Apical Shear Stress Trasport ta' katjoni organiku mtejjeb f'Ċelloli tal-kliewi tal-kliewi tal-kliewi tal-kliewi Madin-Darby trasfettati tal-Bniedem OCT2/MATE1-jinvolvi Sensing Ciliary

Għal aktar informazzjoni:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz, u Shuvo Roy

Dipartimenti tal-Bijoinġinerija u Xjenzi Terapewtiċi (AJ, PS, DLK, SR) u Pedjatrija (PRB),

Università ta’ Kalifornja San Francisco (UCSF), San Francisco, California;

u Dipartiment tal-Mediċina, Diviżjoni tan-Nefroloġija, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ASTRATT

Trasport attiv minnrenalitubuli prossimali għandu rwol sinifikanti fid-dispożizzjoni tad-droga. Matul l-iżvilupp tad-droga, stimi tarenalieskrezzjoni huma essenzjali għad-determinazzjoni tad-doża. Il-bijoreatturi tal-kliewi li jirriproduċu l-kuġini fiżjoloġiċi tal-kliewi, bħall-istress shear indott mill-fluss, jistgħu jbassru aħjar l-imġieba tad-droga in vivo milli jagħmlu l-mudelli in vitro attwali. F'dan l-istudju, investigajna r-rwol tal-hear stress fuq it-trasport attiv ta' 4-(4-(dimethylamino)-styryl)-N-methyl pyridinium iodide (ASP plus) minn Madin-Darby caninekliewiċellolijesprimu b'mod esoġenu t-trasportaturi tal-katjoni organika tal-bniedem trasportatur tal-katjoni organika 2(OCT2) u proteina ta 'estrużjoni multidroga u tossina 1(MATE1). Ċelloli kkultivati ​​fi pjanċa parallela taħt perfużjoni tal-midja kontinwa ffurmaw monosaff issikkat b'barriera għolja għall-inulina. Bi tweġiba għal livelli dejjem jiżdiedu ta 'shear stress (0.2-2 dynes/cm), iċ-ċelloli wrew żieda korrispondenti fit-trasport ta' ASP plus , li laħqu żieda massima ta' 4.2-darbiet f'2. dynes/cm² meta mqabbla ma' ċelloli kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi. Dan it-trasport kien inibit bl-imipramine, li jindika li t-trasport attiv kien preżenti taħt kundizzjonijiet ta 'shear stress. Ċelloli esposti għal shear stress ta' 2 dynes/cm² wrew ukoll żieda fl-espressjoni ta' RNA kemm ta' bnedmin trasfettati kif ukoll ta' OCT2 endoġenu (3.7- u 2.0-darbiet, rispettivament). It-tneħħija ta 'cilia bis-sulfat ta' l-ammonju eliminat l-effetti ta 'shear fuq ASP flimkien ma' trasport bi 0.5 dynes/cm² bl-ebda effett fuq ASP flimkien ma 'trasport taħt kondizzjonijiet statiċi. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-hear stress jaffettwa t-trasport attiv ta’ katjoni organiċi ġewwarenalitubulariċelluli epiteljali b'mod dipendenti fuq il-cilija.

Cistanche huwa tajjeb għall-funzjoni renali

Introduzzjoni

Minkejja avvanzi kbar fil-metodi prekliniċi għall-għażla tal-aħjar kandidati tad-droga, l-iżvilupp tad-droga jibqa 'proċess twil u għali li għandu rendiment baxx ħafna ta' entitajiet molekulari ġodda kkummerċjalizzati (Watkins, 2011). Nuqqas kbir ta' mudelli prekliniċi huwa l-inabbiltà li wieħed ibassar it-tneħħija u t-tossiċità fil-bnedmin. Madwar 30 fil-mija tal-mediċini li huma ta 'suċċess fi studji prekliniċi jonqsu fil-bnedmin bħala riżultat ta' valuri ta 'tneħħija jew tossiċitajiet mhux antiċipati (Kola u Landis, 2004).

Il-kliewi hija mira partikolarment importanti għall-immudellar tal-kultura taċ-ċelluli in vitro minħabba li hija responsabbli għall-eliminazzjoni ta 'aktar minn terz tal-mediċini kollha u l-biċċa l-kbira tal-metaboliti (Morrissey et al., 2013). Il-renalitubuli prossimali huwa importanti għall-ittestjar tad-droga matul l-iżvilupp minħabba li jwettaq il-biċċa l-kbira tat-trasport attiv tal-kandidati tad-droga u huwa partikolarment sensittiv għal korriment tossiku (Giacominiet al., 2010). Il-renalitubulihuwa monosaff ta 'ċelluli epiteljali b'filtrat li jgħaddi tul il-wiċċ apikali. Membrana tal-kantina hija taħt l-epitelju tubulari, u kapillari peritubulari maġenbhom jippermettu r-riassorbiment ta 'ilma u saluts. Il-mikroambjent tat-tubuli prossimali, partikolarment il-fluwidu shear stress u l-gradjenti onkotiċi apikobażali, huwa riprodott b'mod inkomplet minn tekniki konvenzjonali tal-kultura taċ-ċelluli. Bijoreatturi taċ-ċelluli epiteljali li jaqbdu l-fiżjoloġija salienti in vivo jistgħu jtejbu l-eżattezza tat-tneħħija u t-tbassir tat-tossiċità derivati ​​minn analiżi in vitro (Pfaller u Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Evidenza li qed tikber tindika li l-morfoloġija u l-funzjonalità taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali jistgħu jvarjaw mal-ambjent tat-tkabbir, bħal porożità tal-wiċċ tat-tkabbir, espożizzjoni għal fluwidu fuq iż-żewġ naħat, u/jew stress shear fluwidu. Xogħol preċedenti minn Essig u Friedlander (2003), kif ukoll mil-laboratorju tagħna (Ferrell et al.2010), wera li riarranġament indott mill-fluss tal-fluwidu tubulari fiċ-ċitoskeletru tal-aktina apikali taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali (Ferrell et al.,2010) . Sussegwentement, bosta studji wrew li l-istress shear jaffettwa l-livelli ta 'espressjoni u l-lokalizzazzjoni ta' trasportaturi multipli ta 'assorbimenti u efflux, inkluż antiporter tas-sodju-idroġenu 3. Na/K-ATPase, trasportaturi tal-glukożju, kanal tas-sodju epiteljali, u r-riċetturi tal-endoċitosi, megalin u tubulin. (Duan et al.,2010; Raghavan et al.,2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al.,2018). Xogħol ieħor wera li l-fluss ta 'shear f'sistema ta' bijoreattur tubulari jorjenta u jtawwalrenalitubulariċelluli tul il-mogħdija tal-fluss(Venzac et al. 2018). L-evidenza in vitro tindika li xi alterazzjonijiet fl-istruttura ċitoskeletali u l-funzjoni tat-trasport x'aktarx huma relatati mal-funzjoni mekkanika sensorjali ta 'cilia(Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014); madankollu, ftit studji kkunsidraw l-effett ta 'shear stress fuq trasportaturi tad-droga fiċ-ċelloli renali. Barra minn hekk, ftit huwa magħruf dwar l-effett ta 'rati ta' shear differenti fuq il-funzjonalità taċ-ċelluli, partikolarment b'espożizzjoni sostnuta għal shear stress. Il-biċċa l-kbira tal-istudji qiesu rata waħda tal-istress shear u wettqu biss esperimenti għal żmien qasir (1-6 sigħat), li jagħmluha diffiċli li ssir distinzjoni bejn l-effetti veri tal-shear u r-rispons tal-istress ċellulari għal bidliet f'daqqa fil-mikroambjent (Duan et al.2010;Jang et al2013: Maggiorani et al.2015).

Hawnhekk, intuża bijoreattur mikrofluwidiku biex jeżamina l-effett ta 'livelli gradati ta' shear stress fuq il-renalitrasportaturi tad-droga taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali trasportatur ta 'katjoni organiku 2(OCT2) u proteina ta' estrużjoni multidroga u tossina 1 (MATE1). Aħna nuru li ż-żieda fl-istress apical shear twassal għal żieda fit-trasport ta 'katjoni organika u l-espressjoni tat-trasportatur u li cili huma involuti f'dan ir-rispons ċellulari għal shear stress.

Materjali u metodi

Fabbrikazzjoni u Armar tal-Apparat. Preċedentement ippubblikajna d-disinn tagħna għal bijoreattur tal-pjanċa parallela li jipprovdi passaġġ ta 'fluss ta' fluwidu ta 'għoli aġġustabbli tul in-naħa apikali taċ-ċelloli u ġibjun statiku fuq in-naħa bażali (Brakeman et al.,2016). Għax-xogħol ippreżentat hawn, addattajna d-disinn preċedenti tagħna biex noħolqu apparat multiplexed b'erba 'mogħdijiet ta' fluss separati biex jippermettu l-ittestjar ta 'erba' kundizzjonijiet bijoloġiċi f'daqqa (Fig.1). Kull apparat huwa magħmul minn tliet saffi: bażi b'reservoir apikali 5-ml, pjanċa tan-nofs biex iżżomm l-inserzjoni Snapwell (Costar, Corning, Corning, NY) b'erja taċ-ċelluli ta '1.12cm², u pjanċa ta' fuq li fiha ġibjun basolaterali ta' 1-għa 2-ml. Il-pjanċi

kienu mmaxinjati minn polysulfone biex jippermettu l-isterilizzazzjoni bl-awtoklavi. Gaskits tas-silikonju maqtugħa bil-lejżer ta '500- sa 1000-um għoli ġew imdaħħla bejn kull sett ta' pjanċi biex jissiġillaw il-kompartimenti tal-fluwidu u fuq in-naħa apikali biex jiddefinixxu l-għoli tal-kanal. Il-bijoreattur ġie mmuntat bl-użu ta 'viti. Il-ġibjun tal-midja u n-nassa tal-bużżieqa kienet mibnija fil-kolonna. Id-daħliet u l-ħruġ kienu konnessi bl-użu ta 'konnetturi mxewwek ma' tubi tas-silikonju Masterflex LS14 b'dijametru ta 'ġewwa ta' 1.6-mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Il-fluss tal-fluwidu u għalhekk l-istress apicalshear ġew issettjati u kkontrollati minn pompa peristaltika (Cole Parmer).

Kultura taċ-Ċelloli u Fluss. Iċ-ċelloli MDCK trasfettati jew b'vettur vojt jew b'par ta' trasportaturi ta' assorbiment u ħruġ (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) ġew ipprovduti minn Dr Martin Fromm (Erlangen, il-Ġermanja) u kkultivati ​​f' medju essenzjali minimu b'soluzzjoni ta 'melħ ibbilanċjata ta' Earle (UCSF Cell Culture Facility) b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) u 1 fil-mija penicillin-streptomycin (UCSF Cell Culture Facility). Ħames mitt mikrogramma għal kull millilitru hygromycin (UCSF Cell Culture Facility) u 100 mg/h ml geneticin (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) ġew miżjuda mal-midja għaċ-ċelloli transfettati doppji. Għal esperimenti ta 'fluss, ċellola MDCK hOCT2/hMATE1 ġew indurati fuq in-naħa ta’ taħt ta’ inserzjonijiet Snapwell(Corning)f’densità ta’ 300,000 ċelluli/bir(250,000 ċelluli/ċm"), imkabbra taħt kundizzjonijiet statiċi sakemm jikkonfluwixxu. u mbagħad imqiegħda ġo il-bijoreattur.Il-fluss tal-midja apikali żdied fuq 7 ijiem minn 0.1 sa 1-6mlmin sakemm inkiseb l-istress shear mixtieq u mbagħad jitħalla stabbli għal 72 siegħa qabel l-esperimentazzjoni. Iċ-ċelloli tkabbru taħt kundizzjonijiet statiċi għall-istess ammont ta’ ħin bħall-kontrolli .

Immunofluworexxenza. Iċ-ċelloli ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde (Thermo Fisher Scientific), permeabilizzati b'0.1 fil-mija Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich), u mblukkati bl-albumina tas-serum bovin (Sigma-Aldrich). Sussegwentement ġew inkubati b'dilwizzjoni ta' 1:50 ta' antikorp monoklonali tal-ġurdien ittikkettat zonula occludens-1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) jew antikorp monoklonali tal-ġurdien acetylated -tubulin primarju (Life Technologies) għal 60 minuta. Ċelloli ttrattati bl-antikorp a-tubulin imbagħad ġew inkubati b'antikorp sekondarju tal-mogħoż 561 kontra l-ġurdien (Life Technologies) u phalloidin (Thermo Fisher Scientific) għal tbajja 'F-actin. L-immaġini twettqet bl-użu ta 'mikroskopju konfokali spettrali Nikon (Tokyo, Ġappun) b'objettiv taż-żejt 40x.

Prestazzjoni tal-Ostakoli. Inulin, polimeru 5000 Da, huwa markatur magħruf tar-rata ta 'filtrazzjoni glomerulari u huwa markatur tat-tnixxija tat-tubuli prossimali in vivo (Sohtell et al, 1983):

Inulina ttikkettjata FITC (Sigma-Aldrich) ġiet miżjuda mal-midja apikali u tħalliet tgħaddi mill-apparati. Inġabru kampjuni mill-ġibjun bażali kull 24 siegħa u ġew analizzati għall-kontenut ta 'inulina bl-użu ta' qarrej tal-pjanċa tal-fluworexxenza Genios Pro (Tecan, Mannedorf, l-Isvizzera). Il-funzjoni ta 'barriera tal-monosaff taċ-ċelluli ġiet ikkalkulata minn livelli ta' inulina mkejla fil-kompartimenti apikali u bażali kif deskritt minn eq.1.Hawnhekk, Kapital hija l-konċentrazzjoni ta 'inulina fil-kompartiment apikali, u C Mal hija l-konċentrazzjoni fil-kompartiment bażali. Inulinleak ġiet ikkalkulata bħala l-konċentrazzjoni fil-kompartiment bażali (donatur) diviż bl-erja taċ-ċellula wara 24 siegħa.

ASP flimkien ma 'Trasport. Ġeni trasportaturi trasdotti ġew indotti b'10 mM Na-butyrate (Sigma-Aldrich) 24 siegħa qabel esperiment ta 'trasport, kif deskritt qabel (Konig et al,2011). Meta approprjat, iċ-ċelloli ġew inkubati b'inibitur (500μM imipramine jew 1 mM cimetidine(Sigma-Aldrich)) fuq in-naħa bażali għal 30 minuta, segwit biż-żieda ta '25μM 4- (4-dimethylamino) - styryl-N-methyl pyridinium (ASP plus) (Life Technologies) u inkubazzjoni għal siegħa. Inġabru kampjuni mill-midja apikali u bażali. Iċ-ċelluli mbagħad ġew laħlaħ b'salina mbuffer bil-fosfat kiesaħ bis-silġ tliet darbiet u lysed għall-kejl ta 'ASP flimkien ma' akkumulazzjoni u trasport. L-esperimenti tat-trasport saru simultanjament fuq ċelluli taħt shear stress u kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi. Il-konċentrazzjoni ASP plus ġiet ikkwantifikata fuq qarrej tal-pjanċa tal-fluworexxenza Genios Pro (Tecan) f'wavelength ta 'eċitazzjoni ta' 485 nm u wavelength ta 'emissjoni ta' 590 nm.

Kwantifikazzjoni tal-proteina. Iċ-ċelloli ġew lysed b'1 fil-mija SDS-10 M NaOH lysis buffer waqt li tħawwad matul il-lejl. Il-kontenut ta' proteina tkejjel bl-użu ta' kit standard ta' analiżi tal-proteina Pierce BCA (Thermo Fisher). Fejn xieraq, il-kontenut tal-proteini kien normalizzat għaż-żona tat-tkabbir taċ-ċelluli.

Espressjoni RNA. RNA ġie estratt miċ-ċelloli bl-użu ta 'RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja), u cDNA ġie ġġenerat bl-użu ta' kit ta 'skript (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA intuża għall-iskoperta ta' OCT2 u MATE1 tal-bniedem u tal-klieb u P-glycoprotein tal-klieb (P-GP) permezz ta' reazzjoni kwantitattiva tal-katina tar-reverse transcriptase-polymerase bl-użu ta' assay Tagman u sondi (Applied Biosystems) fuq l-istrument Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). Proteina ribosomali S18 (RS-18) intużat bħala kontroll tad-dar. L-effett ta 'shear stress fuq l-espressjoni tat-trasportatur ġie analizzat bl-użu tal-metodu 4ACt bl-użu ta' livelli ta 'trasportatur espressi relattivi għal RS-18(Peters et al.2007; Schmittgen and Livak,2008). P-GP intuża bħala kejl tal-effetti globali tal-hear stress fuq l-espressjoni tat-trasportatur.

Deċiljazzjoni. Iċ-ċelloli tkabbru biex jikkonfluwixxu u mbagħad ġew inkubati fin-nuqqas jew il-preżenza ta 'sulfat ta' l-ammonju 30 mM (Fluka AG) għal 24 siegħa qabel il-kejl ta 'ASP flimkien ma' trasport (Oxergard et al 2009). Il-preżenza ta 'cilia ġiet iddeterminata permezz ta' immaġini ta 'a-tubulin kif deskritt diġà hawn.

Statistika. L-esperimenti kollha saru fi tliet kopji b'minimu ta 'żewġ repliki tekniċi f'kull esperiment. Id-dejta hija espressa bħala medja ± SD u mmarkata bħala kaxxi u whisker plots. Analiżi statistiċi saru permezz ta' analiżi ta' varjanza ta' varjanza mhux imqabbla f'direzzjoni waħda jew f'żewġ direzzjonijiet, u valur P ta'<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Riżultati

Morfoloġija taċ-Ċelloli u Funzjoni ta' Barriera. L-analiżi reċenti ta 'Immunofluo ta' ċelluli mqiegħda taħt il-fluss żvelat formazzjoni ta 'monosaff uniformi mal-proteina tight-junction, zonula occludens-1, lokalizzata għall-junctions stretti bejn iċ-ċelloli taħt kundizzjonijiet kemm statiċi kif ukoll ta' fluss (Fig. 2, A-C). Il-kwantifikazzjoni tal-kontenut totali ta 'proteini wriet sa żieda ta' 1.6-darbiet fil-kontenut ta 'proteini għal kull ċentimetru kwadru tal-monosaff b'reazzjoni għal stress shear (Fig. 2D). Sussegwentement, kejlna l-permeabilità ta 'inulina, markatur ta' tnixxija tat-tubuli prossimali, madwar il-monosaff. L-apparati żammew rata ta' prestazzjoni ta' barriera ta' 97.9 fil-mija 6 1.42 fil-mija fuq 7 ijiem ta' kultura taħt sa 2 dynes/cm2 ta' shear stress (Fig. 2E), li tirriżulta f'rata finali ta' tnixxija ta' inulina f'jum 6 ta' { {15}}.13–0.69 mg/cm2 kuljum.

Effett ta 'Shear Stress fuq it-Trasport Organiku tal-Kation. It-trasport ta 'ASP plus, sottostrat awto-fluworexxenti ta' OCT2 u MATE1, tkejjel għal siegħa f'livelli differenti ta 'shear stress（0.2-2 dynes/cm²）. Ċelloli MDCK li jesprimu b'mod esoġenu hOCT2 u hMATE1 urew żieda ta '4. 2- darbiet fl-ASP flimkien ma' trasport b'reazzjoni għal stress ta 'shear ta' 2 dynes/cm² kif rifless f'miżuri kemm ta 'akkumulazzjoni ċellulari (Fig. 3A) u trasport transċellulari (Fig. 3B). L-effett ta' shear stress fuq ASP flimkien ma' akkumulazzjoni jew trasport transċellulari kien simili taħt shear stress ta' 0.5 u 2 dynes/cm². Biex jiġi ddeterminat jekk it-trasport ASP plus attiv kienx miżjud, it-trasport ta 'ASP plus minn ċelloli esposti għal 0.2 dynes/cm ta' shear stress tkejjel bi jew mingħajr trattament minn qabel b'500 uM imipramine, OCT{{20} } u MATE1-inibitur speċifiku. ASP flimkien ma 'trasport kien inibit minn imipramine 60.3 fil-mija ± 15.8 fil-mija taħt kundizzjonijiet ta' tensjoni ta 'shear meta mqabbla ma' 47.6 fil-mija ± 19.7 fil-mija taħt kundizzjonijiet statiċi (Fig.3C).

Biex tifhem aktar din l-osservazzjoni, l-effett ta 'shear stress fuq l-espressjoni ta' OCT2 uman (trasfettat), OCT2 tal-klieb (endoġenu), u P-GP tal-klieb (endoġenu) kien imkejjel f'ċelloli esposti għal livelli varji ta 'shear għal 72 siegħa wara a. żieda bil-mod tal-shear fuq 7 ijiem (Fig. 4). Meta mqabbla maċ-ċelloli kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi, iċ-ċelloli MDCK esposti għal shear urew espressjoni akbar ta' OCT2 uman u endoġenu trasfettat (sa 3.7- u 2.0-darbiet, rispettivament), mingħajr l-ebda effett sinifikanti fuq l-espressjoni ta’ MATE1 trasfettat jew P-GP endoġenu.

Rwol ta' Cilia f'Rispons għal Shear. L-immaġini wrew li ċ-ċelloli MDCK transfettati doppju jesprimu cilija taħt kundizzjonijiet kemm statiċi kif ukoll ta 'fluss (Fig.5, A u E). L-espożizzjoni taċ-ċelloli għal 30 mM ammonju sulfat għal 24 siegħa ikkawżat telf sħiħ ta 'cilia (Fig.5, C u G). Importanti, id-deċiljazzjoni ma kellha l-ebda effett gross fuq il-junctions taċ-ċelluli-membrana, kif imkejla mill-immaġini ta 'F-actin, li jankra proteini tight-junction fil-junctions taċ-ċelluli-membrana fiċ-ċelluli epiteljali (Fig. 5.D u HD (Stevenson u Begg). 1994). Għalkemm hemm xi tħaxxin tat-tbajja 'F-actin f'dawn l-immaġini, din ma kinitx sejba konsistenti, u għalhekk ma kkwantifikajniex dan l-effett. Id-deċiljazzjoni ma kellha l-ebda effett fuq it-trasport minn ċelloli kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet statiċi. iżda kompletament. eliminat l-effetti ta 'shear stress fuq ASP flimkien ma' trasport fiċ-ċelloli esposti għal 0.5 dynes/cm² ta 'shear (Fig. 6).

Diskussjoni

Il-kliewi għandha rwol ċentrali fl-eliminazzjoni tad-drogi fil-ġisem tal-bniedem. Huwa importanti li timita b'mod preċiż il-kumplessità tal-fiżjoloġija renali għall-ittestjar tad-droga in vitro, partikolarment fir-rigward tal-fluss tal-fluwidu. Intwera li l-istress shear mill-fluss tal-fluwidu jaffettwa l-morfoloġija taċ-ċelluli u t-trasportaturi tal-joni in vitro, iżda ftit hu magħruf dwar l-effetti fuq it-trasportaturi tad-droga (Duan et al.,2010; Ferrell et al.,2012; Jansen et al.,2016) . Barra minn hekk, il-biċċa l-kbira tal-istudji preċedenti kejlu biss l-effett tal-shear għal żmien qasir (1-6 sigħat), li x'aktarx li ma jiżolax kompletament l-effetti tal-hear stress minn risponsi oħra tal-istress ċellulari (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015).F'dawn l-istudji, aħna ffukajna fuq l-effetti ta 'shear stress sostnut (7 ijiem) mill-fluss tal-fluwidu fuq it-trasport tad-droga biex nimitaw aħjar l-hear stress sostnut esperjenzat minnrenalitubulariċelluli in vivo.

Il-fehim ta 'kif it-trasportaturi tad-droga jirrispondu għal stress shear sostnut jista' jtejjeb il-previżjonijiet in vitro tal-immaniġġjar tad-droga in vivo mill-kliewi. Mudelli in vitro tal-kliewi ddisinjati b'mod preċiż jistgħu jistandardizzaw l-ittestjar prekliniku u jnaqqsu r-rati ta 'falliment tad-droga.

F'dan ix-xogħol, intuża bijoreattur mikrofluwidi tal-pjanċa parallela biex jiddetermina l-effetti ta 'shear stress sostnut fuq it-trasport ta' katjoni organiku minn OCT2 u MATE1 f'renalitubulilinja taċ-ċelluli. Diversi linji taċ-ċelluli ġew ikkunsidrati għal dawn l-istudji, inklużi linji taċ-ċelluli umani bħal ċelluli tat-tubuli prossimali umani mill-grupp Hopfer (Orosz et al, 2004) u RPTECs (CRL-4031:American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al.,2008), iżda ċ-ċelluli hOCT2/hMATE1 MDCK transfettati doppjament tqiesu l-aktar għażla xierqa għal dan l-istudju għal diversi raġunijiet. L-ewwel, iċ-ċelloli MDCK juru b'mod konsistenti twaħħil robust mal-inserzjonijiet transwell, li jippermettilhom jifilħu l-istress inizjali tal-fluss tal-fluwidu. It-tieni, dawn iċ-ċelloli jiffurmaw monosaffi stretti, li jipprevjenu t-tnixxija u huwa essenzjali għall-istudju tat-trasport transċellulari ta 'substrati ta' markatur. Fl-aħħarnett, l-espressjoni eżoġena tat-trasportaturi tippermetti skoperta mtejba ta 'trasport attiv u l-effett ta' perturbazzjonijiet.

Iċ-ċelloli mqiegħda taħt il-fluss iffurmaw monosaff konfluwenti u lokalizzati proteina tight-junction lejn il-periferija taċ-ċellula. Huma żammew ukoll funzjoni ta 'barriera għolja kif imkejla mill-permeabilità ta' l-inulina. Il-kapaċità taċ-ċelloli epiteljali li jiffurmaw monosaff li jipprevjeni t-tnixxija ta 'fluwidu u proteina hija estremament importanti għall-funzjoni xierqa tat-tubuli. Hawnhekk, it-tnixxija miċ-ċelluli MDCK kienet minima f'inqas minn 1 ug/cm² kuljum u inqas b'mod sinifikanti minn dik permezz taċ-ċelloli umani. Preċedentement urejna li l-monosaffi taċ-ċelluli tal-kliewi tal-bniedem għandhom 10-20 ug/cm²per day inulina leak (Brakeman et al.,2016), li jappoġġjaw il-konklużjoni li ċ-ċelloli hOCT2/hMATE1 MDCK ffurmaw monosaff robust.

It-trasport ta 'ASP plus żdied b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli hOCT2/hMATE1 MDCK esposti għal livelli varji ta' tensjoni ta 'shear għal 72 siegħa meta mqabbla ma' kontrolli statiċi. ASP plus huwa meħud minn OCT2(SLC22A2) u effluxed minn MATE1 (SLC47A1), żewġ trasportaturi ta 'katjoni organika li jaħdmu flimkien biex jiffaċilitaw il-renalisekrezzjoni ta 'drogi użati komunement, bħal metformin u cisplatin (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). Effetti simili ta 'shear stress ġew irrappurtati għal trasportaturi tal-jone tat-tubuli prossimali. Żidiet fl-assorbiment tal-albumina, assorbiment mill-ġdid tal-joni, u espressjoni u funzjoni ta’ megalin u tubulin ġew irrappurtati b’reazzjoni għal żieda fl-istress shear (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). Espożizzjoni ta'renaliċelluli tat-tubuli prossimali għal shear stress huwa wkoll assoċjat ma 'apoptożi mnaqqsa u rkupru aktar mgħaġġel minn tossiċità akuta ta' cisplatin u inibizzjoni msaħħa tat-trasport ta 'anjoni organiku (Jang et al.2013). Peress li l-istress shear mill-fluss tal-fluwidu huwa kontinwament preżenti fit-tubuli prossimali, dawn is-sejbiet jappoġġaw kollettivament l-użu ta 'sistemi ta' mudelli in vitro aktar fiżjoloġiċi biex ibassru d-dispożizzjoni u t-tossiċità tal-mediċina renali. Ta' min jinnota li m'hemm l-ebda differenza sinifikanti fil-funzjoni tat-trasportatur bejn 0.5 u 2.0 dynes/cm² ta' shear stress. Studji preċedenti minn Essig u Friedlander (2003)kienu sabu li livell minimu ta' shear ta' 0.17 dynes/cm2 huwa meħtieġ biex iwassal għal alterazzjoni fil-morfoloġija taċ-ċelluli, u studji oħra kejlu l-effetti fuq fiżjoloġija sa 1 dyne/cm² (Duan et al., 2010). Dan huwa l-ewwel studju li jesplora l-effetti ta 'firxa ta' livelli ta 'shear stress ogħla u sostnuti fuq il-funzjonalità tat-trasportaturi tad-droga renali, u huwa possibbli li l-kobor tad-differenza bijoloġika bejn il-0.5 u 2.0 dynes/cm² ta' shear stress li aħna evalwat ma kienx kbir biżżejjed biex jippermetti l-identifikazzjoni tad-differenzi bejn dawn il-livelli ta 'shear stress fl-assaġġi tagħna. Għalkemm hija meħtieġa aktar investigazzjoni, ir-riżultati tagħna jitfgħu dawl fuq il-kundizzjonijiet meħtieġa għal mudelli fiżjoloġikament rilevanti u l-effetti ta 'livelli ogħla ta' shear stress minħabba l-marda fuq l-immaniġġjar tad-droga renali.

Waħda mil-limitazzjonijiet tal-metodi sperimentali tagħna hija li indirizzajna biss it-trasport f'pH 7.4 bl-użu ta 'midja b'pH 7.4 fuq iż-żewġ naħat apikali u bażali li jimitaw il-metodi sperimentali deskritti qabel għaċ-ċelluli hOCT2 / hMATE1 MDCK (Konig et al..2011). Grajjent ta 'pH apikali għal bażali jista' jaffettwa l-funzjoni OCT2 u MATE1, u tipikament ikun hemm gradjent ta 'pH taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi (Muller et al.,2013). Il-metodi tagħna, għalhekk, illimitaw il-kapaċità tagħna li nevalwaw l-interazzjoni bejn gradjent ta 'pH apikali għal bażali u stress ta' shear fuq il-funzjoni OCT2 u MATE1. Peress li użajna pHof7.4 konsistenti tul il-kundizzjonijiet sperimentali kollha, dan in-nuqqas ta 'gradjent ta' pH x'aktarx li affettwa s-sejbiet tagħna iżda potenzjalment jillimita l-applikabilità tas-sejbiet tagħna għat-trasport OCT2 u MATE1 fil-preżenza ta 'gradjent ta' pH apikali għal bażali.

B'mod sorprendenti, l-espressjoni ta 'mRNA ta' OCT2 uman u endoġenu trasfettat żdiedet fiċ-ċelloli esposti għal-livelli kollha ta 'shear stress meta mqabbla ma' kontrolli statiċi. Din ir-regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni tat-trasportatur kienet speċifika, mingħajr effett li jista' jitkejjel fuq l-espressjoni P-GP endoġena jew MATE1 trasfettat. Ir-regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni tat-trasportatur tagħti ħarsa lejn il-mekkaniżmu wara ż-żieda fit-trasport u tista' tkun riżultat ta 'stabbiltà mRNA msaħħa jew traskrizzjoni mRNA miżjuda. Huwa interessanti li wieħed jinnota li kemm it-trasportaturi trasfettati kif ukoll dawk endoġeni kienu regolati 'l fuq, li mhuwiex mistenni peress li l-OCT2 trasfettat ġie espress taħt promotur ta' cytomegalovirus u m'għandux ikun soġġett għal mekkaniżmi regolatorji ta 'espressjoni tal-ġeni endoġeni. Għalkemm sorprendenti, din l-osservazzjoni mhijiex bla preċedent. Ġie rrappurtat effett simili fuq ċelluli tat-tubuli prossimali trasfettati OAT1 esposti għall-perfużjoni, iżda l-mekkaniżmu għaż-żieda fl-espressjoni għadu mhux ċar (Jansen et al., 2016). Fi studju ieħor, is-sinjalar Nrf2 instab li għandu rwol fiż-żieda tal-espressjoni MATE2-K endoġena b'reazzjoni għall-istress shear (Fukuda et al., 2017). Aktar studju dwar dan huwa ġġustifikat u se jkun is-suġġett ta' investigazzjonijiet futuri.

Aħna identifikajna wkoll li l-introduzzjoni ta 'shear flow apikali żiedet il-kontenut ta' proteina għal kull ċentimetru kwadru ta 'ċelloli. Dan l-effett kien l-istess kobor kemm għal 0.5 kif ukoll għal 2dynes/cm² ta' shear, simili għall-effett li deher għall-espressjoni ta' mRNA u ASP flimkien ma' trasport. Hemm xi evidenza li l-istress shear jinduċi tallerrenaliċelluli epiteljali, li jirriżultaw f'volum akbar ta 'ċelluli għal kull ċentimetru kwadru u għalhekk żieda probabbli fil-proteina għal kull ċentimetru kwadru; madankollu, dan il-fenomenu ppubblikat qabel kien biss osservazzjoni minuri f'korp akbar ta 'dejta u mhux kwantifikat (Long et al., 2017). Iż-żieda fil-proteina totali fiċ-ċelloli mkabbra fil-preżenza ta’ fluss ta’ shear apikali tista’ tirrappreżenta l-kontenut normali ta’ proteina għal prodotti b’saħħithom.renalitubulariċelluli epiteljali li jistgħu jinkisbu biss bl-espożizzjoni taċ-ċelluli għal fluss ta' shear apikali. Għalhekk, il-livelli aktar baxxi ta 'kontenut ta' proteina fiċ-ċelloli mkabbra f'kultura statika jistgħu jirrappreżentaw stat ċellulari anormali kif jista 'jseħħ klinikament f'sitwazzjonijiet ta' fluss ta 'filtrat apikali baxx bħal ħsara akuta fil-kliewi. Dan il-fenomenu jistħoqqlu aktar studju.

Cilia huma magħrufa li għandhom rwoli mechanosensory fit-tubuli prossimali (Raghavan u Weisz,2016). Għalhekk, biex jiġi ddeterminat jekk għandhomx rwol kritiku fiż-żieda fit-trasport medjat ta' OCT2 u MATE1-irrapportat hawn, tkejjel l-effett tat-tneħħija ta 'cilia fuq il-funzjoni tat-trasportatur. L-imblokk sħiħ taż-żidiet dipendenti fuq il-shear fl-ASP flimkien mat-trasport bit-tneħħija ta 'cilia fl-istudji tagħna huwa simili għall-effett misjub fi studji minn Raghavan et al. (2014), li wrew upregulation dipendenti fuq il-cilia fl-endoċitosi b'reazzjoni għall-fluss tal-fluwidu. Is-sulfat ta 'l-ammonju x'aktarx ikollu effetti oħra mhux ikkaratterizzati fuq l-imġiba u l-funzjonalità taċ-ċelluli li jistgħu jaffettwaw indirettament it-trasport tas-soluti. Minkejja l-effetti mhux fil-mira possibbli, dan il-metodu ta 'deċiljazzjoni jittestja r-rwol tas-sensing ciliary fuq il-moviment medjat mit-trasportatur ta' soluti organiċi. Il-mekkaniżmu tas-sinjalar bejn il-proteini mekkaniku-sensorji fil-cilia u t-trasportatur bħalissa mhux magħruf. Ipotesi waħda hija li l-funzjoni tat-trasportaturi tal-katjoni organiċi tinbidel permezz ta 'trasport tal-joni mibdul. It-tneħħija ta 'cilia hija magħrufa li tbiddel il-motilità tas-soluti fiċ-ċelloli tat-tubuli prossimali, speċifikament billi tnaqqas Nat/K plus. Lokalizzazzjoni tal-membrana ATPase u modifika tat-trasport paraċellulari (Overgaard et al..,2009). Huwa possibbli li dan jirriżulta f'alterazzjonijiet fil-funzjoni MATE1, antiporter dipendenti fuq il-gradjent H. Ipoteżi oħra hija li sensing ta 'shear stress jaffettwa l-espressjoni ta' trasportaturi ta 'katjoni organiċi. Shear stress jimmodula l-funzjoni MATE2-K permezz tas-sinjalar Nrf2 (Fukuda et al.,2017). Trasportaturi ta 'katjoni organiċi oħra jistgħu jirrispondu b'mod simili għal shear stress, li jiġi eliminat meta l-cilia mechanosensory jitneħħew. Ħafna minn dan mhux magħruf u jeħtieġ aktar studju. Interessanti, it-tneħħija ta 'cilia ma kellhiex effett sinifikanti fuq l-ASP flimkien ma' trasport minn ċelloli esposti għal 0.2 dynes/cm² ta 'shear stress, iżda ġie osservat effett robust meta shear stress żdied għal 0.5 dynes/cm2. Dan jissuġġerixxi li l-cilija jħossu livell ta' threshold shear stress; min-naħa tagħhom, il-bidliet tas-sinjali tal-cilia fl-espressjoni u l-funzjoni tat-trasportatur huma mistennija effetti li jistgħu jitkejlu fuq it-trasport. B'mod ġenerali, id-dipendenza tat-trasport tal-cation organiku fuq sensing ciliary ta 'shear stress tipprovdi ħarsa lejn il-mogħdija ta' sinjalazzjoni mechanosensory involuta u l-livell minimu ta 'stress li jista' jkun meħtieġ biex iqanqal rispons robust għal shear.

Fil-qosor, din id-dejta turi li l-istress shear mill-fluss tal-fluwidu għandu effett sinifikanti fuq il-funzjoni u l-espressjoni tat-trasportatur tal-katjoni organika fiċ-ċelloli MDCK. Barra minn hekk, ir-regolazzjoni 'l fuq tat-trasport ta' katjoni organika kienet dipendenti fuq il-preżenza ta 'cilia. Nipproponu li apical shear stress huwa komponent importanti ta 'kwalunkwe mudellar in vitro ta'renalitubulariċelluli u x'aktarx li jkun komponent importanti tal-immudellar tat-tneħħija tas-sekrezzjoni renali u n-nefrotossiċità tad-drogi. Il-mekkaniżmu speċifiku li bih is-sinjali tal-istress mekkaniku jżidu l-attività u l-espressjoni tat-trasportatur għadu mhux ċar u jeħtieġ aktar studju.

Referenzi

Astashkina A, Mann B, and Grainger DW (2012) Evalwazzjoni kritika ta 'mudelli ta' kultura ta 'ċelluli in vitro għal screening u tossiċità ta' drogi b'rendiment għoli. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, u Ciarimboli G (2006) Karatterizzazzjoni ta 'mekkaniżmi regolatorji u stati ta' trasportatur ta 'katjoni organika umana 2. Am J Physiol Cell Physiol 290: C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH, and Ferrell N (2016) A bioreactor mikrofluwidi modulari b'rendiment imtejjeb għall-evalwazzjoni ta 'ċelluli epiteljali renali polarizzati. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S, and Wang T (2010) Bidliet indotti mill-istress tal-qtugħ tal-lokalizzazzjoni u l-espressjoni tat-trasportatur tal-membrana fiċ-ċelloli tat-tubuli prossimali tal-ġurdien. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY, and Feraille E (2018) Nefrectomija tal-Unjoni u stress ta 'shear fluwidu apikali jnaqqsu l-abbundanza ta' ENaC fil-ġbir taċ-ċelloli prinċipali tal-kanal. Am J Physiol Renal Physiol 314: F763–F772.

Essig M u Friedlander G (2003) Stress ta 'shear tubulari u fenotip ta' ċelluli tubulari prossimali renali. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD, and Fissell WH (2010) A bioreactor mikrofluwidi b'elettrodi ta 'kejl ta' reżistenza elettrika transepiteljali integrata (TEER) għall-evalwazzjoni ta 'ċelluli epiteljali renali. Biotechnol Bioeng 107: 707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT, and Fissell WH (2012) Immaniġġjar tal-albumina minn ċelluli epiteljali tubulari renali f'bijoreattur mikrofluwidu. Biotechnol Bioeng 109: 797–803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT, and Fissell WH (2012) A bioreactor mikrofluwidi għal studji ta 'ċelluli epiteljali taħt stress shear fluwidu. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M, and Kawamata Y (2017) Fluid shear stress stimulates MATE2-K espressjoni permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358–364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, et al.; International Transporter Consortium (2010) Trasportaturi tal-membrana fl-iżvilupp tad-droga. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY, and Ingber DE (2013) Tubuli prossimali tal-kliewi tal-bniedem fuq ċippa għat-trasport tad-droga u l-valutazzjoni tan-nefrotossiċità. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF, et al. (2016) Tubuli tal-kliewi bioinġinerija jħeġġu b'mod effiċjenti t-tossini uremiċi. Sci Rep 6:26715.

Kola I u Landis J (2004) Tista' l-industrija farmaċewtika tnaqqas ir-rati ta' attrizzjoni? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C, and Fromm MF (2011) Ċelloli MDCK transfettati doppju li jesprimu OCT1/MATE1 jew OCT2/MATE1 tal-bniedem: determinanti ta 'assorbiment u traslokazzjoni transċellulari ta' katjoni organiċi. Br J Pharmacol 163:546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ, and Weisz OA (2017) Endoċitosi apikali tat-tubuli prossimili hija modulata minn stress shear fluwidu permezz ta 'mogħdija dipendenti fuq mTOR. Mol Biol Cell 28: 2508–2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL, et al. (2015) Alterazzjoni indotta mill-istress shear ta 'organizzazzjoni epiteljali fiċ-ċelloli tubulari tal-kliewi umani. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L, and Giacomini KM (2013) Trasportaturi renali fl-iżvilupp tad-droga. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K, and Fromm MF (2013) Rwol ta 'trasportatur ta' katjoni organiku OCT2 u proteini ta 'estrużjoni multidroga u tossini MATE1 u MATE2-K għat-trasport u l-interazzjonijiet tad-droga tal-lamivudine antivirali. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, et al. (2004) Tkabbir, immortalizzazzjoni, u potenzjal ta 'divrenzjar ta' ċelluli normali tat-tubuli prossimali umani adulti. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A, and Yeaman C (2009) Id-deċiljazzjoni hija assoċjata ma 'rimodelazzjoni drammatika ta' junctions ta 'ċelluli epiteljali u oqsma tal-wiċċ. Mol Biol Cell 20: 102–113.

Peters IR, Peeters D, Jgħin CR, u Day MJ (2007) Żvilupp u applikazzjoni ta 'assaġġi tal-ġeni ta' referenza interna multipli (housekeeper) għal normalizzazzjoni preċiża ta 'studji tal-espressjoni tal-ġeni tal-klieb. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W u Gstraunthaler G (1998) Ittestjar tan-nefrotossiċità in vitro--dak li nafu u dak li rridu nkunu nafu. Environ Health Perspect 106 (Suppl 2): ​​559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD, and Weisz OA (2014) Regolazzjoni ta 'shear stress-dependent of apical endocytosis f'ċelluli tat-tubuli prossimali renali medjata minn cili primarji. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V u Weisz OA (2016) Għarfien tar-rwol tal-mechanosensory fir-regolazzjoni tal-funzjoni tat-tubuli prossimali. Am J Physiol Renal Physiol 310: F1–F5.

Schmittgen TD u Livak KJ (2008) L-analiżi tad-dejta tal-PCR f'ħin reali bil-metodu C(T) komparattiv. Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B, u Ulfendahl H (1983) FITC-inulin bħala markatur tat-tubuli tal-kliewi fil-far. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR u Begg DA (1994) Effetti dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta 'cytochalasin D fuq junctions stretti u filamenti ta' actin fiċ-ċelloli epiteljali MDCK. J Cell Sci 107: 367–375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S, et al. (2018) Inġinerija ta 'tubi żgħar b'bidliet fid-dijametru għall-istudju tal-organizzazzjoni taċ-ċelluli tal-kliewi. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Xjenzi tas-sikurezza tad-droga u l-ostaklu fl-iżvilupp tad-droga. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J u Grillari-Voglauer R (2008) hTERT waħdu jimmortalizza ċelluli epiteljali ta 'tubuli prossimali renali mingħajr ma jbiddel il-karatteristiċi funzjonali tagħhom. Am J Physiol Renal Physiol 295: F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y, and Giacomini KM (2013) Skoperta ta’ inibituri potenti, selettivi multidroga u estrużjoni tat-tossini 1 (MATE1, SLC47A1) permezz ta' profili ta' mediċini bir-riċetta u mudellar komputazzjonali. J Med Chem 56:781–795.