Vaċċin tal-MRNA Iqanqal Rispons Immuni Antitumur dipendenti fuq STING

Astratt

Vaċċini RNA fformulati bil-lipidi intużaw ħafna għall-prevenzjoni u t-trattament tal-mard, iżda l-mekkaniżmu ta 'azzjoni tagħhom u l-komponenti individwali li jikkontribwixxu għal azzjonijiet bħal dawn għad iridu jiġu delineati. Hawnhekk, aħna nuru li vaċċin terapewtiku tal-kanċer magħmul minn qalba ta 'protamine/mRNA u qoxra tal-lipidi huwa qawwi ħafna fil-promozzjoni tar-risponsi taċ-ċelluli T ċitotossiċi CD8þ u l-medjazzjoni tal-immunità kontra t-tumur. B'mod mekkaniku, kemm il-qalba tal-mRNA kif ukoll il-qoxra tal-lipidi huma meħtieġa biex jistimulaw bis-sħiħ l-espressjoni ta 'interferons tat-tip I u ċitokini infjammatorji fiċ-ċelloli dendritiċi. L-istimulazzjoni tal-espressjoni tal-interferon-b hija esklussivament dipendenti fuq STING, u l-attività antitumorali mill-vaċċin tal-mRNA hija kompromessa b'mod sinifikanti fil-ġrieden b'ġene Sting difettuż. Għalhekk, il-vaċċin mRNA jqajjem immunità kontra t-tumur dipendenti fuq STING.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

1. Introduzzjoni

L-iżvilupp rapidu u l-applikazzjoni dinjija tal-vaċċini tal-mRNA għall-prevenzjoni tal-infezzjoni tas-SARS-CoV-2 urew il-qawwa tal-mediċini bbażati fuq l-mRNA fil-kura tas-saħħa1,2. Minħabba l-piż molekulari kbir u l-ħlas negattiv tagħhom, il-molekuli tal-mRNA jeħtieġ li jiġu ppakkjati f'vetturi tal-kunsinna sabiex jidħlu b'mod effettiv fiċ-ċelloli tal-mammiferi. L-ippakkjar fil-vetturi tal-kunsinna ta 'daqs nanometru għandu wkoll il-benefiċċju li jipproteġi l-molekuli tal-mRNA mid-degradazzjoni enżimatika. Ġew żviluppati pjattaformi ta' konsenja multipli biex ikunu adattati għall-iskop, bħal nanopartiċelli tal-lipidi4, lipo polyplex (LPP)5, liposome-protamine-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7, u partiċelli tal-vaċċin bħal virus (VLVP). )8. Filwaqt li kull pjattaforma għandha l-istruttura u l-kompożizzjoni unika tagħha, il-biċċa l-kbira tal-vetturi fihom molekula tal-lipidi joniċi li tiffaċilita l-ippakkjar tal-mRNA u l-ħarba tal-molekuli tal-mRNA mill-endosomi. Bis-suċċess tal-vaċċini profilattiċi, hemm realizzazzjoni ġenerali li t-terapewtiċi tal-mRNA jistgħu jintużaw biex jittrattaw forsi l-aktar jekk mhux kollha, it-tipi ta 'mard9e12. Tabilħaqq, vaċċini terapewtiċi tal-kanċer ibbażati fuq l-mRNA ġew studjati għal ħafna snin13,14. Avvanzi riċenti fil-provi kliniċi wrew ukoll il-potenzjal ta' applikazzjoni tagħhom f'pazjenti magħżula bil-kanċer15e17. B'differenza vaċċini tal-kanċer tal-peptidi li huma ppreparati b'molekuli awżiljarji18e20, il-partiċelli tal-vaċċin tal-mRNA jistgħu jservu wkoll bħala awto-adjuvanti21.

Pereżempju, vaċċin tal-kanċer ibbażat fuq l-mRNA b'żewġ komponenti li fih mRNA kumpless b'xejn u protamina jista 'wkoll jattiva s-sinjalar tar-riċettur 7 (TLR7) li jixbaħ il-pedaġġ22. Madankollu, bit-tħassib dejjem jikber dwar it-tossiċità immuni innata akuta mill-mRNA mikxufa, il-biċċa l-kbira tal-investigaturi u l-kumpaniji qed jużaw RNA modifikat biex jevitaw ir-rikonoxximent intrinsiku mit-TLRs23. Konsegwentement, il-komponenti tal-lipidi qed ikollhom rwol importanti fit-titjib tal-attività awżiljarja fil-partiċelli tal-vaċċin tal-mRNA, preferenzjali billi jattivaw is-sinjalar mhux TLR. Żvela studju reċenti dwar l-RNA-LPX ifformulat bil-lipidi, iċċarġjat b'mod negattiv ikkostitwit b'1,2- di-octadecenyl-3-trimetilammonju (DOTMA, lipidu katjoniku)/dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE, a helper lipid) liposoma attivazzjoni tal-assi tal-antagonist tar-riċettur tal-interleukin 1 (IL1)-interleukin 1 (IL-1ra) fir-regolazzjoni tas-sekrezzjoni ta 'ċitokini proinfjammatorji, u r-rwol essenzjali tal-attivazzjoni tal-mogħdija tal-infjammazzjoni f'żewġ stadji fil-monoċiti24. Interessanti, investigazzjoni reċenti oħra dwar il-BNT162b2 ibbażat fuq LNP ippreparat b'ALC-0315 (lipidu jonizzat), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolina (DSPC, lipidu helper) , polyethylene glycol-2000-N, N-di tetradecyl acetamide (PEG{2000-DTA), u kolesterol urew ir-rwol ewlieni li jattivaw is-sinjalar MDA5 dipendenti fuq l-interferon tat-tip I, iżda mhux TLRs jew inflammasome, fl-istimulazzjoni tat-tnejn. immunità intrinsika u adattiva tal-vaċċin COVID-1925. Dawn l-istudji jindikaw il-possibbiltà li pjattaformi tal-kunsinna magħmula minn molekuli tal-lipidi varjabbli jistgħu jiddependu fuq mogħdijiet differenti tat-trasduzzjoni tas-sinjali għall-attività tal-vaċċin. Għalhekk, huwa importanti li tiġi investigata bis-sħiħ il-funzjoni tal-molekuli ewlenin u l-kombinazzjonijiet tagħhom sabiex ittejjeb aktar it-terapewtika tal-mRNA.

Fl-istudju attwali, waqqafna esperimenti biex jiddissezzjona r-rwol funzjonali ta 'komponenti individwali f'vaċċin terapewtiku tal-kanċer. Il-partiċella tal-vaċċin tal-mRNA (MVP) hija magħmula minn qalba ta 'protamine/mRNA li hija inkapsulata f'qoxra tal-lipidi li tikkonsisti f'lipidu katjoniku, lipidu helper, lipidu pegilat, u kolesterol (Fig. 1A). Intwera li l-inklużjoni ta’ lipid iċċarġjat tista’ tiffaċilita l-kunsinna mmirata ta’ RNA26, u dioleoylethyl phosphatidylcholine (EDOPC) u dioleoyl-3- trimethylammonium propane (DOTAP) huma tnejn mil-lipidi katjoniċi li ġew ittestjati għal dan il-għan5,27. Aħna eżaminajna l-istimulazzjoni tal-espressjoni tal-interferon-b (IFN-b), IL{7}b, u l-fattur tan-nekrożi tat-tumur-a (TNF-a) mill-qalba tal-mRNA, vettura ħielsa mill-mRNA, u l-MVP kollu, u ikkorrelataw attivitajiet bħal dawn mat-TLR7, sinjalazzjoni antivirali mitokondrijali (MAVS, magħrufa wkoll bħala IPS-1), stimulatur tal-ġeni IFN (STING), u adapter li fih id-dominju TIR li jinduċi sinjalazzjoni IFN-b (TRIF). Sussegwentement, investigajna r-rwol tal-protamina fil-qalba u l-lipidi katjoniċi fil-qoxra fl-istimulazzjoni tal-espressjoni ta 'IFN-b u TNF-a. Fl-aħħarnett, qabbilna r-risponsi immuni kontra t-tumur mill-MVP fi ġrieden tat-tip selvaġġ u knockout tal-ġeni.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

2. Materjali u metodi

2.1. Materjali

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N- [amino(polyethylene glycol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (850375) inxtraw minn Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, l-Istati Uniti). Il-kolesterol (C8667) inkiseb minn Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Ir-reaġenti ġew maħlula fl-etanol f'konċentrazzjoni ta '2 mg/mL għal DSPE-PEG2k, 10 mg/mL għall-kolesterol u DOPC, u 20 mg/mL għal EDOPC, DOPE, u DOTAP, rispettivament. Protamine sulfate (P4020) inkiseb minn Sigma Aldrich. Il-molekuli tal-mRNA li jikkodifikaw l-ovalbumina (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201), u luciferase (Luc-mRNA) (L{-7204) inxtraw mingħand TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, l-Istati Uniti). Ilma mingħajr RNase (W0805-010) inkiseb minn GeneDEPOT (Baker, TX, USA). L-agonist TLR7 imiquimod (tlrimq) u l-agonist Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) kienu prodotti minn Invivogen (San Diego, CA, USA). Lipofectamine 2000 (11668019) u Quant-iT™ RiboGreen™ RNA assay kit (R11490) inxtraw minn Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Ġurdien rikombinanti GM-CSF (554586) inxtara minn BD Biosciences (San Diego, CA, USA). 500 Cocktail inibitur tat-trasportatur tal-proteini (00-4980-93) kien prodott minn Invitrogen. Cytofix/Cytoperm kit (AB_2869010) inxtara minn BD Biosciences. EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) inkiseb minn STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). L-antikorpi li ġejjin ġew akkwistati minn BioLegend (San Diego, CA, USA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) u anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643), u anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979), u anti-IFN-g-PE (554412) kienu minn BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) inxtara minn ImmuDex (Fairfax, VA, USA). Kits ELISA għal IL-1b (EM2IL1B) u TNF-a (BMS607-3) inxtraw minn Invitrogen, u kits ELISA għal CCL5 (DY478) u IFN-b (DY8234) inkisbu minn R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, USA). Antikorpi għall-analiżi Western blot inklużi anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antiphospho-TBK1 (5483), anti-b-actin (4970), u anti-GAPDH (5174) inxtraw minn Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Figura 1 Preparazzjoni u karatterizzazzjoni ta 'partiċelli mRNA. (A) Veduta skematika tal-preparazzjoni tal-partiċelli tal-vaċċin. (B) L-elettroforesi tal-ġel tal-agarose turi li l-molekuli tal-mRNA inżammu fil-bir tal-kampjun tat-tagħbija f'kampjuni ppreparati b'mRNA/protamine fi proporzjon ta '1:1 sa 1:2. (CeF) Karatterizzazzjoni ta 'partiċelli tal-vaċċin mRNA (MVPs) ibbażata fuq perċentwali ta' inkapsulament, indiċi ta 'polydispersity, potenzjal zeta, u daqs. (G) Immaġini TEM rappreżentattivi ta 'partiċelli MVP2, bar tal-iskala Z 50 nm. (H) Perċentwal ta 'espressjoni ta' eGFP wara li ċ-ċelloli DC2.4 ġew ittrattati b'eGFP-MVPs għal 16-il siegħa. (I) Immaġini fluworexxenti ta 'ċelluli DC2.4 li jesprimu l-eGFP, bar tal-iskala Z 400 mm. (J) Analiżi kwantitattiva fuq il-bijoluminixxenza f'BMDCs ittrattati b'MVPs inkapsulati b'mRNA li jikkodifika luciferase għal 16-il siegħa. (K) Bidliet fil-vijabbiltà tal-BMDCs ittrattati b'PBS, vettura ħielsa mill-mRNA, qalba mRNA/protamine, jew MVP2 inkapsulat bl-mRNA. Il-konċentrazzjonijiet tat-trattament kienu ekwivalenti għal mRNA. Id-dejta hija ppreżentata bħala SEM medju (n Z 3). *P <0.05; **P < 0.01.

2.2. Linji taċ-ċelluli u kultura taċ-ċelluli

Il-linja taċ-ċelluli dendritiċi murini DC2.4 inkisbet minn ATCC (Manassas, VA, USA), u ġiet ikkultivata f'RPMI-1640 li kien fih 10% serum bovin tal-fetu (FBS) u 1% penicillin-streptomycin. Il-linja taċ-ċelluli tal-melanoma murina B16-OVA ġiet akkwistata minn Dr Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, USA). Iċ-ċelloli B16-OVA ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'10% FBS u 1% penicillin-streptomycin. Il-linja taċ-ċelluli tal-adenokarċinoma tal-kolon murini MC38 inxtrat minn ATCC. Iċ-ċelloli ġew maħduma b'espressjoni OVA u ġew ikkultivati ​​f'DMEM b'10% FBS u 1% penicillin-streptomycin. Il-kultura taċ-ċelluli nżammet f'37 C b'5% CO2.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

2.3. Preparazzjoni tal-partiċelli tal-vaċċin tal-mRNA

Il-partiċelli kollha tal-vaċċin tal-mRNA ġew ippreparati bl-użu tal-istrument mikrofluwidi NanoAssemblr Benchtop minn Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) billi tħallat il-fażi organika u l-fażi milwiema. Biex tipprepara l-fażi organika, EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), kolesterol (10 mg/mL), u bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) ġew maħlula fl-etanol u mħallta f'34. :30:35:1 M proporzjon b'rata ta 'fluss ta' 9 mL/min. Biex tipprepara l-qalba tal-mRNA tal-fażi milwiema, mRNA tħallat ma 'sulfat ta' protamine f'1:1 (w/w) fl-istrument mikrofluwidiku b'rata ta 'fluss ta' 9 mL/min. Wara 20 min inkubazzjoni f'20 C, il-qalba tal-mRNA tal-fażi milwiema tħallat mal-fażi organika biex tiġġenera partiċelli tal-vaċċin tal-mRNA. Wara 20 minuta, is-sospensjoni tal-partiċelli tal-vaċċin ġiet trasferita f'filtru ultra ċentrifugali Amicon (MWCO 30 kDa), u 9-ilma ta 'grad molekulari ta' volum ġie miżjud biex iddilwixxi l-konċentrazzjoni tal-etanol minn 25% għal 2.5%. Is-sospensjoni tal-partiċelli mbagħad ġiet ikkonċentrata permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) f'4 C. Ġie miżjud volum ugwali ta' 2 PBS mal-prodott ikkonċentrat biex taġġusta l-pressjoni osmotika.

2.4. Assaġġ ta' ritardazzjoni tal-ġel

Il-qalba tal-mRNA/protamine ġiet analizzata l-ewwel b'ritardazzjoni tal-ġel. Fil-qosor, il-qalba ta' mRNA/protamine li fiha 0.5 mg ta' mRNA ġiet mgħobbija fil-bir ta' ġel agarose ta' 1% f'soluzzjoni TBE 1 u saret elettroforeżi f'120 V għal 30 min (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). Il-meded ta 'RNA ġew imtebba' b'Gelred (Biotium, Hayward, CA) u nstabu b'sistema GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Karatterizzazzjoni ta 'partiċelli ta' vaċċin mRNA

Id-distribuzzjoni tad-daqs u l-potenzjal ta 'zeta tkejlu b'Zetasizer tat-tifrix tad-dawl dinamiku (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Ir-rata ta' inkapsulament ġiet iddeterminata bl-użu ta' kit ta' analiżi Quant-iT™ RiboGreen™ RNA. Fil-qosor, kampjun ta' partiċelli ta' vaċċin li kien fih 0.5 mg ta' mRNA ġie dilwit b'buffer TriseEDTA (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.5) bi jew mingħajr 2% Triton-X100 f'{ {10}}pjanċa tal-bir. Wara 10 min ta 'inkubazzjoni f'37 C, RiboGreen ġie miżjud f'kull bir, u l-intensità fluworexxenti ġiet imkejla. L-effiċjenza tal-inkapsulament ġiet ikkalkulata kif muri fl-Eq. (1): Il-mikroskopija elettronika tat-trażmissjoni (TEM) tal-partiċelli tal-vaċċin saret wara proċedura deskritta qabel9.

2.6. Annimali

L-operazzjonijiet kollha ta 'l-annimali ġew approvati mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu ta' l-Annimali ta 'Houston Methodist Hospital (numru tal-protokoll AUP06200042). Il-ġrieden kienu miżmuma f'ambjent li ssodisfa kompletament l-istandards regolatorji tal-Istitut Nazzjonali tas-Saħħa u l-istandards tal-Assoċjazzjoni Amerikana tal-Kura tal-Annimali tal-Laboratorju. Ġrieden C57BL/6J tat-tip selvaġġ u ġrieden ta 'inġinerija ġenetika inklużi Tlr7 /, Sting /, Mavs /, u Trif / ġrieden inxtraw minn Jackson Laboratory.

2.7. Ġenerazzjoni ta' ċelluli dendritiċi derivati ​​mill-mudullun tal-ġrieden (BMDCs)

Iċ-ċelluli tal-mudullun ġew imlaħlaħ mill-wirk u t-tibja b'RPMI 1640 komplut. Iċ-ċelluli ħomor tad-demm ġew lisati b'buffer ta' liżi ACK, u ċelluli immaturi tal-mudullun ġew ikkultivati ​​f'RPMI 1640 supplimentat b'20 ng/mL GM-CSF murina rikombinanti għal 10 jiem f'37 C b'5% CO2. Il-medju tal-kultura taċ-ċelluli ġie aggornat fil-Ġranet 3, 6, u 8, u ċelloli dendritiċi mhux aderenti nġabru f'Jum 10.

2.8. Kejl ta 'ċitokini u chemokines

Il-BMDCs inżergħu fi pjanċa ta' 24-bir b'densità ta' 5  105 ċelluli/bir. Wara siegħa ta' settlement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'partiċelli jew kontrolli ta' vaċċin ta' 1 mg/mL imiquimod, 20 mg/mL 20 30 -cGAMP, (ekwivalenti ta' 1 mg/mL mRNA). Il-midja tal-kultura taċ-ċelluli nġabret 24 siegħa wara, u l-livelli ta 'TNF-a, CCL5, IFN-b, u IL-1b ġew imkejla bl-użu ta' kits ta 'assaġġ immunosorbenti marbut ma' enżimi (ELISA) billi ssegwi proċeduri ssuġġeriti mill-manifattur.

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

2.9. Analiżi dwar trasfezzjoni DC, maturazzjoni DC, u stimulazzjoni

Biex tanalizza l-effiċjenza tat-trasfezzjoni tad-DC in vitro, iċ-ċelluli DC2.4 ġew miżrugħa f'2.5 105 ċelluli/bir fi 24-pjanċa tal-bir. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'partiċelli inkapsulati bl-mRNA li jikkodifikaw l-eGFP jew luciferase f'konċentrazzjoni finali ta '1 mg mRNA/mL. Iċ-ċelloli nħasdu 24 siegħa wara, inħaslu b'2% FBS f'soluzzjoni PBS, u mbagħad ġew sospiżi mill-ġdid fl-istess soluzzjoni qabel ma ġew applikati għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss b'ċitometru tal-fluss BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Biex titkejjel il-maturazzjoni tad-DC u l-preżentazzjoni tal-antiġenu in vitro, il-BMDCs ġew miżrugħa f'2.5  105 ċelluli/bir fi 24-pjanċa bir-bir u ttrattati b'1 mg/mL OVA-MVP għal 24 siegħa. Il-BMDCs kienu mtebbgħin għal 30 minuta b'antikorpi speċifiċi għal CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80, u CD86 għall-maturazzjoni DC, u anti-H-2Kb (SIINFEKL) għall-preżentazzjoni tal-antiġen. Biex tiġi ddeterminata l-qawwa stimulanti in vivo, il-ġrieden C57BL/6J ġew imlaqqma darba b'10 mg ta 'OVA-MVP għal kull ġurdien fil-footpad, u LNs popliteali li jbattu nħasdu 24, 48 u markaturi tal-wiċċ taċ-ċelluli li ġejjin: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss fuq l-attivazzjoni u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli T

Biex titkejjel l-attivazzjoni taċ-ċelluli T in vivo, il-ġrieden ġew imlaqqma darba b'10 mg ta 'OVA-MVP, u LNs popliteali ġew iżolati f'24 jew 48 siegħa. Iċ-ċelloli T kienu mtebbgħin bl-antikorpi li ġejjin: CD45, CD3, CD4, CD8, u CD69. Biex jinstabu ċelluli T speċifiċi għall-antiġen, inġabru 5 ijiem wara t-tieni tilqim, tumuri, milsa u lymph nodes popliteali. It-tessuti ġew ipproċessati biex jiġġeneraw sospensjonijiet b'ċellula waħda, u ċ-ċelluli ġew imtebba' b'antikorpi speċifiċi għaċ-ċelluli T u dextramer OVA257e264-MHCI wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Biex jitkejjel il-livell intraċellulari ta' IFN-g, 2  106 splenoċiti jew ċelloli iżolati minn LNs popliteali u tumuri ġew stimulati b'10 mg/mL OVA257e264 peptide f'medja RPMI 1640 kompluta supplimentata b'55 mmol/L b-mercaptoethanol u inibitur ta' trasportatur tal-proteini 1 cocktail għal 18-il siegħa. Iċ-ċelloli ġew maħsuda u mtebbgħin b'antikorpi speċifiċi għaċ-ċelluli T. Wara l-iffissar u l-permeabilizzazzjoni b'kit Cytofix/Cytoperm, iċ-ċelloli ġew imtebba 'b'antikorp anti-IFN-g u applikati għall-analiżi fuq ċitometru tal-fluss BD LSR II (BD Biosciences). Biex titkejjel il-proliferazzjoni taċ-ċelluli T, iċ-ċelluli T ġew iżolati mill-milsa tal-ġrieden transġeniċi OT-I bl-użu ta 'kit ta' iżolament taċ-ċelluli T tal-ġurdien. Kienu mtebbgħin b'1 mmol/L CFSE f'RPMI 1640 li fih 200 mg/mL BSA għal 10 min f'37 C. Ċelloli T ittikkettjati CFSE ġew maħsula darbtejn b'5 volumi ta' RPMI 1640 komplut kiesaħ. Sadanittant, BMDCs maturi ġew ittrattati b' 2 mg/mL OVA mRNA-inkapsulat MVP għal 24 siegħa qabel l-iżolament taċ-ċelluli T. Ladarba ċ-ċelluli T kienu lesti, BMDCs u ċelluli T ġew ko-kultivati ​​fi proporzjon ta '1: 5 (DC: T) għal 72 siegħa. Iċ-ċelloli nġabru u mtebbgħin b'antikorpi tal-wiċċ għaċ-ċelloli T, il-proliferazzjoni ġiet ittestjata bl-użu ta 'ċitometru tal-fluss BD LSR II (BD Biosciences) u analizzat. Ir-riżultati kollha taċ-ċitometrija tal-fluss ġew analizzati bis-softwer FlowJo v10 (Ashland, OH, USA).

2.11. It-traċċar tal-espressjoni tal-proteini fil-ġrieden ħajjin

Ġrieden BALB/c ġew ittrattati b'injezzjoni ġol-footpad b'10 mg ta 'MVP inkapsulat f'mRNA Luc. Ġew injettati intraperitonealment bi 30 mg ta’ RediJect D-luciferin għal kull ġurdien 6, 12, 24, jew 48 siegħa wara, u l-bijoluminixxenza ġiet imkejla bis-sistema ta’ immaġini Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, l-Istati Uniti).

2.12. Assaġġ ELISpot

Il-pjanċi tal-filtri IP tlaħlaħ minn qabel b'50 mL ta' 35% etanol u maħsula sewwa 3 darbiet b'PBS qabel ma l-etanol evapora. Il-pjanċi ġew sussegwentement miksija b'antikorpi ta 'qbid anti-IFN-g f'4 C matul il-lejl. Il-pjanċi ġew imblukkati b'medja kompluta RPMI 1640 li fiha 55 mmol/L b-mercaptoethanol għal sagħtejn f'37 C. Ċelloli (1  105 splenocytes, 1  105 ċelluli minn popliteal LN) ġew miżrugħa f'kull bir, u stimulat għal 36 siegħa b'10 mg/mL OVA257e264 peptide. Il-midja ġiet mormija, u ċ-ċelloli ġew maħsula 4 darbiet b'PBST (PBS li fih 0.05% Tween 20) u darbtejn b'PBS. Wara l-ħasla finali, antikorp ta 'detezzjoni anti-IFN-g ġie miżjud u inkubat għal 2 sigħat f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Il-pjanċi ġew maħsula 4 darbiet b'PBST u darbtejn b'PBS, u avidin-HRP ġie miżjud u inkubati għal 45 minuta oħra f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Fl-aħħarnett, il-pjanċi ġew maħsula b'PBST u PBS għal darb'oħra kif deskritt hawn fuq, u 50 mL ta 'sottostrat AEC ġew applikati u osservati għal reazzjoni fuq il-post. Meta spots saru viżibbli, ir-reazzjoni twaqqfet billi twarrab is-sottostrat AEC u tlaħlaħ b'ilma distillat doppju 5 darbiet. Wara t-tnixxif bl-arja matul il-lejl, il-pjanċi ġew skennjati u analizzati bl-użu tal-CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, USA).

2.13. Analiżi Western blot

Inġabru BMDCs derivati ​​minn ġrieden tat-tip selvaġġ, Mavs KO jew Sting KO, u ċ-ċelloli ġew lisati f'buffer tal-liżi taċ-ċelluli RIPA supplimentat b'inibituri ta 'protease u phosphatase. Il-konċentrazzjoni tal-proteina f'lisat taċ-ċelluli kienet imkejla b'kitt tal-analiżi tal-proteina BCA. Kampjuni ta 'proteini ġew separati b'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) u ttrasferiti għal membrana ta' polyvinylidene difluoride (PVDF). L-espressjoni ta 'MAVS u STING ġiet skoperta wara li l-membrana ġiet inkubata b'antikorp anti-MAVS jew anti-STING f'dilwizzjoni 1:2000 segwita minn immunodetection b'SuperSignal West Pico u Femto Chemiluminexx Substrate. Biex titkejjel l-attivazzjoni tal-mogħdija STING, BMDCs derivati ​​minn ġrieden tat-tip selvaġġ ġew ittrattati b'MVP inkapsulat bl-mRNA ta 'vettura jew OVA f'konċentrazzjoni indikata għal 2 sigħat. Iċ-ċelloli ġew lysed u pproċedew għall-analiżi Western blot b'antikorpi anti-TBK1 u antiphospho-TBK1 f'dilwizzjoni 1:2000.

2.14. Assaġġ kontra t-tumur

Mudelli ta' tumuri tal-marieni ġew iġġenerati billi tlaqqmu 2  105 ċelluli B16-ċelluli tal-melanoma OVA jew 5  105 MC38-ċelluli OVA għal kull ġurdien taħt il-ġilda fil-ġenb tax-xellug ta' 6 sa {{5} }ġrieden femminili C57BL/6J ta’ ġimgħa. Il-ġrieden ġew allokati b'mod każwali fi gruppi ta 'trattament u ttrattati darbtejn separati b'7 ijiem b'10 mg ta' OVA MVP jew kontrolli fil-footpad. It-tkabbir tat-tumur kien immonitorjat kull jumejn. Il-volum tat-tumur ġie kkalkulat skont l-Eq. (2):

Ġrieden ġew ewtanizzati 5 ijiem wara t-tieni tilqim, u l-piż tat-tessuti tat-tumur ġie rreġistrat.

2.15. Analiżi statistika

Ir-riżultati kollha huma ppreżentati bħala SEM medju. L-istatistika ġiet evalwata b'test ANOVA f'direzzjoni waħda bl-użu tal-korrezzjoni ta 'Tukey għal paragun ta' gruppi multipli u test t ta 'żewġ denbu mhux imqabbla għal tqabbil ta' żewġ gruppi. Id-dejta ġiet analizzata bis-softwer GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 tqieset statistikament sinifikanti (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0.005;****P <0.001).

3. Riżultati

3.1. MVP jimmedja espressjoni robusta tal-mRNA fiċ-ċelloli dendritiċi (DC)

Ħejjejna partiċelli tal-vaċċin tal-qalba tal-qoxra f'approċċ mikro-fluwidi f'żewġ stadji (Fig. 1A), u evalwajna b'mod sistematiku komponenti individwali fin-nanopartiċelli biex tiġbor partiċella tal-vaċċin bi stabbiltà għolja, assorbiment ċellulari għoli, u potenzjal ta 'espressjoni għoli f'DCs. L-elettroforeżi tal-ġel uriet li qalba mRNA stabbli tista 'tiġi ffurmata ladarba l-proporzjon ta' mRNA-to-protamine kien f'1 jew inqas (Fig. 1B). Bl-użu tal-mRNA li jikkodifika eGFP bħala markatur surrogat, sibna li kompożizzjoni tal-lipidi bi proporzjon molari ta’ 34% EDOPC/30% DOPE/35% kolesterol/1% DSPEPEG2k ipprovdiet rata ta’ inkapsulament ideali u l-aħjar effiċjenza tal-espressjoni (Tabella 1, Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S1AeS1D). It-tibdil tal-proporzjon ta 'ċarġ ma biddilx b'mod sinifikanti r-rata ta' inkapsulament, l-indiċi tal-polydispersity, jew iċ-ċarġ tal-wiċċ tal-partiċelli (Tabella 2, Fig. 1CeE); madankollu, id-daqs tal-partiċelli li jirriżultaw kien bejn 70 u 80 nm fid-dijametru meta l-proporzjon kien bejn 12 u 16, meta mqabbel ma 'dijametru ta' 120e130 nm ladarba l-proporzjon waqa 'barra mill-medda (Fig. 1F u G). L-aħjar espressjoni ġiet skoperta fiċ-ċelloli DC2.4 ittrattati b'MVP2 li kellhom proporzjon ta 'ċarġ ta' 12 (Fig. 1H u I). Ġie osservat mudell simili meta partiċelli ġew ippreparati b'mRNA li tikkodifika luciferase, u ġiet skoperta espressjoni dipendenti fuq id-doża (Fig. 1J). Il-partiċelli mRNA-inkapsulati wrew stabbiltà mixtieqa peress li ma tilfu l-attività wara lijofilizzazzjoni jew iffriżar-tidwib (Fig. S1E u S1F). Barra minn hekk, ma kien hemm l-ebda ċitotossiċità wara li ċ-ċelluli dendritiċi derivati ​​mill-mudullun (BMDCs) ġew ittrattati bil-qalba tal-mRNA waħedha, partiċelli tal-vettura ppreparati mingħajr molekuli tal-mRNA, jew MVP2 li fihom mRNA (Fig. 1K). Għalhekk, MVP2 wera l-aħjar potenzjal ta 'espressjoni. Intuża għall-esperimenti ulterjuri kollha fl-istudju, u ttikkettjat bħala MVP fil-bqija tat-test. Il-partiċelli MVP jistgħu effettivament iwasslu molekuli mRNA in vivo, u ma kien hemm l-ebda tossiċità li tinkixef mill-MVP inkapsulat bl-mRNA ibbażat fuq bidliet fil-piż tal-ġisem (Fig. S1GeS1I).

3.2. MVP effettivament jinduċi preżentazzjoni ta 'antiġen u attivazzjoni taċ-ċelluli T in vitro u in vivo

Aħna ppreparati mRNA qalba, mRNA ħielsa mill-vettura, u OVA mRNA inkapsulat MVP, u applikathom biex jittestjaw il-maturazzjoni DC u l-preżentazzjoni antiġen (Fig. 2A). Il-BMDCs ittrattati b'MVP wrew espressjoni eċċessiva dipendenti mid-doża ta 'markaturi ta' maturazzjoni DC inklużi CD40, CD80, u CD 86 (Fig. 2BeD). It-trattament jew bil-vettura ħielsa mill-mRNA jew MVP inkapsulat bl-mRNA wassal għal espressjoni eċċessiva tal-MHC I (Fig. 2E), li jindika li l-effett kien assoċjat mal-vettura aktar milli mal-kumpless tal-mRNA. Barra minn hekk, it-trattament MVP irriżulta fil-wiri tal-wiċċ taċ-ċelluli tal-kumpless OVA257e264 tal-antiġen epitope-MHC I (SIINFEKL-MHC I) li ġie skopert b'antikorp anti-SIINFEKL-MHCI (Fig. 2F), li juri proċessar effettiv tal-antiġen u preżentazzjoni mill-BMDCs. . Barra minn hekk, ko-inkubazzjoni ta' BMDCs ittrattati b'MVP ma' B3Z, linja taċ-ċelluli T CD8þ li speċifikament għarfet l-epitopu OVA257e264, jew ċelluli T iżolati mill-milsa ta' ġurdien OT-I li esprimew ċellula T speċifika OVA257e264- riċettur, qajjem sekrezzjoni IL-2, riżultat mhux osservat fiċ-ċelluli T koinkubati ma 'DCs ittrattati b'vettura waħedha jew il-qalba tal-mRNA/protamine waħedha (Fig. 2G). L-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss sabet 32.5% ċelluli T CD8þ proliferattivi wara ko-inkubazzjoni ma 'MVP (Fig. 2H u I). Partiċelli MVP inkapsulati fl-mRNA OVA ġew applikati wkoll biex jittrattaw ġrieden b'injezzjoni intradermali. Eżami taċ-ċelluli fil-lymph nodes li jbattu żvela żieda kostanti fl-espressjoni CD86 fost iż-żewġ DCs klassiċi (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) u DCs plasmacytoid (pDC) matul l-ewwel 48 siegħa, li jindika stimulazzjoni ta 'DC maturazzjoni (Fig. 2J). It-trattament ippromwova wkoll l-arrikkiment taċ-ċelluli CD8þ T fil-lymph nodes, b'żieda sinifikanti fil-popolazzjoni ta 'ċelluli T CD69þCD8þ (Fig. 2K u L), li jindika attivazzjoni taċ-ċelluli T mit-trattament. Biex tiddetermina l-attivazzjoni taċ-ċelluli T, inġabarna ċelluli fil-lymph nodes draining 3, 5, jew 7 ijiem wara t-trattament MVP, u wettaq analiżi ELISpot wara li ċ-ċelloli ġew ikkontestati bil-peptide antiġen OVA257e264 (Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S2). It-trattament ta 'MVP wassal għal qabża kbira fiċ-ċelloli li jxerrdu IFN-g matul iż-żmien, b'attività massima f'Jum 5 (Fig. 2M). Dawn ir-riżultati wrew stimulazzjoni DC robusta, preżentazzjoni ta 'antiġen, u attivazzjoni taċ-ċelluli T wara t-trattament b'MVP.

Tabella 1 Kompożizzjoni ta 'nanopartiċelli inkapsulati b'mRNA li jikkodifika eGFP.

Tabella 2Kompożizzjoni tal-lipidi u proporzjon ta 'ċarġ ta' MVPpartiċelli.

3.3. MVP iqanqal immunità qawwija kontra t-tumur f'mudelli murini ta 'tumur tal-kolorektum u melanoma

MVP ġie applikat biex jikkura ġrieden b'kanċer tal-kolon MC38 u melanoma B16. Fiż-żewġ mudelli, it-trattament b'OVA mRNA inkapsulat MVP darbtejn imblukkat kompletament it-tkabbir tat-tumur taħt il-ġilda; b'paragun, it-trattament b'MVP jew vettura inkapsulat bl-eGFP mRNA waħdu ma kellu l-ebda effett inibitorju li jista 'jinqabad fuq it-tkabbir tat-tumur (Fig. 3AeD, Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S3). F'konformità mal-mudell ta 'CD4 għal CD8 bidla fil-lymph nodes (Fig. 2), aħna osservat żieda fil-proporzjon taċ-ċelluli CD8þ/CD4þ T f'tumuri minn ġrieden ittrattati b'MVP inkapsulat ta' mRNA OVA (Fig. 3E). Barra minn hekk, skoprejna livelli elevati fiċ-ċelluli T IFN-gþCD8þ fil-milsa, lymph nodes, u tumuri fil-ġrieden ittrattati b'MVP inkapsulat bl-mRNA OVA, iżda mhux bil-vettura waħedha jew MVP inkapsulat bl-mRNA GFP (Fig. 3FeH, Informazzjoni ta 'Appoġġ Fig. S4). Barra minn hekk, kien hemm żieda sinifikanti fl-OVA257e264-MHCI dextramer-pożittivi ċelluli T CD8þ f'tumuri mill-grupp ta 'trattament MVP inkapsulat bl-OVA mRNA li jindika proliferazzjoni ta' ċelluli T CD8þ speċifiċi għall-antiġen (Fig. 3I). Assaġġ ELISpot b'ċelloli iżolati mill-milsa u l-lymph nodes ipprovda aktar appoġġ fuq l-attivazzjoni taċ-ċelluli T (Fig. 3JeM).

3.4. L-MVP jistimula risponsi immuni innati billi jattiva s-sinjalar dipendenti fuq STING

Applikajna l-qalba tal-mRNA, il-vettura ħielsa mill-mRNA, u l-MVP inkapsulat tal-mRNA biex nittrattaw il-BMDCs sabiex nidentifikaw fatturi u mogħdijiet ewlenin responsabbli għall-istimulazzjoni tal-IFN tat-tip I u l-espressjoni ta 'ċitokini infjammatorji. Interessanti, l-MVP kien qawwi daqs l-agonist Tlr7 imiquimod fl-iskattar is-sekrezzjoni ta 'IFN-b, u l-vettura waħedha wriet ukoll attività fil-promozzjoni tas-sekrezzjoni ta' IFN-b, għalkemm il-qawwa tagħha ma kinitx għolja daqs MVP; madankollu, il-qalba tal-mRNA waħedha kienet ineffettiva biex tistimula t-tnixxija tal-IFN-b (Fig. 4A). Ir-riżultat jimplika li kemm l-mRNA kif ukoll il-komponenti fil-vettura kienu meħtieġa biex timmassimizza l-espressjoni ta 'IFN-b. Sadanittant, l-imiquimod u l-vettura wrew attività simili fil-promozzjoni tal-espressjoni ta 'TNF-a u IL-1b, filwaqt li MVP kien ħafna aktar qawwi minn kwalunkwe wieħed minnhom (Fig. 4B u C). L-espressjoni ta 'CCL5, ċitokina assoċjata b'mod komuni ma' fatturi regolatorji NF-kB u IFN, kienet stimulata bl-istess mod f'ċelloli ttrattati b'imiquimod, vettura biss, jew MVP (Fig. 4D). TLR7, MAVS, STING, u TRIF huma fatturi ewlenin fil-mogħdijiet ewlenin tat-trasduzzjoni tas-sinjali li jimmedjaw ir-reazzjonijiet ċellulari għal RNA virali u DNA28e30 bil-ħsara. Aħna ġġeneraw BMDCs minn ġrieden b'knockout tal-ġeni Tlr7, Mavs, Sting, jew Trif (KO), u ttrattati ċelluli b'qalba mRNA, vettura ħielsa mill-mRNA, jew MVP inkapsulat mRNA biex neżaminaw l-espressjoni ta 'IFN-b u TNF-a.

Figura 2 Stimulazzjoni tar-risponsi immuni minn MVP. (A) Veduta skematika tal-qalba tal-mRNA/protamine, vettura ħielsa mill-mRNA, u MVP kompluta. (BeD) Maturazzjoni ta 'BMDCs wara li ġew ittrattati b'OVA-MVP għal 24 siegħa. (E u F) Espressjoni MHC I u OVA257e264 antiġen epitope-MHC I kumpless f'BMDCs wara li ġew ittrattati b'OVA-MVP għal 24 siegħa. (G) Livell ta 'IL-2 minn BMDCs ittrattati ko-inkubati ma' ċelluli T B3Z jew OT-I. (H u I) Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss taċ-ċelluli T proliferattivi. Kromatogrammi rappreżentattivi taċ-ċelluli T huma murija. (J) Maturazzjoni DC wara trattament MVP in vivo. Ġrieden C57BL/6J ġew ittrattati b'OVA-MVP, u DCs fil-lymph nodes popliteali ġew analizzati. (K u L) Analiżi tal-popolazzjoni taċ-ċelluli T. Il-ġrieden C57BL/6J ġew ittrattati b'vettura jew OVA-MVP, u ċ-ċelloli T fil-lymph nodes popliteali ġew analizzati b'ċitometrija tal-fluss. (M) Assaġġ ELISpot. Il-ġrieden C57BL/6J ġew ittrattati b'OVA-MVP, u l-lymph nodes inġabru fil-punti taż-żmien indikati. Ċelloli iżolati ġew applikati għall-kejl taċ-ċelloli li jesprimu IFN-g. Id-dejta hija ppreżentata bħala SEM medju (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0.005; ****P < 0.001; ns, mhux sinifikanti.

Figura 3 Attività kontra t-tumur minn MVP. (A) Inibizzjoni tat-tkabbir tat-tumur MC38-OVA. Ġrieden nisa C57BL/6J ġew mlaqqma taħt il-ġilda b'ċelluli tat-tumur 5  105 MC{38-OVA/ġurdien f'Jum 0 u ttrattati b'kontroll PBS, kontroll tal-vettura, GFP-MVP, jew OVA-MVP fuq Ġranet 3 u 10. (B) Inibizzjoni tat-tkabbir tat-tumur B16-OVA. Ġrieden nisa C57BL/6J ġew mlaqqma taħt il-ġilda b'ċelluli tat-tumur 2  105 B{{16-OVA/ġurdien f'Jum 0, u ttrattati b'kontroll PBS, kontroll tal-vettura, GFP-MVP, jew OVA-MVP fil-Ġranet 3 u 10. (Ċ u D) Immaġini u piż ta 'tumuri B16-OVA f'Jum 17. (E) Popolazzjoni taċ-ċelluli T f'tumuri ta' ġrieden ta 'wara t-trattament. (FeH) Ċelloli T IFN-gþCD8þ fil-milsa, lymph nodes (LN), u tumuri ta 'ġrieden ta' wara t-trattament. (I) Ċelloli CD8þ T speċifiċi għall-OVA f'tumuri ta 'ġrieden ta' wara t-trattament. (JeM) Immaġini u analiżi kwantitattiva tal-assaġġ ELISpot ta 'ċelluli tal-milsa u LN minn ġrieden ta' wara t-trattament. Id-dejta hija ppreżentata bħala SEM medju (n Z 5). *P < 0.05; **P <0.01; ***P <0.005; ****P < 0.001.

L-istatus KO ta 'Mavs u Sting f'BMDCs ġie kkonfermat b'analiżi Western blot (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S5A). B'mod sorprendenti, Sting KO neħħa l-attività stimulatorja fuq is-sekrezzjoni ta 'IFN-b kemm mill-vettura waħedha kif ukoll mill-MVP (Fig. 4E), li jindika li l-MVP attivat l-espressjoni ta' IFN tat-tip I permezz ta 'STING. Biex tappoġġja l-kunċett, skoprejna fosforilazzjoni ta 'tank-binding kinase 1 (TBK1) (Fig. S5B), kinase li hija komunement assoċjata ma' attività STING31. Barra minn hekk, din il-mogħdija kienet indipendenti mis-sinjalar TLR7, peress li l-espressjoni ta 'IFN-b ma kinitx kompromessa fiċ-ċelloli ttrattati b'imiquimod (Fig. 4E). B'paragun, Trif jew Mavs KO kellhom impatt minimu fuq l-espressjoni IFN-b promossa minn MVP. Kif mistenni, imiquimod kien ineffettiv biex jistimula t-tnixxija ta' IFN-b f'BMDCs derivati ​​minn Tlr7 KO; madankollu, Tlr7 KO kellu impatt negattiv fuq l-effett stimulatorju minn MVP (Fig. 4E). Interessanti, profil differenti ġie osservat fuq sekrezzjoni ta 'TNF-a mill-istess trattamenti. Knockout ta 'Sting, Trif, jew Tlr7 ma kellux impatt minimu fuq l-espressjoni taċ-ċitokini stimulata minn MVP. Knockout ta 'Mavs, min-naħa l-oħra, naqqas b'mod drammatiku l-livelli ta' TNF-a fiċ-ċelloli ttrattati jew b'vettura waħedha jew MVP (Fig. 4F). Ir-riżultat jindika li MAVS huwa regolatur ewlieni tal-espressjoni ta 'TNF-a fid-DCs fuq trattament MVP.

3.5. MVP jistimula l-mogħdijiet STING u MAVS biex jippromwovi s-sekrezzjoni ta 'IFN-I u ċitokini infjammatorji

Biex nidentifikaw komponenti fil-vettura responsabbli għall-istimulazzjoni tas-sinjalar STING u MAVS, ħejjejna vetturi u MVPs billi ssostitwixxiet jew ħallejt barra komponenti ewlenin u applikajnahom biex nittrattaw BMDCs. L-agonist ta 'Sting GMP-AMP ċikliku (cGAMP) serva bħala kontroll pożittiv fl-istimulazzjoni tas-sekrezzjoni ta' IFN-b. Is-sostituzzjoni tal-lipidu katjoniku EDOPC fil-vettura b'lipidu ieħor iċċarġjat b'mod pożittiv, DOTAP, ħassar kompletament is-sekrezzjoni ta 'IFN-b. B'paragun, l-effett stimulatorju mill-vettura u MVP inżamm bi jew mingħajr protamina, u tali attività stimulatorja kienet dipendenti fuq ġene Sting intatt (Fig. 4G). Interessanti, BMDCs ittrattati b'komponenti individwali tal-qoxra tal-lipidi inkluż EDOPC ma ppromwovux sekrezzjoni qawwija ta 'IFN-b (Informazzjoni ta' Appoġġ Fig. S6). Għalhekk, EDOPC kien essenzjali għall-attivazzjoni ta 'STING, u l-attività tiegħu tiddependi fuq il-formazzjoni ta' nanopartiċelli lipidi (jiġifieri, vettura jew MVP). Vettura u MVP ippreparati b'EDOPC jew DOTAP ġew applikati wkoll biex jittrattaw BMDCS derivati ​​minn ġrieden tat-tip selvaġġ u Mavs KO, u ġew determinati livelli ta 'TNF fil-midja tat-tkabbir taċ-ċelluli. Kif mistenni, is-sostituzzjoni ta 'EDOPC b'DOTAP jew DOPC eliminat sforz stimulatorju mill-vettura u MVP. Barra minn hekk, il-livell ta 'TNF-a kien imnaqqas b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli Mavs KO meta mqabbel ma' ċelloli tat-tip selvaġġ, iżda mhux imnaqqas (Fig. 4H), li jindika fatturi addizzjonali jistgħu jkunu involuti fil-medjazzjoni tal-espressjoni TNF-a stimulata mill-MVP.

3.6. Il-mogħdija STING hija essenzjali għal risponsi immuni kontra t-tumur medjati mill-MVP

Kemm il-ġrieden tat-tip selvaġġ kif ukoll il-ġrieden knockout ġew ittrattati b'MVP inkapsulat tal-mRNA OVA, u ġew eżaminati l-maturazzjoni tad-DC u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli T. Sting KO naqqas b'mod sinifikanti l-perċentwal ta 'ċelluli CD80þ u CD86þ DC u ċelluli T CD69þ (Fig. 5AeD). Assaġġ ELISpot żvela ċelluli li jipproduċu IFN-g mnaqqsa b'mod sinifikanti fil-milsa u l-lymph nodes minn ġrieden Sting KO meta mqabbla ma 'ġrieden tat-tip selvaġġ wara li ġew ittrattati bl-istess doża ta' MVP (Fig. 5EeH). L-impatt minn Mavs KO kien minimu, peress li l-ebda differenza ma ġiet immonitorjata fuq ċelluli T tal-memorja CD44þCD8þ, ċelloli T CD8þ pożittivi għad-dextramer OVA257e264-MHCI, jew numru ta’ ċelloli li jipproduċu IFN-g fil-lymph nodes meta mqabbla ma’ ċelluli selvaġġi. ġrieden tat-tip (Fig. 5IeL). Ir-riżultat isaħħaħ il-kunċett li fatturi addizzjonali minbarra MAVS jistgħu jkunu involuti fl-espressjoni ta 'ċitokini infjammatorji stimulati minn MVP. Kemm il-ġrieden tat-tip selvaġġ kif ukoll il-ġrieden Sting KO ġew applikati biex jitlaqqmu tumuri B16-OVA, u ġrieden ġew ittrattati b'kontroll PBS jew MVP inkapsulat bl-mRNA OVA. Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss fuq kampjuni ta 'lymph node u tumur miġbura minn ġrieden imlaqqma żvelat numru mnaqqas b'mod sinifikanti ta' ċelloli T CD8þ li jipproduċu IFN-g fil-ġrieden Sting KO (Fig. 6A u B). Bħala riżultat, it-tkabbir tat-tumur kien kompletament inibit fil-ġrieden tat-tip selvaġġ ittrattati b'MVP, meta mqabbel ma 'inibizzjoni parzjali biss fil-ġrieden Sting KO (Fig. 6C).

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Diskussjoni

Fl-istudju attwali, eżaminajna b'mod sistematiku r-rwoli funzjonali ta 'komponenti individwali fl-MVP dwar l-istimulazzjoni ta' risponsi immuni kontra t-tumur. L-istudju tagħna bbażat fuq iċ-ċelluli wera biċ-ċar li kemm il-molekuli tal-mRNA kif ukoll il-vettura ħielsa mill-RNA fl-MVP huma meħtieġa għall-attività sħiħa tiegħu fil-promozzjoni tal-espressjoni ta’ IFN-b u numru ta’ ċitokini infjammatorji inklużi IL-1b u TNF -a fiċ-ċelloli dendritiċi. Ċitokini bħal dawn intwerew li għandhom rwoli essenzjali fl-attivazzjoni taċ-ċelluli dendritiċi u l-immunità kontra t-tumur medjata minn vaċċin20. L-istudju tagħna wera wkoll li l-istimulazzjoni tal-produzzjoni taċ-ċitokini hija dipendenti fuq numru ta 'mogħdijiet ewlenin ta' trasduzzjoni tas-sinjali involuti fis-sensing immuni intrinsiku inklużi dawk medjati minn STING u MAVS. Filwaqt li STING huwa essenzjali għall-espressjoni IFN-b, MAVS huwa prinċipalment involut fir-regolazzjoni tal-espressjoni TNF-a (Fig. 6D). Is-sinifikat tas-sinjalar STING fuq l-immunità kontra t-tumur medjata minn MVP hija murija aktar minn attività mnaqqsa taċ-ċelluli T u konsegwentement kompromessa l-inibizzjoni tat-tkabbir tat-tumur fil-ġrieden Sting KO. Dan ir-riżultat huwa konformi ma 'rapporti oħra li l-attivazzjoni ta' STING tiddetermina l-immunità antitumorali medjata minn ċelluli T ċitotossiċi32. MAVS huwa intermedjatur ewlieni fis-sinjalar tar-RIG-I-receptor (RLR) b'reazzjoni għal infezzjoni virali. L-attivazzjoni ta' din il-mogħdija twassal għal kaskata ta' reazzjonijiet infjammatorji33. Huwa intriganti li l-attività taċ-ċelluli T mhix kompromessa fil-ġrieden Mavs KO, peress li s-sinjalar MAVS b'mod ċar qed ikollu rwol kbir fir-regolazzjoni tal-espressjoni ta 'ċitokini infjammatorji inkluż TNF-a. Raġuni possibbli hija li l-istimulazzjoni ta 'ċitokini bħal dawn minn MVP hija medjata minn mogħdijiet multipli, u t-tfixkil tal-mogħdija MAVS ma jnaqqasx l-espressjoni taċ-ċitokini għal livell baxx biżżejjed biex jikkawża impatt sinifikanti. Alternattivament, it-telf tas-sinjalar MAVS huwa kkumpensat mill-mogħdijiet l-oħra. Huma meħtieġa aktar studji biex jiġu identifikati dawn il-mogħdijiet biex jifhmu aktar il-mekkaniżmu ta 'azzjoni tal-vaċċin MVP. Għalkemm TLR7 tradizzjonalment ġie assoċjat mat-terapewtiċi tal-mRNA21, is-sinjalar TLR7 ma jidhirx li għandu rwol ewlieni fil-medjazzjoni tal-attività tal-MVP. L-applikazzjoni ta 'molekuli mRNA kompletament methylated fl-istudju attwali setgħet għamlet is-sinjalar TLR7 inqas rilevanti. Intwera sew li l-metilazzjoni tal-RNA irażżan ir-rikonoxximent mit-TLRs23. TRIF hija proteina adapter ewlenija għas-sinjalar TLR3/7/828. Knockout ta 'Trif lanqas ma jaffettwa l-attività tal-MVP, u jsaħħaħ il-kunċett li t-TLRs ta' hawn fuq inkluż TLR7 ma għandhomx rwol ewlieni fil-medjazzjoni tar-risponsi ċellulari għal MVP. Agonisti multipli ta 'Sting ġew applikati fl-iżvilupp tal-vaċċini tal-kanċer inklużi dinukleotidi ċikliċi u komposti molekulari żgħar u kbar34e37. Tali agonisti ta' Sting jeħtieġ li jiġu miżjuda bħala aġġuvanti esterni waqt il-preparazzjoni tal-vaċċin li jżid saff ieħor ta' kumplessità mal-kompożizzjoni tal-vaċċin. Barra minn hekk, l-agonist Sting miżjud esternament jista 'jikkawża effetti avversi mhux mixtieqa ladarba jissepara mill-kumpless tal-mRNA. B'paragun, l-MVP tagħna jservi bħala awto-adjuvant u jaħdem fil-kuntest ta 'vaċċin tal-kanċer, peress li l-ebda komponenti individwali tal-vaċċin inkluż EDOPC ma jista' jippromwovi l-espressjoni taċ-ċitokini. Interessanti, il-fosfolipidu katjoniku EDOPC ma jistax jiġi sostitwit bid-DOTAP mhux fosfolipidu li huwa wkoll iċċarġjat b'mod pożittiv. Huwa intriganti li wieħed jispekula l-mekkaniżmu potenzjali għad-differenza bejn dawn iż-żewġ lipidi katjoniċi. Madankollu, ġie dokumentat li proprjetajiet oħra ta 'komponent ta' molekula lipidi bħall-idrofobiċità jista 'jkollhom impatt profond fuq il-funzjoni ġenerali ta' nanopartiċella u l-effikaċja tal-kunsinna tagħha għall-aċidi nuklejċi38. Għalhekk, għandha tingħata attenzjoni fl-għażla tal-molekuli xierqa biex tipprepara vaċċin mRNA kompletament funzjonali. Fil-qosor, żviluppajna vaċċin terapewtiku tal-kanċer ibbażat fuq l-mRNA u assenjat komponenti individwali fil-vaċċin bil-funzjonalità tagħhom. Il-mekkaniżmu ta 'azzjoni tiegħu huwa pjuttost differenti minn pjattaformi mRNA oħra użati għal interventi profilattiċi u terapewtiċi. L-għarfien derivat mill-istudju attwali żgur jiggwida l-iżvilupp futur ta 'terapewtiċi addizzjonali tal-mRNA.

Figura 4 Promozzjoni ta 'risponsi immuni intrinsika minn MVP. (AeD) BMDCs ittrattati b'1 mg/mL imiquimod, 1 mg/mL qalba ekwivalenti għal mRNA, vettura, jew MVP għal 24 siegħa. Il-livelli ta' IFN-b, TNF-a, IL-1b, u CCL5 tkejlu b'ELISA. (E u F) IFN-b u TNF-a espressjoni ta 'BMDCs derivati ​​minn ġrieden tat-tip selvaġġ u knockout tal-ġeni (KO). Il-BMDCs ġew ittrattati bir-reaġenti indikati għal 24 siegħa. IFN-b u TNF-a ġew imkejla bl-ELISA. (G) IFN-b f'BMDCs derivati ​​minn ġrieden knockout tat-tip selvaġġ u Sting. Il-BMDCs ġew ittrattati b'20 mg/mL cGAMP, 1 mg/mL qalba ekwivalenti għal mRNA, vettura, jew MVP għal 24 siegħa. Vettura (DOTAP): ippreparata billi tissostitwixxi EDOPC b'DOTAP; vettura (mingħajr protamina): ippreparat billi tħalli barra l-protamina. ND: ma jinstabx. (H) TNF-a f'BMDCs derivati ​​minn ġrieden knockout tat-tip selvaġġ u Mavs. Il-BMDCs ġew ittrattati b'qalba, vettura jew MVP ekwivalenti għal 1 mg/mL għal 24 siegħa. Vettura (DOTAP): ippreparata billi tissostitwixxi EDOPC b'DOTAP; vettura (DOPC): ippreparat billi tissostitwixxi EDOPC b'DOPC. Id-dejta hija ppreżentata bħala SEM medju (n Z 3). ***P < 0.005; ****P < 0.001; ns, mhux sinifikanti.

Figura 5 Reazzjonijiet immuni kontra t-tumur fi ġrieden knockout Sting u Mavs. (AeD) Attivazzjoni mnaqqsa taċ-ċelluli DC u T fi ġrieden knockout Sting. Kemm il-ġrieden knockout tat-tip selvaġġ u Sting ġew ittrattati b'MVP inkapsulat bl-mRNA OVA, u l-lymph nodes inġabru 48 siegħa wara għall-kejl taċ-ċelluli DC u T. (EeH) Ċelluli T li jesprimu IFN-g imnaqqsa fil-milsa u l-lymph nodes minn ġrieden knockout Sting. Jintwerew kemm stampi ta' spots kif ukoll analiżi kwantitattiva. (IeL) L-ebda impatt fuq l-attività taċ-ċelluli T fil-ġrieden knockout Mavs. Kemm ġrieden knockout tat-tip selvaġġ kif ukoll Mavs ġew ittrattati b'kontroll PBS jew MVP inkapsulat bl-mRNA OVA, u nġabru lymph nodes 48 siegħa wara għall-kejl taċ-ċelluli T tal-memorja CD44þCD8þ (I), OVA257e264-MHCI dextramer-pożittiv CD8þ Ċelloli T (J), u numru ta 'ċelluli li jipproduċu IFN-g (K u L). Id-dejta hija ppreżentata bħala SEM medju (n Z 3 jew 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0.005; ****P < 0.001; ns, mhux sinifikanti.

Figura 6 Immunità kontra t-tumur dipendenti fuq Sting. (A u B) Analiżi ta 'ċelluli T li jesprimu IFN-g f'lymph nodes u tessuti tat-tumur wara wildtype u ġrieden knockout Sting li jkollhom tumuri B 16-OVA ġew ittrattati b'MVP inkapsulat fl-mRNA OVA. Ġrieden ġew ittrattati f'Jiem 3 u 10, u nġabru lymph nodes u tumuri f'Jum 15. Ċelloli singoli ġew analizzati b'ċitometrija tal-fluss. (C) Inibizzjoni tat-tkabbir tat-tumur fi ġrieden knockout wildtype u Sting. Ġrieden ġew ittrattati b'kontroll PBS jew MVP fil-Ġranet 3 u 10. Id-dejta hija ppreżentata bħala SEM medju (n Z 5). *P <0.05; ****P < 0.001; ns, mhux sinifikanti. (D) Veduta skematika dwar l-istimulazzjoni tal-MVP ta 'mogħdijiet ta' trasduzzjoni tas-sinjali li jwasslu għall-produzzjoni ta 'ċitokini f'DCs. Filwaqt li l-istimulazzjoni tal-espressjoni ta' IFN-b hija medjata esklussivament minn STING, hemm fatturi multipli inklużi MAVS li jimmedjaw l-espressjoni ta' TNF-a u IL-1b.

Referenzi

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Effikaċja tal-vaċċin mRNA-1273 SARS-CoV{-2 mat-tlestija tal-fażi blinded. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Sigurtà u effikaċja tat-tielet doża tal-vaċċin BNT162b2 Covid-19. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Negħlbu l-ostakli ċellulari għat-terapewtiċi tal-RNA. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Sistemi nanopartiċelli lipidi biex jippermettu terapiji tal-ġeni. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, et al. Lipopolyplex isaħħaħ l-immunità kontra t-tumur tat-tilqim ibbażat fuq l-mRNA. Bijomaterjali 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Twassil sistemiku ta 'mRNA modifikat li jikkodifika virus herpes simplex 1 thymidine kinase għal terapija mmirata tal-ġeni tal-kanċer. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Il-kunsinna sistemika ta' RNA liċ-ċelloli dendritiċi tisfrutta d-difiża antivirali għall-immunoterapija tal-kanċer. Natura 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, et al. Vaċċin mRNA li jimita l-virus għat-trattament tal-kanċer. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. vaċċini mRNA era ġdida fil-vaċċinoloġija. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. Iċ-ċelluli CAR T huma prodotti in vivo biex jittrattaw korriment kardijaku. Xjenza 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Fl-era tal-vaċċini tal-mRNA, Hemm xi tama għal kura funzjonali tal-HIV? Viruses 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. Vaċċin mRNA mhux infjammatorju għat-trattament ta 'enċefalomielite awtoimmuni sperimentali. Xjenza 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. vaċċin mRNA għall-immunoterapija tal-kanċer. Mol Cancer 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA fl-immunoterapija tal-kanċer: lil hinn minn sors ta 'antiġen. Mol Cancer 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Vaċċini RNA mutanome personalizzati jimmobilizzaw immunità terapewtika poli speċifika kontra l-kanċer. Natura 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, et al. Vaċċin RNA jmexxi l-immunità fil-melanoma kkurata b'inibitur tal-punt ta' kontroll. Natura 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Prova tat-tilqim attivament personalizzata għal glijoblastoma li għadha kif ġiet dijanjostikata. Natura 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Immunoterapija tal-kanċer. Vaċċin taċ-ċelluli dendritiċi jżid il-wisa 'u d-diversità taċ-ċelluli T speċifiċi għan-neoantiġen tal-melanoma. Xjenza 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Il-vaċċin neoantiġen jiġġenera risponsi taċ-ċelluli T intratumorali fil-prova tal-glioblastoma tal-fażi Ib. Natura 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Attivazzjoni sinerġistika ta' immunità kontra t-tumur permezz ta' vaċċin terapewtiku partikuli. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Nagħmlu sens intrinsiku ta 'adjuvantiċità tal-vaċċin mRNA. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Vaċċini bbażati fuq l-RNA Messenger b'attività doppja jinduċu risponsi immuni adattivi bilanċjati dipendenti fuq TLR-7-u jipprovdu attività kontra t-tumur. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Soppressjoni tar-rikonoxximent tal-RNA minn riċetturi Toll-like: l-impatt tal-modifika tan-nukleosidi u l-oriġini evoluzzjonarja tal-RNA. Immunità 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, et al. IL-1 u IL-1ra huma regolaturi ewlenin tar-rispons infjammatorju għal vaċċini RNA. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Mekkaniżmi ta 'immunità intrinsika u adattiva għall-vaċċin PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Is-sostituzzjoni tal-lipidi helper b'alternattivi ċċarġjati fin-nanopartiċelli tal-lipidi tiffaċilita l-kunsinna mmirata tal-mRNA lejn il-milsa u l-pulmuni. J Kontroll Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. RNA żgħir li jinterferixxi għat-trattament tal-kanċer: negħlbu l-ostakli fil-kunsinna. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Rispons tal-interferon tat-Tip I u sensing immuni innat tal-kanċer. Xejriet Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Progressjoni mitotika wara ħsara fid-DNA tippermetti rikonoxximent tal-mudell fi ħdan mikronuklei. Natura 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. Il-ħsara fid-DNA tippremja s-sistema tal-interferon tat-tip I permezz tas-sensor tad-DNA ċitosolika STING biex tippromwovi l-immunità innata anti-mikrobika. Immunità 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. L-helicase DDX41 iħoss DNA intraċellulari medjat mill-adapter STING fiċ-ċelloli dendritiċi. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, et al. Il-kobor tal-attivazzjoni terapewtika STING tiddetermina l-immunità kontra t-tumur medjata miċ-ċelluli T CD8þ. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Mekkaniżmi ta 'rikonoxximent u sinjalazzjoni tal-mudelli ta' RIG-I u MDA5. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. Vaċċini tal-kanċer ifformulati bl-agonisti STING jistgħu jfejqu tumuri stabbiliti reżistenti għall-imblokk tal-PD-1. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. L-attivazzjoni diretta ta 'STING fil-mikroambjent tat-tumur twassal għal rigressjoni u immunità qawwija u sistemika tat-tumur. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, et al. Il-kunsinna ta 'vaċċini mRNA b'lipidi eteroċikliċi żżid l-effiċjenza kontra t-tumur permezz ta' attivazzjoni taċ-ċelluli immuni medjata minn STING. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, et al. Nano vaċċin li jattiva STING għall-immunoterapija tal-kanċer. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Attività ta 'trasfezzjoni ta' taħlitiet binarji ta 'derivattivi katjoniċi ta' fosfatidilkolina o-sostitwiti: il-qalba idrofobika timmodula bil-qawwa l-proprjetajiet fiżiċi u l-effikaċja tal-kunsinna tad-DNA. Biophys J 2006;91:3692e706.