Nanoribbon tal-Ossidu tal-Graphene Antiossidant Bħala Aġent ġdid li jbajdu jinibixxi l-Mekkaniżmu tal-Melanoġenesi

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang, u Chia-Liang Sun*

ASTRATT:Fil-proċess ta 'sintesi tal-melanin, ir-reazzjonijiet ossidattivi għandhom rwol essenzjali, u hija strateġija tajba biex tinibixxi l-produzzjoni tal-melanin billi tnaqqas l-istress ossidattiv. Fullerene u d-derivattivi tiegħu, jew il-kumplessi, kienu kkunsidrati bħala kenniesa qawwija tar-radikali ħielsa, u aħna applikajna aktar nanokarbons sp2 b'ħafna saffi biex niskoprumelaninmekkaniżmi inibitorji tas-sinteżi. Fl-istudju preżenti, użajna nanomaterjali ġodda, bħal nanotubi tal-karbonju b'ħafna ħitan (MWCNTs), MWCNTs short-type, graphene oxide nanoribbons (GONRs), u GONRs short-type, bħala aġenti anti-ossidattivi biex jirregolaw il-produzzjoni tal-melanin. Ir-riżultati wrew li GONRs kellhom kapaċitajiet anti-ossidattivi aħjar fi pjattaformi ta 'analiżi ta' stress ossidattiv intraċellulari u extraċellulari minn oħrajn. Aħna pproponejna li l-GONRs għandhom gruppi funzjonali li fihom l-ossiġnu. Fl-assaġġ tad-diaċetat ta '2′,7′-dichlorodihydrofluorescein, sibna li GONR jista' jikkelata joni tal-metall biex ineħħi speċijiet reattivi tal-ossiġnu. Fil-fehma tal-għarfien molekulari, osservajna li dawn in-nanomaterjali rregolaw is-sintesi tal-melanin billi naqqsu l-espressjonijiet tal-ġeni relatati mal-fattur ta 'traskrizzjoni assoċjati mal-mikroftalmja, u kien hemm konsegwenzi simili fl-espressjonijiet tal-proteini. Fil-qosor, il-GONRs huma aġent potenzjali bħala antiossidant ġdid u materjal tal-kosmetoloġija li jbajdu l-ġilda.

Cistanche huwa wkollaġent potenzjali bħala rumanzantiossidantu jbajdu l-ġildamaterjal tal-kosmetoloġija.

1. INTRODUZZJONI

Il-ġilda hija l-organu li jkopri l-wiċċ ta 'barra tal-ġisem tal-bniedem. Peress li l-interface hija f'kuntatt ma 'l-ambjent, is-saff tal-ġilda għandu rwol importanti fil-protezzjoni tal-ġisem kontra l-patoġeni, jevita telf eċċessiv ta' ilma, jirregola t-temperatura tal-ġisem, eċċ. Melanoċiti jikbru fil-membrana bażali tal-epidermide tal-ġilda u jammontaw għal 5 fil-mija sa 10 fil-mija tal-kontenut ċellulari. Ġew ikkaratterizzati bħala "glandoli" uniċellulari li għandhom dendriti u fergħat irqaq, twal, bħal streamer. Melanoċiti jiċċaqilqu miċ-ċelloli epidermali fil-viċinanza immedjata tagħhom, u joħolqu kostellazzjoni ta 'ċelluli epidermali madwar kull melanocyte. Hemm ħafna kawżi interni u esterni tat-tixjiħ tal-ġilda, u fattur wieħed bħal dan huwa r-radjazzjoni ultravjola (UV) mid-dawl tax-xemx.1 Waqt l-espożizzjoni UV, il-livelli ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) fil-ġilda jiżdiedu b'mod drammatiku, li huwa magħruf bħala stress ossidattiv. Diversi fatturi ta 'tossiċità ambjentali jtejbu wkoll l-istress ossidattiv għall-ġilda, bħal pestiċidi, tetraklorur tal-karbonju, metalli tqal, amini aromatiċi, u materja partikulata 2.5 (PM2.5) .2 Fil-mekkaniżmu bijokimiku, l-ossidanti intraċellulari huma ġġenerati mill-non- sistema enżimatika, li tittrasformahom f'ROS biex tiskatta l-mogħdija tal-melanoġenesi.3

Minbarra ROS, hemm ħafna fatturi li jaffettwawproduzzjoni tal-melanin, inkluża l-espressjoni tal-ġeni, infjammazzjoni, bidliet endokrinali, u teħid ta 'pigment.1 Fl-ewwel passi tal-produzzjoni tal-melanin, tyrosinase għandu rwol fil-katalizzar tat-tyrosine f'phenomelanin u eumelanin. Iż-żewġ mekkaniżmi tal-manifattura tal-pigmenti huma simili, li jinkludu l-idrossilazzjoni ta 'L-tyrosine għal 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) u ossidazzjoni L-DOPA għal dopaquinone. Fil-pass li jmiss, id-dopamina tiġi ossidizzata mill-proteina 1 relatata mat-tyrosinase (TRP-1) u l-proteina 2 relatata mat-tyrosinase (TRP-2) fil-melanosome, li hija rregolata mill-fattur tat-traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmja ( MITF) biex jiffurmaw melanin. Fl-aħħarnett, il-melanin jiġi mmaturat u preċipitat fi ħdan l-istratum corneum.4,5 Dawn jippenetraw il-keratinoċiti ġirien tas-saff bażali u jipproteġu d-DNA tagħhom minn kwalunkwe mutazzjoni jew modifiki kkaġunati mill-UV. Il-melanin immaturat fi ħdan il-melanożomi jiġi trasferit għal keratinocytes6-9 u finalment iwassal għal pigmentazzjoni fit-tul. Lentigines, freckles, u tikek kannella/suwed jikkawżaw problemi soċjali fl-irġiel u n-nisa kultant. L-imblukkar tal-istress ossidattiv jew it-trażżin tal-attività tyrosinase hija strateġija waħda biex tirregola s-sindromu ta 'iper-pigmentazzjoni u disturbi dermatoloġiċi. L-antiossidanti jfejqu iper-pigmentazzjonijiet ikkawżati minn ROS u ħsara ċellulari.10,11 Għalhekk, komposti anti-ossidattivi sintetizzati għandhom ħafna applikazzjonijiet bijofunzjonali f'applikazzjonijiet għall-kura tal-ġilda.

Fullerene (C60), nanotubu tal-karbonju (CNT), graphene, u graphene nanoribbon (GNR) huma erba’ tipi ta’ nanokarbon sp2 riċerkati b’mod wiesa’ madwar id-dinja.12 Fullerene u d-derivattivi jew kumplessi tiegħu tqiesu b’saħħithomkenniesa tar-radikali ħielsagħal żmien twil. Yodh et al. uża C60 li jinħall fl-ilma bħala aġent protettiv kontra d-deġenerazzjoni indotta mill-istress kataboliku. Injetta et al. ikkonkluda li C60(OH)24 huwa kompost antiossidant qawwi meta l-istress ossidattiv ikun għoli wisq. Okuda et al. issuġġerixxa li l-kumplessi C60 jistgħu jipprevjenu l-ħsara taċ-ċelluli medjata minn NO.13,14 Tong et al. wera li C60complexes jistgħu jkunu kandidati promettenti għat-trattament ta 'mard relatat mal-moħħ ikkawżat minn livelli miżjuda ta' superoxide. Fil-fatt, kumpanija Ġappuniża identifikat fullerenes b'attività antiossidant qawwija għall-użu kożmetiku fl-2006. Lucente-Schultz et al. wera li l-kapaċità ta 'scavenging radikali ta' l-ossiġnu ta 'CNTs b'ħitan wieħed funzjonalizzati (SWCNTs) hija kważi 40 darba akbar minn dik ta' C60.15-19 dendritiku Fenoglio et al. osserva li CNTs b'ħafna ħitan (MWCNTs) jippossjedu kapaċità notevoli ta 'scavenging radikali f'kuntatt ma' sors estern ta 'radikali hydroxyl jew superoxide.20 Il-kalkoli tat-teorija funzjonali tad-densità żvelaw ukoll mudell ta' SWCNTs bħala kenniesi ta 'radikali ħielsa. Fl-2004, Novoselov et al. l-ewwel wera li l-grafene wera effett elettriku ambipolari qawwi u jista’ jkun promettenti għal applikazzjonijiet elettroniċi.21 Wara dan, komplew juru li l-graffen għandu proprjetajiet elettroniċi li huma distintivi għal gass 2D ta’ partiċelli deskritti mill-ekwazzjoni ta’ Dirac.22,23 Peress li dawn iż-żewġ karti innovattivi, ingħatat aktar u aktar attenzjoni lir-riċerka bbażata fuq il-grafene.24−30 Per eżempju, Qiu et al. fl-2014 wera li l-ossidu tal-grafin u l-grafin ta 'ftit saffi juru attività antiossidant sinifikanti u jistgħu jipproteġu diversi molekuli bijomolekulari mill-ossidazzjoni.31 Han et al. wera b'mod sperimentali fl-2007 li d-distakk tal-enerġija tal-GNRs jista 'jiġi kkontrollat ​​matul il-proċess tal-litografija billi tinbidel il-wisa' taż-żigarella.32 Fost l-erba 'nanokarburi, il-GNRs irċevew l-inqas attenzjoni. Sa fejn nafu tagħna, ftit hemm riċerka dwar il-proprjetajiet antiossidanti tan-nanoribbons tal-ossidu tal-graffen (GONRs).31,33 Għalhekk, f'dan l-istudju, ippreparajna bir-reqqa MWCNTs, MWCNTs qosra, GONRs, u GONRs qosra u mmirati biex inqabblu l-proprjetajiet antiossidanti tagħhom u riżultati relatati sistematikament.

2. RIŻULTATI U DISKUSSJONI

2.1. Morfoloġija ta 'MWCNTs u GONRs.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm sa 2−3 μm. Fl-istess ħin, ġie osservat li t-trattament tal-aċidu nitriku jħares l-uċuħ tat-tubi lixxi. Xi talji u forom irregolari huma murija fl-istampa ta 'ingrandiment għoli. Barra minn hekk, bl-użu ta 'MWCNTs u MWCNTs qosra permezz ta' reazzjonijiet microwave jikseb GONR u GONR qasir, rispettivament. Illustrajna wkoll l-istampi tat-TEM ta’ tkabbir baxx u għoli ta’ GONR u GONR qosra. Minħabba l-unzipping lonġitudinali maġġuri u l-qtugħ orizzontali minuri, jidher li l-GONRs kienu iqsar mill-MWCNTs. Min-naħa l-oħra, stampi ta 'ingrandiment għoli wrew dijametri akbar, jiġifieri, 0.11−0.18 μm, ta' GONRs minn dawk ta 'MWCNTs, li jindikaw li l-proċess ta' unzipping kien ta 'suċċess. Bl-istess mod, GONRs qosra wrew tul iqsar u dijametru akbar minn MWCNTs qosra. Fil-kompressur tal-arja tal-proċess il-ġdid tagħna ta 'unzipping, l-istrutturi b'saffi irqaq tal-GONRs kienu inqas minn dak li ksibna fir-rapport bikri għall-istess qawwa microwave ta' 250 W filwaqt li żammew l-MWCNTs ċentrali eħxen.12 Dan kien ifisser MWCNT tal-qalba tal-qoxra. L-eterostruttura /GONR aktar probabbli tidher minflok l-istruttura tan-nanoribbon kompletament unzipped permezz tas-setgħat kollha tal-microwave fil-proċess il-ġdid. Biex tqabbel mal-GONR qasir fl-istudji preċedenti tagħna,34 l-ogħla qawwa microwave ġġenerat aktar talji fuq in-naħa taż-żigarelli u ma ffurmawx truf sbieħ u lixxi taż-żigarella. Innota li użajna żewġ tipi differenti ta 'grids ta' Cu fil-Figura 1a. Għal MWCNTs u GONRs b'tul biżżejjed, intużat il-grid Gu b'formvar lacey stabbilizzat bil-karbonju (prodott nru 01881-F, Ted Pella, Inc., USA). It-toqob miftuħa f'film tal-karbonju bizzilla ma ħallewx immaġni ta 'trażmissjoni li tikkoinċidi bejn in-nanokarburi u l-film tal-karbonju. In-netwerks griż skur jappartjenu għall-film tal-karbonju lacey. Madankollu, il-grilja Gu b'formvar stabbilizzat bil-karbonju (prodott Nru. 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) kienet meħtieġa għal MWCNT qasir u GONR qasir. Dan kien minħabba li t-toqob kbar fil-film tal-karbonju lacey ikkawżaw problemi biex jinżammu l-MWCNT qasir u l-GONR qasir b'mod effiċjenti. Kif muri fil-Figura 1, il-kuntrast griż ċar taħt il-MWCNTs qosra u l-GONRs qosra huwa saff ħafif ta 'karbonju. Dan is-saff tal-karbonju stabbilizza l-film tal-formvar espost għar-raġġ ta 'l-elettroni permezz tal-proprjetajiet tiegħu ta' konduzzjoni tas-sħana u l-elettriku.

2.2. Konfigurazzjonijiet ta' twaħħil ta' MWCNTs u GONRs.

L-ispettri Raman tal-erba 'nanokarburi huma ppreżentati fil-Figura 1b; il-medda D ta 'GONRs kienet ogħla minn dik ta' MWCNTs wara l-proċess ta 'unzipping. Dan kien attribwit għal-livell ogħla ta 'ossidazzjoni u numru akbar ta' strutturi tat-tarf ta 'GONR meta mqabbla ma' MWCNTs. Dan il-fenomenu huwa wkoll simili għal dak li osservajna f'2011.12 Minħabba l-livell għoli ta' grafitizzazzjoni, il-medda G ta' MWCNTs kellha l-inqas numru ta' wisa' sħiħ fin-nofs massimu. Il-proporzjonijiet ID/IG tal-erba 'nanokarburi kienu {{10}}.076, 0.502, 0.483, u 0.700, rispettivament. Fil-qosor, it-tul imnaqqas u l-ossidazzjoni tal-wiċċ żiedu l-livell ta 'difett u għalhekk għamlu l-proporzjonijiet ID/IG ogħla. Il-quċċata D′ hija preżenti fil-grafeni difettużi kollha u hija meqjusa bħala kejl ta’ kwalità.35 Kif muri fil-Figura 1b, il-qċaċet D′ fl-erba’ spettri jsiru aktar prominenti wara jew il-proċess tat-tqattigħ jew l-unzipping, li jissuġġerixxi li huma distruttivi. proċessi li jintroduċu ħafna difetti. Figura 1c, d juri l-ispettri tal-ispettroskopija tal-fotoelettroni tar-raġġi X tal-erba 'nanokarburi. Apparentement, il-quċċata D′ hija l-aktar ċara għal GONRs qosra. Kif muri fil-Figura 1c, il-livell O żdied b'mod sinifikanti minn 7.6 fil-mija (MWCNTs) għal 19.9 fil-mija (GONRs) minħabba l-kapaċità ta 'ossidazzjoni qawwija ta' KMnO4 f'ambjent aċiduż. Min-naħa l-oħra, il-livell O żdied bi ftit b'0.8 fil-mija mill-MWCNT għall-MWCNTs qosra. Importanti, l-ogħla livell O huwa 38.3 fil-mija għall-GONR qasir, li jimplika li t-truf tan-nanoribbons ikunu aktar faċli biex iwaħħlu gruppi funzjonali tal-ossiġnu mill-uċuħ sp2 planari. In-numru akbar ta 'wisa' sħiħ f'nofs il-massimu u l-bidla għal enerġija vinkolanti għolja ta 'qċaċet C 1s wara l-proċess ta' unzipping kemm ta 'MWCNTs kif ukoll ta' MWCNTs qosra huma illustrati fil-Figura 1d. Għall-ossidi tal-graffen, il-qċaċet dekonvoluti fin-naħa ta’ enerġija li torbot għolja jistgħu jiġu assenjati għal C−C(CC), C−O, CO, u rbit COOH.36 Aħna kkaratterizzajna GONR (200 W) fl-2013 ,37 u r-riżultati kienu simili għar-riżultati ta 'dan l-istudju. Dan l-istudju kkonkluda l-fenomeni tal-ispettri Raman, li jfisser li aktar gruppi funzjonali li fihom l-ossiġnu ġew iġġenerati matul it-trasformazzjoni minn tubu għal żigarella (Figura 2).

2.3. Proprjetajiet Anti-ossidattivi ta 'MWCNTs u GONRs.

2.3.1. Determinazzjoni ta' 1,1-Diphenyl-2-picrylhy- drazyl Assaġġi ta' Attività ta' Tkessiħ ta' Radikali Ħieles.

1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) attività ta' tneħħija tar-radikali ħielsa hija pjattaforma antiossidant applikata biex tiskopri l-kapaċità anti-ossidativa; ir-riżultati għall-erba 'nanokarburi huma deskritti fit-Tabella 2. Fl-assaġġ DPPH, il-vitamina Ċ f'konċentrazzjoni ta' 100 μM intużat bħala kontroll pożittiv. Biex jiġu ttestjati l-attivitajiet anti-ossidattivi ta 'MWCNTs, MWCNTs qosra, GONRs, u GONRs qosra, dożaġġi ta' 1, 5, u 10 mg/L ġew inkubati fis-soluzzjoni ta 'reazzjoni biex jitkejlu l-proprjetajiet. MWCNTs, MWCNTs qosra, GONRs, u GONRs qosra kellhom abbiltajiet inibitorji moderati f'10 mg/L (19.2 ± 0.3, 12.1 ± 0.3, 26.8 ± 0.3, u 30.0 ± 0.4 fil-mija), filwaqt li l-vitamina Ċ kellha kundizzjoni simili f'100 μM (93.4 ± 0.1 fil-mija) għas-soppressjoni.

2.3.2. Assaġġ tal-Attività tal-Ion-Chelating.

Fi ħdan is-sitwazzjoni ta 'stress ossidattiv, il-ferrozine jista' jiżviluppa kumpless b'Fe2 plus biex jitkejjel kwantitattivament. Fil-preżenza ta 'medjaturi kelanti, il-kumpless jinkiser, u jikkawża li l-joni tal-ħadid jitnaqqsu minn kulur aħmar skur tal-kumpless Fe2 plus. Aħna użajna l-EDTA bħala l-kontroll pożittiv. Tabella 2 turi li MWCNTs, MWCNTs qosra, GONRs, u GONRs qosra kellhom attività kelanti f'10 mg/L (29.2 ± {{{10}}.8, 28.7 ± 0 .7, 69.7 ± 0.6, u 68.9 ± 0.3 fil-mija), filwaqt li l-kontroll pożittiv kellu l-kundizzjoni simili f'100 μM (93.4 ± 0.1 fil-mija).

2.3.3. Kejl tal-Enerġija Antiossidanti li Tnaqqas il-Ferriku.

L-assaġġ tal-potenzjal li jnaqqas il-ferriku huwa test sempliċi u affidabbli użat biex jikkwantifika s-sinteżi tal-kumpless Fe(III)-ferricyanide. F'dan l-assaġġ, il-qawwa tat-tnaqqis ta 'l-erba' nanokarburi li jipproduċu l-kumpless tal-ħadid Fe(III)-TPTZ ġiet skoperta minn bidliet fil-kulur tas-soluzzjoni minn isfar għal aħdar u blu. Tabella 2 turi li s-setgħat ta 'tnaqqis ta' MWCNT, MWCNT qasir, GONR, u GONR qasir kienu densità ottika (OD) 1.11, 1.13, 1.15, u 1.11 f'10 mg/L.

2.3.4. MWCNTs u GONRs Inibixxu l-Akkumulazzjoni Intraċellulari ta' ROS.

Bosta rapporti wrew li ROS jeqred l-integrità strutturali tal-membrani taċ-ċelluli, inklużi membrani taċ-ċelluli u membrani nukleari biex iwasslu għal ħsara taċ-ċelluli u għal telf ta 'funzjoni normali.38-40 Barra minn hekk, ROS huwa wkoll wieħed mill-fatturi importanti biex jikkatalizza l-formazzjoni ta' tyrosinase. melanin, u l-inibizzjoni tal-produzzjoni ROS hija strateġija tajba biex tirregola s-sintesi tal-melanin. F'dan l-istudju, użajna l-assaġġ tat-tbajja '2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) biex tanalizza l-livell ta' stress ossidattiv intraċellulari fiċ-ċelloli tat-trattament MWCNT u GONR. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) indotta stimulazzjonijiet ossidattivi fil-gruppi MWCNT u GONR u ntuża bħala kontroll negattiv.41 Meta l-konċentrazzjoni tal-PMA kienet 20 ng/mL, indotta stress ossidattiv, u żiedet il-valur għal 38 fil-mija; wara t-trattament ta 'GONRs u MWCNTs, il-livelli ta' ROS kienu regolati 'l isfel għal-livell normali. Id-dejta wriet li ż-żewġ materjali inibixxu l-livelli ta 'stress ossidattiv, u l-effett anti-ossidattiv ta' GONRs kien ogħla minn dak ta 'MWCNTs (Figura 3). Tabella 1 turi lista ta' konsegwenzi simili. Aħna sostna li hemm tliet raġunijiet għas-sejbiet il-ġodda tagħna: l-ewwel, l-ordni tas-solubilità ta’ dawn il-materjali kienet kif ġej: GONRs qosra > GONRs > MWCNTs qosra > MWCNTs, li jfisser li l-erja ta’ kuntatt ta’ GONRs qosra kienet l-akbar, għalhekk kienet superjuri għall-iskeda ta 'ROS. It-tieni, GONRs u MWCNTs kienu sp2-strutturi tal-karbonju li setgħu jeqirdu l-elettriku ROS permezz tal-formazzjoni tal-adduct jew it-trasferiment tal-elettroni.42 Sibna li l-effetti antiossidanti tal-istrutturi tan-nanoribbon kienu aħjar minn dawk tal-istrutturi tan-nanotubi, għalhekk in-nanoribbons jagħmluha eħfef biex jittrasferixxu elettroni minn nanotubi. Fl-aħħarnett, fil-Figura 1b, aħna nosservaw li s-sit tal-karbonju GONR sp2-kien fih aktar gruppi funzjonali tal-ossiġnu minn MWCNTs, il-gruppi tal-aċidu karbossiliku jistgħu jikkelaw joni tal-metall, u l-gruppi tal-idroksil jistgħu jkunu donatur H biex jaħarbu ROS u jinibixxi l-produzzjoni tal-melanin.

2.4. Ċitotossiċità ta 'MWCNTs u GONRs Ittrattati f'Ċelloli tal-Fibroblast Dermali tal-Bniedem.

Il-metodu {{0}}(4,5-Dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ġie applikat biex jiġi evalwat il- Proprjetajiet ċitotossiċi ta 'GONRs fuq ċelloli Hs68 (Figura 3), u ċelloli ġew ikkultivati ​​f'dożi differenti ta' 1, 5, u 10 ug/mL. Aħna eżaminajna li l-vijabbiltajiet taċ-ċelluli ta 'MWCNT kienu 100.7 ± 3.7, 99.8 ± 4.9, u 94.1 ± 4.7 fil-mija f'konċentrazzjonijiet ta' 1, 5, u 10 mg/L, rispettivament; vijabbiltajiet għall-MWCNT qasir ġew ikkalkulati fl-istess ordni u nstabu li kienu 93.9 ± 2.2, 86.4 ± 3.0, u 98.9 ± 2.1 fil-mija. Aħna osservajna li ċ-ċelloli B16-F10 ġew inkubati f'konċentrazzjonijiet għoljin, u s-sopravivenza taċ-ċelluli taċ-ċelloli Hs68 kienet aktar minn 80 fil-mija, li jissuġġerixxi li l-MWCNT u l-MWCNT qasir ma kellhom l-ebda effett tossiku fuq iċ-ċelloli tal-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem. Il-vijabbiltajiet taċ-ċelluli ta 'GONR u GONR qasir kienu 86.24 ± 2.1, 90.87 ± 3.5, 88.58 ± 2.5, 89.03 ± 3.6, 90.71 ± 2.8, u 90.64 ± 2.5 fil-mija. Huwa wkoll indikat fil-Figura 4a li GONR u GONR qasir ma kellhomx effett ċitotossiku dixxernibbli fuq iċ-ċelloli HS68. F'rapporti preċedenti, l-użu ta 'nanomaterjali mhux ittestjati għal skopijiet kożmetiċi jista' jitqies dubjuż,43,44 u ġeneralment kien minħabba l-attakk tad-DNA wara li n-nanopartiċelli daħlu fiċ-ċelloli. Wara t-test taċ-ċitotossiċità, sibna li l-materjali tagħna ma kkawżawx tossiċità għaċ-ċelloli normali tal-ġilda. Aħna kkonkludejna li wara li n-nanomaterjali daħlu fiċ-ċelloli, in-nanomaterjali biss jinibixxu l-produzzjoni tal-melanin billi jnaqqsu l-istress ossidattiv u l-joni tal-metall kelanti u ma jagħmlux ħsara lill-mitokondrija jew id-DNA, li jfisser li MWCNTs u GONRs kienu sikuri biex jintużaw.

2.5. Żewġ Tipi ta 'MWCNTs u GONRs f'Attività Ċellulari Tyrosinase B16−F10 u Kontenut ta' Melanin.

Fil-mogħdija tas-sintesi tal-melanin, tyrosinase għandu rwol kritiku. Tyrosinase jossidizza u jifforma eumelanin u pheomelanin permezz ta 'serje ta' reazzjonijiet bijokimiċi. Sabiex jiġi ddeterminat jekk GONRs u MWCNTs jinibixxux l-attivitajiet ta 'tyrosinase u jikkawżaw tnaqqis fil-produzzjoni tal-melanin, analizzajna l-attività ta' tyrosinase fiċ-ċelloli B16-F10. Sibna li MWCNTs u MWCNTs qosra inibixxu l-attività ta 'tyrosinase b'madwar 17.1 fil-mija u 23 fil-mija f'10 mg/L. GONRs u GONRs qosra kellhom effetti aħjar fit-trażżin tal-attività tyrosinase fl-istess konċentrazzjonijiet meta mqabbla ma' GONR ieħor. Kienu wkoll b'mod dipendenti fuq id-doża u inibixxu 49.8 fil-mija u 44.7 fil-mija tal-attività tyrosinase, kif muri fil-Figura 4b.

Il-melanin huwa pigment indispensabbli fil-ġisem tal-bniedem, iżda l-espressjoni żejda tal-melanin ħafna drabi twassal għal serje ta 'mard. Fi studji preċedenti, Xiao et al. uża materjal simili, Radical Sponge, nanoparticle fullerene, bħala aġent kontra l-melanin.45 Kien hemm xi riżultati tajbin; madwar 20 fil-mija tal-produzzjoni tal-melanin tista' tiġi inibita. Sabiex intejbu l-effiċjenza tagħha, tjiebna aktar il-materjal tal-ittestjar biex tkejjel ir-rata ta 'inibizzjoni tal-melanin u l-mekkaniżmu molekulari tiegħu, kif muri fil-Figuri 4c u 5. MWCNTs u MWCNTs qosra naqqsu l-kontenut ta' melanin b'17.6 ± 5.5 u 13.2 ± {{ 16}}.2 fil-mija f'10 mg/L u b'mod dipendenti mid-doża. GONRs u GONRs qosra rregolaw b'mod qawwi l-valuri għal 32.0 ± 2.3 u 35.3 ± 3.4 fil-mija f'10 mg/L. Ir-riżultati sperimentali ssuġġerew li l-erba 'tipi kollha jistgħu jinibixxu s-sintesi ta' melanin u l-GONRs kellhom effett aktar qawwi. Min-naħa l-oħra, osservajna wkoll li l-GONR qasir għandu effett aħjar fl-inibizzjoni tal-produzzjoni tal-melanin. Aħna nikkonkludu li l-GONRs qosra għandhom aktar gruppi funzjonali u jistgħu jipprevjenu b'mod effettiv it-tyrosinase katalizzat minn joni tal-metall, u jkompli jinibixxi l-produzzjoni ta 'melanin (Figura 2). Fit-Tabella 1, aħna nosservaw li l-isforz tat-tip qasir ta 'chelating tal-jone tal-metall huwa ogħla mit-tip normali; dan ifisser li dawn il-GONRs qosra jistgħu jiġu applikati potenzjalment fil-qasam kożmetiku bħala aġenti għall-kura tal-ġilda.

2.6. Mekkaniżmu ta 'MWCNTs u GONRs Inibixxi l-Kontenut ta' Melanin Ċellulari B16−F10.

Iċ-ċelloli jirrispondu għall-istress ossidattiv estern billi jirregolaw l-espressjoni tal-proteini. Iċ-ċelluli B16-F10 isaħħu l-espressjoni tal-ġene c-myc u l-AMPK regolata 'l fuq biex inaqqsu l-livelli ossidattivi,46 u f'dan ix-xogħol, MITF huwa fattur ta' traskrizzjoni speċifiku ta 'tyrosinase biex jirregola l-passaġġ tas-sinjal tas-sintesi tal-melanin molekulari.47-49 Fil-Figura 5a, MWCNTs u GONRs jirregolaw 'l isfel il-fattur ta' traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmja billi jnaqqsu l-istress ossidattiv, u mbagħad, downstream ġene TRP-1 u TRP-2 ġew ukoll irregolati. Għal-livell tal-proteini, instab fenomenu simili, fejn MWCNTs u GONRs irregolaw il-mogħdija tal-melanoġenesi relatata mal-MITF u mbagħad finalment naqqsu l-kontenut tal-melanin (Figura 5b).

3. MATERJALI U METODI SPERIMENTALI

3.1. Preparazzjoni ta' MWCNTs u GONRs.

Il-proċess rilevanti biex isiru GONRs ġie rrappurtat f'dokument preċedenti.12 MWCNT (0.{05 g) ġie sospiż f'9:1 H2SO4/H3PO4 u ttrattat b'reattur microwave (CEM-Discover) bil-qawwa ssettjata għal 250 W għal 2 min. Wara ż-żieda ta 'KMnO4 (0.25 g) mas-soluzzjonijiet, is-soluzzjonijiet ġew ittrattati bl-istess qawwa microwave f'65 grad għal 4 min12 Aħna mbagħad immodifika dan il-proċess billi tuża ħin iqsar microwave tat-tieni stadju ta' 8 min billi nutilizzaw kompressur tal-arja. Hawnhekk, il-kompressur tal-arja jintuża biex jikkontrolla t-temperatura tar-reattur tal-microwave matul il-proċess. Il-qawwa tal-microwave ġiet issettjata għal 250 W fit-testijiet preliminari.

3.2. Tħejjija ta' MWCNTs Qosra u GONRs Qasira.

Il-proċess rilevanti biex isiru GONRs qosra ġie rrappurtat fid-dokument preċedenti tagħna.34 Il-ħin tat-trattament aċiduż intgħażel bħala 8 h. Il-qawwa tal-microwave ġiet issettjata għal 250 W, li hija l-istess bħal dik biex jinkisbu GONRs.

3.3. DPPH Attività Radical Scavenging.

DPPH intuża ta 'spiss biex jiddeċiedi l-kapaċità ta' scavenging tal-kampjuni u l-proprjetajiet ta 'antiossidazzjoni.50 DPPH huwa reaġent vjola li jibdel il-kulur minn vjola għal isfar jekk ir-radikali ħielsa jiġi trasferit għall-analite. Kampjuni anti-ossidattivi pożittivi b'konċentrazzjonijiet xierqa ġew miżjuda mas-soluzzjoni, u l-kampjuni ġew analizzati f'517 nm għal 30 min. Aħna użajna l-perċentwali tad-DPPH li jifdal minbarra l-kampjuni tal-ittestjar biex tkejjel l-ammont ta 'antiossidant meħtieġ biex tnaqqas ir-radikali DPPH preċedenti. Vitamina Ċ f'100 μM intużat bħala l-kontroll pożittiv. L-attività tat-tkessiħ ( fil - mija ) kienet imkejla bħala

Kapaċità ta' tneħħija (perċentwali)=(Kampjun − Ablank) / (Acontrol − Ablank) × 100 fil-mija (1)

3.4. Metal-Chelating Attività.

Il-jone tal-metall huwa l-fattur li jikkawża ossidazzjoni eċċessiva tal-lipidi, u Fe2 plus huwa wieħed mill-joni l-aktar li jinfluwenzaw.50 Konċentrazzjonijiet differenti ta 'nanobijomaterjal (1 μL) ġew mgħobbija fi 96-pjanċa ta' bir, li kien fih 2 mM FeCl2·4H2O (10 μL), u mbagħad mgħobbija f'ferrozine (5 mM, 20 μL). It-taħlita kienet imħallata bis-sħiħ ma '69 μL mentol u miżmuma f'temperatura tal-kamra għal 10 min. Imbagħad, is-soluzzjoni ta 'reazzjoni tal-kampjun ġiet osservata f'562 nm. L-EDTA intuża bħala kontroll pożittiv f'100 μM, u l-formula tal-kalkolu tal-attività tal-chelating tal-metall kienet ibbażata fuq eq 1.

3.5. Tnaqqis tal-Qawwa.

Il-kalkolu tal-qawwa tat-tnaqqis huwa bbażat fuq studju preċedenti.50 L-ewwel, 2.5 μL materjali tal-grafene tħalltu ma 'buffer PBS (67 mM, pH 6.8) u K3Fe(CN)6 (2.5 μL, 20 fil-mija) u mbagħad inkubati f'50 grad. għal 20 min. Imbagħad, 10 fil-mija trichloro acetic acid (160 μL) tħallat mar-reaġenti fi 300g ċentrifugati għal 20 min. It-tul ta 'assorbiment ġie ddeterminat f'700 nm wara li tħallat ma' 25 μL FeCl3 (2 fil-mija). Butylated hydroxyanisole (BHA) intuża f'100 μM.

3.6. Eżamijiet tal-Proliferazzjoni taċ-Ċelloli.

Il-linja taċ-ċelluli tal-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem HS68 ġiet impjegata biex tanalizza l-proporzjon tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli. HS68 ġie inkubat fil-mezz Eagle modifikat ta 'Dulbecco (DMEM) li fih 10 fil-mija serum bovin fetali u 1 fil-mija peniċillina u streptomycin imħallat.50,51 Wara li ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' kampjuni, applikajna MTT biex niskopru l-proporzjon ta 'proliferazzjoni taċ-ċelluli. 8000 ċellula ġew miżrugħa fi 96-pjanċi tal-bir u ttrattati b'kampjuni għal 24 siegħa. Is-soluzzjoni supernatant tneħħiet, u użajna s-soluzzjoni MTT għall-kultura għal 2 sigħat f'37 grad. Wara l-inkubazzjoni, neħħejna l-midja li kien fiha MTT u ħallejna b'dimethyl sulfoxide (DMSO). Is-soluzzjoni nqrat f'OD 590 nm u r-rata kkalkulata b'eq 1.

3.7. Valutazzjoni tal-Kontenut tal-Melanin Ċellulari.

Aħna użajna metodu b'modifiki minuri bbażat fuq l-assaġġ preċedenti.52,53 Il-gerbub taċ-ċelluli ta 'B16−F10 minn Bioresource Collection and Research Centre (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Tajwan) ġew maħlula f'taħlita ta' 2.0 N NaOH u 10 fil-mija DMSO. Il-kampjun kien sussegwentement imsaħħan għal siegħa f'90 grad u ċentrifugat f'10,000g għal 10 minuti oħra biex jinkiseb is-supernatant iċċarat. L-għadd tal-melanin ġie ddeterminat bil-monitoraġġ tal-OD tas-supernatant f'475 nm.

3.8. B16−F10 Attività Ċellulari tat-Tyrosinase.

Għall-attività tat-tyrosinase ċellulari B16-F10, irreferejna għax-xogħol preċedenti b'xi modifiki. Ċelloli 50 ġew ikkultivati ​​fi 12- pjanċi ta 'bir f'105 ċelluli kull bir. Wara trattamenti b'kampjuni, iċ-ċelloli ġew lysed f'1 fil-mija Triton X-100/PBS u 2 mM L-tyrosine (50 μL) għal 3 sigħat. Wara l-inkubazzjoni, neħħejna l-midja u qrajna l-assorbiment f'OD 590 nm. Il-formula tal-attività tyrosinase ġiet ikkalkulata bl-eq 1.

Cistanche huwa inibitur tat-tyrosinase.

3.9. Sejbien ta 'ROS minn DCFDA Staining.

B'referenza għall-istudju preċedenti,54 1.2 1.105 ċelluli B16−F10 ġew miżrugħa fi 6-pjanċi bir-bir u ttrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta' kampjuni. Iċ-ċelloli ġew sospiżi f'PBS u mbagħad mgħobbija b'DCFDA (5 μM) f'DMEM mhux fenol aħmar għal 30 min f'37 grad. Iċ-ċitometru tal-fluss (Guava, Merck, il-Ġermanja) intuża biex jiskopri s-sinjal fluworexxenti tad-DCFDA. Wavelengths ta 'eċċitazzjoni u emissjoni ta' DCFDA kienu 488 u 535 nm, rispettivament.

3.10. Reazzjoni kwantitattiva tal-katina tal-polimerażi f'ħin reali.

Aħna segwejna l-metodi ta 'Lin et al. (2018) .1 Reazzjoni kwantitattiva tal-katina ta' traskrizzjoni inversa-polimerażi kwantitattiva f'ħin reali (qRT-PCR) kienet tikkonsisti minn sonda primer esklussiva biex tiġġenera fluworexxenza. Uża teknika ta 'skoperta ta' fluworexxenza li tħoss kull ċiklu bl-użu ta 'Sistema 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, USA). Hija skopra ċ-ċiklu bbażat fuq l-ammont ta 'fluworexxenza rilaxxata, u mbagħad il-prodott ta' kull ċiklu ġie kkalkulat għall-kontenut iġġenerat, li rriżulta fil-kisba ta 'għanijiet kwantitattivi f'ħin reali. Trizol (Invitrogen, USA) intuża biex jiġi estratt RNA komplut tat-tessut tal-pulmun, skont id-direzzjoni mogħtija mill-manifattur. Sussegwentement, intuża kit ta 'traskrizzjoni inversa (Takara, il-Ġappun) biex jiġġenera DNA. Fil-qRT-PCR bl-użu ta 'primers, elenkati fit-Tabella 1, l-ewwel, il-kampjun kien imsaħħan biex jifforma linja waħda ta' DNA; imbagħad seħħ twaħħil primer biex jifforma DNA double-stranded (dsDNA), u wara ġie kkombinat SYBR Green dsDNA, li għalih intuża l-kit tar-reaġent SYBR green plus (Roche, Basel, Svizzera), li rriżulta fir-rilaxx tal-fluworexxenza. Ir-riżultat kien mgħoddi minn sistema ta 'skoperta ta' fluworexxenza. L-iskoperta ta 'sinjali fluworexxenti seħħet matul il-fażi ta' titwil jew ittemprar ta 'kull ċiklu; wara l-iskoperta, il-kontenut tal-kampjun ġew imbuttati lura mill-intensitajiet ta 'fluworexxenza misjuba.55 Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni fil-mira ġew normalizzati għal-livelli ta 'tubulina bl-użu tal-metodu 2−ΔΔCt.

myricetin

3.11. Test Western Blot.

Iċ-ċelloli B16-F10 ġew lysed fi gradi 4 matul il-lejl b'baffer ta 'assaġġ ta' radjuimmunopreċipitazzjoni (Thermo Scientific Co., USA), li fih inibituri tal-protease. Il-kit tal-assaġġ tal-proteina tal-aċidu bicinchoninic (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) intuża biex jikkwantifika l-ammont tal-proteina. Il-proteini tal-kampjun ġew separati fuq ġel ta '10 fil-mija sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide u trasferiti fuq membrana polyvinylidene difluoride (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). Il-membrana PVDF ġiet imblukkata b'buffer imblukkar (Thermo Scientific) għal siegħa u inkubata bl-antikorp primarju speċifiku matul il-lejl f'4 gradi. Sussegwentement, il-membrana ġiet maħsula b'Tris buffered saline-Tween 20 buffer darbtejn u inkubata b'antikorpi sekondarji għal 1.5 sigħat. Wara dan, il-membrana ġiet dipped f'reaġenti ta 'skoperta ta' kimiluminixxenza (Thermo Scientific) u analizzata minn imager MiniChemi Chemiluminescence (Beijing Sage Creation Science, iċ-Ċina). Sorsi ta' antikorpi kienu jinkludu fenek anti-MITF, fenek anti-TRP-1, fenek anti-TRP-2, u -actin (Thermo Scientific).

3.12. Analiżi tal-Materjal.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) ġie utilizzat biex josserva l-morfoloġija tan-nanokarburi. Spettrometru Raman mikro (PTT, RAMaker) ġie applikat biex jiċċekkja l-modi ta 'reżonanza tan-nanokarburi. Twettqu wkoll kejl tal-ispettroskopija tal-fotoelettroni tar-raġġi X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) għad-determinazzjoni tal-analiżi tal-kompożizzjoni.12,34

3.13. Analiżi Statistika.

Il-kampjuni u l-esperimenti standard kollha ġew ripetuti mill-inqas tliet darbiet. Aħna applikajna t-test ta' Student biex inqabblu u nesprimi l-medja tal-valuri medji ± devjazzjoni standard statistikament.

4. KONKLUŻJONIJIET

Fil-qosor, osservajna li l-GONR qasir kien materjal potenzjali għall-prodotti tal-kura tal-ġilda minħabba l-proprjetajiet bijofunzjonali multipli tiegħu (Figura 6). Ir-riżultati wrew li n-nanokarburi kellhom rwol bħala antiossidant extraċellulari u intraċellulari. Sadanittant, in-nanokarbon inibixxi l-attività tat-tyrosinase u l-kontenut tal-melanin u ma kkawża l-ebda ħsara serja liċ-ċelloli tal-pigment. Dan ix-xogħol stabbilixxa l-funzjonijiet kontra l-melanogenesis ta 'erba' tipi ta 'nanokarbons; studji futuri se jiġu eżaminati l-mekkaniżmu ta 'dawn il-komposti fuq espressjonijiet ta' ġeni u proteini speċifiċi relatati mal-maturazzjoni, it-trasport u l-akkumulazzjoni tal-melanin.

Cistanche itejjeb il-bajd.

Jekk jogħġbok ikklikkja l-istampa u tikseb aktar dettalji.