Effetti Anti-Aging Ta Polyoxometalates Fuq Ġilda

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Astratt:Ġenerazzjoni eċċessiva ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) mill-infjammazzjoni u l-glikazzjoni tikkontribwixxi għal diversi bidliet fil-ġisem relatati mat-tixjiħ. Għalhekk, l-inibizzjoni tal-produzzjoni ta 'ROS tista' tipprevjeni t-tikmix, il-makula, il-matt, u n-nuqqas fil-ġilda. Biex jiġu evalwati l-effetti kontra t-tixjiħ ta 'żewġ polyoxometalates (PMs: VB2 u VB3) fuq il-ġilda, dan l-istudju investiga jekk tejbux ir-risponsi kontra t-tixjiħ ta' fibroblasti dermali umani normali (NHDF) għal stress ossidattiv minħabba prodotti aħħarija avvanzati ta 'glycation (AGEs). ) jew espożizzjoni għall-H2C 2. Meta mqabbel mal-livelli ta' espressjoni ta' mRNA ta' riċetturi ta' AGE f'ċelloli esposti għal AGEEs waħedhom, trattament addizzjonali b'VB2 jew VB3 żied b'mod sinifikanti l-livelli ta' espressjoni ta' ĦOSS-1, ĦOSS-2, u RAGE. Taħt kundizzjonijiet ta 'stress indotti mill-AGE, il-livelli ta' espressjoni ta 'ħames proteini ta' xokk tas-sħana żdiedu b'mod notevoli mit-trattamenti VB. Bil-maqlub, VBs irażżnu l-induzzjoni tal-mewt taċ-ċelluli u l-produzzjoni intraċellulari ta 'ROS. Il-VBs eżerċitaw ukoll effetti profilattiċi fuq dawn l-avvenimenti ta 'ħsara taħt kundizzjonijiet ta' stress. Barra minn hekk, trattamenti VB instabu li jipprevjenu kemm is-soppressjoni tal-espressjoni AQP-1/AQP{-3 kif ukoll is-soppressjoni tal-produzzjoni tal-hyaluronan u l-elastin indotta permezz tal-espożizzjoni tal-H2O2. Dawn ir-riżultati juru l-potenzjal ta 'VB2 u VB3 bħala aġenti kontra t-tixjiħ.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Kliem ewlieni:polyoxometalate; stress ossidattiv; HyO2; speċi ta' ossiġnu reattivi; prodott aħħari avvanzat ta 'glycation; superoxide dismutase; hyaluronan; akkwaporin

1. Introduzzjoni

Il-glikazzjoni, l-ossidazzjoni u l-infjammazzjoni kronika huma 3reazzjonijiet maġġuri relatati mat-tixjiħ, u speċijiet reattivi tal-ossiġnu (ROS), li huma ġġenerati u jakkumulaw fis-siti ta’ dawn ir-reazzjonijiet, intwerew li jinduċu diversi fenomeni ta’ tixjiħ [1-5]. Minħabba li dawn ir-reazzjonijiet relatati mat-tixjiħ iseħħu fil-ġilda, il-ġenerazzjoni mrażżna ta 'ROS hija kkunsidrata li hija effettiva għall-prevenzjoni tat-tikmix, tal-makula, tat-tfixkil u tal-laxk [6].

Il-glikazzjoni hija reazzjoni kimika mhux enżimatika li biha molekuli taz-zokkor jew intermedji tal-metaboliżmu tal-glukożju (eż., glyceraldehyde) jaderixxu ma 'residwi ta' aċidi amminiċi f'diversi proteini u eventwalment jiġġeneraw prodotti finali ta 'glikazzjoni avvanzata (AGEs) [7].puritani vitamina ċL-AGEs għandhom rwoli sinifikanti mhux biss fil-fenomeni ta 'tixjiħ fil-ġisem kollu, iżda wkoll f'varjetà wiesgħa ta' mard. Pereżempju, il-kollaġen fil-ġilda huwa glycated b'mod naturali u, għalhekk, l-ammont ta 'prodotti ta' glycation jiżdied bl-età. Żidiet fl-AGEs ġew ssuġġeriti li għandhom rwol kawżattiv fid-dijabete abbażi tas-sejbiet li juru li l-kontenut tagħhom fil-kolla-ġen tal-ġilda kien ogħla f'pazjenti dijabetiċi milli f'individwi b'saħħithom imqabbla mal-età [8]. Barra minn hekk, il-formazzjoni u l-akkumulazzjoni ta 'AGEs fiċ-ċelloli ġew implikati fit-tixjiħ tal-ġilda [8], il-marda ta' Alzheimer [9], pressjoni għolja [10], arterjosklerożi [1], u osteoporożi [12].

Cistanche jista 'anti-aging

L-AGEs huma prodotti taħt kundizzjonijiet patoloġiċi speċifiċi, bħal stress ossidattiv, u jiffunzjonaw bħala medjaturi proinfjammatorji. Huma jaffettwaw kważi kull tip ta 'ċellula fil-ġisem. Ħafna mill-effetti ċellulari ta 'AGEs jinvolvu żewġ tipi differenti ta' riċetturi AGE; tip wieħed ġie implikat fl-infjammazzjoni u l-ġenerazzjoni ta 'ROS permezz tal-attivazzjoni tiegħu ta' mogħdijiet tas-sinjali intraċellulari, filwaqt li t-tip l-ieħor huwa involut fid-degradazzjoni u l-eliminazzjoni ta 'AGEs permezz ta' riċettur medjat. endoċitożi u proteoliżi dipendenti fuq il-lisosomi (Figura 1).puritani vitamina ċL-effetti tar-riċetturi AGE preċedenti jeħtieġ li jiġu mrażżna, filwaqt li dawk ta 'l-aħħar jeħtieġ li jiġu promossi biex jipprevjenu jew idewmu s-senescence ċellulari. Ir-riċetturi AGE fil-grupp ta 'qabel jinkludu r-riċettur għal prodotti finali ta' glikazzjoni avvanzata (RAGE) u r-riċettur AGE 2 (AGE-R2), u dawk fil-grupp tal-aħħar jinkludu fasciclin EGF-like, lamin-type EGF, link domain-li fihom riċettur ta' kennies-1 (ĦOSS-1), ĦOSS-2, AGE-R1, AGE-R3, u CD36.

Fost ir-riċetturi tal-AGE AGE-R1, FEEL-1, FEEL-2, u CD-36 jikkontribwixxu għall-endoċitożi ta' AGEs extraċellulari fiċ-ċelloli u d-degradazzjoni tagħhom permezz tal-fużjoni phagosome-lysosome. Riċetturi AGE oħra, bħal AGE-R2, AGE-R3, u RAGE, iżidu l-ġenerazzjoni ta 'ROS intraċellulari direttament jew indirettament permezz tal-attivazzjoni ta' NADPH oxidase.

Ħsara lid-DNA, proteini u lipidi, li hija kkawżata minn ROS iġġenerat taħt kundizzjonijiet ta 'stress ossidattiv, hija avveniment ċellulari ewlieni li ġie implikat b'mod qawwi fit-tixjiħ aċċellerat u l-iżvilupp u l-aggravar ta' mard ġerjatriku [7,13]. Għalhekk, huwa importanti li titrażżan l-akkumulazzjoni ta 'ROS u tkabbar il-livelli ta' antiossidanti, bħal superoxide dismutase (SOD), biex tikkontrolla l-proċess tat-tixjiħ[14]. Barra minn hekk, aquaporin (AQP)-1 u AQP-3, li jikkontrollaw il-permeabilità tal-molekuli tal-ilma fil-membrana taċ-ċelluli, kif ukoll il-hyaluronan u l-elastin jipparteċipaw fl-idratazzjoni u l-anti-aging tal-ġilda. Il-livelli ta' espressjoni ta' AQP-art AQP-3 intwerew li jonqsu taħt kundizzjonijiet ta' stress ossidattiv [15].sistancheId-degradazzjoni tal-elastin, proteina ewlenija tal-fibri elastiċi, hija meqjusa bħala kawża tal-formazzjoni tat-tikmix, filwaqt li l-produzzjoni sostenibbli u adegwata tagħha hija involuta mill-qrib fir-riġenerazzjoni tal-ġilda [16,17]. Għalhekk, huwa importanti li jinżammu dawn il-molekuli taħt kundizzjonijiet ta 'stress biex irażżnu l-fenomeni tat-tixjiħ fil-ġilda.

Diversi mijiet ta’ polyoxometalates (PMs), li huma ossidi tal-metall li jiffurmaw diversi strutturi, ġew sintetizzati sal-lum, u xi wħud juru attivitajiet anti-neoplastiċi, antivirali u anti-batteriċi[18]. Preċedentement identifikajna 2PMs (VB2 u VB3) b'attivitajiet anti-batteriċi u anti-virali qawwija u wrejna li inibixxu l-adeżjoni u l-invażjoni ta 'viruses fiċ-ċelloli billi jorbtu ma' partiċelli virali[19]. L-iżvilupp ta' prodotti bi proprjetajiet iġjeniċi eċċellenti jista' jkun possibbli billi jiġu inkorporati PM stabbli u antimikrobiċi fil-materjali [20].

Fl-istudju preżenti, eżaminajna l-effetti tal-PMs (VB2 u VB3) fuq ir-rispons tal-istress tal-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem għal AGEs u perossidu tal-idroġenu (H2O2) u evalwajna l-attivitajiet tagħhom kontra t-tixjiħ.

2. Materjali u Metodi

2.1.PMs

Trabijiet bl-ingrossa ta' VB2(K1H[(VO)(SbWgO3)2]27H-O) u VB3(Na[SbWg]-19H2O) ġew sintetizzati bl-użu tal-metodu privattiva tagħna (numru tal-pubblikazzjoni tal-privattiva internazzjonali: WO2{{11} }19/230210).Kull trab tal-massa kien mitħun f'mehrież, maħlul f'ilma ultrapur, u s-soluzzjoni ntużat f'esperimenti wara li għaddiet minn filtru 0.45-um. 2.2.Materjali

DL-glyceraldehyde u HzOg inxtraw minn Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, il-Ġappun). L-albumina tas-serum bovin (BSA) (Frazzjoni V) inxtrat minn SIGMA (St. Louis, MO, USA).

2.3.Glycation tal-BSA

L-AGEs ġew ippreparati kif deskritt qabel [21].cistanche benefíciosBSA (25 mg/mL) ġie inkubat b'0.1 M DL-glyceraldehyde f'salina buffered bil-fosfat, pH7.4 (PBS), f'37 grad għal 7 ijiem, u użat bħala AGEs f'esperimenti. 2.4.Kulturi taċ-Ċelloli

Fibroblasti dermali umani normali (NHDF) derivati ​​minn prepuzju żagħżugħ (C-12300, PromoCell, Sickingenstr.63/65,69126 Heidelberg, il-Ġermanja) ġew ikkultivati ​​bl-użu ta' mezz speċjali għat-tkabbir tal-fibroblasti (C-23010, PromoCell, Sickingenstr). .63/65, 69126 Heidelberg, il-Ġermanja) fi 37 grad f'5 fil-mija CO2.

2.5. Effetti tal-VBs fuq l-espressjoni tal-mRNA tar-Riċetturi AIGE u l-Proteini tax-Xokk tas-Sħana (Hsps) fiċ-Ċelloli Ttrattati bl-AGE

L-NHDF ġew ittrattati b'AGE (100 ug/mL) fil-preżenza jew in-nuqqas ta' 10 ug/mL VBs f'37 grad għal 4 sigħat u RNA totali ġie estratt miċ-ċelloli bl-użu tar-reaġent TRIzol (Am-bion). Il-livelli ta' espressjoni tal-mRNA ta 'AGE ir-riċetturi u l-Hsps ġew imkejla bl-użu tal-metodu kwantitattiv tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi-traskrizzjoni inversa (qRT-PCR).

2.6.Effetti tal-VBs fuq l-espressjoni tal-mRNA ta' AQP-1 u AQP-3 f'Ċelloli Ttrattati b'HzO2

Biex jiġu vvalutati l-effetti terapewtiċi ta 'VBs taħt kundizzjonijiet ta' stress ossidattiv, NHDF ġew ittrattati b'{{0}}.2 mM HzO2 għal 2 sigħat, maħsul b'PBS, u mbagħad ikkultivat b'10 ug/mL VBs għal 4 sigħat. Biex jiġu evalwati l-effetti profilattiċi tagħhom, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'10ug/mL VBs għal 4h, maħsula, u kkultivati ​​b'0.2 mM H-O2 għal 2h [22].Cistanche kontra t-tixjiħL-RNA totali mbagħad ġie estratt, u l-espressjoni ta 'mRNAs ġiet eżaminata bil-qRT-PCR.

2.7.qRT-PCR

Il-livelli tal-mRNA tar-riċetturi AGE, inklużi RAGE, FEEL-1 (Stabilin-1), FEL-2 (Stabilin-2), CD-36, AGE-R1 ,AGE-R2, u AGE-R3, dawk ta' Hsps, bħal Hsp104, gp96, Hsp90, Hsp70, Hsp60, u Hsp32, u dawk ta' AQP, inklużi AQP-1 u AQP{-3, fi L-NHDF ġew imkejla bl-użu ta 'qRT-PCR ta' pass wieħed u settijiet ta 'primer speċifiċi (Tabella 1). Il-livell ta' mRNA ta' glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase tkejjel ukoll bħala kontroll intern [23-28]. RT-PCR f'pass wieħed, li fih sinteżi ta' cDNA b'reazzjoni ta' traskrizzjoni inversa u qPCR tista' ssir f'tubu tat-test wieħed bl-użu ta' RNA totali (500 ng) bħala l-mudell għall-PCR, twettqet bl-użu tal-qRT- Luna Universali One-Step- Kit PCR. Is-sistema PCR użata kienet Takara Thermal Cycler Dice Real Time System Ⅱ.x'inhu cistancheLuna Universali ta' Reazzjoni f'pass wieħed (2x), 10 μL, Luna WarmStart RT Enzyme Mix （20×), 1 μL, primer forward (10μM), 0.8μL, primer reverse ,0.8μL, u template RNA tħalltu f'sistema ta 'reazzjoni waħda, u l-volum totali ġie aġġustat għal 20 uL b'ilma mingħajr nukleażi. Ir-reazzjoni kienet tikkonsisti f'ċiklu 1 f'95 grad għal 30s u 50 ċiklu f'95 grad għal 5 s u mbagħad f'60 grad għal 30 s. Bidla ta' 4-darbiet jew akbar fl-espressjoni tal-mRNA (2 ċikli ta' PCR) ġiet iġġudikata li kienet sinifikanti.

2.8.Effetti tal-VBs fuq il-Vijabilità taċ-Ċelloli taħt Kundizzjonijiet ta' Stress Ossidattiv

Biex teżamina l-effetti tal-VBs fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli taħt kundizzjonijiet ta 'stress ossidattiv, iċ-ċelloli ġew ittrattati kif deskritt fit-Taqsima 2.6 tal-Materjali u l-Metodi u kkultivati ​​għal 18-il siegħa oħra f'mezz speċjali ta' tkabbir tal-fibroblasti. Iċ-ċelloli nġabru u l-vijabbiltà ġiet imkejla bl-użu tal-kit tal-għadd taċ-ċelloli-8 (DOJINDO, Tokyo, Ġappun).

2.9.Kejl tal-Produzzjoni ta' ROS Intraċellulari

ROS intraċellulari ġew imkejla bil-fluworometrija bl-użu ta 'dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Iċ-ċelloli ġew ittrattati kif deskritt fit-Taqsima 2.6 tal-Materjali u l-Metodi, maħsula b'PBS, u inkubati b'10 uM DCF-DA f' 37 grad għal 20 min. Il-livelli ta ' ROS intraċellulari ġew evalwati billi titkejjel l-intensità tal-fluworeċenza f'wavelength ta' eċċitazzjoni ta '525 nm bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate (SYNERGY/HT, BioTek, Tokyo, Ġappun).

2.10.Kejl tal-Produzzjoni SOD

SOD tkejjel bl-użu ta' SOD Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Wara li ġew ittrattati b'VBs u H2O2, kif deskritt fit-Taqsima 2.6 tal-Materjali u l-Metodi, iċ-ċelluli ġew ikkultivati ​​għal 24 siegħa f'mezz speċjali għat-tkabbir tal-fibroblasti u omoġenizzati wara ż-żieda ta 'liżi buffer. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, 10 μL tal-kampjun tħalltu ma '200 uL ta' xanthine oxidase f'temperatura tal-kamra, u l-assorbiment f'450 nm tkejjel wara 30 min.

2.11. Evalwazzjoni tal-Produzzjoni ta 'Hyaluronan u Elastin

Wara li ċ-ċelloli kienu ġew ittrattati b'VBs u HzO2 kif deskritt fit-Taqsima 2.6 tal-Materjali u l-Metodi, il-kwantifikazzjoni ta 'hyaluronan fis-supernatant tal-kultura saret bl-użu ta' Hyaluronan Enzyme Linked Immunosorbent Assay kit (R&D sys-tems., Inc., Minneapolis). , MN, USA). Biex titkejjel il-produzzjoni tal-elastin, iċ-ċelloli ġew lisati, u ġie ppreparat lisat ċar. L-ammont ta' elastin fil-lisat ġie kkwantifikat bl-użu tal-Kit ELISA ta' Elastin Solubbli Uman (Aviscera Bioscience Inc., SK00806-01, Santa Clara, CA, USA).

2.12.Analiżi Statistika

L-esperimenti kollha saru fi tliet kopji. Ir-riżultati huma ppreżentati bħala l-medja ± SD. Is-sinifikat tad-differenzi ġie eżaminat bl-użu tat-test t ta' Student, u d-differenzi kienu kkunsidrati bħala sinifikanti meta p<0.05.>

3.1. Effetti Anti-Aging ta 'VBs f'Ambjent ta' Stress Indott mill-AGE

3.1.1.Espressjoni ta' mRNAs tar-Riċetturi AGE

Aħna wrejna li VB2 u VB3 it-tnejn urew attivitajiet anti-mikrobiċi sinifikanti kontra diversi patoġeni umani billi jorbtu ma 'mikro-organiżmi b'affinità għolja u jinterferixxu ma' interazzjonijiet maċ-ċelloli ospitanti. Biex niċċaraw aktar l-abbiltajiet tal-VBs għall-multipotenza funzjonali, hawnhekk ippruvajna neżaminaw l-effetti kontra t-tixjiħ tal-VBs fuq il-ġilda. L-NHDF ġew ikkultivati ​​b'VBs taħt kundizzjonijiet ta 'stress u tkejlu l-livelli ta' diversi parametri relatati ma 'fenomeni kontra t-tixjiħ. L-NHDF huma ċelluli importanti li huma preżenti fid-dermis u jinfluwenzaw il-kundizzjoni tal-epidermide flimkien ma 'keratinoċiti epidermali. Meta NHDF ġew ikkultivati ​​b'VB2 jew VB3 dilwit serjament waħdu, ma ġew osservati l-ebda bidliet sinifikanti fil-livelli ta 'espressjoni ta' mRNA tar-riċetturi AGE. Madankollu, it-trattament b'AGE indotta l-espressjoni tal-biċċa l-kbira tar-riċetturi AGE fil-fibroblasti tal-ġilda. F'paragun mal-livelli ta' espressjoni ta' mRNA tar-riċetturi AGE b'rispons għal AGEs waħedhom, trattament addizzjonali b'VB2 jew VB3 żiedet b'mod notevoli l-livelli tagħhom. Il-livelli ta' espressjoni tal-mRNA ta' ĦOSS-1, ĦOSS-2, u RAGE żdiedu b'mod notevoli (Figura 2).

3.1.2.Espressjoni ta' mRNAs Hsp

Aħna investigajna l-kapaċitajiet ta 'VB2 u VB3 biex jinduċu l-espressjoni ta' mRNAs Hsp f'NHDF ittrattat bl-AGE. Ma ġew osservati l-ebda bidliet fil-livelli tagħhom ta 'RNA ta' Hsp varji meta VB2 jew VB3 ġew miżjuda waħedhom. Madankollu, il-livelli ta 'mRNA ta' l-Hsps kollha, ħlief għal Hsp90, żdiedu b'mod sinifikanti biż-żieda ta 'AGE, u dan ir-rispons żdied b'mod notevoli bit-trattament addizzjonali b'VB2 u VB3 (Figura 3).

3.2.Effetti tal-VBs fuq il-Vijabilità taċ-Ċelloli taħt Kundizzjonijiet ta' Stress Ossidattiv

F'esperimenti sussegwenti, eżaminajna jekk il-VBs tejbux ir-rispons ta 'NHDF għal stress ossidattiv. Meta l-NHDF kienu esposti għal stress ossidattiv bi 0.2 mM H2O2, ir-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelluli naqset għal 59 fil-mija. Meta VB2 jew VB3 ġew miżjuda ma 'dawn iċ-ċelloli taħt l-istess kundizzjonijiet ta' stress, ir-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelluli rkuprat b'mod sinifikanti b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni VB. Rigward it-trattamenti b'VBs, ir-rata ta 'sopravivenza żdiedet għal 76 fil-mija b'VB2 bi 300 ug/mL u 78 fil-mija b'VB3 f'300 ug/mL. Barra minn hekk, meta NHDF kienu esposti għal stress ossidattiv wara t-trattament b'VB2 jew VB3, iċ-ċelloli kienu aktar probabbli li jsiru reżistenti għall-istress ossidattiv. Din ir-reżistenza indotta kienet kompletament dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta 'l-VBs u ġiet osservata żieda sinifikanti fil-vijabbiltà taċ-ċelluli f'ċelloli ttrattati b'VB2 u VB3 f'konċentrazzjonijiet baxxi daqs 10 ug/mL (Figura 4).

3.3.Effetti ta 'VBs fuq il-Produzzjoni ta' ROS Intraċellulari u SOD

Biex jiġu investigati l-effetti tal-VBs bħala aġenti kontra t-tixjiħ, l-impatt tal-VBs fuq il-produzzjoni intraċellulari ROS indotta minn stress ossidattiv ġie evalwat bl-użu ta 'DCF-DA fluworexxenti bħala indikatur (Figura 5a). L-intensità tal-fluworexxenza żdiedet fiċ-ċelloli esposti għal H2O2 minn 3.7-darbiet minn ċelluli normali. Meta ċ-ċelluli ġew ittrattati b'VBs wara li ġew esposti għal H-O2, il-produzzjoni intraċellulari ta 'ROS kienet mrażżna b'mod sinifikanti mit-trattamenti b'VBs b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Barra minn hekk, il-livelli ROS indotti mill-H2O2-kienu mrażżna b'mod notevoli mit-trattament preċedenti ta' ċelloli b'VBs.

B'kuntrast mal-produzzjoni ta 'ROS, il-livelli ta' SOD naqsu għal 56 fil-mija tal-kontroll wara espożizzjoni għal H2O2 u rkuprati bit-trattamenti VB b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Barra minn hekk, trattament preċedenti b'VBs deher li jagħti reżistenza għal tnaqqis ikkaġunat minn H2O2- fil-produzzjoni ta' SOD (Figura 5b).

3.4.Effetti ta' VB fuq l-espressjoni ta' mRNA ta' AQP-1 u AQP-3 u fuq il-Produzzjoni ta' Hyaluronan u Elastin taħt Kundizzjonijiet ta' Stress Ossidattiv

Il-Figura 6a,b juru l-livelli ta' mRNA ta' AQP-1 u AQP-3, li huma molekuli tal-wiċċ taċ-ċelluli li jikkontribwixxu għall-idratazzjoni tal-ġilda. L-espressjoni tal-mRNA ta' AQP-1 u AQP-3 naqset b'mod notevoli meta NHDF ġew esposti għal H202, iżda ġiet irkuprata mit-trattamenti VB b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni wara stress ossidattiv. It-trattament preċedenti ta' ċelloli b'VBs ikkonferixxa reżistenza għal tnaqqis indott ta' H2O2- fil-livelli ta' espressjoni ta' mRNA. L-effetti ta 'VBs fiċ-ċelloli kienu osservati f'konċentrazzjonijiet ta' 1 ug/mL u ogħla, u ma ġew innutati l-ebda differenzi sinifikanti bejn VB2 u VB3.

Il-Figura 7a,b turi l-ammont ta 'hyaluronan imnixxi fis-supernatant tal-kultura u l-ammont ta' elastin intraċellulari. Il-livell ta 'hyaluronan naqas għal madwar 50 fil-mija dak tal-kontroll wara t-trattament H-O2 u dan it-tnaqqis ma ġiex irkuprat mit-trattamenti VB. Min-naħa l-oħra, it-tnaqqis ikkawżat minn HO2- fil-produzzjoni tal-hyaluronan deher li kien minimizzat mit-trattament preċedenti ta 'ċelloli b'VBs f'konċentrazzjonijiet ogħla (Figura 7a).

Simili għall-hyaluronan, il-produzzjoni ta 'elastin naqset għal 56 fil-mija dik tal-kontroll wara t-trattament H2O2. Dan it-tnaqqis ma ġiex irkuprat mit-trattamenti VB. Min-naħa l-oħra, it-tnaqqis indott minn HzOz fil-produzzjoni tal-elastin deher li l-aktar ġie kkanċellat mit-trattament preċedenti ta 'ċelloli b'VBs f'konċentrazzjonijiet ogħla. Il-produzzjoni tal-elastin żdiedet għal livelli 'l fuq mill-kontroll meta ċ-ċelloli ġew ittrattati b'VB2 f'100 ug/mL jew ogħla u VB3 f'300 ug/mL (Figura 7b).

4.Diskussjoni

Preċedentement irrappurtajna li VBs huma molekuli stabbli ħafna li juru attivitajiet anti-virali u anti-batteriċi qawwija [19]. Minbarra dawk is-sejbiet, il-VBs huma kkaratterizzati miċ-ċitotossiċità estremament baxxa tagħhom. Fil-fatt, instab li ma jeżerċitaw l-ebda ċitotossiċità anke meta ċ-ċelloli jiġu ttrattati b'konċentrazzjonijiet 300 darba ogħla minn dawk użati f'dan l-istudju. Biex tinvestiga l-versatilità ta '2 PMs (VB2 u VB3), aħna hawnhekk iffukaw fuq l-effetti tagħhom kontra t-tixjiħ fuq il-ġilda kif ukoll il-kapaċità tagħhom li jinduċu risponsi ċitoprotettivi f'NHDF esposti għal AGE u H-Oz. Ir-riżultati miksuba wrew biċ-ċar li ż-żieda ta 'VBs ma' fibroblasti tal-ġilda normali waħedhom ma induċiex bidliet notevoli fiċ-ċelloli, iżda rregolat 'l fuq l-espressjoni ta' molekuli ċitoprotettivi u tjiebu r-risponsi avversi f'ċelloli esposti għal stress. Speċifikament, la VB2 u lanqas VB3 affettwaw il- L-espressjoni ta' mRNA ta' riċetturi AGE jew Hsps f'NHDF meta użat waħdu (Figuri 2 u 3) F'NHDF espost għal AGE, VB2 u VB3 żiedu b'mod sinifikanti t-traskrizzjoni tar-riċetturi AGE, partikolarment FEEL-1, FEEL-2, u RAGE. Studju preċedenti rrapporta li FEEL-1 u FEEL-2 kellhom rwol fiċ-ċitoprotezzjoni billi pparteċipaw fl-endoċitosi ta' AGEs ħielsa fiċ-ċelloli u d-degradazzjoni tagħhom mill-liżosomi [29]. Min-naħa l-oħra, RAGE huwa magħruf li jikkontribwixxi għall-ġenerazzjoni ta 'ROS billi jattiva NADPH oxidase. It-traskrizzjoni msaħħa ta 'RAGE tista' tkun marbuta ma 'żieda fil-produzzjoni ta' ROS. Fil-każ ta 'RAGE, mutazzjonijiet splice jseħħu waqt it-traskrizzjoni, li jirriżultaw f'żewġ varjanti; wieħed huwa RAGE li m'għandux dominji intraċellulari (C-terminally truncated RAGE: C-RAGE), li hija proteina RAGE solubbli rilaxxata miċ-ċelloli, u l-oħra hija RAGE li m'għandhiex dominju V extraċellulari (N-terminally truncated RAGE:N-RAGE ) [30,31]. Minħabba li dawn iż-żewġ RAGE maqtugħin ma eżerċitaw l-ebda funzjoni bħala riċetturi AGE, it-traskrizzjoni miżjuda ta 'RAGE tista' mhux neċessarjament tippromwovi l-produzzjoni ta 'ROS. Din il-kwistjoni teħtieġ aktar studju.

Imbagħad eżaminajna l-effetti tal-VBs fuq l-espressjoni tal-mRNA tal-Hsps. L-espressjoni ta 'Hsps hija ġeneralment regolata 'l fuq minn stress ambjentali, bħal sħana, dawl ultravjola, u ROS. L-Hsps iwettqu funzjonijiet ta' chaperone billi jistabbilizzaw proteini li għadhom kif ġew sintetizzati biex jiżguraw it-tiwi korrett jew billi jgħinu biex jerġgħu jintwew proteini bil-ħsara mill-istress. Hsp104 intwera li jimmedja d-diżaggregazzjoni tal-proteini[32] u gp96 hija involuta fil-preżentazzjoni intraċellulari tal-antiġeni [33]. Hsp90 jgħin lill-proteini biex jintwew sew u jibqgħu stabbli meta jkunu esposti għal stress u jiffaċilita l-maturazzjoni ta 'proteini magħżula strettament [34]. Intwera li Hsp70 jirregola l-kwalità tal-proteini billi jikkontrolla t-tiwi, it-trasport u d-degradazzjoni tagħhom [35,36]. Hsp60 iżomm it-tiwi tal-proteini fil-mitokondrija u huwa involut fil-penetrazzjoni tal-membrana tal-proteini fil-mitokondrija [37]. Hsp32 huwa involut fid-degradazzjoni tal-heme, li l-prodotti tagħha juru attivitajiet antiossidanti [38]. Minħabba li VB2 u VB3 huma t-tnejn kapaċi jinduċu bl-istess mod l-espressjoni ta 'Hsps f'ċelloli soġġetti għal stress AGE, VBs jidhru li jiffunzjonaw bħala aġenti ċitoprotettivi qawwija taħt kundizzjonijiet ta' stress.

F'esperiment biex tinvestiga r-rispons taċ-ċelloli esposti għal H202, osservajna tnaqqis ta 'madwar 40 fil-mija fil-vijabbiltà taċ-ċelluli. B'kuntrast, it-trattamenti VB żiedu notevolment il-vijabbiltà taċ-ċelluli b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Barra minn hekk, ir-rispons taċ-ċelloli ttrattati b'VBs u mbagħad inkubati b'H2O2 (l-effetti profilattiċi ta 'VBs) kien aktar b'saħħtu minn dak ta' ċelloli inkubati b'H2O2 qabel it-trattamenti VB (l-effetti terapewtiċi ta 'VBs; Figura 4). Biex niċċaraw il-mekkaniżmi sottostanti, ivvalujna l-livelli ta 'produzzjoni ta' ROS u SOD intraċellulari. Il-livelli ta 'ROS intraċellulari żdiedu b'mod notevoli bit-trattament HzO2 iżda mrażżna minn VB2 u VB3 b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Dan l-effett profilattiku ta 'VBs fuq il-produzzjoni ta' ROS kien ukoll aktar b'saħħtu mill-effett terapewtiku tiegħu (Figura 5a). Min-naħa l-oħra, il-produzzjoni ta 'SOD, kennies qawwi ta' ROS, naqset b'mod sinifikanti bit-trattament H2O2; l-ammont ta 'SOD ġie kemmxejn imtejjeb mit-trattamenti VB (Figura 5b). Għalhekk, il-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-H2O2- tidher li hija relatata ma' żidiet fil-livelli ta' ROS intraċellulari. Minħabba li l-livelli ta 'produzzjoni ta' SOD ma kinux affettwati b'mod notevoli minn VBs, it-tnaqqis osservat fil-produzzjoni ta 'ROS wara t-trattamenti VB jista' jkun dovut għal effett inibitorju fuq ir-rispons ċellulari għall-ġenerazzjoni ta 'ROS. S'issa, id-DCF-DA użata f'dan l-istudju hija sonda versatili għall-iskoperta ta 'ROS u m'għandha l-ebda speċifiċità, għalhekk ma ġiex iċċarat liema kof l-ispeċi ROS hija mrażżna bi trattament b'VBs, jew jekk il-produzzjoni ta' kull speċi ROS hijiex. mrażżna minn VBs. Din il-kwistjoni teħtieġ aktar kjarifika.

Intwera li l-fibroblasti għandhom rwol fl-umdità epidermali, u r-rwol funzjonali tal-AQP, partikolarment l-AQP-1 u l-AQP-3, li huma espressi f'fibroblasti u involuti fl-influss ta' molekuli tal-ilma fiċ-ċelloli, qed jiġbed l-attenzjoni dejjem akbar. Barra minn hekk, hyaluronan imnixxi miċ-ċelloli ġie implikat fl-umdità tal-ġilda [39]. Fl-istudju preżenti, l-espressjoni tal-mRNA ta’ AQP-1 u AQP-3 u s-sekrezzjoni ta’ hyaluro-nan tnaqqsu t-tnejn minn stress ossidattiv (Figuri 6a,b u 7a), iżda ġew irkuprati f’ċelloli ttrattati b’ VB2 jew VB3. Simili għar-riżultati preċedenti, l-effetti ta 'titjib indotti minn VB fuq l-istress ossidattiv kienu aktar effettivi meta aġixxew b'mod profilattiku (Figura 7a, b). Fil-bnedmin, 50 fil-mija tal-hyaluronan huwa preżenti fil-ġilda [40]. Hyaluronan jonqos fl-epidermide mat-tixjiħ, filwaqt li jinżamm fid-dermis. Din l-alterazzjoni tikkontribwixxi għat-telf ta 'umdità, tnaqqis fl-elastiċità, u t-tnaqqis tal-ġilda [40]. Barra minn hekk, l-istress ossidattiv intwera li jnaqqas il-kollaġen u l-elastin, li huwa segwit mill-formazzjoni ta 'tikmix u tnaqqis fir-riġenerazzjoni tal-ġilda |41]. Fl-istudju preżenti, l-użu profilattiku ta 'VBs trażżan it-tnaqqis fl-hyaluronan u l-elastin taħt kundizzjonijiet ta' stress ossidattiv, li jissuġġerixxi l-potenzjal ta 'VB2 u VB3 bħala aġenti kontra t-tixjiħ u l-użu profilattiku tagħhom biex jeżerċitaw attività kontra t-tixjiħ. S'issa, wrejna l-effetti ta 'VB fuq fibroblasts umani taħt kundizzjonijiet ta' stress, iżda biex jiġu ċċarati l-effetti eżatti kontra t-tixjiħ ta 'VB fuq il-ġilda, ikun meħtieġ li jiġi ddeterminat l-effett ta' VB fuq keratinoċiti u twettaq esperimenti in vivo. Nippruvaw naħdmu fuq dawn il-kwistjonijiet fi stadju bikri u niċċaraw l-effetti tal-VB. Barra minn hekk, jekk il-mekkaniżmi ta 'benefiċċju tal-VBs isiru ċari, aħna nippruvaw napplikaw VBs għal prodotti tal-iġjene u kożmetiċi biex niżviluppaw prodotti ta' valur għoli li jikkontribwixxu aktar għas-soċjetà.

5. Konklużjonijiet

L-effetti tal-VBs ibbażati fuq ir-riżultati preżenti huma miġbura fil-qosor fil-Figura8. L-ebda tibdil ma ġie osservat f'diversi parametri meta ċ-ċelloli ġew ittrattati b'VB2 jew VB3 waħedhom. Madankollu, taħt kundizzjonijiet ta 'stress ikkawżati minn AGE u HzOz, il-produzzjoni intraċellulari ta' ROS ġiet miżjuda. VB2 u VB3 preferenzjali indottaw l-espressjoni ta 'molekuli li jipproteġu ċitoprotettivi u soppressi l-produzzjoni ta' ROS, li eventwalment jistgħu jikkawżaw mard serju, bħal arterjosklerożi u kanċer, kif ukoll fenomeni relatati mat-tixjiħ. VB2 u VB3 huma komposti li t-tnejn juru attivitajiet anti-virali u anti-batteriċi qawwija. Ir-riżultati preżenti jissuġġerixxu l-potenzjal ta 'VB2 u VB3 bħala aġenti kontra t-tixjiħ għall-ġilda.

F'ambjent normali mingħajr stress, antiossidanti prodotti omeostatikament jerġgħu jimxu ROS. Min-naħa l-oħra, il-produzzjoni ta 'ROS tiżdied taħt kundizzjonijiet ta' stress indotti minn AGE u H2O2, li jistgħu jwasslu għal tixjiħ, infjammazzjoni u aterosklerożi. VBs ap-pear li jkollhom l-abbiltà li jippromwovu l-produzzjoni ta ' l-antiossidanti taħt kondizzjonijiet ta ' stress u jtejbu r-rispons stress taċ-ċelloli.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Appl. Sci. 2021, 11, 11948. https://doi.org/10.3390/app112411948 https://www.mdpi.com/journal/applsci