, u immunosoppressjoni, iżda l-immirar terapewtiku ta 'dan it-tip ta' ċellula kien ta 'sfida.

Minflok strateġija ta’ tnaqqis sistemiku22, hawnhekk aħna evalwajna l-potenzjal tal-inġinerija CAR biex isostni l-fenotip kontra t-tumur tan-newtrofili. In-newtrofili derivati ​​minn CAR hPSC u PB ġew ittrattati b'ipoksja (3% O2) u TGF, li jikkontribwixxu għall-immunosoppressjoni tal-mikroambjent tat-tumur37,38, biex jevalwaw l-attività sostnuta tagħhom li joqtlu t-tumur. Filwaqt li n-newtrofili PB ippreżentaw ċitoliżi mnaqqsa b'mod sinifikanti kontra ċelluli GBM taħt kundizzjonijiet immunosoppressivi, in-newtrofili CAR sostnew attivitajiet għoljin ta 'qtil tat-tumur (Fig. 4a Supplimentari). Saru wkoll osservazzjonijiet simili fir-rilaxx ta 'TNF u l-ġenerazzjoni ROS (Figura Supplimentari 4b, c) minn PB jew CAR-newtrofili taħt kundizzjonijiet immunosoppressivi u normali. Biex nikkonfermaw aktar il-fenotip tan-newtrofili taħt kundizzjonijiet iposiċi u TGF, kejlna l-espressjoni ta' N1-iNOS speċifiċi u N2- N{2-arginase speċifiċi fuq in-newtrofili iżolati permezz ta' ċitometrija tal-fluss (Fig. 4d–f). Meta mqabbla man-normossja, l-ipoksja immunosoppressiva, u t-TGF naqsu b'mod sinifikanti l-livelli ta 'espressjoni ta' iNOS u żiedu l-livelli ta 'arginase fin-newtrofili PB, filwaqt li n-newtrofili CAR żammew livelli ta' espressjoni għolja ta 'iNOS. Studji preċedenti jindikaw li l-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar Syk-Erk twassal għall-produzzjoni ROS39-42. Għalhekk, skoprejna u qabbilna l-attivazzjoni ta’ Syk-Erk f’newtrofili mhux modifikati u newtrofili CAR, u r-riżultati tagħna ssuġġerew attivazzjoni ogħla b’mod sinifikanti tal-mogħdija Syk-Erk fin-newtrofili CAR taħt ipoksja (Fig. Supplimentari 5a–d), li tista’ ssostni il-produzzjoni ta' ROS mhux mibdula ta' newtrofili CAR taħt ipoksja. Meħuda flimkien, in-newtrofili CAR sostnew fenotip kontra t-tumur u żammew attivitajiet anti-tumur għoljin taħt kundizzjonijiet li jimitaw il-mikroambjent tat-tumur in vitro, u enfasizzaw il-potenzjal tagħhom f'immunoterapija mmirata.

Fig. 2|Skrinjar ta' strutturi ta' riċettur ta' antiġen kimeriku speċifiku għan-newtrofili (CAR) b'attivitajiet imtejba kontra t-tumuri medjati min-newtrofili. a Skematika ta' diversi strutturi CAR. b Skematika tal-kostruzzjoni ta' CAR #1 u strateġija ta' knock-in immirata fil-locus tal-port sigur AAVS1 taċ-ċelloli staminali pluripotenti umani (hPSCs). Il-vleġġa vertikali tindika l-AAVS1 li jimmira sgRNA. Vleġeġ orizzontali ħomor u blu jindikaw primers għall-analiżi tal-effiċjenza tal-immirar u l-omozigożità, rispettivament. HDR: tiswija ta' rikombinazzjoni omologa. c Skematika ta' differenzjazzjoni ottimizzata tan-newtrofili minn hPSCs taħt kundizzjonijiet definiti kimikament. d Twettqu analiżi taċ-ċitotossiċità kontra ċelluli tal-glioblastoma U87MG f'proporzjonijiet differenti ta' mira ta' newtrofili għal tumuri bl-użu ta' newtrofili indikati. Id-dejta hija rappreżentata bħala medja ± SD ta' ħames repliki bijoloġiċi indipendenti, it-test t ta' Student b'żewġ denbu. Ġenerazzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) (e) u analiżi ELISA tar-rilaxx ta 'TNF (f) minn newtrofili differenti wara kokultura b'ċelloli U87MG ġew determinati. n=5 kampjuni bijoloġikament indipendenti. Id-dejta hija rappreżentata bħala medja ± SD, test t ta' Student b'żewġ denbu. Id-dejta tas-sors hija pprovduta bħala fajl tad-dejta tas-sors.

Preparazzjoni u karatterizzazzjoni ta' newtrofili CAR hPSC mgħobbija b'nanopartiċelli SiO2 li fihom tirapazamine (TPZ)

In-newtrofili PB intużaw bħala trasportaturi ċellulari biex iwasslu mediċini għall-immaġini u terapewtiċi fit-tumuri tal-moħħ8–10, għalkemm l-infiltrazzjoni mmirata tan-newtrofili teħtieġ infjammazzjoni kkawżata minn kirurġija jew dawl u twassil ta' mediċina mhux fil-mira jista' jkun ta' tħassib11. Biex intejbu aktar l-attivitajiet kontra t-tumur tan-newtrofili CAR, ħejjejna nanopartiċelli tas-silika (SiO2-NP) b'wiċċ mhux maħdum jew lixx biex jgħabbi mediċini kimoterapewtiċi jew radjazzjoni fin-newtrofili. Immaġini ta 'mikroskopju elettroniku ta' trażmissjoni (TEM) wrew li ż-żewġ nanopartiċelli SiO2 kienu mxerrda sew u urew morfoloġija sferika b'daqs uniformi (Fig. 3a, Fig. Supplimentari 6a). Analiżi tad-distribuzzjoni tal-kompożizzjoni permezz ta 'skannjar TEM (STEM) bi spettroskopija tar-raġġi X (EDS) mxerrda bl-enerġija uriet li l-element tal-kubrit (S) kien imqassam b'mod ugwali fi ħdan in-nanopartiċelli SiO2 mhux maħduma kollha (R-SiO2) (Fig. 3b). Bl-użu ta 'isotermi ta' adsorbiment-desorbiment tan-nitroġenu (N2) u analiżi tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-pori korrispondenti, id-daqsijiet tal-pori ta 'R- u SSiO2 NPs tkejlu bħala 25 nm u 35 nm (Fig. 3c, Fig. Supplimentari 6b), rispettivament. Minħabba l-erja tal-wiċċ għolja u d-daqs kbir tal-pori, il-mediċini terapewtiċi jistgħu jitgħabbew b'mod effettiv kemm f'R- kif ukoll f'S- SiO2 NPs, kif eżemplati mill-ipoxia-responsive pro-drog tirapazamine (TPZ) (Fig. 3d, Supplimentari Fig. 6c) . Wara t-tagħbija TPZ, bidliet sinifikanti ma ġewx osservati fid-dispersità, il-morfoloġija u d-daqs ta 'R-SiO2-TPZ bl-użu ta' TEM u analiżi dinamika tat-tifrix tad-dawl (Figura Supplimentari 6d, e). Ir-rabtiet tetra-sulfide inkorporati fl-R-SiO2 NPs huma sensittivi għal ambjenti riduttivi u jistgħu jiġu degradati malajr mill-ammont kbir ta 'glutathione (GSH) preżenti fiċ-ċelloli tat-tumur43. Sussegwentement iddeterminajna d-degradabilità li tirreaġixxi għal GSH ta 'R-SiO2–TPZ NPs fil-preżenza ta' 10 mM, 1 mM, u 10 μM GSH, li kienu l-istess bħall-kundizzjonijiet intraċellulari taċ-ċelluli tal-kanċer, ċelluli normali u ambjenti extraċellulari43, rispettivament. Fuq trattament ta '10 mM GSH, l-istruttura sferika inizjali ta' R-SiO2-TPZ NPs ġiet meqruda severament wara 24 siegħa (Fig. Supplimentari 6f, g). In-nanopartiċelli ġew kompletament diżintegrati f'debris żgħar wara 48 siegħa, li rriżultaw fir-rilaxx ta 'TPZ b'mod li jirrispondu għal GSH (Fig. 3e). Id-debris ta 'R-SiO2 NPs ma kkawża l-ebda ċitotossiċità sinifikanti għaċ-ċelloli ttestjati in vitro (Figura Supplimentari 6h), li jindika s-sigurtà relattiva ta' R-SiO2 NPs.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Wara evalwajna l-fattibbiltà li nużaw SiO2–TPZ NPs biex jgħabbi mediċini terapewtiċi fin-newtrofili CAR bħala kimoimmunoterapija kombinatorja biex tinkiseb effikaċja terapewtika msaħħa. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, kejlna l-assorbiment ċellulari ta 'SiO2-TPZ NPs minn newtrofili bl-użu ta' mikroskopju fluworexxenti u analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss (Fig. 3f, g), u skoprejna assorbiment ċellulari aktar sinifikanti ta 'R-SiO2-TPZ NPs minn S-SiO2- TPZ NPs minn newtrofili. Il-kontenut ta 'Si ċellulari fin-newtrofili tkejjel bħala 11.3 u 19.1 ng Si/ug proteina għal SiO2 NPs@TPZ bla xkiel u mhux maħdum (Fig. 3h), rispettivament, permezz ta' spettrometrija tal-massa tal-plażma akkoppjata b'mod induttiv (ICP-MS). Minħabba l-kapaċità ta 'tagħbija għolja tagħhom fin-newtrofili, R-SiO2–TPZ NPs ġew impjegati għal esperimenti sussegwenti. Imbagħad fittxejna li nittestjaw il-funzjonijiet fiżjoloġiċi tan-newtrofili CAR wara li tgħabbew R-SiO2–TPZ NPs. Ma ġew osservati l-ebda bidliet fil-vijabbiltà taċ-ċelluli (Fig. 3i, Fig. 6i Supplimentari), kapaċità ta 'migrazzjoni transwell (Fig. 3j), kimotassi, u veloċità korrispondenti (Fig. 3k, l) ta' CAR-newtrofili qabel jew wara t-tagħbija R-SiO2 –TPZ NPs, li juru l-bijokompatibilità għolja tagħhom. Twettqet ukoll analiżi tat-tagħbija tan-nano-droga li tiddependi mill-ħin u l-kontenut massimu tat-tagħbija intlaħaq f'siegħa 1 wara l-inkubazzjoni taċ-ċelluli-NP (Figura Supplimentari 7a). Aktar minn 95% CAR-newtrofili ġew mgħobbija b'suċċess b'R-SiO2-TPZ NPs (Figura Supplimentari 7b). Il-livell ta 'espressjoni ta' CD11b, proteina tal-wiċċ tan-newtrofili li timmedja l-funzjoni ta 'adeżjoni u migrazzjoni fuq stimulazzjoni ta' molekula infjammatorja, ma nbidilx fuq newtrofili CAR bi jew mingħajr tagħbija R-SiO2-TPZ (Fig. Supplimentari 7c, d). Superoxide jew speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) huma rilaxxati minn newtrofili attivi biex joqtlu mikrobi u ċelluli tat-tumur44. Kif mistenni, il-ġenerazzjoni ta' ROS min-newtrofili CAR żdiedet b'mod sinifikanti wara t-trattament ta' N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP), u ma ġewx osservati differenzi sinifikanti fil-produzzjoni ta' ROS minn CAR-newtrofili qabel u wara t-tagħbija ta' R-SiO 2- TPZ (Fig. 3m). Meħuda flimkien, id-dejta tagħna wriet li n-newtrofili CAR mgħobbija R-SiO2-TPZ żammew l-attivitajiet fiżjoloġiċi ta 'newtrofili tat-tip selvaġġ u setgħu jemigraw b'mod attiv lejn stimuli infjammatorji, u jenfasizzaw il-potenzjal tagħhom f'kimoimmunoterapija mmirata tal-kanċer.

In-newtrofili CAR mgħobbija b'nanopartiċelli R-SiO2-TPZ joqtlu b'mod effettiv iċ-ċelloli tal-glioblastoma

Wara evalwajna l-effett ta 'R-SiO2-TPZ fuq il-kapaċità ta' qtil tat-tumur tan-newtrofili CAR. Interazzjoni intima effettur-mira kienet prerekwiżit għaċ-ċitoliżi medjata minn newtrofili. Kif mistenni, CAR-newtrophils@R-SiO2-TPZ iffurmaw sinapsi immuni b'ċelluli tat-tumur fi żmien sagħtejn u wrew numri ta 'interazzjoni effettur-mira simili bħal newtrofili CAR ħielsa mid-droga (Fig. 4a, Fig. Supplimentari 8) . Notevolment, ma nstabu l-ebda interazzjoni osservabbli bejn CAR-newtrophils@RSiO2-TPZ u ċelluli somatiċi mhux kanċeroġeni (Fig. 8 Supplimentari), li jenfasizzaw l-ispeċifiċità ta 'CLTX-CAR kontra tumuri tal-moħħ. Barra minn hekk, R-SiO2-TPZ NPs ġew rilaxxati min-newtrofili fil-mezz tal-kultura (Figura 9a, b Supplimentari) 12-il siegħa wara l-kokultura u daħlu fiċ-ċelloli tat-tumur li kien fadal (Fig. 4a). Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-ko-inkubazzjoni ta 'CAR-newtrofili mgħobbija b'SiO2–TPZ NP b'ċelluli tat-tumur, sa 95% taċ-ċelluli tat-tumur kien fihom R-SiO2–TPZ NPs (Fig. 4a, Fig. Supplimentari 9c), li jindika suċċess. kaskata tat-trasport li tinvolvi newtrofili trasportaturi li jeżerċitaw il-funzjoni taċ-ċelluli effettor tagħhom u jgħaddu minn apoptożi, u b'hekk jirrilaxxaw b'mod passiv R-SiO2–TPZ NPs għaċ-ċelloli tat-tumur fil-mira45. Aħna vvalidajna wkoll il-funzjoni ta 'rispons iposiku u ċ-ċitotossiċità ta' TPZ pro-droga fi ħdan iċ-ċelluli tat-tumur permezz ta 'analiżi spettroskopija ta' reżonanza paramanjetika elettronika (EPR) tal-ġenerazzjoni ta 'radikali minn TPZ (Fig. Supplimentari 9d) u analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss ta' TOPRO-3 fuq it-tumur ċelluli (Fig. 9e Supplimentari) taħt ipoksja u normoksja. Biex tiddetermina ċ-ċitoliżi ta 'newtrofili CAR mgħobbija R-SiO2-TPZ NP, implimentajna mudell in vitro ta' sfida mill-ġdid tat-tumur normoxia-hypoxia (Fig. 4b). Erbgħa u għoxrin siegħa wara kokultura normoxic, CAR-newtrofili mgħobbija b'R-SiO2-TPZ NPs jew ma wrewx ċitotossiċità kontra t-tumur simili (Fig. 4c), u t-tnejn kienu ogħla minn dak ta 'PB-newtrofili mgħobbija b'R -SiO2-TPZ NPs jew le u R-SiO2- TPZ NPs waħedhom. Iċ-ċitotossiċità mtejba hija prinċipalment dovuta għall-kapaċità miżjuda ta 'l-immirar tat-tumur tan-newtrofili wara l-inġinerija CAR. Wara kokultura iposika addizzjonali ta '12 u 24-h b'ċelluli tat-tumur, R-SiO2- TPZ NP-loaded CAR-newtrophils wrew kapaċità superjuri kontra t-tumur meta mqabbla ma' gruppi oħra (Fig. 4d, e). Barra minn hekk, in-newtrofili CAR mgħobbija b'NPs R-SiO2-TPZ urew ċitoliżi eċċellenti kontra ċelluli tat-tumuri friski miżrugħa mill-ġdid (Fig. 4f), li jindika l-kapaċità kontra t-tumur ta' R-SiO2-TPZ rilaxxat nanopartiċelli wara apoptożi tan-newtrofili.

Imbagħad wettaqna analiżi tas-sekwenzjar tal-RNA (RNA-seq) fuq ċelluli tat-tumur biex niċċaraw il-mekkaniżmu molekulari potenzjali sottostanti ċitoliżi mtejba kontra t-tumuri ta 'newtrofili bl-espressjoni CAR u R-SiO2-TPZ NPs. L-analiżi tal-espressjoni tal-ġeni wriet li meta mqabbla mal-kontroll u R-SiO2-TPZ NPs, in-newtrofili CAR mgħobbija bi jew mingħajr R-SiO2-TPZ NPs naqqsu b'mod sinifikanti l-espressjoni taċ-ċitoplasma u l-ġeni tal-membrana fiċ-ċelloli tat-tumur ( Fig. 10a Supplimentari, Fig. 4g), li jappoġġjaw aktar il-fagoċitożi tagħhom taċ-ċelloli tat-tumur mal-kokultura. Filwaqt li l-gruppi sperimentali kollha żiedu l-istress ossidattiv ċellulari fiċ-ċelluli tat-tumur, in-newtrofili CAR mgħobbija bi R-SiO2-TPZ qabżu gruppi oħra fl-iskattar tas-sinjalar tal-istress ossidattiv. Barra minn hekk, in-newtrofili CAR mgħobbija b'R-SiO2-TPZ ippromwovew b'mod sinifikanti l-apoptosi u naqsu l-proliferazzjoni fiċ-ċelloli tat-tumur. Biex nifhmu aktar l-attivitajiet imtejba kontra t-tumur tan-newtrofili CAR mgħobbija bi R-SiO2-TPZ, applikajna inibitur tal-fagoċitosi cytochalasin D u speċi reattiva tal-ossiġnu (ROS) scavenger N-acetyl-cysteine ​​(NAC) u inibitur ROS GSK2795039 għall-kokultura tat-tumur-newtrofili. Iċ-ċitoliżi taċ-ċelluli tat-tumur minn CAR-newtrofili tnaqqset b'mod sinifikanti b'5 μM cytochalasin D, 5 mM NAC, u 100 nM GSK2795039 (Figura Supplimentari 10b, c), li jindika r-rwol prominenti tal-fagoċitosi u ROS fiċ-ċellula tat-tumur medjata minn CAR newtrophil. qtil. L-40%-50% lisi taċ-ċelluli tat-tumur li jifdal fil-preżenza ta 'newtrofili u NAC jew GSK2795039 jindika l-involviment ta' mekkaniżmu indipendenti ROS fil-qtil tat-tumur medjat minn newtrofili li jiswew aktar investigazzjoni.

Fig. 3|Preparazzjoni u karatterizzazzjoni ta 'hPSC CAR-newtrofili mgħobbija b'nanopartiċelli SiO2 li fihom tirapazamine (TPZ). a–e Mikroskopju elettroniku tat-trażmissjoni (TEM) (a) u immaġini ta 'mapping elementali ta' spettroskopija dispersiva tal-enerġija (EDS) (b) ta 'nanopartiċelli SiO2 mhux maħduma huma murija. c Isoterma ta 'adsorbiment-desorbiment tan-nitroġenu ta' nanopartiċelli SiO2 mhux maħduma flimkien ma 'plott tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-pori Barrett-JoynerHalenda (BJH). It-triplikati bijoloġiċi saru b'mod indipendenti. Il-kontenut ta' tagħbija ta' TPZ f'nanopartiċelli SiO2 (d) u ​​glutathione (GSH)--rilaxx ta' TPZ reattiv (e) ġew imkejla fil-ħin indikat. n=3 kampjuni bijoloġikament indipendenti. Analiżi one-way tal-varjanza (ANOVA) għal (e). Immaġini ta' fluworexxenza (f) u analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss (g) ta' newtrofili mgħobbija b'SiO2-TPZ lixx u mhux maħdum. It-triplikati bijoloġiċi saru b'mod indipendenti. h Ġie mkejjel il-kontenut ta' SiO2 ċellulari fin-newtrofili CAR derivati ​​minn hPSC. n=5 kampjuni bijoloġikament indipendenti, test t ta' Student b'żewġ denbu. Vijabilità ċellulari (i), n=3 kampjuni bijoloġikament indipendenti, trasmigrazzjoni (j), n=5 kampjuni bijoloġikament indipendenti, kapaċitajiet ta’ kimoattrazzjoni (k, l), n=20 kampjuni bijoloġikament indipendenti, u Intwera l-kapaċità ta 'ġenerazzjoni ta' ROS (m) ta 'newtrofili CAR derivati ​​minn hPSC mgħobbija bi jew mingħajr SiO2-TPZ mhux maħduma, n=5 kampjuni bijoloġikament indipendenti, test t ta' Student b'żewġ denbu. PMA: phorbol myristate acetate. Id-dejta kollha f'din il-figura hija rappreżentata bħala medja ± SD. Id-dejta tas-sors hija pprovduta bħala fajl tad-dejta tas-sors.

Evalwazzjoni funzjonali ta' CAR-newtrofili mgħobbija b'nano-drogi bl-użu ta' mudelli ta' glijoblastoma bijomimetiċi in vitro

Biex nivvalutaw aktar l-attivitajiet tan-newtrofili CAR mgħobbija b'R-SiO2-TPZ NP, implimentajna mudell ta' tumur ta' barriera tad-demm-moħħ (BBB) ​​ibbażat fuq transwell bl-użu ta' ċelloli endoteljali mikrovaskulari ċerebrali umani (Fig. 5a, Fig Supplimentari . 11a). Kif mistenni, in-newtrofili CAR mgħobbija b'R-SiO2-TPZ NP wrew kapaċità ta' trasmigrazzjoni eċċellenti fuq mudell BBB in vitro (Fig. 5b), effettivament joqtlu ċelluli tat-tumur immirati wara t-trasmigrazzjoni taħt kundizzjonijiet kemm normosiċi kif ukoll iposiċi (Fig. 5c). , d), u tirrilaxxa aktar ċitokini infjammatorji (Fig. 5e) li jistgħu jattiraw ċelluli effector oħra biex joqtlu ċ-ċelloli tat-tumur. Barra minn hekk, in-newtrofili CAR ma affettwawx b'mod sinifikanti l-vijabbiltà taċ-ċelloli endoteljali wara t-trasmigrazzjoni (Fig. 11b Supplimentari). R-SiO 2- TPZ NP-loaded CAR-newtrofili żammew kapaċità ta 'trasmigrazzjoni eċċellenti matul it-tieni esperiment ta' trasmigrazzjoni (Fig. 5f) u kapaċità superjuri kontra t-tumur meta mqabbla ma 'gruppi oħra (Fig. 5g). Mudell tridimensjonali (3D) tat-tumur spheroid kien imbagħad impjegat biex jevalwa l-kapaċità ta 'penetrazzjoni tat-tumur ta' R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-newtrophils (Fig. 5h). CAR-newtrofili gradwalment emigraw lejn iċ-ċentru ta 'l-isferojde tat-tumur u mqassma b'mod uniformi fl-isferode wara 8 sigħat ta' inkubazzjoni (Fig. 5i). Ġie osservat grad għoli ta' ko-lokalizzazzjoni bejn in-newtrofili CAR u R-SiO2-TPZ NPs (Figura Supplimentari 12a–c), li juri li R-SiO2-TPZ NPs kienu inkapsulati b'mod stabbli fil-CAR -newtrofili waqt l-infiltrazzjoni tat-tumur qabel iċ-ċitoliżi tagħhom. Mingħajr twassil medjat minn newtrofili, R-SiO2-TPZ NPs instabu biss fuq is-saff ta 'barra ta' spherojdi tat-tumur. Meta mqabbla ma 'R-SiO2-TPZ NPs u CAR-newtrofili, R-SiO2-TPZ NP-loaded newtrofili CAR urew ċitolisi superjuri kontra t-tumur fil-mudell tat-tumur 3D (Fig. 5j). CAR-neutrophils@R-SiO2 NPs jistgħu wkoll jiġu impjegati biex iwasslu mediċini oħra, inkluż temozolomide kliniku (TMZ) u JNJ - 64619187, f'mudelli ta 'tumur 3D u joqtlu b'mod effiċjenti ċ-ċelloli GBM (Fig. Supplimentari 12d-f). Meħuda flimkien, in-newtrofili CAR u nano mediċini kombinatorji wrew attivitajiet eċċellenti kontra t-tumur f'kundizzjonijiet li jimitaw il-mikroambjent tat-tumur bijomimetiku in vitro, u enfasizzaw il-potenzjal terapewtiku ta 'kimoimmunoterapija kombinatorja bbażata fuq newtrofili.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Distribuzzjoni in vivo ta' nanopartiċelli R-SiO2-TPZ mogħtija bin-newtrofili CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% tan-nanodrogi amministrati ngħataw lil tumuri tal-moħħ minn newtrofili CAR meta mqabbla ma' 1% minn nanodrogi b'xejn li huwa konsistenti mar-rapporti preċedenti6. Twassil immirat ta 'R-SiO2-TPZ NPs lill-moħħ ospitanti madwar BBB minn CAR-newtrofili ġie kkonfermat ukoll permezz ta' analiżi istoloġika (Fig. 6d). Għall-kuntrarju, R-SiO2-TPZ NPs waħedhom prinċipalment akkumulaw fil-fwied u l-milsa. B'mod kollettiv, id-dejta tagħna wriet konsenja mmirata mtejba ta' R-SiO2-TPZ NPs min-newtrofili CAR mingħajr il-ħtieġa li tinduċi infjammazzjoni addizzjonali fis-sit tat-tumur, u enfasizza l-fattibilità u s-sigurtà tal-kimoimmunoterapija bbażata fuq in-newtrofili fit-trattament tal-kanċer.

Il-kimoimmunoterapija kombinatorja ta' CAR-newtrofili u nanopartiċelli R-SiO2-TPZ urew attivitajiet eċċellenti kontra l-glioblastoma in vivo

Biex tiddetermina l-effikaċja terapewtika tan-newtrofili CAR mgħobbija b'R-SiO2-TPZ NP, ġie stabbilit mudell ta' xenograft in situ ta' glijoblastoma fil-ġrieden NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) bl-użu ta 'ċelluli U87MG li jesprimu luciferase. Ġrieden li jġorru tumuri ġew amministrati ġol-vina 5 × 106 newtrofili kull ġimgħa (Fig. 7a), u l-piż tat-tumur fl-ospiti kien imkejjel u kkwantifikat (Fig. 7b, c). Meta mqabbel ma 'ġrieden ittrattati b'PBS jew b'newtrofili PB, it-trattament b'car-newtrofili u CAR newtrophil@R-SiO2-TPZ NPs naqqset b'mod effettiv it-tkabbir tat-tumur. CAR neutrophils@R-SiO2–TPZ NPs wrew ċitotossiċità kontra t-tumur ħafna ogħla minn kwalunkwe grupp sperimentali ieħor. Għall-kuntrarju, in-newtrofili PB ippromwovew b'mod sinifikanti t-tkabbir tat-tumur fil-moħħ, li rriżultaw fil-mewt ta 'ġrieden li jġorru tumur sa jum 23 (Fig. 7d), li jissuġġerixxu li newtrofili mhux maħduma jistgħu joħolqu riskji addizzjonali. Imbagħad imkejla r-rilaxx taċ-ċitokini umani fil-plażma ta 'gruppi ta' ġrieden sperimentali differenti (Fig. 7e). Il-gruppi sperimentali kollha mhux PBS ipproduċew TNF u IL-6 li jistgħu jinstabu fil-plażma mill-jum 5 sas-26 jum, li jissuġġerixxu l-attivazzjoni tan-newtrofili umani mal-istimulazzjoni tat-tumur. B'mod konsistenti mar-rata ogħla ta' tkabbir tat-tumur osservata, newtrofili mhux modifikati gradwalment rilaxxaw aktar IL-6 u TNF, li jistgħu jwasslu għal sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini f'pazjenti u jeħtieġu aktar studji fil-fond dwar is-sigurtà b'imblokkaturi tal-IL-646,47 . Notevolment, CAR-newtrophils@RSiO2–TPZ NPs wrew kapaċità ta 'produzzjoni ta' ċitokini mnaqqsa f'punti ta 'żmien aktar tard (jum 19 u jum 26), li jissuġġerixxu riskju potenzjalment baxx ta' sindromu ta 'rilaxx ta' ċitokini f'pazjenti kkurati b'kimoimmunoterapija bbażata fuq CAR-newtrophil. Il-bijokompatibilità ta 'car-newtrofili kombinatorji u R-SiO2-TPZ NPs ġiet evalwata permezz ta' kejl ta 'kull ġimgħa tal-piżijiet tal-ġisem u monitoraġġ ta' bidliet patoloġiċi fl-organi ewlenin tal-ġrieden. L-ebda differenza ma ġiet osservata fil-piżijiet tal-ġisem bejn ġrieden CAR newtrophils@R-SiO2–TPZ NP-trattati u xi gruppi sperimentali oħra (Fig. 7f), li jindikaw tossiċità sistemika minima u bijokompatibilità eċċellenti ta 'CAR-newtrophils@ R-SiO2–TPZ NPs fi ħdan 28 jum ta 'trattament. Analiżi istoloġika fuq organi maġġuri mqattgħin mill-ġrieden fil-jum 30 wriet li ġrieden ittrattati CAR-newtrophils@R-SiO2–TPZ NP ma kkawżawx anormalità notevoli jew ħsara lill-organi fil-qalb, fwied, milsa, pulmun u kliewi (Fig. 13), li tikkonferma aktar is-sigurtà tan-newtrofili CAR kombinatorji u R-SiO2-TPZ NPs.

Fig. 4|In-newtrofili CAR mgħobbija b'nanopartiċelli R-SiO2-TPZ joqtlu b'mod effettiv iċ-ċelloli tal-glioblastoma. Intwerew stampi rappreżentattivi ta 'sinapsi immunoloġiċi indikati minn akkumulazzjoni polarizzata ta' F-actin fl-interface bejn in-newtrofili CAR u ċelluli tat-tumur f'6, 12, u 24 siegħa. Nanopartiċelli R-SiO2-TPZ rilaxxati min-newtrofili CAR mal-fagoċitosi taċ-ċelluli tat-tumur ġew meħuda miċ-ċelloli tat-tumur. It-triplikati saru b'mod indipendenti. b Skematika tal-assaġġ taċ-ċitotossiċità kontra t-tumur medjat minn newtrofili. Iċ-ċitotossiċità kontra ċ-ċelloli tal-glioblastoma U87MG twettqet fi proporzjonijiet differenti ta 'mira ta' newtrofili għal tumur bl-użu ta 'newtrofili indikati f'24 h (c), 36 h (d), 48 h (e) u 72 h (f). n=3 kampjuni bijoloġikament indipendenti. Id-dejta hija rappreżentata bħala medja ± SD, analiżi one-way tal-varjanza (ANOVA). g Analiżi tas-sekwenzjar tal-RNA bl-ingrossa saret fuq ċelloli U87MG taħt kundizzjonijiet varji. Il-mappa tas-sħana turi livelli ta 'espressjoni ta' ċitoplasma magħżula, membrana, stress ossidattiv, apoptożi, u ġeni relatati mal-proliferazzjoni fiċ-ċelluli tal-glioblastoma indikati. n=2 kampjuni bijoloġikament indipendenti. Id-dejta tas-sors hija pprovduta bħala fajl tad-dejta tas-sors.

Fig. 5|Evalwazzjoni funzjonali ta' CAR-newtrofili mgħobbija b'nanopartiċelli R-SiO2-TPZ bl-użu ta' mudelli ta' glijoblastoma bijomimetika (GBM) in vitro. a Skematika tal-mudell tat-tumur in vitro tagħna ta 'GBM b'barriera tad-demm-moħħ (BBB), li hija magħmula minn ċelluli endoteljali fuq il-membrana tad-dħul taċ-ċellula u ċelluli tat-tumur fil-qiegħ tal-istess transwell. b Analiżi tal-migrazzjoni Transwell tan-newtrofili fi 12-il siegħa hija murija. Iċ-ċitotossiċità kontra l-GBM tan-newtrofili indikati f'24 siegħa (c) u 36 siegħa (d) ġiet imkejla u kkwantifikata. Twettqet analiżi ELISA ta' IL-6 u TNF rilaxxati minn newtrofili indikati f'36 siegħa. f Tiġi murija t-tieni migrazzjoni ta' newtrofili differenti fi 48 siegħa. g Ġiet imkejla u kkwantifikata ċ-ċitotossiċità kontra l-GBM tan-newtrofili indikati f'60 siegħa. h–j Skematika ta 'mudell ta' tumur tridimensjonali (3D) infiltrat bin-newtrofili in vitro intwera f'(h). Intwerew immaġini fluworexxenti rappreżentattivi ta 'newtrofili infiltrati fil-mudelli tat-tumur 3D. DAPI intuża biex itebba ċ-ċellula nukleari u CD45 intuża biex itebba n-newtrofili. Vireg tal-iskala, 200 μm. It-triplikati bijoloġiċi saru b'mod indipendenti. j Il-kapaċità korrispondenti ta' qtil tat-tumur tan-newtrofili indikati ġiet imkejla u kkwantifikata bl-użu ta' kit ta' ċitotossiċità. Id-dejta hija rappreżentata bħala medja ± SD ta' ħames repliki bijoloġiċi indipendenti, analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA). Id-dejta tas-sors hija pprovduta bħala fajl tad-dejta tas-sors.

Filwaqt li l-NPs CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ naqqsu b’mod sinifikanti t-tkabbir tat-tumur fil-ġrieden xenograft, id-differenza fis-sopravivenza tal-annimali fi gruppi sperimentali ta’ CAR-newtrofili, SiO2–TPZ NPs u CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ NPs hija insinifikanti (p > 0.05), li possibbilment hija dovuta għall-mewt ta 'newtrofili ta' ħajja qasira waqt il-preparazzjoni taċ-ċelluli u l-injezzjoni. Imbagħad iffukajna fuq dawn it-tliet gruppi u ddeterminajna jekk tnaqqis fil-ħin tal-preparazzjoni taċ-ċelluli u żieda fid-dożaġġi ta 'CAR-newtrofili u nano drogi jagħmlux differenza fis-sopravivenza tal-annimali (Fig. 7g). Meta amministrati b'mod sistemiku 6 darbiet, CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs qabżu ż-żewġ gruppi l-oħra fl-estensjoni tal-ħajja tal-ġrieden li jġorru tumur (Fig. 7h), filwaqt li d-differenza ta 'sopravivenza tal-annimali fi gruppi ta' CAR-newtrofili u SiO2- TPZ NPs baqgħu insinifikanti. Filwaqt li kienet osservata kurva ta’ sopravivenza simili tal-grupp R-SiO2- TPZ bejn dawn iż-żewġ studji indipendenti fuq l-annimali, naqas ħin fl-iżolament taċ-ċelluli u l-preparazzjoni għall-injezzjoni minn total ta’ ~4 sigħat għal siegħa matul l-ewwel 4 newtrofili. dożi wasslu għal sopravivenza mtejba tal-annimali fi gruppi CAR-newtrofili qabel il-jum 32. Kollettivament, id-dejta tagħna wriet l-importanza tal-preparazzjoni tan-newtrofili u l-ottimizzazzjoni tad-dożaġġ f'applikazzjonijiet kliniċi futuri tat-terapewtiċi tan-newtrofili.

Diskussjoni

In-newtrofili tal-ġrieden intwerew bħala trasportatur b'saħħtu biex iwassal b'mod effiċjenti nanodrogi għal tumuri tal-moħħ wara l-operazzjoni infjammati8,9. Xorta waħda, il-fattibilità u s-sigurtà tal-użu tan-newtrofili umani fit-twassil tad-droga jibqgħu elużivi. L-ammont kbir ta’ newtrofili tal-ġrieden (10 darbiet ogħla min-numru totali ta’ newtrofili li jiċċirkolaw fil-ġrieden11) użat f’dawn l-istudji biex jinkiseb benefiċċju terapewtiku jista’ jkompli jxekkel it-traduzzjoni klinika tagħhom peress li l-estrazzjoni ta’ għadd kbir ta’ newtrofili minn pazjenti bil-kanċer tista’ twassal għal newtropenja u toħloq. riskji oħra. Biex nindirizzaw dawn l-isfidi, użajna s-setgħa tal-hPSCs li jġeddu lilhom infushom biex niksbu newtrofili umani de novo illimitati29. Aħna żviluppajna sistema qawwija ta 'konsenja tad-droga medjata minn newtrofili bijoinspirata b'CAR-engineering29 u użajna CAR-newtrofili umani ta' inġinerija bħala nanocarrier b'attivitajiet impressjonanti kontra t-tumur. NPs SiO2 mhux maħduma jaħdmu aħjar minn NPs SiO2 bla xkiel f'trasportaturi CAR-newtrofili, konsistenti ma 'osservazzjonijiet preċedenti li n-newtrofili preferenzjali jiffagoċitaw patoġeni mikrobjali mhux maħduma30. In-newtrofili kienu rrappurtati li jippromwovu l-proliferazzjoni u l-progressjoni taċ-ċelloli tal-glijoma48. Aħna osservajna effett simili pro-tumur ta 'newtrofili mhux modifikati fl-istudju tagħna fuq l-annimali, li enfasizza l-ħtieġa ta' inġinerija CCAR jew modifiki oħra fin-newtrofili biex tiġi żgurata s-sigurtà tagħhom fil-kunsinna tad-droga u applikazzjonijiet terapewtiċi oħra. Notevolment, il-kunsinna tad-droga medjata minn CAR-newtrofili tagħna tiddependi biss fuq l-abbiltà indiġena ta’ kimo-attrazzjoni tal-GBM, iżda mhux is-sinjali infjammatorji amplifikati post-kirurġiċi, li jissuġġerixxu l-ispeċifiċità għolja u l-potenzjal terapewtiku tas-sistema tagħna ta’ kunsinna tad-droga fil-qerda ta’ glijomi infiltrati fil-fond. li ma jistgħux jitneħħew b'kirurġija. Peress li r-resezzjoni kirurġika u l-kimoterapija/radjoterapija awżiljarja huma l-interventi kliniċi primarji għal GBM12, trattament kombinat b'nanocarriers tan-newtrofili CAR u kirurġija/radjuterapija jistgħu jiksbu l-aħjar effikaċja terapewtika u ta 'min jiswew aktar investigazzjoni. Il-kostruzzjonijiet CAR speċifiċi għaċ-ċelluli T u NK intużaw ħafna biex itejbu l-attivitajiet kontra t-tumur taċ-ċelluli T u NK, iżda CARs speċifiċi għan-newtrofili li jtejbu l-funzjonijiet kontra t-tumur tan-newtrofili ma ġewx deskritti. Ir-riċetturi immuni kimeriċi CD4ζ u CD4 kienu rrappurtati qabel li jtejbu ċ-ċitoliżi tan-newtrofili kontra ċelluli trasfettati b'HIVenv in vitro. Xorta waħda, l-effiċjenza tal-liżi kienet biss ~ 10% bi proporzjon effettur-to-mira (E: T) ta '10:128. Fc RIIA (CD32a) huwa riċettur transmembrana b'katina waħda ta' affinità baxxa għal IgG monomeriku li huwa espress ħafna f'newtrofili (30,000 sa 60,000 molekuli/ċellula31), u l-ligazzjoni tiegħu tinduċi Fc - funzjonijiet dipendenti fin-newtrofili, bħar-rilaxx ta' kontenut ta' granuli, mobilizzazzjoni ta' Ca2+, ċitotossiċità kontra t-tumur, u fagoċitosi49. Minħabba r-rwol prominenti ta 'CD32a fl-attivazzjoni u l-funzjoni tan-newtrofili, iddisinjajna u ttestjajna kostruzzjonijiet CAR ibbażati fuq CD32a. Madankollu, ir-riżultati tagħna wrew li CD3ζ jimmedja ċitolisi b'mod sinifikanti aħjar minn CD32a meta espress f'newtrofili derivati ​​minn hPSC, li jista 'jkun parzjalment minħabba l-kopji ogħla ta' ITAMs f'CD3ζ minn CD32a: tliet kopji u kopji waħda, rispettivament, u livelli ta 'espressjoni ogħla ta' ζ milli fuq il-wiċċ taċ-ċellula tan-newtrofili28. Bħal CD32a, Fc RIII (CD16b) huwa riċettur ieħor ta 'affinità baxxa għal IgG monomeriku u huwa espress f'livell ħafna ogħla minn CD32a fuq newtrofili31. Filwaqt li l-cross-linking ta’ CD16b jinduċi biss mobilizzazzjoni u degranulazzjoni ta’ Ca2+, iżda mhux fagoċitożi u ċitoliżi fin-newtrofili28,50, xorta se jkun ta’ interess fi studji futuri li jsir paragun sistematiku fuq il-kapaċitajiet ta’ CD3ζ- u CD16b -CARs fil-bidu u t-titjib tal-funzjonijiet kontra t-tumur tan-newtrofili.

Fig. 6|Distribuzzjoni in vivo ta' nanopartiċelli R-SiO2-TPZ (NPs) mogħtija bin-newtrofili CAR. a Skematika ta' NPs CAR neutrophil@R-SiO2 u R-SiO2 NPs mogħtija ġol-vini għal studju ta' traċċar taċ-ċelluli in vivo. Ċelloli U87MG li jesprimu luciferase (Luci) 5 × 105 ġew impjantati b'mod stereotattiku fil-forbrain tal-lemin tal-ġrieden NRG. Wara 4 ijiem, ġrieden ġew ittrattati ġol-vini b'PBS, 5 × 106 Cy5-ittikkettjati CAR neutrophil@R-SiO2 NPs u R-SiO2 NPs. b Il-bijodistribuzzjoni li tiddependi mill-ħin tan-newtrofili Cy5+ fil-ġisem kollu, fil-moħħ, u f'organi oħra ġiet iddeterminata u kkwantifikata permezz ta' immaġini ta' fluworexxenza fis-sigħat indikati. c Il-bijodistribuzzjoni ta' CAR neutrophil@R-SiO2 NPs u R-SiO2 NPs fil-ġrieden f'24 siegħa wara l-injezzjoni ġiet analizzata permezz ta' spettrometrija ta' emissjoni ottika-plażma akkoppjata b'mod induttiv (ICP-OES) ibbażata fuq l-element Si, u d-dejta ġiet espressa bħala l-perċentwali ta' doża injettata għal kull gramma ta' tessut (%ID/g). n=5 kampjuni bijoloġikament indipendenti. Id-dejta hija rappreżentata bħala medja ± SD. Id-dejta tas-sors hija pprovduta bħala fajl tad-dejta tas-sors. d Intwerew immaġini ta 'fluworexxenza rappreżentattivi ta' CD45 u SiO2 fil-ksenografts tal-glioblastoma indikati iżolati minn ġrieden li jġorru tumur. Vireg tal-iskala, 100 μm. It-triplikati bijoloġiċi saru b'mod indipendenti.

Fig. 7|Attivitajiet in vivo kontra t-tumur ta' CAR-newtrofili kombinatorji u nanopartiċelli R-SiO2-TPZ (NPs) ġew ivvalutati permezz ta' injezzjoni ġol-vini. a Skematika ta' PBS, PB-newtrofili, CAR-newtrofili, u CAR-newtrophil@ R-SiO2-TPZ NPs mogħtija ġol-vini għal studju in vivo tal-qtil tat-tumur. Ċelloli U87MG li jesprimu luciferase (Luci) 5 × 105 ġew impjantati b'mod stereotattiku fil-forbrain tal-lemin tal-ġrieden NRG. Wara 4 ijiem, ġrieden ġew ittrattati ġol-vini b'newtrofili indikati kull ġimgħa għal xahar. Il-piż tat-tumur li jiddependi mill-ħin ġie ddeterminat (b) u kkwantifikat (c) permezz ta 'immaġini bijoluminixxenti (BLI) fil-jiem indikati. Id-dejta hija medja ± SD għall-ġrieden f'(b) (n=5), analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA). d Il-kurva ta' Kaplan-Meier li turi s-sopravivenza ta' gruppi sperimentali indikati (n=5) intweriet. Fattur tan-nekrożi tat-tumur uman rilaxxat- (TNF) u IL-6 fid-demm periferali (e) u l-piż tal-ġisem (f) ta 'gruppi differenti ta' ġrieden ġew imkejla fil-jiem indikati. Id-dejta hija medja ± SD, n=5 kampjuni bijoloġikament indipendenti. g, h Ġiet ivvalutata attività kontra t-tumur ta' frekwenzi ta' dożaġġ miżjuda ta' CAR-newtrofili u RSiO2-TPZ NPs. g Skematika ta' CAR-newtrofili amministrati ġol-vini, R-SiO2-TPZ NPs, u CAR-newtrophil@ R-SiO2-TPZ NPs għal studju in vivo tal-qtil tat-tumur. h Intweriet il-kurva Kaplan-Meier li turi s-sopravivenza tal-gruppi sperimentali indikati (n=5). Il-kurvi Kaplan-Meier ġew analizzati bit-test tal-log-rank. Id-dejta tas-sors hija pprovduta bħala fajl tad-dejta tas-sors.

Aħna ppreżentajna wkoll hawnhekk pjattaforma modulari u versatili ta 'twassil ta' drogi tan-newtrofili hPSC li tista 'tiġi mfassla mill-ġdid u rranġata fil-futur biex tappoġġja sforzi oħra bbażati fuq newtrofili biex jittrattaw mard uman ieħor. L-ewwel, l-inġinerija CAR hija aktar aċċessibbli fl-hPSCs milli fiċ-ċelloli T immuni primarji u n-newtrofili. Jeħtieġ biss editjar tal-ġenoma ta' darba biex tinkiseb espressjoni stabbli u omoġenja ta' diversi CARs29. Minbarra l-CLTX CARs, bnejna wkoll linji stabbli ta 'hPSC li jesprimu universali anti-fluorescein (FITC)51 jew anti-PD-L1 CAR52, li t-tnejn jistgħu jiġu sfruttati biex jiksbu newtrofili CAR-carrier tan-nanocarrier solidi universali li jimmiraw tumur. Modifiki ġenetiċi oħra, bħall-fibrożi li jimmiraw kontra l-FAP CARs53, jistgħu wkoll isiru biex jidderieġu n-nanocarriers tan-newtrofili biex jittrattaw mard deġenerattiv fatali, inkluż trawma fil-moħħ u fibrożi kardijaka. Barra minn hekk, hPSCs li jesprimu CAR jistgħu wkoll jiġu adattati faċilment biex jipproduċu ċelluli CAR-T jew CAR-NK29, u kombinazzjonijiet ta 'dawn l-immunoterapiji ma' nanocarriers CAR-newtrophil jistgħu jiksbu benefiċċji terapewtiċi ottimali kontra t-tumur. Fl-aħħarnett, is-sistema tan-nanodroga tan-nanodrug bijoinspirata tagħna (GSH) li tirreaġixxi hija pjattaforma modulari u versatili biex tgħabbi mediċini kimoterapewtiċi jew radjuattivi promettenti f'car-newtrofili għal twassil immirat tad-droga, kif muri minn TMZ kliniku, JNJ64619187, u TPZ pro-droga. Studji futuri dwar l-ittestjar ta 'nanopartiċelli oħra jistgħu jagħtu tagħbija ottimizzata tal-mediċina fin-newtrofili u jiksbu effikaċja terapewtika massima in vivo.

Filwaqt li wrejna l-kunċett terapewtiku li nużaw in-newtrofili CAR biex inwasslu b'mod speċifiku u effiċjenti kimo-drogi lil tumuri tal-moħħ madwar BBB, hemm ftit limitazzjonijiet f'dan l-istudju. L-ewwel, 4-jum it-tilqim taċ-ċelluli tat-tumur jista 'ma jkunx biżżejjed biex jistabbilixxi tumuri li jimitaw ix-xenarju kliniku għal investigazzjoni terapewtika, u ħidma futura b'perjodi differenti ta' tilqim tat-tumur hija meħtieġa biex tirrikapitola l-istadji differenti tal-iżvilupp tal-glioblastoma u r-rispons terapewtiku f'diversi pazjenti54,55. It-tieni, il-ġrieden immunodefiċjenti li użajna hawn m'għandhomx immunità adattiva, u mudelli prekliniċi oħra b'sistema immuni intatta, bħal klieb domestiċi bi glioma56 spontanju, huma meħtieġa biex jevalwaw aħjar is-sigurtà u l-effikaċja tan-newtrofili CAR prodotti in vitro. B'mod partikolari, il-profili tat-tossiċità off-mira ta' CAR-newtrofili bi jew mingħajr tagħbija ta' nano-drogi f'annimali infużi, inkluż is-sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini, newrotossiċità, u tossiċitajiet fuq il-mira off-tumur osservati fiċ-ċelloli CAR-T57, huma meħtieġa, minkejja l-ħajja qasira. tan-newtrofili. Filwaqt li approċċi fattibbli, bħall-inġinerija ta’ hPSCs ta’ donatur universali ipoimmunoġeniku58–61 u ta’ libreriji ta’ hPSC omozigoti tal-antiġen tal-leukoċiti umani (HLA)62, huma faċilment disponibbli biex jiġi evitat ir-riskju potenzjali ta’ mard tal-graft-versus-host (GvHD), mudelli ta’ annimali prekliniċi b’ sistema immuni intatta għadhom meħtieġa biex jiġi vvalutat il-potenzjal tat-traduzzjoni tat-terapewtiċi tan-newtrofili tagħna. Fl-aħħarnett, ġew osservati ċitotossiċità limitata kontra t-tumur u estensjoni tal-ħajja tal-annimali tat-terapewtiċi tan-nanofarmaċi newtrofili CAR. Għalhekk, l-esplorazzjoni futura ta 'mediċini ta' kimoterapija jew radjosensitizers aktar effettivi, u terapiji kombinatorji b'CAR-T klassika u risezzjoni kirurġika hija essenzjali biex tinkiseb effikaċja massima kontra t-tumur tat-terapewtiċi CAR-newtrofili. Pereżempju, studju reċenti dwar disinn ibbażat fuq mekkaniżmu wassal għal mediċina KL-50 aktar effettiva li tegħleb ir-reżistenza miksuba kif osservat fil-mediċina TMZ klinika63 u għalhekk tista' tiġi inkorporata fil-pjattaforma modulari tagħna tan-nanofarmaċi newtrofili CAR għal potenzjalment. effikaċja terapewtika aħjar. L-estensjoni tal-ħajja fuq l-ixkaffa tan-newtrofili għal 5 ijiem permezz ta’ trattament ta’ CLON-G (caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inibizzjoni flimkien ma’ fattur li jistimula l-kolonja tal-granulocyte64) u/jew l-użu ta’ sistema ta’ rilaxx ta’ mediċina kkontrollata għal żmien itwal fin-CAR-newtrofili tista’ wkoll tikseb effikaċja sostnuta in vivo kontra t-tumur wara apoptożi tan-newtrofili. B'mod kollettiv, is-sejbiet tagħna wrew biċ-ċar li n-newtrofili CAR mgħobbija R-SiO2-TPZ jistgħu jsostnu l-fenotip N1 kontra t-tumur u joqtlu b'mod effiċjenti ċ-ċelluli tat-tumur taħt diversi kundizzjonijiet simili ta' tumur in vitro. In-newtrofili CAR funzjonali jistgħu wkoll jiġu prodotti fi kwantitajiet kbar minn hPSCs inġinerija biex iwasslu b'mod preċiż nano mediċini li jirrispondu għall-mikroambjent tat-tumur biex jimmiraw il-GBM in vivo, li jwasslu għal kimoimmunoterapija kombinatorja b'attivitajiet anti-GBM robusti u speċifiċi u twassil minimu ta' mediċina mhux fil-mira li ħajja fit-tul fil-ġrieden li jġorru t-tumur.

Referenzi

1. Yang F. et al. Immunoterapija sinerġistika tal-glioblastoma b'mira doppja ta' IL-6 u CD40. Nat. Komun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. L-istat attwali tal-immunoterapija għall-glioblastoma. Nat. Dun Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Il-kunsinna intratumorali ta' IL-12 tagħti s-setgħa lill-immunoterapija taċ-ċelluli CAR-T f'mudell pre-kliniku ta' glijoblastoma. Nat. Komun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils bħala miri terapewtiċi emerġenti. Nat. Dun Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophils bħala mira terapewtika emerġenti u għodda għat-terapija tal-kanċer. Ħajja Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-analiżi tal-kunsinna ta 'nanopartiċelli għal tumuri bl-użu ta' mudellar u simulazzjoni farmakokinetiċi bbażati fiżjoloġikament. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Analiżi tal-kunsinna ta 'nanopartiċelli għal tumuri. Nat. Dun Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Twassil ta 'mediċina kontra l-kanċer medjat minn newtrofili għat-trażżin ta' rikorrenza ta 'glijoma malinna wara l-operazzjoni. Nat. Nanoteknoloġija. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Traċċar tal-immaġini MR ta 'newtrofili ta' inġinerija attivabbli bl-infjammazzjoni għal terapija mmirata ta 'glijoma kkurata kirurġikament. Nat. Komun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Il-priming ta 'fotosensibilizzazzjoni ta' mikroambjenti tat-tumur itejjeb il-kunsinna ta 'nanoterapewtiċi permezz ta' infiltrazzjoni ta 'newtrofili. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Terapija tal-kanċer: Traffiku tan-newtrofili fin-nanodrogi tal-kanċer. Nat. Nanoteknoloġija. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Rwoli ta 'newtrofili fil-glijoma u metastasi tal-moħħ. Quddiem. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polarizzazzjoni tal-fenotip tan-newtrofili assoċjati mat-tumur minn TGF-beta: "N1" kontra "N2" TAN. Ċellula tal-Kanċer (2009).

14. Blaisdell, A. et al. In-newtrofili jopponu l-karċinoġenesi epiteljali tal-utru permezz tad-debridement taċ-ċelloli tat-tumur ipossiċi. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Is-serħan tal-ipoksja tat-tumur joħroġ il-potenzjal tumuriċida tan-newtrofili. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. In-newtrofili polimorfonukleari umani jirrikonoxxu u joqtlu b'mod speċifiku ċ-ċelloli tal-kanċer. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Id-diversità tan-newtrofili u l-plastiċità fil-progressjoni u t-terapija tat-tumur. Nat. Dun Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Progress tar-riċerka dwar iċ-ċelloli staminali tal-glijoma fil-mikroambjent immuni tal-glijoma. Quddiem. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Mikroambjent immuni tal-gliomi. Lab. Investig. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Plastiċità taċ-ċelluli tat-tumur, eteroġeneità u reżistenza f'niċeċ mikroambjentali kruċjali fil-glijoma. Nat. Komun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Immunoterapiji emerġenti għal glijoma malinna: Mill-immunoġenomika għat-terapija taċ-ċelluli. Newro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Ferroptożi indotta minn newtrofili tippromwovi nekrożi tat-tumur fil-progressjoni tal-glioblastoma. Nat. Komun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Diversità fenotipika u plastiċità f'sottopopolazzjonijiet newtrofili li jiċċirkolaw fil-kanċer. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Ċelloli killer naturali derivati ​​mill-iPSC tal-Bniedem maħdumin b'riċetturi tal-antiġeni kimeriċi jtejbu l-attività kontra t-tumur. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Ċelloli CAR T immirati b'Interleukin-13 mutanti b'affinità għolja jtejbu l-kunsinna ta' nanopartiċelli fluworexxenti bijodegradabbli li jistgħu jiġu kklikkjati lill-glioblastoma. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Sistema ġdida ta’ twassil tal-ligand biex tivviżwalizza b’mod mhux invażiv u tisfrutta terapewtikament il-bijomarkatur IL13R 2 ristrett għat-tumur. Newro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Ċelloli CAR T diretti mill-klorotossina għal immirar speċifiku u effettiv tal-glioblastoma. Sci. Transl. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Ċitoliżi speċifika għall-antiġen minn newtrofili u ċelluli NK li jesprimu riċetturi immuni kimeriċi li jkollhom dominji ta' sinjalazzjoni zeta jew gamma. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Inġinerija ta 'newtrofili tar-riċettur ta' l-antiġenu kimeriku minn ċelloli staminali pluripotenti umani għal immunoterapija mmirata tal-kanċer. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. In-newtrofili preferenzjali phagocytose partiċelli tawwalija opportunità għal mira selettiva f'mard infjammatorju akut. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Espressjoni, rwol, u regolazzjoni ta 'riċetturi Fc newtrofili. Quddiem. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Importanza tar-riċettur fc -katina ITAM Tyrosines fl-attivazzjoni tan-newtrofili u l-artrite awtoimmuni in vivo. Quddiem. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Rwol ta' forom polimorfiċi newtrofili Fc RIIa (CD32) u Fc RIIIb (CD16) fil-fagoċitosi ta' batterji u eritroċiti opsonizzati IgG1- u IgG3-umani. Trasfus. Med. Rev https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Ir-riċetturi tan-newtrofili Fc tal-bniedem jibdew u għandhom rwoli speċjalizzati mhux redundant f'mard infjammatorju medjat minn antikorpi. Immunità. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Ġenerazzjoni definita kimikament ta 'endotelju emoġeniku uman u ċelloli proġenitriċi ematopojetiċi definittivi. Bijomaterjali 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Ġenerazzjoni effettiva u rapida ta' newtrofili funzjonali minn ċelloli staminali pluripotenti indotti bl-użu ta' mRNA modifikat ETV2-. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Ir-rwol tal-ipoksja fil-mikroambjent tat-tumur u l-iżvilupp taċ-ċelluli staminali tal-kanċer: approċċ ġdid għall-iżvilupp tat-trattament. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Impatt tal-mikroambjent tat-tumur iposiku u l-plastiċità taċ-ċelluli tat-tumur fuq l-espressjoni tal-punti ta 'kontroll immuni. Kanċer Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Rwol ta 'proteina-tyrosine kinase Syk fis-sinjalar ta' stress ossidattiv fiċ-ċelloli B. Antiossidanti Sinjal Redox. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS u sinjalazzjoni ċellulari medjata minn ROS. Oxidat. Med. Ċellula. Lonġevità. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Mogħdija ta' attivazzjoni ta' Ras dipendenti fuq il-fosforilazzjoni Syk ta' protein kinase C. Proc. Natl. Acad. Sci. L-ISTATI UNITI. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ The SYK tyrosine kinase: Attur kruċjali f'funzjonijiet bijoloġiċi diversi. Nat. Dun Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Nanokompost li jirrispondu għat-tumur-mikroambjent għall-gass ta 'sulfid ta' l-idroġenu u Terapija dinamika ta 'enżimi msaħħa bi trimodali. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mekkaniżmi ta 'attivazzjoni ta' NADPH oxidase u reżistenza batterjali. Quddiem. Ċellula. Infetta. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. In-newtrofili jippermettu kunsinna ta' liposomi lokali u mhux invażivi lill-muskolu skeletriku infjammat u lill-qalb iskemika. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Sommarju tal-approvazzjoni tal-FDA: tocilizumab għat-trattament tas-sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini sever jew ta 'theddida għall-ħajja indott miċ-ċelluli T tar-riċettur tal-antiġen kimeriku. Onkologu 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini u newrotossiċità assoċjata fl-immunoterapija tal-kanċer. Nat. Dun Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. In-newtrofili jippromwovu l-fenotip tal-glijoma malinna permezz ta 'S100A4. Clin. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Regolazzjoni speċifika taċ-ċelluli, dipendenti fuq l-attivazzjoni tal-funzjoni li torbot il-ligand CD32A tan-newtrofili. Demm https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Ċitotossiċità medjata minn riċetturi Fc umani għal IgG. Immunol. Illum. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Ir-regolamentazzjoni tat-tossiċità bħal sindromu tar-rilaxx taċ-ċitokini medjata minn ċelluli CAR T bl-użu ta' adapters ta' piż molekulari baxx. Nat. Komun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Riċettur ġdid ta' antiġenu kimeriku li fih dominju ta' sinjalar JAK-STAT jimmedja effetti antitumorali superjuri. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Timmira tal-fibrożi kardijaka b'ċelluli T inġinerija. Natura. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-ċelluli NK speċifiċi għal terapija mmirata tal-glioblastoma. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. Ċelloli CAR T għal tumuri tal-moħħ: Lezzjonijiet mitgħallma u t-triq 'il quddiem. Immunol. Rev https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Dejta dwar is-sigurtà u s-sopravivenza interim wara l-amministrazzjoni intrakranjali ta' M032, HSV-1 onkolitiku maħdum ġenetikament li jesprimi IL-12, fi klieb domestiċi bi glijomi sporadiċi. Neurosurg. Focus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Avvanzi u skoperti riċenti fil-mekkaniżmi u l-funzjonijiet taċ-ċelloli CAR T. Nat. Dun Kanċer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Ġenerazzjoni ta 'ċelluli T ipoimmunoġeniċi minn ċelluli staminali pluripotenti indotti mill-bniedem alloġeniċi ta' inġinerija ġenetika. Nat. Biomed. Inġ. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Derivattivi ipoimmunoġeniċi ta 'ċelloli staminali pluripotenti indotti jevadu r-rifjut immuni f'riċevituri alloġeniċi kompletament immunokompetenti. Nat. Bijoteknoloġija. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Ġenerazzjoni ta 'ċelluli staminali pluripotenti umani ipoimmunoġeniċi. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. L-editjar tal-ġenoma HLA DR b'TALENs f'iPSCs tal-bniedem ipproduċa ċelluli dendritiċi immunotolleranti. Ċelloli Stem Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. It-tqabbil tal-MHC itejjeb it-tilqim ta' newroni derivati ​​mill-iPSC fil-primati mhux umani. Nat. Komun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Disinn ibbażat fuq mekkaniżmu ta 'aġenti li jimmiraw b'mod selettiv glijoma reżistenti għall-mediċina. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. L-immirar ta' mogħdijiet ta' mewt taċ-ċelluli multipli jestendi l-ħajja fuq l-ixkaffa u jippreserva l-funzjoni tan-newtrofili tal-bniedem u tal-ġrieden għat-trasfużjoni. Sci. Transl. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Indikaturi fluworexxenti għal rappurtar kontinwu u speċifiku għan-nisel tal-fażijiet taċ-ċiklu taċ-ċelluli f'ċelloli staminali pluripotenti umani. Bijoteknoloġija. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Ġenerazzjoni definita kimikament ta' ċelloli staminali ematopojetiċi u proġenitriċi umani definittivi. STAR Protoc. 4, 101953 (2023).