BCAT2 Jiffurma Mikroambjent tat-Tumur Mhux Infjammat U Jinduċi Reżistenza għall-Immunoterapija Anti-PD-1/PD-L1 Billi Jirregola b'mod Negattiv Chemokines Proinfjammatorji U Immunità Kontra l-Kanċer

Biex tittejjeb ir-rata ta 'rispons ta' monoterapija ta 'imblokk tal-punt ta' kontroll immuni (ICB), huwa meħtieġ li tinstab mira emerġenti f'terapija kombinata. Permezz tal-analiżi tal-indikaturi relatati mal-mikroambjent tat-tumur (TME), huwa vvalidat li BCAT2 jifforma TME mhux infjammat fil-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina. Ir-riżultati tal-multiomics jindikaw li BCAT2 għandu effett inibitorju fuq ir-reklutaġġ ta 'limfoċiti ċitotossiċi billi trażżan attivitajiet ta' mogħdijiet relatati ma 'ċitokini/chemokine proinfjammatorji u mogħdija taċ-ċelluli T-chemotaxis. L-immunoassaġġi jiżvelaw li s-sekrezzjoni ta' kimokini relatati maċ-ċelluli CD8+T iżomm korrelazzjoni negattiva b'saħħitha ma' BCAT2, li tiġġenera tendenza li tonqos ta' ċelluli CD{8+T madwar ċelluli tat-tumur BCAT{2+ minn bogħod għal qrib. Kotrattament ta' defiċjenza ta' BCAT2 u antikorp anti-PD-1 għandu effett sinerġistiku in vivo, li jimplika l-potenzjal ta' BCAT2 f'terapija kombinata. Barra minn hekk, il-valur ta 'BCAT2 fit-tbassir tal-effikaċja tal-immunoterapija huwa vvalidat f'koorti multipli ta' immunoterapija. Flimkien, bħala molekula ewlenija fit-TME, BCAT2 huwa mira emerġenti flimkien ma 'ICB u bijomarkatur ta' terapija ta 'preċiżjoni ta' gwida.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

1. Introduzzjoni

Il-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina (BLCA) huwa wieħed mill-aktar tumuri malinni komuni fis-sistema urinarja.[1] Huwa stmat li aktar minn 430,000 pazjent jiġu djanjostikati madwar id-dinja kull sena.[2] Minkejja trattament ta' kirurġija radikali, kważi nofs il-pazjenti b'kanċer tal-bużżieqa tal-awrina li invażiv fil-muskoli jseħħu metastasi.[3] Għalhekk, it-terapija sistemika għandha rwol importanti fil-kanċer avvanzat tal-bużżieqa tal-awrina. Bl-iżvilupp ta 'l-immunoterapija, speċjalment l-imblokk tal-punt ta' kontroll immuni (ICB), l-evidenza akkumulata indikat li l-ICB għandu prestazzjoni eċċellenti fl-eliminazzjoni tal-piż tat-tumur.[4] Madankollu, għad hemm numru kbir ta' pazjenti li jonqsu milli jirrispondu għal monoterapija ta' ICB minħabba reżistenza primarja jew reżistenza miksuba.[5] Biex tissolva l-ħtieġa klinika mhux sodisfatta, il-kombinazzjoni ta 'terapiji razzjonali oħra ma' ICB tipprovdi ħarsa ġdida fjamanta dwar ir-reżistenza għall-monoterapija. Il-mikroambjent tat-tumur (TME) huwa sistema kkumplikata u għandu impatt profond fuq l-effikaċja tal-immunoterapija.[6] B'livell ta 'infiltrazzjoni insuffiċjenti ta' limfoċiti T ċitotossiċi (CTLs), TME mhux infjammat kien ikkunsidrat bħala fattur kritiku biex naqas milli jiġġenera rispons immuni qawwi kontra t-tumur waqt l-immunoterapija.[7] Għalhekk, huwa vitali li tinstab molekula ewlenija li tista 'tbiddel it-TME mhux infjammat f'TME infjammat u għandha l-potenzjal li tkun mira ta' terapija kombinata. Branched-chain aminotransferase 2 (BCAT2) hija enzima ċentrali fil-proċess tal-metaboliżmu tal-aċidu amminiku tal-kubrit.[8] Li et al. sabet li BCAT2 kien essenzjali għall-iżvilupp tal-kanċer tal-frixa billi medja l-kataboliżmu tal-aċidi amminiċi b'katina ramifikata (BCAAs).[9] Lee et al. wera li d-defiċjenza ta' BCAT2 inibixxi t-tkabbir tat-tumur tal-adenokarċinoma tal-kanal tal-frixa (PDAC) billi tirregola l-metaboliżmu tal-lipidi.[10] Għalkemm kien hemm diversi riċerki dokumentati li BCAT2 influwenza direttament il-proċess bijoloġiku tat-tumuri billi jirregola mogħdijiet relatati mal-metaboliżmu, ir-rwol tiegħu fir-regolazzjoni tal-istatus immuni tat-TME qatt ma ġie esplorat. Fl-istudju tagħna, permezz ta 'analiżi komprensiva ta' indikaturi relatati mat-TME fil-koorti Xiangya BLCA u koorti BLCA pubbliċi multipli, aħna skrinjaw li BCAT2 probabbilment jifforma TME immunosoppressiv f'BLCA. Għall-esplorazzjoni tal-mekkaniżmi molekulari, wettaqna aktar sekwenzar ta 'RNA ta' ċellula waħda (siRNA seq) u bulk-RNA seq, u żvela li BCAT2 għandu parti ripressiva fir-reklutaġġ ta 'CTLs f'TME, billi inibixxi attivitajiet ta' mogħdijiet tas-sinjali assoċjati ma 'ċitokini / chemokine u Mogħdijiet tas-sinjali Tcell-chemotaxis. In vitro, multi-immunoassays wrew li s-sekrezzjoni ta' kimokini relatati ma' CTL għandha korrelazzjonijiet negattivi stabbli mal-espressjoni ta' BCAT2. Skont analiżi panoramiċi tal-mikroarray tat-tessuti (TMA), sibna relazzjoni esklużiva reċiprokament bejn CTLs u ċelluli tat-tumur BCAT2+ fid-distribuzzjoni spazjali. In vivo, ġie żvelat effett kooperattiv f'terapija kombinata ta 'telf ta' BCAT2 u ICB. Aktar importanti minn hekk, ir-rwol tiegħu fit-tbassir tal-effett kurattiv tal-immunoterapija ġie vvalidat fil-koorti tal-immunoterapija Xiangya BLCA.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

2. Riżultati

2.1. BCAT2 Jikkorrelata b'mod negattiv mal-Immunità ta' Kontra l-kanċer ta' TME f'BLCA

Fil-biċċa l-kbira tat-tipi ta 'kanċer, l-espressjoni ta' BCAT2 hija ogħla fit-tessuti tal-kanċer milli f'tessuti normali (Figura S1A, Informazzjoni ta 'Appoġġ) u l-mudell ta' espressjoni tiegħu f'BLCA ġie vvalidat f'Xiangya BLCA Cohort (Figura S1B, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Barra minn hekk, BCAT2 huwa espress b'mod wiesa 'f'diversi linji taċ-ċelluli tal-kanċer (Figura S1C, Informazzjoni ta' Appoġġ). Barra minn hekk, ir-riżultati ta’ analiżi komprensiva tal-pan-kanċer fuq is-sistema chemokine, MHCs, immunostimulaturi u TIICs indikaw li BCAT2 għandu effetti immunosoppressivi sinifikanti f’koppja ta’ tipi ta’ kanċer, inkluż kanċer tal-bużżieqa tal-awrina (BLCA), kanċer tas-sider (BRCA), ċellula papillari renali tal-kliewi. karċinoma (KIRP), adenokarċinoma tal-frixa (PAAD), sarkoma (SARC) u karċinoma tat-tirojde (THCA) (Figura S2A, B, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Barra minn hekk, instabu wkoll korrelazzjonijiet negattivi bejn BCAT2 u punti ta’ kontroll immuni inibitorji komuni (PD- 1, PD-L1, CTLA-4, u LAG-3) (Figura S2C–F, Informazzjoni ta’ Appoġġ ). Permezz ta 'analiżi komprensiva tal-pan-kanċer, sibna li BCAT2 għandu l-aktar effett immunosoppressiv profond fil-BLCA. Għalhekk, esplorajna aktar ir-rwol immunoloġiku tiegħu fil-BLCA. Fuq il-bażi tal-valur tal-espressjoni medjan ta 'BCAT2, qsamna individwi fil-grupp ta' BCAT2 għoli u grupp ta 'BCAT2 baxx fil-koorti TCGA-BLCA. Ovvjament, serje ta 'chemokines, riċetturi tal-chemokine, molekuli relatati mal-MHC u immunostimulators kienu espressi 'l isfel fil-grupp ta' BCAT2 għoli u espressi żżejjed fil-grupp ta 'BCAT2 baxx (Figura 1A). Riżultat simili instab fiċ-ċiklu tal-immunità tal-kanċer, li jkopri passi essenzjali multipli fir-reklutaġġ u l-infiltrazzjoni taċ-ċelloli immuni (Figura 1B). Barra minn hekk, urejna konnessjonijiet negattivi robusti bejn il-livelli ta’ infiltrazzjoni ta’ ċelluli immuni (ċellula CD8+T, CD4+T cell, cell killer nature (NK) cell, u cell dendritic (DC)) u BCAT2 f’diversi algoritmi (Figura 1C). Bl-istess mod, espressjoni aktar baxxa tal-ġeni effettur taċ-ċellula immuni (ċellula CD8+T, ċellula NK, Macrophage, ċellula T helper 1 (Th1) u ċellula DC) instabu fil-grupp b'BCAT2 għoli meta mqabbel mal-BCAT2 baxx. grupp (Figura 1D). Aktar importanti minn hekk, meta BCAT2 korrelata mal-punteġġ TIS (Figura S3, Informazzjoni ta 'Appoġġ) u punti ta' kontroll immuni inibitorji (Figura 1E), ġew żvelati relazzjonijiet negattivi ovvji bejniethom. Għalhekk, aħna spekulajna li BCAT2 jista 'jirregola b'mod negattiv ir-rispons immuni TME u jaffettwa l-effikaċja tal-immunoterapija b'mod profond. Barra minn hekk, ir-riżultati ta 'hawn fuq ġew ivvalidati tajjeb f'disa' koorti BLCA indipendenti (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE 86411, GSE87304, u GSE128702 - Informazzjoni ta 'Appoġġ) (Figuri, S4-12). Fl-aħħar, erġajna vverifikajna l-assoċjazzjoni bejn BCAT2 u TME f'Xiangya BLCA Cohort. B'mod konsistenti, l-espressjoni ta 'BCAT2 għandha relazzjonijiet negattivi mal-attività taċ-ċiklu tal-immunità tal-kanċer, livelli ta' infiltrazzjoni ta 'TIICs, punteġġ TIS, u livelli ta' espressjoni ta 'punti ta' kontroll immuni (Figura 2A-C). B'mod kollettiv, aħna żvelaw li espressjoni għolja ta 'BCAT2 tifforma TME mhux infjammat f'BLCA u espressjoni baxxa ta' BCAT2 tifforma TME infjammat f'BLCA.

2.2. L-esplorazzjoni tal-Mekkaniżmu ta' BCAT2 fl-iffurmar ta' TME permezz ta' Bulk RNA-seq u siRNA-seq

Fil-koorti TCGA-BLCA, DEGs bejn gruppi BCAT2 għoli/baxx, gruppi ta 'punteġġ immuni għoli/baxx, u gruppi ta' punteġġ stromali għoli/baxx ġew identifikati u ħadu intersezzjoni (Figura S13A, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Interessanti, DEGs relatati pożittivi BCAT2 ma kellhom l-ebda intersezzjoni ma 'DEGs relatati mal-punteġġ pożittiv immuni u stromali (Figura 2D). Sadanittant, l-istess fenomenu seħħ f'EGs relatati negattivi fosthom (Figura S13B, Informazzjoni ta' Appoġġ). Dawn is-sejbiet indikaw li BCAT2 probabbilment jirregola b'mod negattiv il-mogħdijiet relatati mal-immunità. B'koinċidenza, ir-riżultati tal-analiżi GO u KEGG wrew li DEGs relatati BCAT2-kienu arrikkit l-aktar b'mod sinifikanti fil-mogħdijiet tal-migrazzjoni tal-lewkoċiti, l-attivazzjoni taċ-ċelluli T, u l-interazzjoni ċitokine--riċettur taċ-ċitokin (Figura 2E, F). Għalhekk, spekulajna li BCAT2 jifforma TME mhux infjammat f'BLCA billi jinibixxi l-attivitajiet ta 'mogħdijiet relatati ma' cytokine/chemokine. Madankollu, il-karatteristika tas-sekwenzjar tal-massa NA tiddetermina l-limitazzjoni tagħha, li l-livell ta 'espressjoni tiegħu tal-ġene huwa kkalkulat mill-valur medju taċ-ċelloli kollha fit-tessut. Biex tingħeleb il-limitazzjoni, siRNA twettqet fuq tliet kampjuni BLCA. Aktar minn 19 000 ċelluli ġew analizzati u kklassifikati f'sitt kategoriji: ċellula epiteljali, ċellula fibroblast, ċellula T/NK, ċellula endoteljali, ċellula B, u ċellula majelojde (Figura 3A), irreferi għal bijomarkaturi rikonoxxuti (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1, u VWF).[11] B'mod impressjonanti, BCAT2 kien espress prinċipalment f'ċelloli epiteljali (EPCAM +), aktar milli ċelloli endoteljali u ċelloli immuni. Fuq il-bażi ta 'akkumulazzjoni ta' CNV, iċ-ċelloli epiteljali EPCAM + tqiesu bħala ċelloli uroteljali malinni. Biex jiġi vvalidat il-mudell ta 'espressjoni ta' BCAT2, żewġ koorti ta 'siRNA esterni ġew inklużi fl-istudju. Fil-koorti scRNA GSE135337, aktar minn 36,000 ċelluli ġew ipproċessati u maqsuma f'ħames gruppi, Is-sottotip taċ-ċelluli espressi primarjament ta 'BCAT2 kien għadu ċellula uroteljali tal-bużżieqa malinna (Figura 3B). Mudell ta 'espressjoni simili reġa' deher fil-koorti siRNA GSE145137 (Figura 3C). Għalhekk, il-mudell ta 'espressjoni tal-maġġoranza fuq ċelluli malinni dedotta li BCAT2 jaġixxi bħala parti immunoregolatur fit-TME prinċipalment permezz ta' karatteristiċi li jvarjaw taċ-ċelloli tal-kanċer. Ibbażat fuq il-livell ta 'espressjoni ta' BCAT2, ċelluli uroteljali malinni ġew maqsuma fi grupp ta 'BCAT2 għoli u grupp ta' BCAT2 baxx. L-analiżi GSEA tat-termini GO fil-koorti siRNA GSE135337 u GSE145137 wriet li mazz ta 'mogħdijiet relatati ma' cytokine/chemokine kienu rregolati b'mod sinifikanti fil-grupp b'BCAT2 għoli, inkluża l-produzzjoni ta 'chemokine, sekrezzjoni ta' chemokine, regolamentazzjoni ta 'chemokine medjata, rispons għal mogħdija ta' sinjalazzjoni kimokine, twaħħil tar-riċetturi tal-kitokini, attività taċ-ċitokini, irbit taċ-ċitokini u rbit tar-riċetturi taċ-ċitokini (Figura 3D–G; Figura S14B, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Sadanittant, il-kemotassi tal-lewkoċiti, il-kimotassi tal-limfoċiti, il-kimotassi taċ-ċelluli T, u l-mogħdijiet regolatorji tagħhom kellhom korrelazzjonijiet negattivi b'mod sinifikanti għal BCAT2 (Figura 3E-I; Figura S14A, Informazzjoni ta 'Appoġġ). L-analiżi GSEA tat-termini KEGG indikat li l-mogħdijiet ta 'interazzjoni tar-riċettur cytokine-cytokine u l-ipproċessar u l-preżentazzjoni ta' l-antiġeni kienu ovvjament downregolati fil-grupp ta 'BCAT2 għoli (Figura 3F). Flimkien, espressjoni għolja ta 'BCAT2 tirreprimi l-attivitajiet ta' ċitokini proinfjammatorji u mogħdijiet relatati ma 'kimokini, li jwasslu għal livell imnaqqas ta' infiltrazzjoni ta 'TIICs, li fl-aħħar mill-aħħar jifforma TME mhux infjammat.

Figura 1. BCAT2 jikkorrelata b'mod negattiv ma 'immunità kontra l-kanċer fit-TME ta' BLCA. A) Mudell ta 'espressjoni ta' chemokines, riċetturi ta 'chemokine, molekuli MHC, u immunostimulators fi gruppi BCAT2 għoljin u baxxi. B) Attività taċ-ċiklu tal-immunità tal-kanċer fi gruppi BCAT2 għoljin u baxxi. Seba 'kuluri jirrappreżentaw seba' passi fiċ-ċiklu. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. C) Korrelazzjonijiet bejn BCAT2 u tipi multipli ta' ċelluli immuni (ċellula CD8+T, ċellula CD4+T, ċellula DC, u ċellula NK) f'sitt algoritmi indipendenti. D) Mudelli ta' espressjoni ta' sottotipi multipli ta 'ċelluli immuni (ċellula CD8+T, ċellula NK, Macrophage, ċellula Th1, u ċellula DC) ġeni effettur relatati fi gruppi BCAT2 għoli u baxx. E) Korrelazzjonijiet bejn BCAT2 u ġeni effettur relatati mal-ICB. Numru fiċ-ċirku jfisser koeffiċjent ta' korrelazzjoni.

Figura 2. Validazzjoni tal-funzjoni ta 'BCAT2 mill-koorti Xiangya BLCA. A) Korrelazzjonijiet bejn BCAT2/ċiklu tal-immunità tal-kanċer (xellug) u BCAT2/TIICs (lemin). Linji solidi u bit-tikek ifissru relazzjonijiet pożittivi u negattivi, ħxuna tal-linji tfisser koeffiċjent ta 'korrelazzjonijiet, linji b'kuluri differenti jirrappreżentaw il-valur p ta' korrelazzjonijiet. B) Korrelazzjonijiet bejn BCAT2 u ġeni effettur relatati mal-ICB. C) Korrelazzjonijiet bejn BCAT2 u ġeni effettur relatati mal-punteġġ TIS. In-numru fiċ-ċirku jirrappreżenta l-koeffiċjent ta' korrelazzjoni. D) Intersezzjoni ta 'BCAT2, punteġġ immuni u punteġġ stromali ġeni relatati pożittiv. E,F) L-aqwa 20 mogħdija ta' sinjalar ta' arrikkiment ta' analiżi GO u KEGG fil-ġeni relatati2-BCAT.

Figura 3. L-esplorazzjoni tal-mekkaniżmu ta 'BCAT2 fit-tiswir ta' TME permezz ta 'RNA-seq bl-ingrossa u scRNA-seq. A, B) plottijiet tSNE tal-mudell ta 'espressjoni ta' ċellula waħda ta 'BCAT2 fil-koorti Xiangya siRNA u l-koorti GSE135337. C) Plott tal-vjolin tal-mudell tal-espressjoni ta 'ċellula waħda ta' BCAT2 fil-koorti GSE145137. D, E) L-analiżi GSEA tat-terminu GO tindika attivitajiet ta 'mogħdijiet relatati ma' cytokine/chemokine u mogħdijiet relatati ma 'kimotassi taċ-ċelluli immuni bejn gruppi BCAT2 differenti fil-koorti GSE135337. F) Analiżi GSEA tat-terminu KEGG tindika attivitajiet ta 'preżentazzjoni ta' antiġenu u interazzjoni ta 'ċitokini u mogħdija tar-riċetturi taċ-ċitokini bejn gruppi BCAT2 differenti fil-koorti GSE145137. G–I) L-analiżi GSEA tat-terminu GO tindika attivitajiet ta 'mogħdijiet relatati ma' cytokine/chemokine, mogħdijiet relatati ma 'kimotassi taċ-ċelluli immuni, u mogħdijiet relatati mal-migrazzjoni ta' ċelluli immuni bejn gruppi BCAT2 differenti fil-koorti GSE145137. J, K) Analiżi GO u KEGG tad-DEGs bejn il-linji taċ-ċelluli BCAT2 OE u BCAT2 KD.

2.3. BCAT2 Ivarja Disinji ta' Espressjoni ta' CD8+Kemokini Relatati maċ-Ċellula T u Inibixxi l-Kapaċità Ċitotossika ta' CTLs

Biex jiġu vvalidati l-mogħdijiet ta’ arrikkiment imsemmija hawn fuq, inbnew b’suċċess linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina tal-bniedem (T24)/murine (MB49) ta’ espressjoni żejda BCAT2 (BCAT2 OE) u BCAT2 knockdown (BCAT2 KD) u ġew ittestjati b’ sekwenzar ta' RNA b'rendiment għoli. Expectedgy, analiżi GO tal-linji taċ-ċelluli T24 wriet li DEGs kienu arrikkit b'mod sinifikanti fil-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni medjata minn chemokine, rispons għal chemokine, migrazzjoni tal-lewkoċiti, u migrazzjoni tal-lewkoċiti (Figura 3J). L-analiżi tal-mogħdija KEGG tal-linji taċ-ċelluli T24 wriet li l-mogħdija tas-sinjalar tal-chemokine, il-mogħdija ta 'interazzjoni tar-riċettur taċ-ċitokini--ċitokini, u l-mogħdija tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina ġew arrikkit b'mod sinifikanti (Figura 3K). Bl-istess mod, instabu diversi mogħdijiet kritiċi relatati ma 'ċitokini/kimokini f'analiżi GO u KEGG tal-linji taċ-ċelluli MB49 (Figura S16A, B, Informazzjoni ta' Appoġġ). Ovvjament, diversi ċitokini u chemokines għandhom rwoli kritiċi fir-regolazzjoni tat-TME. Għalhekk, huwa meħtieġ li jiġu skrinjati ċitokini/chemokines li huma regolati speċifikament minn BCAT2. Għalhekk, ProcartaPlex immunoassays multipli ġew applikati biex jidentifikaw varjazzjoni ta 'sekrezzjoni ta' ċitokini/chemokines fil-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-bużżieqa tal-bniedem u tal-ġrieden. B'mod sorprendenti, il-livelli ta' sekrezzjoni ta' CCL3, CCL4, CCL5, u CXCL10 irregolati 'l fuq f'linji ta' ċelluli BCAT2-KD umani u murini u rregolati 'l isfel f'linji ta' ċelluli BCAT2-OE umani u murini (Figura 4A, B; Figura S16C). , D, Informazzjoni ta' Appoġġ). Fi studji preċedenti, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, u CXCL10 tqiesu bħala kemokines kruċjali għar-reklutaġġ ta' ċelluli CD8+T f'TME.[12] Konsegwentement, għal analiżi komprensiva aħjar tal-kimokini relatati maċ-ċelluli T CD8+, kollha kemm huma ġew inklużi għal validazzjoni ulterjuri. B'mod impressjonanti, il-livelli ta 'espressjoni ta' RNA ta 'CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, u CXCL10 kienu rregolati b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli BCAT2 OE u regolati b'mod sinifikanti f'ċelloli BCAT2 KD (Figura 4C). Bl-istess mod, ir-riżultati ta 'ELISA wrew li l-livelli ta' proteina mnixxija kellhom ukoll korrelazzjonijiet negattivi ma 'espressjoni ta' BCAT2 (Figura 4D). Dawn is-sejbiet indikaw li l-espressjoni żejda ta' BCAT2 tinibixxi l-livelli ta' transcriptome u proteina ta' chemokines relatati maċ-ċelluli CD8+T, inklużi CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, u CXCL10. Aktar importanti minn hekk, l-assaġġ tal-kimotassi żvela li l-linja taċ-ċelluli BCAT2 OE inibbet b'mod sinifikanti l-abbiltà tal-kimotassi taċ-ċelluli CD8+T (Figura 4E, xellug). Bil-maqlub, is-supernatanti taċ-ċelluli tal-linja taċ-ċelluli BCAT2 KD kienu kapaċi jattiraw aktar ċelluli CD8+T mill-kontroll negattiv tiegħu (Figura 4E, dritt). Dawn is-sejbiet indikaw li BCAT2 jista' jaffettwa l-kapaċità tal-kimotassi taċ-ċelluli CD8+T billi jirregola l-livelli ta' mRNA u proteina ta' kimokini relatati. Barra minn hekk, intuża test tal-qtil taċ-ċelluli tal-kanċer medjat minn ċelluli T biex jesplora l-varjazzjoni taċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli T wara kuntatt dirett ma 'ċelluli tat-tumur li jesprimu livell differenti ta' BCAT2. Kif muri fil-Figura 4F u l-Figura S17A, B (Informazzjoni ta 'Appoġġ), l-espressjoni żejda ta' BCAT2 fuq ċelluli tat-tumur soppressa direttament il-funzjoni ċitotossika taċ-ċelluli T u t-twaqqigħ ta 'BCAT2 fuq ċelluli tat-tumur qaleb b'mod sinifikanti t-tendenza. L-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss taċ-ċelluli T miġbura sabet li proporzjonijiet taċ-ċelluli CD8+TNF-𝛼+ T u ċ-ċelluli T CD{8+IFN-𝛾+ kellhom differenzi sinifikanti f'sistemi ta' kokultura differenti, li fisser bidla massiva fil- l-attività taċ-ċelluli CD8+T (Figura 4G; Figura S17C, D, Informazzjoni ta' Appoġġ). Kollettivament, BCAT2 huwa kapaċi jinibixxi l-abbiltà ta' reklutaġġ taċ-ċelluli CD8+T billi jirregola l-livelli ta' kimokini relatati kif ukoll iwaqqaf l-attivitajiet ta' CTLs b'kuntatt dirett. Barra minn hekk, ir-riżultat tal-assaġġ tal-qtil taċ-ċelluli tal-kanċer medjat minn ċelluli T (mingħajr grupp ta 'ċelluli T) jista' jiddeduċi li BCAT2 għandu rwol onkoġeniku fil-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina. Għalhekk, l-assaġġ tal-kolonja tal-pjanċa u l-assaġġ tal-migrazzjoni/invażjoni transwell ġew utilizzati biex jivvalidaw din l-ipoteżi. Kif antiċipat, l-espressjoni eċċessiva ta 'BCAT2 tejbet b'mod sinifikanti l-proliferazzjoni, il-migrazzjoni u l-kapaċità ta' invażjoni taċ-ċelloli tat-tumur, u t-twaqqigħ ta 'BCAT2 soppressa b'mod sinifikanti dawn l-imgieba (Figura S18A-F, Informazzjoni ta' Appoġġ).

2.4. Validazzjoni ta' Relazzjoni Spazjali Esklussiva bejn BCAT2+ Ċellula tat-Tumur u CD8+Ċellola T minn TMA ta' Xiangya BLCA Cohort

Skont riżultati ta' esperimenti bulk RNA-seq, scRNA-seq, u vitro, aħna wrejna li BCAT2 għandu rwol immunosoppressiv fil-BLCA billi jrażżan ir-reklutaġġ u ċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli CD8+T. Madankollu, l-interazzjoni taċ-ċelloli tat-tumur BCAT2+ u ċ-ċelloli CD8+T għadha mhix magħrufa fil-livell tat-tessut uman. Fil-koorti Xiangya BLCA, immaġini rappreżentattivi u punteġġ ġenerali ta' IHC żvelaw korrelazzjoni negattiva bejn BCAT2 u CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Figura 5A, B). Tbajja b'ħafna kuluri IF taċ-ċelluli tat-tumur BCAT2+ (BCAT2+CK{19+) u ċelluli BCAT{2+CD{8+T saret f'TMA u analizzat semi-awtomatiku bl-użu tal- Pjattaforma ta 'kwantifikazzjoni panoramiċi TissueFAXS. Kif muri fil-Figura 5C, l-ambitu tal-espressjoni ta 'BCAT2 u CK19 kien fil-biċċa l-kbira koinċidenza. Bil-maqlub, l-ambitu tal-espressjoni ta' BCAT2 u CD8 kien distint u separat. Proporzjonijiet ta' koespressjoni dettaljati taċ-ċelluli BCAT2+CK{19+ u ċelluli BCAT2+CD{8+T kienu 87.29% u 5.09% (Figura 5D, E), li kienet konsistenti mal- mudell ta' espressjoni ta' BCAT2 f'scRNA-seq. F'TMA ġenerali, kien għad hemm differenza sinifikanti fil-proporzjon tal-koespressjoni bejniethom (Figura S19A, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Aktar importanti minn hekk, fl-analiżi multidimensjonali tal-gradjent tad-distanza (0–25, 25–50, 50–100, u 100–150 μm) madwar iċ-ċelluli tat-tumur BCAT2+, l-għadd taċ-ċelluli CD8+T żdiedu gradwalment minn qrib għal bogħod (Figura 5F; Figura S19B, Informazzjoni ta' Appoġġ). Flimkien, urejna li fil-livell tat-tessut uman, BCAT2 huwa wkoll prinċipalment espress fiċ-ċelluli tat-tumur, u ċ-ċellula tat-tumur BCAT2+ għandha relazzjoni spazjali esklussiva maċ-ċellula CD{8+T.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

2.5. Telf ta' BCAT2 Isaħħaħ l-Effikaċja tat-Terapia Anti-PD-1

B'impatt negattiv prominenti fuq TME u korrelazzjoni mill-qrib negattiva mal-imblokk inibitorju tal-punt ta 'kontroll, iqajjem interess kbir li jiġi esplorat l-effett sinerġistiku tat-telf ta' BCAT2 u trattament kontra l-PD- 1. Qabel l-immunoterapija, inbena mudell ta 'kanċer tal-bużżieqa tal-awrina taħt il-ġilda minn BCAT2 KD u jikkontrolla linji ta' ċelluli murini. Imbagħad, terapija kontra l-PD-1 u terapija ta 'kontroll ġew applikati għal ġrieden li jġorru t-tumur (Figura 6A). B'mod konsistenti mar-rwol onkoġeniku tagħha u l-mekkaniżmu ta 'regolazzjoni fuq il-kimokini in vitro, id-defiċjenza ta' BCAT2 inibixxi t-tkabbir tat-tumur u l-ħin ta 'sopravivenza fit-tul in vivo, billi rregola l-kimokini relatati CD8+T (Figura 6B–E; Figura S20A, Informazzjoni ta' Appoġġ). Fl-aspett tal-effikaċja tal-immunoterapija, għalkemm il-monoterapija kontra l-PD-1 setgħet inaqqas parzjalment il-piż tat-tumur, il-kotrattament ta' BCAT2 KD u antikorp monoklonali (mab) anti-PD-1 indika effett aħjar ta' soppressjoni tat-tumur u kiseb aktar benefiċċju tas-sopravivenza. Fil-ġurnata skedata, it-tumuri ġew maħsuda u ppreparati għal aktar analiżi. Parti minnhom ġiet diġerita f'sospensjoni ta 'ċellula waħda u wettqet analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. B'popolazzjoni simili ta 'lewkoċiti u ċelluli T (Figura S20B–E, Informazzjoni ta' Appoġġ) fit-tumur, proporzjon ogħla ta 'ċelluli CD8+T intwera fil-grupp ta' defiċjenza BCAT2 milli fil-grupp ta 'kontroll negattiv. Bl-istess mod, il-grupp ta 'terapija kombinata kellu infiltrazzjoni aktar massiva ta' CTLs mill-grupp ta 'monoterapija (Figura 6F-H). Aktar importanti minn hekk, indikaturi ta 'ċitotossiċità (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼, u Perforin) ta' CTLs ġew ukoll rinfurzati f'tumuri murini b'telf ta 'BCAT2 u trattament kombinat meta mqabbel mal-kontroll korrispondenti (Figura 6G, I-L). Il-partijiet l-oħra tat-tumuri saru f'sezzjonijiet iffriżati u implimentati tbajja 'IF. Kif mistenni, id-densità taċ-ċelluli CD8+T fir-reġjun ta 'interess (ROI) wriet l-istess tendenza bl-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss (Figura 6M, N). Dawn is-sejbiet indikaw li d-defiċjenza ta 'BCAT2 fuq iċ-ċelloli tat-tumur tista' tifforma TME infjammat u għandha effikaċja kbira mat-trattament tal-immunoterapija. Biex insemmu r-rwol taċ-ċelluli CD8+T fl-effett sinerġistiku tal-kotrattament, CD8𝛼 mab ġie applikat biex jantagonizzahom fil-ġrieden immuni-kompetenti (Figura S21A, Informazzjoni ta 'Appoġġ) u vvalida l-effett tat-tnaqqis tiegħu permezz ta' ċitometrija tal-fluss u IF (Figura S21B, C, Informazzjoni ta' Appoġġ). Ovvjament, wara t-tnaqqis, il-piż tat-tumur u l-ħin ta 'sopravivenza ġew maqluba b'mod sinifikanti (Figura S21D-G, Informazzjoni ta' Appoġġ). Dawn is-sejbiet indikaw li ċ-ċelluli CD8+T għandhom parti indispensabbli fl-effett sinerġistiku tat-terapija kombinata.

Figura 4. BCAT2 ivarja l-mudelli ta' espressjoni ta' CD8+kimokini relatati maċ-ċelluli T u jinibixxi l-kapaċità ċitotossika ta' CTLs. A,B) Il-mapep tas-sħana ta' immunoassays multipli ProcartaPlex juru varjazzjoni ta' sekrezzjoni ta' ċitokini u kemokini komuni f'BCAT2 OE, BCAT2 KD u gruppi ta' kontroll negattiv (n=3 għal kull grupp). C, D) L-istogrammi juru livelli normalizzati ta' espressjoni ta' mRNA u konċentrazzjonijiet ta' sekrezzjoni ta' proteini ta' CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, u CXCL10 f'BCAT2 OE (xellug), BCAT2 KD (lemin) u gruppi ta' kontroll negattiv (n {{ 15}} għal kull grupp). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0.001. E) Assaġġ tal-kimotassi jindika kapaċità differenti ta' kimotassi ta' CTLs f'BCAT2 OE, BCAT2 KD, u gruppi ta' kontroll negattiv (n=3 għal kull grupp). *p < 0.05; **p < 0.01. F) Assaġġ tal-qtil taċ-ċelluli tal-kanċer medjat minn ċelluli T jindika kapaċitajiet differenti ta 'qtil ta' ċelluli T kokulturati b'BCAT2 OE, BCAT2 KD, u linji ta 'ċelluli ta' kontroll negattiv (n=3 għal kull grupp). G) L-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss tindika attivitajiet differenti ta' ċelluli CD8+T fi gruppi ta' kokultura differenti (n=3 għal kull grupp).

Figura 5. Validazzjoni ta' relazzjonijiet spazjali esklussivi ta' ċelluli tat-tumur BCAT2+ u ċelluli CD8+T minn TMA tal-koorti Xiangya BLCA. A) Immaġini IHC ta 'BCAT2 u CD8 f'tipi infjammati u mhux infjammati ta' TME. Skala bar: 50 μm. B) Korrelazzjoni bejn BCAT2 u CD8 fuq il-bażi tal-punteġġi IHC tagħhom fit-TMA ġenerali. C) Immaġini IF b'ħafna kuluri ta 'BCAT2, CK19, CD8, u indiċi ta' kombinazzjoni f'tipi infjammati u mhux infjammati ta 'TME. Ċellula BCAT2+ (roża), ċellula CK19+ (cyan), ċellula CD8+T (oranġjo), u nukleu taċ-ċellula (blu). Skala bar: 50 μm. D,E) Rati ta' koespressjoni dettaljati taċ-ċelloli BCAT2+CK19+ u BCAT2+CD{8+ fil-kampjun tipiku. F) Analiżi tal-gradjent tad-distanza (0–25, 25–50, 50–100, u 100–150 μm) taċ-ċelluli CD8+T madwar ċelluli BCAT2+CK{19+ fiċ-ċelluli tipiċi kampjun.

Figura 6. It-telf ta' BCAT2 isaħħaħ l-effikaċja tat-terapija kontra l-PD-1. A) Dijagramma tal-fluss tal-pjan tat-trattament. B) Tumuri maħsuda ta' korsijiet ta' terapija differenti (n=5 għal kull grupp). C–E) Kwantifikazzjoni tal-volum tat-tumur, il-piż tal-ġisem, u l-ħin ta 'sopravivenza f'korsijiet ta' terapija differenti (n=5 għal kull grupp). ns: l-ebda sinifikat; *p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

Barra minn hekk, flimkien maċ-ċelloli tat-tumur, proporzjon żgħir ta' BCAT2 huwa espress ukoll fiċ-ċelloli CD8+T. Għalhekk, esplorajna aktar jekk il-livell ta' espressjoni differenti ta' BCAT2 fuq iċ-ċelluli CD8+T jistax jaffettwa l-attivitajiet tagħhom. Wara li tebgħat is-sospensjoni ta' ċellula waħda tal-milsa tal-marini b'antikorpi fluworexxenti BCAT2 u relatati maċ-ċelluli T, qabbilna proporzjonijiet ta' ċelluli CD8+ TNF-𝛼+T u CD8+ IFN-𝛾+T bejn BCAT 2+CD8+ u gruppi BCAT2−CD8+. Interessanti, sibna li l-proporzjonijiet kienu simili bejn iż-żewġ gruppi, u żvelaw li l-attività taċ-ċellula CD8+T hija indipendenti mil-livell ta 'espressjoni tagħha ta' BCAT2 (Figura S22A-C, Informazzjoni ta 'Appoġġ).

2.6. BCAT2 Tbassar Rispons għall-Immunoterapija f'diversi Koorti ta' Immunoterapija fid-Dinja Reali

Is-sejbiet ta 'hawn fuq urew rwol immunosoppressiv ta' BCAT2 fit-TME u l-effett sinerġetiku li tgħaqqad it-telf ta 'BCAT2 ma' terapija anti-PD-1. Madankollu, il-potenzjal ta 'tbassir tiegħu dwar l-effikaċja ta' l-immunoterapija mhuwiex ċar. Għalhekk, fil-koorti TCGA-BLCA, il-punteġġi ta 'arrikkiment ta' mogħdijiet relatati mal-immunoterapija tqabblu bejn gruppi BCAT2 għoljin u baxxi. Kif muri fil-Figura S23A (Informazzjoni ta 'Appoġġ), il-grupp b'BCAT2 baxx kellu ġeni aktar attivi f'mogħdijiet relatati mal-immunoterapija, li jistgħu jiddeduċu li l-espressjoni baxxa ta' BCAT2 tirrappreżenta stat aktar sensittiv għall-immunoterapija. Għal aktar validazzjoni, 58 pazjent bil-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina li invażiva fil-muskoli (MIBC) li aċċettaw terapija neoadjuvant anti-PD-1 fl-isptar tagħna ġew inklużi fil-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA. Immaġini rappreżentattivi IHC, IF, u CT tar-responsed u li ma rrispondewx implikaw li l-livell ta’ espressjoni ta’ BCAT2 għandu relazzjoni mill-qrib mal-effikaċja tal-immunoterapija — individwu b’livell baxx ta’ espressjoni ta’ BCAT2 huwa aktar probabbli li jirrispondi għall-immunoterapija minn individwu b’ livell għoli ta' espressjoni BCAT2 (Figura 7A–C). Barra minn hekk, il-punteġġ IHC tal-koorti tal-immunoterapija Xiangya BLCA u l-matriċi tal-espressjoni tal-mRNA tal-koorti IMvigor210 indikaw korrelazzjoni negattiva robusta bejn BCAT2 u PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=-0.41, p < 0.001) (Figura S23B, C, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Għalhekk, qabbilna direttament l-effikaċja tal-immunoterapija bejn il-gruppi ta 'BCAT2 għoli u baxx fil-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA u sibna li l-grupp ta 'BCAT2 baxx kellu proporzjon ogħla b'mod sinifikanti ta' rispons mill-grupp ta 'BCAT2 għoli (p=0.001) (Figura 7D). Barra minn hekk, ivvalutajna l-valuri ta’ tbassir ta’ BCAT2, PD-L1, u indiċi ta’ kombinazzjoni (BCAT2+PD-L1) dwar ir-rispons patoloġiku għall-immunoterapija u sibna l-prestazzjoni kbira tal-indiċi ta’ kombinazzjoni (BCAT2+PD- L1) dwar l-eżattezza tat-tbassir (Figura 7E). B'mod ta 'ispirazzjoni, fl-aspett tar-riżultat tas-sopravivenza, il-grupp BCAT2 baxx kellu sopravivenza mingħajr mard (DFS) itwal mill-grupp BCAT2 għoli (p=0.032) (Figura 7F), li juri l-valur tal-pronjosi ta' BCAT2 f' Immunoterapija BLCA. Fil-klinika, individwi b'TME tad-deżert huma aktar probabbli li jkollhom effikaċja limitata ta 'immunoterapija minn individwi b'TME infjammat, u jenfasizzaw aktar l-importanza ta' indikaturi tat-tbassir. Konsegwentement, għażilna l-individwi kollha b'TME tad-deżert fil-koorti IMvigor210 u wettaqna l-valutazzjoni komprensiva. F'paragun dirett tal-livell ta 'espressjoni ta' BCAT2 fost gruppi ta 'rispons differenti, il-grupp CR (responder) kellu livell ta' espressjoni b'mod sinifikanti aktar baxx ta 'BCAT2 mill-gruppi SD u PD (nonresponder) (Figura 7G). Aktar importanti minn hekk, l-indiċi tal-kombinazzjoni (BCAT2+PD-L1) kellu wkoll prestazzjoni terribbli fuq l-eżattezza tat-tbassir (Figura 7H). Għalkemm ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fis-sopravivenza ġenerali (OS) bejn gruppi BCAT2 għoljin u baxxi fit-tip tad-deżert tal-koorti IMvigor210, it-tendenza ta 'pronjosi kienet għadha simili għar-riżultat tal-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA (Figura 7I). Minbarra l-PD-L1, l-instabbiltà tal-mikrosatelliti (MSI) hija tbassir essenzjali l-ieħor tal-effikaċja tal-immunoterapija. L-istatus ta’ tiswija ta’ nuqqas ta’ qbil (MMR)—MMR profiċjenti (pMMR) u MMR defiċjenti (dMMR) iżommu konformità għolja ma’ MSI ta’ frekwenza baxxa (MSI-L) u MSI ta’ frekwenza għolja (MSI-H).[13] Għalhekk, għamilna evalwazzjoni komprensiva tal-individwi kollha fil-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA ibbażata fuq ir-riżultati tat-tbajja' ta' erba 'ġeni markaturi MMR (MLH1, MSH2, MSH6, u PMS2). Ir-riżultat żvela proporzjon ogħla b'mod sinifikanti ta 'dMMR (MSI-H) fil-grupp BCAT2 baxx meta mqabbel mal-grupp BCAT2 għoli (p=0.02) (Figura S23D, E, Informazzjoni ta' Appoġġ). Barra minn hekk, aħna evalwajna l-valuri ta 'tbassir ta' MMR, BCAT2, u indiċi ta 'kombinazzjoni (MMR + BCAT2) dwar l-effikaċja ta' l-immunoterapija u sibna li l-indiċi ta 'kombinazzjoni (MMR + BCAT2) kellu prestazzjoni eliġibbli fuq l-eżattezza tat-tbassir (Figura S23F, Informazzjoni ta' Appoġġ). Flimkien, dawn is-sejbiet urew li BCAT2 huwa kkwalifikat biex jaġixxi bħala tbassir kumplimentari tal-effikaċja tal-immunoterapija BLCA. Fl-aħħarnett, il-valur ta 'tbassir ta' BCAT2 b'reazzjoni għall-immunoterapija ġie esplorat f'diversi tipi ta 'kanċer. Sibna li individwi b'espressjoni għolja ta 'BCAT2 wrew rata ta' rispons sinifikament ifqar (p=0.04) fil-koorti GSE35640 (melanoma) (Figura 7J). Għalkemm ma kien hemm l-ebda differenzi sinifikanti fir-rata ta’ rispons bejn il-gruppi BCAT2 għoljin u baxxi f’GSE173839 (kanċer tas-sider), GSE135222 (NSCLC), u koorti Gide 2019 (melanoma), pazjenti b’espressjoni baxxa ta’ BCAT2 xorta kienu aktar probabbli li jkollhom rispons pożittiv. għall-immunoterapija (Figura 7K–M).

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.7. Il-Valur ta 'BCAT2 fit-Tbassir tas-sottotip molekulari u t-terapija ta' preċiżjoni ta 'gwida

B'eteroġeneità kbira eżistenti fil-klassifikazzjoni tal-istoloġija tradizzjonali, evidenza dejjem tiżdied uriet li s-sottotip molekulari huwa kapaċi jipprovdi klassifikazzjoni aktar preċiża fuq il-bażi tal-profil tat-traskriptome f'BLCA.[14] Barra minn hekk, b'karatteristiċi immunoloġiċi simili fl-istess sottotip, il-klassifikazzjoni molekulari għandha potenzjal kbir biex tbassar TME u tiggwida terapija ta' preċiżjoni fil-klinika.[15] Permezz ta 'analiżi komprensiva ta' sistemi ta 'sottotip molekulari differenti fil-koorti TCGA-BLCA, sibna li individwi b'espressjoni baxxa ta' BCAT2 huma aktar probabbli kklassifikati f'sottotip bażali, akkumpanjati minn mogħdijiet attivati ​​ta 'differenzjazzjoni bażali, differenzjazzjoni EMT, differenzjazzjoni immuni, rispons ta' interferon, u l-bqija. Individwi b'espressjoni għolja ta 'BCAT2 huma prinċipalment klassifikati f'sottotipi luminali, akkumpanjati minn mogħdijiet attivi ta' differenzjazzjoni luminali, differenzjazzjoni uroteljali, u Ta (Figura S24A, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Skont il-kunsens tas-sottotip molekulari, is-sottotip bażali għandu aktar livell ta 'infiltrazzjoni ta' limfoċiti effetturi u passaġġ ta 'sinjalazzjoni IFN-𝛾 aktar attiv mis-subtip luminali,[16] li jimplika effikaċja aħjar tal-immunoterapija. Imbagħad, l-AUC ġiet utilizzata biex tevalwa l-eżattezza tat-tbassir. B'mod tal-għaġeb, ħlief is-sistema tas-sottotip Baylor (AUC=0.76), il-biċċa l-kbira tal-AUC kienet lil hinn minn 0.90 f'sistemi oħra (Figura S24B, Informazzjoni ta' Appoġġ), li tfisser preċiżjoni robusta ta' tbassir ta' BCAT2 f' is-sottotip molekulari. Biex tesplora aktar ir-rwol tagħha fit-tbassir tal-effikaċja ta 'terapiji oħra, qabbilna l-attività ta' terapija fil-mira tar-riċettur tal-fattur tat-tkabbir epidermali (EGFR) u mogħdijiet relatati mar-radjuterapija bejn gruppi BCAT2 għoljin u baxxi. B'attivitajiet ovvji regolati 'l fuq, pazjenti fil-grupp b'BCAT2 baxx huma aktar probabbli li jkollhom rispons pożittiv għal terapija fil-mira EGFR u radjuterapija (Figura S24C, Informazzjoni ta' Appoġġ). Għat-titjib tal-affidabbiltà tat-tbassir fuq is-sottotip molekulari u s-sensittività tat-trattament, tmien koorti BLCA (koorti Xiangya BLCA, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329, u E-MTAB {{28} koorti BLCA) u terapija waħda kienu applikat għal validazzjoni esterna. Flimkien ma 'eżattezza eċċellenti ta' tbassir, instabu sejbiet simili f'dawn il-koorti (Figuri S25-S27, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Mard iperprogressiv (HPD) huwa stat estremament insensittiv għall-immunoterapija. Għall-esplorazzjoni tal-influwenza tal-BCAT2 fuq l-HPD, inġabru bijomarkaturi assoċjati mal-HPD minn studji preċedenti[17] u s-CNV tal-bijomarkaturi tqabblu bejn gruppi BCAT2 baxxi u għoljin. Ħlief għall-EGFR, ir-rati ta 'amplifikazzjoni CNV ta' bijomarkaturi oħra assoċjati pożittivi għall-HPD (simbolu aħmar) kienu ogħla fil-grupp ta 'BCAT2 għoli, speċjalment MDM2 (p=0.0116). Ir-rati ta 'tħassir ta' CNV ta 'bijomarkaturi assoċjati negattivi HPD (simbolu aħdar) kienu aktar baxxi fil-grupp ta' BCAT2 għoli (Figura S24D, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Ir-riżultat indika li pazjenti b'espressjoni għolja ta' BCAT2 għandhom riskju potenzjali ta' HPD waqt l-immunoterapija. Il-kimoterapija neoadjuvanti (NAC) hija terapija kruċjali fil-BLCA. Markers li jbassru r-rispons għan-NAC fil-BLCA inġabru minn reviżjoni ta' Buttigliero et al.[18] u r-rati ta' mutazzjoni tagħhom tqabblu bejn iż-żewġ gruppi. Ibbażat fuq rati ta 'mutazzjoni ġenerali ogħla ta' bijomarkaturi u mutazzjoni aktar frekwenti ta 'RB1 fil-grupp ta' BCAT2 baxx, spekulajna li individwu b'espressjoni baxxa ta 'BCAT2 għandu effikaċja aħjar ta' NAC fil-klinika (Figura S24E, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Għalhekk, id-database Drugbank ġiet utilizzata biex tqabbel l-effikaċja ta 'diversi reġimi ta' kimoterapija komuni bejn żewġ gruppi u sabet li individwi b'espressjoni baxxa ta 'BCAT2 huma aktar probabbli li jirrispondu għall-kimoterapija. Barra minn hekk, il-grupp b'BCAT2 baxx wera wkoll effikaċji aħjar f'reġimi komuni ta 'immunoterapija u terapija ERBB. B'mod mhux mistenni, pazjenti b'espressjoni għolja ta 'BCAT2 probabbilment jiksbu effetti kurattivi aħjar fit-terapija antianġjoġenika (Figura S24F, Informazzjoni ta' Appoġġ). B'mod kollettiv, individwi b'espressjoni baxxa ta 'BCAT2 jappartjenu għal sottotip molekulari infjammat, sottotip bażali, li jfisser rispons aktar pożittiv għal immunoterapija, kimoterapija, radjuterapija, terapija fil-mira EGFR, u terapija ERBB. Sfortunatament, pazjenti b'espressjoni għolja ta 'BCAT2 għandhom rispons fqir għal dawn it-trattamenti. Madankollu, it-terapija antianġjoġenika tista 'tkun glimmer ta' dawl għalihom.

Figura 7. BCAT2 tbassar rispons għall-immunoterapija f'diversi koorti ta 'immunoterapija tad-dinja reali. A) Immaġini IHC ta 'BCAT2 u PD-L1 bejn rispons u nonresponder fil-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA. Skala bar: 50 μm. B) Immaġini IF b'ħafna kuluri ta 'BCAT2 u PD-L1 bejn rispons u nonresponder fil-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA. Skala bar: 50 μm. Ċellula BCAT2+(aħdar), ċellula PD-L1+(isfar), u nukleu taċ-ċellula (blu). C) Immaġini CT tad-differenza fl-effikaċja tal-immunoterapija bejn individwi b'livelli ta 'espressjoni għolja u baxxi ta' BCAT2. Il-vleġġa ħamra tipponta lejn iż-żona tat-tumur. D) Differenza ġenerali fir-rata ta 'rispons bejn gruppi BCAT2 għoljin u baxxi fil-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA. E) Preċiżjoni ta' tbassir ta' BCAT2, PD-L1, u indiċi ta' kombinazzjoni (BCAT2+PD-L1) dwar ir-rispons għall-immunoterapija fil-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA. F) Differenza fis-sopravivenza mingħajr mard (DFS) bejn gruppi BCAT2 għolja u baxxi fil-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA. G) Differenzi fil-livell ta 'espressjoni ta' BCAT2 fost gruppi CR, PR, SD, u PD fit-tip tad-deżert tal-koorti IMvigor210. *p < 0.05; ns: l-ebda sinifikat. H) Preċiżjoni ta' tbassir ta' BCAT2, PD-L1, u indiċi ta' kombinazzjoni (BCAT2+PD-L1) dwar ir-rispons għall-immunoterapija f'tip ta' deżert ta' koorti IMvigor210. I) Differenza fis-sopravivenza ġenerali (OS) bejn gruppi BCAT2 għoljin u baxxi f'tip ta' deżert ta' koorti IMvigor210. J–M) Differenzi fir-rispons għall-immunoterapija bejn gruppi BCAT2 għoljin u baxxi fil-koorti GSE35640, GSE173839, GSE135222, u Gide2019.

3. Diskussjoni

Bħala enzima ewlenija fil-proċess tal-kataboliżmu tal-BCAAs, riċerka preċedenti ffukat prinċipalment fuq ir-rwol relatat mal-metaboliżmu ta 'BCAT2 fil-mard, bħall-obeżità, id-dijabete u l-arritmija. Ma et al. wera li t-tneħħija ta' BCAT2 fit-tessut xaħmi tista' taċċellera l-kannella tax-xaħam u t-termoġenesi, li twassal għal rata mnaqqsa ta' obeżità fil-ġrieden.[19] Permezz tas-sejbien ta 'kampjuni tad-demm ta' aktar minn 2000 individwu, Gerszten et al. wera profil ta' metabolit relatat mad-dijabete u sabet li l-BCAAs trasformati BCAT2-jaqdu rwol kruċjali fl-iżvilupp tal-mard.[20] Portero et al. żvelat li mutazzjonijiet bla sens ta' BCAT2p.Q300*/p.Q300* jirriżultaw f'livelli elevati ta' BCAAs u jinduċu arritmiji fil-ġrieden.[21] Riċentement, ftit studji sabu li BCAT2 għandu relazzjoni mill-qrib mal-kanċer. Lei et al. żvelat li d-degradazzjoni medjata mill-aċetilazzjoni ta' BCAT2 tista' tittardja l-iżvilupp ta' adenokarċinoma tal-kanal tal-frixa (PDAC) billi tirregola l-livell tal-metaboliżmu tal-BCAAs.[22] Wang et al. ikkunsidra li l-livell ta' traskrizzjoni mrażżna ta' BCAT2 iwassal għal livell imnaqqas ta' glutamate intraċellulari, li jistimula ferroptosis taċ-ċelluli tal-epatoma.[23] Madankollu, ir-riċerka eżistenti kollha enfasizzat l-influwenza tal-kataboliżmu tal-BCAA medjat bCAT2-fuq il-proċess bijoloġiku tal-kanċer aktar milli tesplora mekkaniżmu ġdid fjamant. F'dan l-istudju, aħna żvelaw ir-rwol immunosoppressiv ta 'BCAT2 fit-TME għall-ewwel darba. L-applikazzjoni tal-immunoterapija tiffina mill-ġdid it-trattament tal-kanċer, bi kwalità ta 'għajxien terribbli u żmien ta' sopravivenza fit-tul. Madankollu, minħabba l-eteroġeneità tas-sistema ekoloġika immuni tat-tumur, porzjon biss ta 'individwi jiksbu effikaċja sodisfaċenti. TME hija sistema kkumplikata, magħmula minn ċelloli tat-tumur, ċelloli immuni, ċelloli stromali, u kapillari.[24] Skont il-livell ta' infiltrazzjoni ta' CTLs, it-TME jista' jiġi kklassifikat f'tipi infjammati u mhux infjammati b'mod ġenerali.[25] Evidenza dejjem tikber indikat li TME infjammat għandu rwol pożittiv fil-ħolqien ta 'risponsi immuni effettivi kontra t-tumur waqt it-terapija.[26] Għalhekk, analizzajna b'mod komprensiv indikaturi multipli relatati mat-TME u sibna li l-espressjoni għolja ta 'BCAT2 tifforma TME mhux infjammat, b'ċiklu ta' immunità tal-kanċer imxekkel, mudell ta 'espressjoni ripressiva ta' profil ta 'chemokine, molekuli MHC, u livell ta' infiltrazzjoni insuffiċjenti ta 'TIICs. Barra minn hekk, BCAT2 huwa relatat b'mod negattiv ma 'TIS u ġeni effettur ta' ICB, li jimplika li individwi b'espressjoni għolja ta 'BCAT2 huma aktar probabbli li ma jirrispondux għall-immunoterapija. Biex nivvalidaw l-ipoteżi tagħna, qabbilna r-rata ta 'rispons bejn il-gruppi BCAT2 għolja u baxxa fil-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA u koorti ta 'immunoterapija oħra. B'mod sorprendenti, kien hemm differenzi sinifikanti f'koorti multipli, li indikaw li BCAT2 huwa kapaċi wkoll li jbassar l-effikaċja tal-immunoterapija, speċjalment fil-BLCA. Barra minn hekk, scRNA-seq intuża għall-esplorazzjoni tal-mekkaniżmu regolatorju ta 'BCAT2 f'TME u indika li l-attività ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni relatati ma' cytokine / chemokine, mogħdija ta 'sinjalazzjoni ta' chemotaxis taċ-ċelluli T, u mogħdija ta 'sinjalazzjoni tal-migrazzjoni taċ-ċelluli T għandhom korrelazzjonijiet negattivi sinifikanti ma' BCAT2. Bħala netwerk ta 'regolamentazzjoni kritika, iċ-ċitokini u l-kimokini huma indispensabbli għat-traffikar ta' diversi ċelloli immuni f'TME. Is-sistema tal-kimokini għandha erba' superfamilies: C, CC, CXC, u CX3C, b'redundancy konsiderevoli fil-parir ta' ligands u riċetturi.[27] Iċ-ċitokini jistgħu jinqasmu f'sottofamilji Th1, Th2, u Th17 ibbażati fuq il-funzjoni bijoloġika tagħhom.[28] Permezz tat-tnixxija ta' livelli differenti minnhom, il-ġlieda bejn iċ-ċelloli tat-tumur u ċ-ċelloli immuni hija biżżejjed biex tipprogramma mill-ġdid il-karatteristiċi tat-TME.[29] Madankollu, fost il-biċċa l-kbira taċ-ċitokini u l-kimokini, huwa meħtieġ li jiġi eżaminat l-aktar raggruppament siewi. Bl-użu ta' panel ta' immunoassaġġ ta' 34-ċitokini u kimokini, aħna żvelajna li kimokini inklużi CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, u CXCL10, huma korrelatati b'mod negattiv b'mod qawwi mal-espressjoni ta' BCAT2 fiċ-ċellula tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina tal-bniedem u tal-marieni. Huwa magħruf sew li CXCL9 u CXCL10 huma responsabbli għar-reklutaġġ ta' ċelluli CD8+T f'TME.[30] Biex niżguraw il-funzjoni ta 'CCL3, CCL4, u CCL5, fittixna riċerka preċedenti. Harlin et al. għamel użu minn arrays ta' proteini u qPCR biex jiżvela li r-regolazzjoni 'l fuq ta' CCL3, CCL4, u CCL5 hija kapaċi tippromwovi l-migrazzjoni taċ-ċelluli CD8+T fil-melanoma.[31] Noman et al. sabet li żieda fil-popolazzjoni ta' sekrezzjoni ta' CCL5 tgħin fl-istabbiliment ta' TME proinfjammatorju billi jittraffika CTLs fit-tessut tal-kanċer tal-kolorektum.[32] Permezz ta 'IHC u RNA-seq ta' profil ta 'chemokine f'koorti multipli, Romero et al. wera li CCL4 u CCL5 għandhom assoċjazzjoni qawwija mal-livell ta' infiltrazzjoni taċ-ċelluli CD8+T fil-kanċer tal-frixa.[33] Għalhekk, ikkunsidrajna li l-kimokini relatati maċ-ċelluli CD8+T huma kimokini ewlenin regolati minn BCAT2 fil-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina. Għalkemm urejna l-korrelazzjonijiet negattivi robusti bejn il-BCAT2 u l-kimokini relatati maċ-ċelluli CD8+T, il-mekkaniżmu regolatorju sottostanti bejniethom għad irid jiġi esplorat aktar. L-istudju ta' Peterson et al. wera li l-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar tal-MAP kinase (MAPK) tista' tinduċi l-produzzjoni ta' CX3CL1.[34] Xu et al. żvelat li l-mogħdija tas-sinjalar JAK-STAT irregolat is-sekrezzjoni ta' kimokini relatati ma' Th1-, u kkawża tnaqqis fil-livell ta' infiltrazzjoni ta' TILs.[35] Riċentement, Peng et al. sabet li demethylase JMJD3 jista 'jinibixxi l-espressjoni ta' CD4+chemokines relatati maċ-ċelluli T u jnaqqas il-livell ta 'infiltrazzjoni taċ-ċelluli T taċ-ċitotossiċità fit-TME, li jirrappreżenta rwol kruċjali ta' modifika epiġenetika fir-regolazzjoni tal-espressjoni tal-chemokine.[36] Mayo et al. żvela wkoll li inibitur epiġenetiku, histone deacetylase 1, għandu kapaċità kbira li jrażżan l-espressjoni ta 'CXCL8 permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija ta' sinjalazzjoni tal-fattur nukleari-𝜅B (NF-𝜅B).[37] Barra minn hekk, bħala simboli tal-metaboliżmu taċ-ċelluli tat-tumur, glikolisi aerobika u speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS), li jindikaw prestazzjonijiet kbar fuq l-induzzjoni ta' espressjoni ta 'CXCL8 u CXCL14 billi jgħollu l-attivitajiet ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ta' NF-𝜅B u proteina attivatur tal-fattur ta 'traskrizzjoni 1 (AP{93 }}).[38] Interessanti, fl-istudju tagħna, mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ta' NF-𝜅B, STAT, u MAPK kienu arrikkit b'mod sinifikanti bejn linji taċ-ċelluli BCAT2 għoljin u baxxi (Figura 3K; Figura S16A, B, Informazzjoni ta 'Appoġġ). Għalhekk, flimkien ma 'l-istudji ta' hawn fuq, se nesploraw aktar il-molekula ewlenija fil-mekkaniżmu ta 'regolazzjoni ta' BCAT2 u kimokini relatati ma' CD8+T. Ir-rata ta' rispons oġġettiv limitat ta' monoterapija b'ICB twassal għall-miġja ta' strateġija ta' terapija kombinata. Għall-konverżjoni ta 'TME mhux immunoloġiku f'TME immunoloġiku, Wolchok et al. Applika trattament konġunt ta' nivolumab (terapija kontra l-PD-1) u ipilimumab (terapija kontra CTLA-4) f'pazjenti b'melanoma u sabet effett kurattiv inkoraġġanti, li jatribixxi għal priming, attivazzjoni u qtil sinkroniċi mtejba ta' CTLs .[39] Aktar milli tikkombina ma 'tip ieħor ta' ICB, kimoterapija flimkien ma 'immunoterapija hija l-għażla ta' terapija alternattiva. Bħala reġim ta 'trattament ta' l-ewwel linja għal karċinoma uroteljali avvanzata, koppja ta 'studji sabu li kimoterapija bbażata fuq cisplatin hija kapaċi li tifforma TME proinfjammatorju billi żżid il-livell ta' espressjoni tal-klassi MHC I fuq ċelluli dendritiċi u tagħmel ħsara lill-MDSCs u Tregs.[40] B’kumbinazzjoni, Homma et al. żvelat li mediċina oħra ta' kimoterapija komuni għall-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina—gemcitabine—tista' ttejjeb il-kwantità ta' infiltrazzjoni taċ-ċelluli CD8+T u tfixkel iċ-ċelloli immuni immunosoppressivi fit-TME.[41] Fl-esperiment prekliniku tagħna fuq l-annimali, il-kotrattament ta’ telf ta’ BCAT2 u anti-PD-1 mab wera effikaċja kontra t-tumur aktar distinta meta mqabbel mal-monoterapija ta’ anti-PD-1 mab fi ġrieden immuno-kompetenti, li jipprovdi trattament innovattiv strateġija għal pazjenti b'reżistenza ICB. Sadanittant, permezz ta 'analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss u IF, urejna li t-twaqqigħ ta' BCAT2 mhux biss jirrekluta aktar popolazzjoni ta 'CTLs f'TME iżda wkoll isaħħaħ l-attività tal-qtil ta' CTLs. Bl-istess mod, Peng et al. sabet li l-espressjoni żejda ta 'LGALS2 tnaqqas il-kwantità ta' CTLs li jinfiltraw kif ukoll bijomarkaturi ċitotossiċi fil-ġrieden li jġorru l-kanċer tas-sider.[42] Yang et al. wera li CXCL13 huwa kapaċi li jżid ir-rispons għall-immunoterapija f'mudelli ta' ġrieden tal-kanċer tal-ovarji billi jżid il-livell ta' infiltrazzjoni taċ-ċelluli CD8+T u l-livell ta' sekrezzjoni ta' GZMB, IFN-𝛾, u IL-2.[43] Akkumpanjament ta 'rispons aktar b'saħħtu kontra l-kanċer, it-terapija kombinata tkompli tħarbat il-linja eżistenti ta' feedback immuni, li probabbilment twassal għal effetti sekondarji severi. Skont il-mudell tal-espressjoni ta 'BCAT2 fil-livell ta' siRNA, espress speċifikament fiċ-ċelloli tat-tumur aktar milli f'ċelloli immuni u ċelloli endoteljali, nistgħu preliminarjament niddeduċu li t-telf ta 'BCAT2 jew l-inibitur ta' BCAT2 huwa inqas probabbli li jirriżulta f'effetti ħżiena terribbli. Madankollu, għad iridu jiġu esplorati l-aħjar dożaġġ u l-intervall tal-ħin tal-inibitur BCAT2 u anti-PD-1 mab f'terapija kombinata.

Biex niggwidaw it-terapija ta 'preċiżjoni f'individwi, aħna kkorrelajna BCAT2 mas-sottotip molekulari ta' BLCA u bijomarkaturi kritiċi ta 'diversi terapiji. Ibbażat fuq tbassir kredibbli f'koorti multipli, sibna li l-immunoterapija, il-kimoterapija, ir-radjuterapija u t-terapija fil-mira EFGR huma adattati għal pazjenti b'espressjoni baxxa ta 'BCAT2. Terapija antianġjoġenika hija rakkomandata għal pazjenti b'espressjoni għolja ta' BCAT2. Differenti mill-proċess ikkumplikat ta 'skoperta ta' sottotipi molekulari, BCAT2 huwa tbassir portabbli għal terapija ta 'preċiżjoni. Inevitabbilment, hemm xi limitazzjonijiet fl-istudji tagħna. L-ewwel, id-daqsijiet tal-kampjun u l-ħin ta 'segwitu tal-koorti ta' Xiangya BLCA u l-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA kienu limitati. Irridu nkabbru aktar id-daqs tal-kampjun u nkomplu s-segwitu standardizzat. It-tieni, bħala koorti fid-dinja reali, il-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA kien fihom għażliet ta' kirurġija differenti li probabbilment ikkawżaw preġudizzju potenzjali. Aħna se nkabbru aktar il-koorti tagħna u nwettqu analiżi tas-sottogrupp ibbażata fuq l-istess għażla ta 'kirurġija. It-tielet, l-effett kooperattiv tat-terapija kombinata in vivo jeħtieġ li jiġi vvalidat aktar bl-użu tal-applikazzjoni tas-sistema tal-inibitur BCAT2. Fil-qosor, bħala rwol immunosoppressiv fit-TME ta 'BLCA, BCAT2 huwa mira emerġenti f'terapija kombinata ta' ICB u bijomarkatur preċiż ta 'terapija ta' preċiżjoni.

Benefiċċji ta' cistanche tubulosa-ssaħħaħ is-sistema immuni

4. Taqsima Sperimentali

cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1.5 u l-valur p aġġustat < 0.05. Analiżi tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) u tal-Enċiklopedija ta' Kjoto tal-Ġeni u l-Ġenomi (KEGG) saru fuq DEGs identifikati permezz tal-pakkett ClusterProfiler R.[51] Il-pakkett Seurat R bl-algoritmu Findmarker ġie applikat biex jiġi kkalkulat il-livell ta 'espressjoni ta' BCAT2 fuq ċelloli epiteljali f'scRNA-seq. Fuq il-bażi ta 'klassifikazzjoni varjata tal-espressjoni tal-ġeni skont il-valur tal-bidla (FC), ġiet implimentata analiżi tal-arrikkiment tas-sett tal-ġeni (GSEA) biex jiġu ġġudikati korrelazzjonijiet pożittivi u negattivi. Identifikazzjoni ta 'DEGs Immune Relatati: Il-pakkett ESTIMATE R kien impjegat biex jikkalkula l-punteġġi immuni u stromali fil-koorti TCGA-BLCA. Skont il-valur medjan ta 'żewġ punteġġi u l-livell ta' espressjoni ta 'BCAT2, il-pakkett Limma R ġie applikat biex jidentifika DEGs pożittivi/negattivi relatati mal-immunità u stromali. Dijagramma Venn R pakkett intuża biex tieħu l-intersezzjoni ta 'diversi gruppi u tagħmel ċerti DEGs komuni. Klassifikazzjoni ta 'Individwi li Jużaw Sottotipi Molekulari ta' BLCA: Seba 'sottotipi molekulari ta' BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT, u Consensus) ġew applikati b'mod wiesa 'fl-klinika għall-valutazzjoni tal-karatteristiċi tat-TME u l-effikaċja ta' diversi terapiji.[52] B'konsiderazzjoni ta 'l-interazzjoni kumplessa ta' sottotipi varji, aħna kollettivament qassmu f'żewġ kategoriji ewlenin-sottotipi bażali u luminali.[16] Pakketti R ta 'Consensus MIBC u BLCAsubtyping ġew impjegati biex jikklassifikaw individwi f'sottotipi speċifiċi. Wara n-normalizzazzjoni, l-erja taħt il-kurva ROC (AUC) ġiet utilizzata biex tiġi vvalutata l-affidabilità ta 'BCAT2 fit-tbassir tal-klassifikazzjoni. Valutazzjoni ta' Terapija ta' Preċiżjoni tal-Pazjenti: Kif muri fl-istudju preċedenti tagħna,[53] serje ta 'firem kritiċi tal-ġeni, li jistgħu jbassru l-effikaċja tal-kimoterapija, radjuterapija, terapija mmirata, u immunoterapija, inġabru minn studji u databases differenti.[16, 54] L-algoritmu ssGSEA intuża biex jiġi kkalkulat il-punteġġi ta' arrikkiment tal-firem tal-ġeni.[55] Linji taċ-Ċelloli: Ċelloli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-bniedem (T24) u ċelluli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina tal-marini (MB49) inxtraw minn Procell Life Science & Technology (Wuhan, iċ-Ċina) u Meisen CTCC (Jinhua, iċ-Ċina), rispettivament. Inżammu f'medja DMEM (BasalMedia, iċ-Ċina) b'10% serum bovin tal-fetu (FBS) (BI, Iżrael), 1% peniċillina u streptomycin (NCM Biotech, iċ-Ċina), u kkultivati ​​f'inkubatur f'37 sena. temperatura ta 'grad li fiha 5% CO2. Kostruzzjoni u RNA-seq ta' Ċelloli ta' Trasfezzjoni Stabbli: Il-vettur lentiviral plenti-BCAT2-flag-puromycin (GV341) ġie ddisinjat u mibni minn GeneChem (Shanghai, iċ-Ċina) għal espressjoni żejda ta' BCAT2-stabbli (BCAT2 OE) linja taċ-ċelluli u l-kontroll negattiv tagħha (oe-vector). Barra minn hekk, BCAT2- short hairpin RNA (shRNA) ġie kklonat f'vettur GV112-lentiviral minn GeneChem (Shanghai, iċ-Ċina) għal linja taċ-ċelluli BCAT2-knock down (BCAT2 KD) stabbli . Sekwenzi fil-mira ta 'shRNA ġew elenkati fit-Tabella S3 (Informazzjoni ta' Appoġġ). Imbagħad, lentiviruses BCAT2 rikombinanti ġew trasfettati f'ċelloli oġġettivi skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. 2 ug mL-1 puromycin (Amersco, USA) kien impjegat biex jiffiltra ċelluli ta 'trasfezzjoni stabbli għal tlett ijiem. Western blot u PCR ta 'traskrizzjoni inversa kwantitattiva (qRT-PCR) ġew applikati biex tiġi vvalidata l-effikaċja tat-trasfezzjoni. Eventwalment, intgħażlet ċellula ta 'trasfezzjoni stabbli bl-aħjar effikaċja għal RNA-seq u esperimenti ulterjuri. Tliet kampjuni duplikati ta 'kull linja taċ-ċelluli ntbagħtu lill-pjattaforma BGI RNA-seq (Shenzhen, iċ-Ċina). Il-kriterji għall-għażla tad-DEGs u l-analiżi tal-mogħdijiet ta' arrikkiment kienu l-istess bħal dawk murija f'2.3 (analiżi tal-mogħdijiet ta' arrikkiment). ProcartaPlex Multiple Immunoassays għall-Individwazzjoni tal-Livell ta' Sekrezzjoni ta' Chemokines u Ċitokini tal-Linji taċ-Ċelloli tal-Kanċer: Panel tal-immunoassaġġ ProcartaPlex tal-Bniedem (Cat: EPX340-12167-901) u panel tal-immunoassay ProcartaPlex tal-ġurdien (Cat: EPX{{{0}) nxtraw minn ThermoFisher Scientific (Massachusetts, USA) biex jinstabu livelli ta' espressjoni ta' proteini ta' aktar minn 30 kemokini u ċitokini kruċjali f'ċelluli stabbli tal-kanċer tat-trasfezzjoni. Fil-qosor, is-supernatanti tal-kultura taċ-ċelluli nġabru minn 24-pjanċa tal-bir u ċ-ċentrifugazzjoni biex jitneħħew iċ-ċelloli u l-fdalijiet taċ-ċelluli. Imbagħad, is-supernatanti li jiċċaraw ġew inkubati bi żibeġ fil-pannell wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Pjattaforma ta 'skoperta Luminex (ThermoFisher Scientific, USA) intużat biex twettaq analiżi kwantitattiva fuq kull kampjun. Indikaturi mhux skoperti ġew esklużi mill-analiżi. qRT-PCR: L-RNA totali ġie iżolat minn ċelluli b'Kit ta 'Iżolament ta' RNA Totali taċ-Ċellula u Kit ta 'Iżolament ta' RNA Totali ta 'Annimali (Foregene, iċ-Ċina) skont il-protokoll tal-manifattur. cDNA ġie sintetizzat bl-użu tas-Sistema RTPCR UeIris II għas-Sinteżi tal-cDNA tal-Ewwel Strand (US Everbright, iċ-Ċina). qRTPCR twettqet bl-użu ta 'SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, iċ-Ċina) fuq is-Sistema CFX Connect (Bio-Rad, USA). GAPDH intuża bħala kontroll standard intern. Il-primers ġew iddisinjati u sintetizzati minn Sangon Biotech (Shanghai, iċ-Ċina) u sekwenzi dettaljati tal-primer ġew elenkati fit-Tabella S4 (Informazzjoni ta 'Appoġġ). ELISA: Konċentrazzjonijiet ta 'CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG), u CXCL10 (IP10) f'supernatanti tal-kultura taċ-ċelluli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina umana ġew determinati minn kits ELISA tal-bniedem wara l-protokoll tal-manifattur (Proteintech, USA). Ġie impjegat qarrej tal-mikroplate biotech (ThermoFisher Scientific, USA) biex ikejjel il-valuri tad-densità ottika (OD). Fid-dawl tad-diversità enormi ta 'livelli ta' sekrezzjoni fost ċitokini u kimokini differenti, għamilna standardizzazzjoni tad-dejta (trasformazzjoni log 2) qabel l-analiżi. Western Blot: buffer RIPA (NCM biotech, iċ-Ċina) miżjud b'1% Protease Inhibitor Cocktail (NCM biotech, iċ-Ċina) intuża biex lyse ċelluli. BCA Protein Assay Kit (NCM biotech, iċ-Ċina) kien impjegat biex jiddetermina l-konċentrazzjonijiet tal-proteini. Wara li ġew trasferiti fuq membrani PVDF, il-proteini taċ-ċelluli ġew inkubati b'antikorpi primarji u antikorpi sekondarji speċifiċi konjugati bl-HRP suċċessivament. Is-sinjali nqabdu mis-sistema tal-immaġini XRS (Bio-Rad, USA). Antikorpi primarji jinkludu antikorp anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA) u antikorp anti-GAPDH (Cat: ab8245, Abcam, USA). Antikorpi sekondarji jinkludu mogħoż HRP kontra l-fniek IgG (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, USA) u HRP mogħoż kontra l-ġrieden IgG (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, USA). Assaġġ tal-Qtil taċ-Ċelloli tal-Kanċer Mediat bil-Limfoċiti T u Assaġġ tal-Kokultura: Inġabru kampjuni tad-demm minn 10 donaturi b'saħħithom fl-isptar tagħna. Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, iċ-ċentrifugazzjoni tal-gradjent ġiet impjegata biex jiġu estratti ċelluli mononukleari tad-demm periferali (PBMCs) minn Lymphoprep (Cat: 07851, StemCell Technologies, USA). Barra minn hekk, Red Blood Cell Lysis Buffer (Solarbio, iċ-Ċina) intuża biex jelimina ċ-ċelluli ħomor imħallta ma 'PBMCs. Sabiex jiġu attivati ​​ċ-ċelloli T, il-PBMCs ġew ikkultivati ​​f'medja DMEM (Gibco, USA), li jissupplimentaw IL-Bniedem rikombinanti - 2 (10 ng mL-1, Cat: 202-1L{-050, R&D , USA), u attivatur taċ-ċelluli T ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 (25 μL mL-1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, USA) għal ġimgħa. Fil-proporzjon ta' 1:5, ċelluli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina tal-bniedem (BCAT2-OE, BCAT{2-KD, u l-kontrolli negattivi tagħhom) ġew kokulturati b'ċelluli T attivati ​​f'medja DMEM b'antikorp anti-CD3 (100 ng mL−1, Thermo Scientific, USA) u IL-2 (10 ng mL−1) minn donatur wieħed fi 12- pjanċa tal-bir għal 72 siegħa. Imbagħad, iċ-ċelluli T inġabru għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. L-istrateġija dettaljata tal-bieb tal-analiżi tal-fluss tidher fil-Figura S28 (Informazzjoni ta 'Appoġġ). Iċ-ċelloli tal-kanċer li kien fadal kienu mtebbgħin bil-vjola kristall u l-valur OD imkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate. Antikorpi għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss jinkludu Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, USA), APC/ Cy7 anti-human CD45 (Cat: 368516, Biolegend, USA), Pacific Blue anti-human CD3 Antibody (Cat: 300329, Biolegend, USA), PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 Antibody (Cat: 317427, Biolegend, USA), FITC anti-human CD8a Antibody (Cat: 301006, Biolegend, USA), PE/Dazzle 594 anti-human TNF- 𝛼 Antikorp (Cat: 502946, Biolegend, USA), u Brilliant Violet 711 anti-human IFN- 𝛾 Antibody (Cat: 502540, Biolegend, USA). Assay tal-Chemotaxis: L-assaġġ tal-Chemotaxis ġie implimentat fi 24-platt transwell well b'dijametru tal-qalba ta' 3 μm (Corning, USA). Kit tal-Iżolament taċ-Ċelloli CD8+T tal-bniedem (Cat: 480012, Biolegend, USA) intuża biex jiġu estratti ċelluli CD{8+T minn PBMC. Ġew miżjuda 1 × 105 ċelluli iżolati f'volum ta '200 μL fil-kamra ta' fuq u 600 μL supernatanti ta 'linji ta' ċelluli ta 'trasfezzjoni stabbli differenti ġew miżjuda fil-kamra t'isfel. Wara l-inkubazzjoni għal 6 sigħat f'37 grad, iċ-ċelloli emigraw fil-kamra t'isfel u nħasdu u ngħaddu permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. Proliferazzjoni taċ-Ċelloli, Migrazzjoni, u Assaġġi ta' Invażjoni: Intuża analiżi tal-formazzjoni tal-kolonji tal-pjanċa biex tiġi vvalutata l-abbiltà tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli. BCAT2-OE, BCAT2-KD, u ċelloli tal-kanċer tal-bużżieqa tal-awrina tal-bniedem ta' kontroll negattiv ġew ikkultivati ​​fi 6-pjanċi ta' bir għal kull bir. Wara l-inkubazzjoni f'atmosfera umidifikata ta '37 grad għal ġimgħatejn, il-kolonji ġew iffissati u miżbugħin b'paraformaldehyde u vjola kristall, rispettivament. Kmamar Transwell b'inserzjonijiet tal-membrana tal-polikarbonat tal-pori ta '8.0 μm (Corning, USA) ġew impjegati biex jevalwaw il-kapaċità tal-migrazzjoni taċ-ċelluli u l-invażjoni in vitro. 1 × 105 ċelluli trasfettati stabbli ġew sospiżi f'medju ħieles minn serum u miżrugħa fil-kamra ta 'fuq bi jew mingħajr Matrigel (Corning, USA), għall-assaġġ ta' invażjoni u migrazzjoni separatament. Wara l-inkubazzjoni għal 24 siegħa (assaġġ ta 'migrazzjoni) u 48 siegħa (assaġġ ta' invażjoni), iċ-ċelloli li jeħel mal-wiċċ t'isfel tal-membrana ġew iffissati u mtebbgħin. Iċ-ċelloli li baqgħu fil-kamra ta' fuq tneħħew permezz ta' tampuni. Ħames oqsma każwali ġew magħżula taħt mikroskopju biex jikkalkulaw in-numri taċ-ċelluli. Immunofluworexxenza (IF) u Immunohistochemistry (IHC): Multicolor IF fuq TMAs ta 'Xiangya BLCA Cohort u Xiangya BLCA immunotherapy Cohort ġiet implimentata minn kit ta' tbajja immunoistokimiku fluworexxenti multiplu (Absin, iċ-Ċina). Fil-qosor, wara dewaxing, rehydrating, u rinnovazzjoni tal-antiġenu, TMA ġiet inkubata b'antikorpi primarji u antikorpi sekondarji li jqanqlu l-irbit ta 'luċiferini differenti permezz ta' amplifikazzjoni tas-sinjal tat-tyramide (TSA). Wara li jintmesaħ antikorpi mhux marbuta b'ċitrat buffer, il-proċess ta' inkubazzjoni ġie ripetut darbtejn. DAPI kien impjegat biex counterstain nuklei taċ-ċelluli u immaġini ġew skannjati mill-pjattaforma Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Ungerija). Antikorpi primarji fuq TMA tal-koorti Xiangya BLCA jinkludu anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-Cytokeratin 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, USA). ) u DAPI (Invitrogen, USA). Antikorpi sekondarji u fluorochrome fuq TMA tal-koorti Xiangya BLCA jinkludu HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Antikorpi primarji fuq TMA tal-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA jinkludu anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, USA), u DAPI (Invitrogen, USA). Antikorpi sekondarji u fluorochrome fuq TMA tal-koorti ta 'immunoterapija Xiangya BLCA jinkludu HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus, u Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF fuq it-tessuti tat-tumur murini ġie inkubat b'antikorp primarju—anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, USA)—u antikorp sekondarju—konjugat taż-żebgħa Alexa Fluor 488 kontra l-ġurdien (Invitrogen, USA) sekwenzjali. DAPI ġie applikat għan-nukleu taċ-ċelluli viżwalizzat. Ħames oqsma każwali ġew magħżula taħt mikroskopju biex jikkalkolaw numri ta 'ċelluli ta' tbajja pożittivi. IHC fuq TMAs ta' Xiangya BLCA Cohort u Xiangya BLCA immunotherapy Cohort tmexxiet minn SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, iċ-Ċina). Wara l-irkupru u l-imblukkar tal-antiġeni, antikorpi primarji, u antikorpi sekondarji ġew inkubati b'tessuti tat-tumur min-naħa tagħhom. Imbagħad, id-diaminobenzidine (DAB) ġie applikat għal antiġeni fil-mira taż-żebgħa. Is-sinjal kannella kien meqjus bħala tbajja pożittiva. Punteġġ tal-intensità tat-tebgħa (assenti=0, dgħajfa=1, moderata=2, u qawwija=3) punteġġ multiplikatur tal-persentaġġ pożittiv (l-ebda tbajja=0, ċelluli tat-tbajja ' inqas minn 25%=1, 25%–50% ċelluli tat-tbajja=2, 50%-75% ċelluli tat-tbajja=3, u ċelluli tat-tbajja 'aktar minn 75%=4) kien punteġġ IHC aħħari tal-kampjuni. Il-punteġġi ta 'BCAT2/CD8/PD-L1 inqas minn sitt punti ġew ikklassifikati bħala espressjoni baxxa, il-punteġġi tagħhom akbar minn jew ugwali għal sitt punti ġew ikklassifikati bħala espressjoni għolja. Biex jiġi ġġudikat l-istatus ta 'individwu fuq MMR, il-kampjuni kollha mill-koorti ta' immunoterapija Xiangya BLCA ġew evalwati abbażi tar-riżultati tat-tebgħa ta 'erba' ġeni markaturi MMR (MLH1, MSH2, MSH6, u PMS2). Kif muri fi studji preċedenti,[56] meta l-erba’ ġeni markaturi kollha kienu tebgħa pożittiva, l-individwu kien immarkat bħala MMR. Meta xi wieħed mill-erba' ġeni markaturi kellu tbajja negattiva, l-individwu kien immarkat bħala dMMR. Żewġ patoloġisti indipendenti ġew mistiedna biex iwettqu l-valutazzjoni. L-antikorpi jinkludu: anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, USA), anti-MLH1 (Cat: A4858, Abcolonal, iċ-Ċina), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, iċ-Ċina), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, iċ-Ċina), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, iċ-Ċina), u HRP Goat Anti -Fenek/Ġurdien IgG (ZSGB-BIO, iċ-Ċina). TissueFAXS Analiżi Panoramika tal-Interazzjoni Spazjali fit-TME: Għall-evalwazzjoni tal-interazzjoni spazjali taċ-ċelloli malinni BCAT2+ u ċ-ċelloli T effeturi, il-pjattaforma panoramiċi TissueFAXS (Tissue Gnostics, l-Awstrija) ġiet utilizzata biex tiskennja u tanalizza b'mod semiawtomatiku ċelloli oġġettivi mtebbgħin b'IF multicolor fuq TMA ta' Xiangya BLCA Cohort. It-TMA kien magħmul minn bijopsiji tal-qalba ta' 1.5 mm minn kampjuni ta' tessuti tat-tumur inkorporati fil-paraffin. Fid-dettall, ċelluli BCAT2+, ċelluli malinni, u ċelluli CD8+T kienu mtebbgħin b'antikorpi primarji speċifiċi u antikorpi sekondarji. DAPI (Invitrogen, USA) intuża biex itebba n-nukleu taċ-ċellula. Passi dettaljati ġew deskritti fl-istudju ta' Makarevic et al.[57] Fil-qosor, skont l-intensitajiet tal-fluworexxenza ta 'indikaturi differenti u proprjetajiet fiżiċi taċ-ċelloli, ċelloli pożittivi ġew immarkati u kwantifikati. Aktar importanti, id-distribuzzjonijiet spazjali taċ-ċelluli CD8+T madwar iċ-ċelluli BCAT{2+CK{19+ kienu murija permezz ta' scatter plots fuq il-bażi tad-distanza spazjali (0–25, 25–50, 50– 100, u 100-150 μm). Żewġ patoloġisti b'esperjenza ġew mistiedna biex jiċċekkjaw ir-riżultat tad-deċiżjoni tal-pjattaforma panoramiċi TissueFAXS. Esperimenti fuq l-Annimali: Ġrieden femminili C57BL / 6 (6-7 ġimgħat) inkisbu mid-Dipartiment tal-Annimali tal-Laboratorju, Università Ċentrali tan-Nofsinhar. L-operazzjonijiet kollha fuq il-ġrieden ġew iċċekkjati u approvati mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Isptar Xiangya, Università Ċentrali tan-Nofsinhar (Numru tal-oġġett: 2021101175). Fuq kollox, biex tinvestiga r-rwol ta 'BCAT2 fuq it-tkabbir tat-tumur in vivo, iċ-ċelloli BCAT2 KD MB49 (5 × 105) u ċ-ċelloli ta' kontroll tagħha f'volum medju ta '100 μL ġew injettati taħt il-ġilda fil-ġenb tal-lemin tal-ġrieden. Barra minn hekk, wara li bniet b'suċċess mudell ta 'tumur taħt il-ġilda (volum tat-tumur sa 100 mm3), 100 ug InVivomAb kontra l-ġurdien PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, USA) u kontroll tal-isotip IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, USA) ġew injettati intraperitonealment f'kull ġurdien, għall-valutazzjoni tal-effett sinerġistiku tat-telf ta' BCAT2 u t-terapija kontra l-PD-1. Terapija kontra l-PD-1 ġiet implimentata fuq ġrieden kull 3 ijiem u damet sa ħames korsijiet. Barra minn hekk, biex jiġi ġġudikat jekk l-effett kooperattiv tal-kotrattament kienx dipendenti fuq iċ-ċelluli CD8+T. Terapija kombinata ta' akkumpanjament, 100 ug InVivoPlus kontra l-ġurdien CD8𝛼 (Cat: BP0117, Bioxcell, USA) u kontroll tal-isotip IgG2b (Cat: BP0090, Bioxcell, USA) ġew impjegati biex inaqqsu ċ-ċelluli CD8+T fil-ġrieden. Il-piżijiet tal-ġisem tal-ġrieden ġew irreġistrati kull tlett ijiem. Fid-data skedata, it-tumuri ġew maħsuda, imkejla, u ppreparati għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss, tbajja IF, u qRT-PCR. Għall-esplorazzjoni tal-interazzjoni bejn il-livell ta' espressjoni ta' BCAT2 fuq ċelluli CD8+T u l-attività taċ-ċelluli CD8+T, il-milsa ta' ġrieden C57BL/6 nisa (6-7 ġimgħat) mingħajr tumur kienu dissoċjat u ppreparat għal sospensjoni ta' ċellula waħda għal aktar analiżi. Analiżi taċ-Ċitometrija tal-Fluss: Tumuri murini ġew mitħunin u diġeriti f'sospensjoni ta' ċellula waħda minn Collagenase IV (Cat: C5138, Sigma, USA), hyaluronidase (Cat: H3506, Sigma, USA), u DNase I (Cat: DN25, Sigma, USA). ). Passaturi taċ-ċelluli ta '70 μm (BIOFIL, iċ-Ċina) intużaw biex jiffiltraw l-impuritajiet u kien impjegat counter taċ-ċelluli (Countstar, iċ-Ċina) biex jiksbu (3-5) × 106 ċelluli f'kull kampjun. Wara li identifikat ċelluli ħajjin bl-użu ta 'Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, USA) u l-imblukkar tar-riċettur Fc b'antikorp CD16/32 kontra l-ġurdien (Cat: 156603, Biolegend, USA), l-antiġeni tal-membrana taċ-ċelluli ġew imtebba minn APC-Cy7 kontra l-maws CD45 (Cat: 103116, Biolegend, USA), BV421 kontra l-maws CD3 (Cat: 100341, Biolegend, USA), BV605 kontra l-maws CD8a (Cat: 100744, Biolegend, USA) u PerCPCy5.5 kontra l-maws CD4 (Cat: 100540, Biolegend, USA). Imbagħad, il-bijoxjenza Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Cat: 2400632, Invitrogen, USA) intuża għall-iffissar u l-permeabilizzazzjoni taċ-ċellula u l-membrana tan-nukleu. L-antiġeni relatati mal-effett ċitotossiku ġew miżbugħin minn PE anti-bniedem/ġrieden Granzyme B (Cat: 372208, Biolegend, USA), PE-Cy7 anti-mause TNF-𝛼 (Cat: 506324, Biolegend, USA), PE-Dazzle 594 anti- ġurdien IFN-𝛾 (Cat: 505846, Biolegend, USA), APC kontra l-ġurdien Perforin (Cat: 154304, Biolegend, USA). L-istrateġija gating tal-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss tidher fil-Figura S29 (Informazzjoni ta 'Appoġġ). BCAT2 anti-bniedem / ġurdien (Cat: A7426, Abclonal, Ċina) ġie inkubat b'kit ta 'tikkettar ta' antikorpi Flexible 488 (Cat: KFA001, Proteintech, USA) għal sintetizzazzjoni ta 'antikorp fluworexxenti BCAT2 personalizzat għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. Imbagħad, antikorpi BCAT2 u antikorpi relatati maċ-ċelluli T ġew imħallta u miżjuda f'sospensjoni ta' ċellula waħda tal-milsa tal-marieni biex tiġi esplorata l-interazzjoni bejn il-livell ta' espressjoni ta' BCAT2 fuq CD8+ċellula T u l-attività ta' CD{{357} }ċellula T. L-istrateġija gating tal-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss tidher fil-Figura S30 (Informazzjoni ta 'Appoġġ). Instabu kampjuni mtebbgħin fuq Cytek DxpAthena Flow cytometry (Cytek Biosciences, USA) u d-dejta ġiet analizzata permezz ta 'softwer tal-verżjoni Flowjo (BD Biosciences, USA). Analiżi Statistika: Id-dejta ġiet ippreżentata bħala medja ± SD. t-test bi jew mingħajr korrezzjoni Welch ġie utilizzat biex iqabbel varjabbli kontinwi bejn żewġ gruppi. Analiżi One-way ANOVA bi jew mingħajr testijiet Brown–Forsythe u Welch intużat biex tqabbel varjabbli kontinwi bejn gruppi multipli. Ġie applikat it-test Chi-squared jew it-test eżatt ta' Fisher biex jitqabblu varjabbli dikotomika. It-test tal-koeffiċjenti ta 'korrelazzjoni ta' Pearson jew Spearman kien impjegat biex tiġi stmata l-intensità tal-korrelazzjoni bejn varjabbli differenti. Il-kurva tas-sopravivenza Kaplan-Meier ġiet impjegata biex turi analiżi pronjostiċi ta 'varjabbli dikotomika, u t-test tal-log-rank intuża biex jiġġudika d-differenzi statistiċi. Żewġ naħat p < 0.05 kien definit bħala l-limitu ta 'sinifikat. Is-softwer R (verżjoni 4.0) u GraphPad Prism8 ġew applikati biex jipproċessaw id-dejta fl-istudju.

Referenza

[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.

[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.

[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Cancer Treat. Rev 2019, 76, 10.

[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3rd, NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.

[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Cancer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.

[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.

[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Kanċer 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Kanċer 2020, 19, 53.

[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Xjenza 2016, 353, 1161.

[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Cell Biol. 2020, 22, 167.

[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.

[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Cancer 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.

[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Dun Immunol. 2017, 17, 559.

[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.