Effetti kontra l-proliferazzjoni tas-salsa ta' Cistanches fuq il-progressjoni tal-iperplażja beninna tal-prostatika Ⅰ

Astratt:Cistanche Tubulosaintuża fil-mediċina tradizzjonali għat-trattament tadefiċjenza tal-kliewi, newrastenja, mard b'disfunzjoni sesswali, uiperplażja beninna tal-prostata(BPH). L-għan ta' dan l-istudju kien li jinvestiga l-mekkaniżmu li bih l-estratt ta' C. tubulosa (CSE) iqajjem aneffett anti-proliferattiv fuq it-tessut tal-prostatatal-firien indotti minn BPH. L-effetti ta 'CSE fuq BPH ġew evalwati f'termini ta' piż tal-prostata, produzzjoni ta 'seruln dihydrotestosterone (DHT), u l-espressjoni ta' mRNA ta '5o-reductase tip 1 u tip 2 fit-tessut tal-prostata ta' firien indotti minn BPH. Barra minn hekk, tbajja ta 'ematossilina u eosina (H & E) twettqet għal eżami istoloġiku tal-morfoloġija tal-glandola tal-prostata, u l-livelli ta' espressjoni tal-proteini fit-tessut tal-prostata ġew investigati permezz ta 'analiżi western blot. It-trattament CSE naqqas il-piż tal-prostata, il-konċentrazzjoni tad-DHT fis-serum, u l-espressjoni tal-mRNA ta '5o-reductase tip 1 u tip 2 fit-tessut tal-prostata ta' firien indotti minn BPH. Barra minn hekk, it-trattament CSE soppressa l-proliferazzjoni taċ-ċelluli billi rregola l-livelli ta 'espressjoni ta' proteini relatati mal-infjammazzjoni (nitric oxide synthase u cyclooxygenase 2 inducibbli) u proteini assoċjati mal-apoptosi (caspase-3 u proteini tal-familja Bcl-2). CSE jista' jkun kandidat terapewtiku potenzjali għal BPH minħabba l-abbiltà tiegħu li jirregola l-espressjoni ta' proteini infjammatorji u relatati mal-apoptosi.

Kliem ewlieni:iperplażja beninna tal-prostata, Cistanche Tubulosa, dihydrotestosterone, infjammazzjoni, apoptożi, Bcl-2.

Ittratta BPH Cistanche

Introduzzjoni

Cistanche Tubulosahija pjanta parassitika indiġena għall-majjistral taċ-Ċina. Iz-zokk tiegħu huwa mediċina orjentali tradizzjonali importanti li tintuża għat-trattament ta 'defiċjenza tal-kliewiunewrastenja(Deng et al.2004).C.tubulosa ġie rrappurtat ukoll li huwa effikaċi fit-trattament ta 'mard b'disfunzjoni sesswali, bħalimpotenzauiperplażja beninna tal-prostata(BPH) fil-ktieb tal-mediċina Koreana msejjaħ il-DonguiBogam. Phenylethanoid glycosides (PhGs) huma l-kostitwenti attivi ewlenin ta 'din il-ħaxix (Jimenez u Riguera 1994). Ħafna PhGs intwerew li għandhom firxa wiesgħa ta' proprjetajiet bijoloġiċi, inklużi effetti antiossidanti u antitumorali. Acteoside, PhG minn C. tubulosa, jinibixxi l-apoptożi indotta mill-jone tal-1-metil-4-phenylpyridinium (MMP*) fin-newroni tal-granuli ċerebellari (Pu et al. 2003). Għalkemm saru studji dwar il-funzjonijiet fiżjoloġiċi ta' C. tubulosa, il-mekkaniżmu(i) molekulari li fuqhom huma bbażati l-effetti ta' C. tubulosa fuq BPH ma ġewx investigati.

BPH hija kkaratterizzata minn tkabbir tal-prostata, minħabba tkabbir mhux kanċeruż fil-glandola (Andriole et al. 2004). Żidiet fil-prevalenza u l-inċidenza ta' BPH qed iseħħu fil-kuntest ta' popolazzjoni li qed tixjieħ. Sal-2030,20 fil-mija tal-popolazzjoni tal-Istati Uniti se jkollha 65 sena jew aktar, ċifra li se tinkludi aktar minn 20 miljun raġel (Parsons 2010). Għalkemm BPH hija disturb komuni fl-irġiel anzjani, l-etjoloġija u l-patoloġija ta BPH mhumiex definiti kompletament, u bħalissa m'hemm l-ebda trattament perfett għall-BPH (Djavan et al.2010).

Għażliet ta' trattament għal BPH jinkludu strateġiji farmakoloġiċi u kirurġiċi.

F'dawn l-aħħar snin, in-numru ta 'interventi kirurġiċi f'pazjenti b'pazjenti b'BPH naqas favur trattamenti farmakoloġiċi (Emberton et al. 2011). Minħabba n-natura tal-BPH, it-trattament farmakoloġiku jeħtieġ użu fit-tul u kontinwu tal-medikazzjoni. Għalhekk, it-tollerabilità fit-tul u kontinwa tal-medikazzjoni hija kwistjoni importanti ħafna. Diversi tipi ta 'aġenti farmako-loġiċi bħal inibituri 5a-reductase (finasteride u du-tasteride) u antagonisti a-adrenoceptor (alfuzosin, terazosin, doxazosin, tamsulosin) jintużaw għat-trattament ta' BPH (Lepor 2011);

Untergasser et al.2005).L-aġenti farmakoloġiċi ewlenin għat-trattament tal-BPH huma inibituri 5a-reductase, li huma magħrufa li jirregolaw il-livelli ta '5o-dihydrotestosterone, u imblokkaturi o-adrenerġiċi (Tiwari et al. 2005). Għalkemm dawn l-aġenti farmakoloġiċi huma kkunsidrati li jinibixxu b'mod sinifikanti l-progress tal-BPH, bosta studji rrappurtaw l-effetti sekondarji mhux mixtieqa tagħhom (Patel and Chapple 2006). mijopatija severa, minħabba x-xebh strutturali tagħha ma 'ormoni sterojdi (McConnell et al.2003; Uygur et al.1998). Minħabba li dawn l-aġenti farmakoloġiċi juru effetti sekondarji mhux mixtieqa, is-sejba ta' rimedji erbali li jittrattaw b'mod effettiv BPH għandha valur mediċinali konsiderevoli.

Biex nevalwaw l-effett ta 'C. tubulosa fuq BPH, aħna wrejna li l-estratt ta' C. tubulosa (CSE) jista 'jimmodula l-iżbilanċ bejn it-tkabbir taċ-ċelluli tal-prostata u l-apoptosi f'mudelli ta' firien BPH indotti minn testosterone.

Materjali u metodi Materjali u reaġenti

C.tubulosa inxtara minn Omniherb Co.Ltd. (Daegu, ir-Repubblika tal-Korea) u finasteride inkiseb minn Merck u Co.Inc. (New Jersey, l-Istati Uniti). Testosterone, phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), Triton X-100, propidium iodide (PI), Nonidet P-40(NP{-40), u protein inhibitor cocktail (PIC) inxtraw minn Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Missouri, l-Istati Uniti). GAPDH oligonucleotide primers u 5o-reductase tip 1 u tip 2 inxtraw minn Bioneer (Deajeon, Korea), u SYBR Primix Ex Taq inxtara minn Takara (Shuzo, Shiga, Japan). Antikorpi għal anti-iNOS (M{{9} }), COX-2(C-20),poly(ADP-ribose)polimerażi-1(PARP-1,(D-1),caspase{{ 16}} (H-277),Bcl-2(C-2),Bcl-xL(H{-5),Bax(B{-9),u anti- -actin(ACTBD11B7)inxtraw minn Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA). L-antikorp għall-anti-PCNA inxtara minn BD Biosciences,Pharmingen (San Diego, California, USA). Preparazzjoni ta' C estratt ta' tubulosa (CSE)

Il-ħxejjex aromatiċi ta 'C. tubulosa inxtraw minn Omniherb Co.Ltd. (Yeongcheon, Kyungpook, ir-Repubblika tal-Korea). Huma kellhom kontenut ta 'umdità ta'<13% by="" weight="" and="" were="" air-dried.="" afterward,="" herbs="" underwent="" extraction="" with="" 50%(v/v)="" ethanol-water="" at="" 60="" ℃for="" 8="" h.="" the="" extract="" obtained="" was="" filtered="" through="" 20="" μm="" cartridge="" paper,="" and="" ethanol="" was="" removed="" by="" vacuum="" rotary="" evaporation="" (eyela,="" japan).="" the="" concentrate="" was="" subsequently="" freeze-dried,="" and="" the="" yield="" was="" found="" to="" be="" 12%="" w/w.="" the="" experiment="" was="" performed="" by="" dissolving="" the="" dry="" extract="" in="" distilled="" water,="" and="" the="" rest="" of="" extract="" was="" stored="" at="" -20="" ℃.="" the="" identities="" of="" the="" active="" components="" of="" the="" extract,as="" determined="" by="" hplc,="" were="" reported="" previously(jiang="" and="" tu="">

Annimali

Firien Sprague-Dawley maskili ta 'għaxar ġimgħat (200±20 g) inxtraw minn Daehan Biolink (Daejeon, Repubblika tal-Korea). L-annimali kienu miżmuma taħt kundizzjonijiet li kienu skont il-linji gwida għall-kura u l-użu ta 'annimali tal-laboratorju, adottati u promulgati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura tal-Annimali tal-Università ta' Sangji (Reg. Nru. 2014-09). Il-firien ġew akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal ġimgħatejn qabel ma bdew l-esperiment. Ġew ipprovduti aċċess liberu għall-ikel u l-ilma għal ġimgħat 4 u nżammu taħt ċiklu ta 'dawl ta' 12-il siegħa/12-il siegħa skur f'temperatura kostanti ta '22±2 grad u umdità relattiva ta' 55±9 fil-mija matul l-esperiment. Il-firien ġew assenjati b'mod każwali għal wieħed minn 4 gruppi (n=6): il-grupp ta 'kontroll (Con, prostata normali b'soluzzjoni ta' vettura: phosphate buffered saline (PBS) 200μL, po); grupp indott minn BPH （BPH）, Grupp indott minn BPH ittrattat b'finasteride (5 mg/kg/kuljum, po,(Fina));Grupp indott minn BPH ittrattat b'CSE (200 mg/kg/jum; po) Il-firien fil-grupp ta' kontroll inqatgħu miftuħa u imbagħad meħjuta mingħajr ma tneħħi t-testikoli wara anestetizzazzjoni b'zoletil@ 50 (20 mg/kg, ip);firien fil-gruppi l-oħra ġew kastrati.Wara 3 ijiem ta 'rkupru, il-gruppi indotti minn BPH ġew injettati b'propionate ta' testosterone (10mg/kg). /jum,ip, maħlul fiż-żejt tal-qamħ) waħdu jew flimkien ma 'CSE jew finasteride kuljum għal ġimgħat 4. Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-aħħar amministrazzjoni, il-firien kollha ġew sagrifikati wara anestetizzazzjoni b'zoletil@ 50 (20 mg/kg,ip). Ġew meħuda kampjuni tad-demm mill-vina cava kawdali, u s-serum ġie separat permezz ta' ċentrifugazzjoni u maħżun fi grad-80. Il-glandola tal-prostata kollha tneħħiet u miżuna (Guo et al.2004).

Proporzjon tal-piż tal-prostata mal-piż tal-ġisem

It-tessuti tal-prostata tneħħew, laħlaħ, u jintiżnu immedjatament. Il-proporzjon tal-piż tal-prostata mal-piż tal-ġisem (proporzjon PW/BW) ġie kkalkulat kif deskritt hawn taħt.

Proporzjon PW/BW

= (kull piż tal-prostata ta' annimal minn grupp sperimentali/kull piż tal-ġisem ta' annimal minn grupp sperimentali) x 100 Inibizzjoni tat-tkabbir tal-piż tal-prostata

Mat-tlestija tal-istudju, il-prostati tneħħew u jintiżnu. Il-perċentwal ta' inibizzjoni tat-tkabbir ġie kkalkulat kif ġej:100-[(grupp ta' kontroll tal-grupp ittrattat)(grupp ta' kontroll tal-grupp BPH)×100]. Konċentrazzjonijiet fis-serum ta' analiżi ta' dihydrotestosterone (DHT).

Konċentrazzjonijiet fis-serum ta' DHT ġew determinati b'ELISA kummerċjali (ALPCO Diagnostics, Salem, New Hampshire, USA). Kif jgħid twettqu skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Analiżi istoloġika

It-tessut tal-prostata f'kull grupp ġie ffissat f'soluzzjoni ta 'formalina ta' 4 fil-mija, inkorporat fil-paraffin, u mbagħad maqtugħ f'sezzjonijiet ta '4 pm. Is-sezzjonijiet kienu mtebbgħin b'ematossilina u eosina (H&E) għal eżami istoloġiku. Immaġini ġew akkwistati permezz ta 'mikroskopju SZX10 (Olympus, Tokyo, Ġappun). L-analiżi istoloġika u l-ħxuna tat-tessut epitelju mill-prostata (TETP) tkejlu minn istologu professjonali minn Seoul Medical Science Institute (Seoul, Korea) bl-użu Leica Application Suite (LAS, ver. 3.3.0) softwer għall-valutazzjoni oġġettiva fl-analiżi istoloġika. Analiżi kwantitattiva f'ħin reali tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR).

It-tessut tal-prostatiku minn kull annimal ġie omoġenizzat, u l-RNA totali ġie iżolat bl-użu ta 'Easy-Blue@ Reagent (Intron Biotech-nology Inc., Gyeongi-do, Repubblika tal-Korea) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-RNA totali ġie kkwantifikat bl-użu ta 'sistema ta' spettrofotometru Epoch@micro-volum (BioTek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, USA). L-RNA totali mill-fwied u t-tessuti tax-xaħam vixxerali ġie kkonvertit f'cDNA permezz ta' kit ta' traskrizzjoni inversa ta' cDNA b'kapaċità għolja (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). L-amplifikazzjoni tal-PCR saret bl-użu ta' SYBR green (Applied Biosystems) ). L-oligonucleotide primers għal 5o-reductase tip 1, iddisinjati mill-far, kienu GGAAGG TTT CAT GGCCTT CG(forward) u TCG AGG GCA GCT GTA TG(reverse), il-5o-reductase tip 2 primers, iddisinjati mill-far, kienu ATG GGG ACC CTG ATC CTG TG (quddiem) u CGA CAC CACAAA GGA AGG CA (reverse), u l-primers GAPDH, użati bħala ġene tad-dar u ddisinjati mill-far, kienu TGA TTC TAC CCA CGG CAA GT (quddiem) u AGC ATC ACC CCA TTT GAT GT (reverse).Traskrizzjoni inversa twettqet bl-użu ta 'thermocy-cler (Gene Amp⑧ PCR system 9700, Applied Biosystems), u r-riżultati ġew espressi bħala l-proporzjon ta' densità ottima għal GAPDH. Analiżi Western blot

Tessut tal-prostataminn kull annimal ġie omoġenizzat fil-liżi buffer kummerċjali PRO-PREP⑧(Intron Biotechnology Inc.) u inkubat għal 25 min fuq is-silġ biex jinduċi liżi taċ-ċelluli. L-estratti tat-tessuti ġew ċentrifugati f'16 000g(4 gradi) għal 20min, u s-supernatant ġie trasferit għal tubu nadif. Il-konċentrazzjoni tal-proteina kienet tiskoraġġixxi wriet bidliet istoloġiċi tipiċi, inkluż epitelju glandulari mħaxxen, ċitoplasma vacuolated li tipponta lejn il-lumen glandulari, u żona luminali glandulari mnaqqsa (Fig. 3A). L-amministrazzjoni ta 'CSE għal 4 ġimgħat ssoppressa dawn ix-xejriet iperplastiċi tipiċi, li jirrappreżentaw bidla istoloġika minn tessut normali tal-prostata għal iperplażja tal-prostata. Fil-qosor, eżami istoloġiku ta 'gruppi kkurati b'finasteride u CSE wera tendenza ċara għat-titjib tal-iperplażja tal-prostata. Barra minn hekk, kif muri fil-Fig. 3B, l-analiżi TETP wriet li l-aktar tessut epiteljali mħaxxen kien osservat fil-firien indotti minn BPH meta mqabbel ma 'dak fi kwalunkwe gruppi ta' studju oħra, u gruppi ttrattati b'finasteride u CSE wrew tnaqqis sinifikanti fil-ħxuna tal-prostata .

Biex tevalwa l-proliferazzjoni ta 'ċelluli epiteljali tal-prostata, eżaminajna l-espressjoni tal-proteina ta' PCNA fit-tessut tal-prostata ta 'firien indotti minn BPH. Kif muri f'Fig. 3C, l-analiżi tal-western blot indikat żieda fl-espressjoni tal-proteina PCNA fil-grupp indott minn BPH meta mqabbel mal-livelli ta 'PCNA fil-grupp ta' kontroll. Meta mqabbel mal-grupp indott minn BPH, madankollu, il-gruppi ttrattati b'finasteride u CSE wrew espressjoni mnaqqsa tal-proteina PCNA, li jindika l-effetti tagħhom kontra l-proliferazzjoni f'BPH.

Fig.2.Effett ta 'l-amministrazzjoni ta' l-estratt ta 'Cistanche Tubulosa (CSE) fuq il-produzzjoni tas-serum dilhydrotestosterone (DHT) u l-livelli ta' mRNA 5a-reductase tat-tip 1 u tat-tip 2 f'tessuti tal-prostata ta 'mudelli ta' far indotti minn iperplażja prostatika beninna (BPH). (A) Konċentrazzjonijiet fis-serum ta 'DHT ġew determinati bl-użu ta' analiżi ELISA. (B) 5a-Reductase tat-tip 1 u tat-tip 2 mRNA expressionin tessut tal-prostata ġew analizzati b'PCR kwantitattiv f'ħin reali. Id-dejta murija tirrappreżenta medja ± SEM ta’ 6 firien għal kull grupp.”p<><0.001 vs.con=""><0.001 vs.bph="">