Vaċċin tal-adenovirus li fih is-SARS-CoV maqtugħ-2 Spike Protein S1 Subunità Twassal Għal Rispons Immuni Speċifiku fil-ġrieden

Abstract:L-iżvilupp ta' vaċċin effiċjenti u sikur tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19) huwa approċċ kruċjali għall-ġestjoni tal-pandemija tal-koronavirus 2 (SARS-CoV-2) tal-marda respiratorja akuta severa fid-dawl tal-kundizzjonijiet attwali. F'dan l-istudju, ipproduċejna segment imqassar tal-ġene spike SARS-CoV-2 ottimizzat (2043 bp, imsejjaħ S1) li kien kapaċi jikkodifika proteina S1 maqtugħa. Il-proteina ġiet ittestjata biex tiddetermina jekk tistax tqajjem immunizzazzjoni effiċjenti fil-ġrieden kontra s-SARS-CoV-2. Il-preżenza tal-proteina S1 ġiet ikkonfermata b'immunofluworexxenza u Western blotting. Vaċċin tal-adenovirus li jkollu l-framment tal-ġene S1 (Ad-S1) ingħata ġol-muskoli lill-ġrieden erba' darbiet fuq 4 ġimgħat. L-immunità umorali tal-proteina SARS-CoV-2 S1 intweriet fil-ġrieden immunizzati kollha. Is-serum minn ġrieden immunizzati wera attività eċċellenti kontra l-infezzjoni in vitro. Ġie osservat rispons immuni umorali robust kontra SARS-CoV-2 fil-ġrieden wara t-tilqim b'Ad-S1, li jissuġġerixxi li l-vaċċin tal-adenovirus jista' jgħin fl-iżvilupp ta' vaċċini kontra SARS-CoV-2 u oħrajn ġenetikament distinti. viruses.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Kliem ewlieni: SARS-CoV-2; vaċċini; vettur adenovirali; ġene S1; immunità

1. Introduzzjoni

Il-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19) ħafna drabi hija assoċjata ma’ falliment ta’ organi multipli u rati għoljin ta’ mortalità [1] u toħloq theddida kbira għas-sikurezza pubblika madwar id-dinja. Mill-15 ta' Lulju 2022, il-pandemija tal-COVID-19 baqgħet tippersisti globalment, b'557,917,904 każ ikkonfermat, inklużi 6,358,899 mewt, irrappurtati lill-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa (WHO). Barra minn hekk, total ta’ 12,130,881,147 doża ta’ vaċċin ġew amministrati mill-11 ta’ Lulju 2022. Għalhekk, it-tfassil u l-iżvilupp ta’ vaċċini ġodda għall-koronavirus (nCoV) huma ta’ importanza kbira u waħda mill-ogħla prijoritajiet tas-saħħa globali. Il-proteina S hija fattur ewlieni fid-dħul tas-SARS-CoV-2 koronavirus 2 tal-marda respiratorja akuta severa (SARS-CoV-2) fiċ-ċelloli ospitanti [2,3]. Il-proteina torbot mar-riċettur ospitanti u tippermetti li l-virus jidħol fiċ-ċellula ospitanti bla xkiel [4]. Glycans N-linked joħorġu mill-wiċċ tat-trimer u jżejnu l-proteina S b'mod estensiv, li jaffettwaw it-tiwi tal-proteina S, l-immunità umorali, u l-ipproċessar tal-protease taċ-ċelluli ospitanti [5]. Il-proteina S SARS-CoV-2 għandha densità aktar baxxa ta' glycan N-linked minn proteini S oħra patoġeniċi umani indotti mill-koronavirus [6]. Għalhekk, il-proteina S tista 'tkun immunoġenika ħafna u hija mira ewlenija ta' antikorpi newtralizzanti. Il-proteina S għandha tliet oqsma strutturali, fosthom id-dominju S1 huwa l-antiġen tal-wiċċ tal-proteina S l-aktar importanti [4]. Minħabba d-diffikultà li tipproduċi proteini rikombinanti kbar (id-dominju extraċellulari tal-proteina S huwa madwar 1300 aċidu amminiku) u r-riskju ta 'titjib dipendenti fuq l-antikorpi (ADE) ta' infezzjoni, S1 (madwar 700 aċidu amminiku) u d-dominju tiegħu li jorbot mar-riċetturi (RBD, madwar 200 aċidu amminiku) huma ġeneralment meqjusa bħala l-aktar miri potenzjali attraenti għal vaċċin tal-koronavirus [7,8]. Adenovirus uman serotip 5 (HAdV-C5) huwa użat ħafna fil-viroloġija bażika bħala terapija tal-ġeni u vettur tat-twassil tal-vaċċin [9]. HAdV-C5 għandu diversità naturali u jista 'jiparassita l-biċċa l-kbira tal-ospiti, li jifforma l-bażi għall-iżvilupp ta' esperimenti fuq l-annimali. Vetturi ta 'adenovirus rikombinanti b'replikabilità u difetti ta' replikazzjoni mibnija minn HAdV-C5 intużaw ħafna fit-twassil tal-vaċċin u t-terapija tal-ġeni [9,10]. Bħalissa, l-adenoviruses ġew approvati bħala vaċċini kontra infezzjonijiet respiratorji akuti u kien hemm ħafna provi ta' tali vaċċini, bħall-malarja u l-HIV-1 [9]. F'dan id-dokument, niddeskrivu vaċċin tal-vettur ta' adenovirus defiċjenti fir-replikazzjoni umana tas-SARS-CoV-2 u l-preparazzjoni u l-applikazzjoni tiegħu. F'dan l-istudju, il-vaċċin tal-adenovirus kien mibni kif ġej: il-vettur kien adenovirus HAdV-C5 difettuż fir-replikazzjoni umana b'tħassir E1 u E3, il-plasmid tal-iskeletru kien adenovirus rikombinanti b'pBHGlox∆E1,3Cre, il-linja taċ-ċelluli tal-ippakkjar kienet ċelluli HEK293, u l-ġene fil-mira kien il-ġene tal-proteina S1 maqtugħa tas-SARS-CoV-2. L-espressjoni tal-proteina S1 fil-vaċċin ġiet identifikata minn Western blot u analiżi tal-immunofluworexxenza. Biex tiddetermina l-kwalità tar-risponsi immuni indotti mill-kandidati għat-tilqim ibbażati fuq spike, ir-rispons tal-antikorpi wara t-tilqim ġie eżaminat fid-dettall. Il-benefiċċju immuni tal-vaċċin ġie evalwat b'test tal-antikorpi li jorbtu (assaġġ immunosorbenti marbut mal-enżimi [ELISA]) u test tal-antikorpi tan-newtralizzazzjoni. Is-sejbiet tagħna jipprovdu l-bażi għall-iżvilupp u l-evalwazzjoni ta’ vaċċini u trattamenti COVID-19 ibbażati fuq il-proteina S1.

2. Materjali u Metodu

2.1. Ċelloli u Annimali

F'dan l-istudju ntużaw linji taċ-ċelluli tal-kliewi tax-xadini HEK293 u Vero E6. Iż-żewġ linji taċ-ċelluli tkabbru fil-mezz Eagle modifikat ta 'Dulbecco (DMEM) supplimentat b'serum bovin tal-fetu 2% (FBS) u 1% peniċillina u streptomycin f'37 ◦C b'5% CO2 u umdità saturata. Għoxrin ġurdien C57BL/6 mara (6-8 ġimgħat) inxtraw miċ-Ċentru Sperimentali tal-Annimali ta 'Zhejiang, Provinċja ta' Zhejiang. Il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'żewġ gruppi b'10 ġrieden f'kull grupp. Grupp wieħed ġie immunizzat (100 µL injezzjoni intraperitoneali) b'vettur Ad5 li jesprimi l-proteina spike SARS-CoV-2 (Ad{5-S) u l-ieħor b'PBS (100 µL injezzjoni intraperitoneali) bħala kontroll. L-ammont totali tal-virus kien 5 × 109 VP Il-ġrieden kollha ġew immunizzati b'injezzjoni intramuskolari D0/D14 [11,12]. F'D14, ittieħed demm periferali ta' 100 µL, is-serum ġie separat, u t-tieni injezzjoni ngħatat sagħtejn wara l-ġbir tad-demm. F'D28, id-demm inġabar permezz ta' titqib retro-orbitali u s-serum ġie separat. Antikorpi li jorbtu ġew skoperti 3 ijiem wara kull ġbir tad-demm, antikorpi newtralizzanti ġew skoperti 7 ijiem wara kull ġbir tad-demm, u ċitokini ġew skoperti 7 ijiem wara t-tieni ġbir tad-demm. Il-ġrieden kollha ġew ewtanizzati; it-testijiet kollha twettqu f'konformità stretta mal-"Linji Gwida għall-Kura u l-Użu ta 'Annimali Sperimentali tar-Repubblika Popolari taċ-Ċina" u approvati mill-Kunsill Etiku ta' l-Università ta 'Zhejiang Shuren.

2.2. Vaċċini

Ir-razez kollha tas-SARS-CoV-2 użati f'dan l-istudju nġabru minn pazjenti COVID-19 bil-kunsens. Il-Laboratorju Ewlenin tal-Istat għad-Djanjożi u t-Trattament tal-Mard Infettiv żviluppa vaċċin tal-adenovirus (ċellula Vero, razza WuHan, numru GISAID: EPI_ISL{_415711) kontra SARS-CoV-2 u mbagħad il-vaċċin ġie manifatturat f'ambjent konformi mal-livell ta' bijosigurtà (BSL). L-ispeċifikazzjoni tal-vaċċin hija 0.5 mL/doża u fiha Tris, NaCl, zokkor tal-kannamieli, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, etanol assolut, u l-proteina SARS-CoV-2 S1.

2.3. Kostruzzjoni ta' Adenovirus rikombinanti

Is-sekwenza tal-proteina SARS-CoV-2 S1 (nru QRU91950.1) inkisbet minn PubMed. Skont id-deġenerazzjoni tal-ġeni, is-sekwenza ottimizzata tan-nukleotide tal-kodon adattata għall-espressjoni taċ-ċelluli tal-mammiferi kienet iddisinjata abbażi tal-premessa li s-sekwenza tal-aċidu amminiku tal-proteina tal-prodott kodifikata mill-proteina SARS-CoV-2 S1 baqgħet ma nbidlitx. It-tul totali kien 2043 bp. Is-sekwenza tal-prekursur 50 ġiet sintetizzata b'attivatur tal-plażminoġenu tat-tessuti (tPA) u s-sekwenza li tikkodifika SARS-CoV-2 S1 amino acid 2-688 u s-sekwenza tal-prekursur tPA ġew ligati. Sekwenza Kozak u sit ta’ restrizzjoni SpeI ġew miżjuda quddiem il-kodon tal-bidu u s-sit ta’ restrizzjoni XbaI ġie miżjud wara l-kodon tat-terminazzjoni. Is-sekwenzi tan-nukleotidi tal-ġeni ta 'hawn fuq ġew sintetizzati u kklonati f'pUC18 minn Sangon Biotech biex jinkiseb il-plasmid ikklonat tal-ġene sintetiku. Is-sekwenza tal-ġene S1 sintetizzata u l-vettur pDC316 ġew diġeriti b'endonucleases ta' restrizzjoni SpeI u XbaI. Il-framment fil-mira u l-vettur ġew irkuprati mill-ġel u konnessi biex jiffurmaw plasmid shuttle. Il-plasmid tax-shuttle SARS-CoV-2 ġie ppakkjat bil-plasmid tal-iskeletru tas-sistema AdMax adenovirus pBHGloxd∆E1 u 3Cre permezz ta' ko-trasfezzjoni taċ-ċelloli HEK293. Is-soluzzjoni tal-virus primarju nkisbet wara friża-tidwib u ċentrifugazzjoni ripetuti, u l-virus ġie amplifikat u kkultivat wara purifikazzjoni tal-plakka.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Determinazzjoni tat-Titer ta' Adenovirus

Ċelloli HEK293 f'saħħa tajba ġew magħżula u sospiżi mill-ġdid biex jippreparaw sospensjoni taċ-ċelluli ta' 5.0 × 1{{05 ċelluli/mL, li kienet miżrugħa fi 24-pjanċa bir-bir (1 mL/bir). ) u kkultivati ​​f'37 ◦C f'ambjent ta' 5% CO2. Il-kampjun ġie dilwit b'għaxar darbiet fis-serje u kampjun dilwit (0.1 mL) ta' 10-5 sa 1{0-8 ċelluli ġie mlaqqam fuq 24-pjanċa tal-bir . Imbagħad, il-pjanċi ġew esposti għal infezzjoni f'37 ◦C b'5% CO2 għal 48 siegħa. Sussegwentement, il-mezz tal-kultura tneħħa, ġie miżjud metanol imkessaħ minn qabel (0.5 mL), u l-kampjuni ġew iffissati f'-20 ◦C għal 20 min. Wara l-iffissar, il-kampjuni ġew maħsula b'salina buffered bil-fosfat (PBS) u mblukkati b'1% albumina tas-serum bovin (BSA, 0.2 mL) f'37 ◦C għal siegħa. Sussegwentement, l-antikorpi primarji (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) u sekondarji (Goat pAb għal MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) ġew miżjuda u inkubati għal siegħa, li matulha PBS intuża għall-ħasil. Wara l-inkubazzjoni, ġiet miżjuda soluzzjoni tax-xogħol ippreparata ġdida (0.2 mL) u ġiet inkubata għal 5-10 min f'temperatura tal-kamra. Imbagħad, is-soluzzjoni tax-xogħol twarrbet, il-kampjuni ġew maħsula b'PBS, u PBS (1 mL) reġa' ġie miżjud. In-numru medju ta 'ċelluli pożittivi fil-qasam mikroskopiku (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) ġie kkalkolat, fejn intgħażlet gradjent b'5-50 ċellula pożittiva fil-qasam tal-vista u ġew magħżula b'mod każwali mill-inqas ħames żoni għall-għadd. . In-numru ta' kampi viżwali f'kull bir tal-pjanċa tal-{48}}bir ġie kkalkulat. Imbagħad, it-titer tal-virus ġie kkalkulat skont il-Formula (1) li ġejja:

2.5. PCR f'ħin reali

Biex tiskopri l-espressjoni tal-mRNA taċ-ċelluli HEK293 wara infezzjoni virali, estrajna RNA intermedju skont l-istruzzjonijiet operattivi TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). L-RNA totali ġie estratt bl-użu ta 'TRIzol u pproċessat b'DNase I mingħajr RQ1 RNase (Promega, Madison, WI, USA) biex jelimina d-DNA residwu. DNA Kumplimentari (cDNA) inkiseb bit-traskrizzjoni inversa tal-RNA estratt bl-użu ta' PrimerScript™ RT Reagent Kit b'gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Ġappun). Frammenti tad-DNA ġew iġġenerati bil-primers speċifiċi P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) u P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​tal-ġene fil-mira (S1). Il-ġene ġie amplifikat bi primers P3 (50 -GCTTCACCCACCATGGAGAA-30 ) u P4 ({50 -TAAGCAGTTGGTGGGTGCAG{-30 ) bħala l-kontroll intern (GAPHD).

2.6. Western Blot

Il-lisat taċ-ċellula u s-supernatant ġew isseparati b'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) u mbagħad trasferiti għal membrani tal-fluworidu tal-polyvinylidene (PVDF). Il-blots ġew viżwalizzati b'tagħmir tal-immaġini Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Fil-qosor, il-membrani ġew trasferiti għal TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7.5, 8 g NaCl [0.5 mL], 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween -20) b'5% trab tal-ħalib niexef bla xaħam u mħawwad fuq shaker decolorizing f'temperatura tal-kamra għal siegħa. Il-membrani tal-gruppi sperimentali u ta' kontroll tneħħew mis-soluzzjoni tas-siġillar u inkubati bl-antikorp primarju: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kat #40591- T62, Sino Biological, Beijing, iċ-Ċina)] f'temperatura ambjentali. L-antikorpi primarji tħawwdu u ġew inkubati matul il-lejl fuq shaker decolorizing f'4 ◦C. Il-blot tlaħlaħ b'soluzzjoni TBST u inkubata għal 2 sigħat bl-antikorp sekondarju [immunoglobulina tal-mogħoż kontra l-fenek G (IgG) H&L (HRP) (1:10,000, cat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Wara t-tlaħliħ, il-blots ġew inkubati għal 1 min b'kitt tas-soluzzjoni tas-Sustrate LumiBest ECL (cat. #4AW011-100, 4A Biotech), u mbagħad osservati f'imager.

2.7. Assaġġ ta' immunofluworexxenza

Iċ-ċelloli HEK293 (3 × 106/bir) ġew miżrugħa fi 12-pjanċi tal-bir. Wara 48 siegħa, iċ-ċelloli ġew infettati b'adenovirus li kien fih il-ġene S1 (Ad-S1). Wara 48 siegħa, il-medju ġie aspirat, u ċ-ċelloli ġew maħsula darba b'PBS li kien fih 2% BSA, u ffissati għal 15-il minuta b'metanol li kien imkessaħ minn qabel għal 15-il minuta f'-20 ◦C. Wara tliet ħasliet b'2% BSA f'PBS, iċ-ċelloli ġew permeabilizzati b'0.5% Triton X-100 għal 10 min. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew imblukkati għal siegħa b'2 mL 2% BSA, is-soluzzjoni ta 'l-imblukkar ġiet mormija, u ċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'PBS. Sussegwentement, 2 mL antikorp primarju [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #{40591-T62, Sino Biological)] ġie miżjud ma' kull bir u inkubati f'temperatura tal-kamra għal siegħa jew 4 ◦C matul il-lejl. Imbagħad, il-kampjun tlaħlaħ tliet darbiet b'2% BSA għal 5 min kull tlaħliħ. Sussegwentement, 2 mL antikorp sekondarju [mogħoż kontra l-fenek IgG H & L (Alexa Fluor 488) (1:1000, cat. #550037, ZenBio)] ġie miżjud ma 'kull bir u inkubati f'temperatura tal-kamra għal siegħa. Sussegwentement, il-kampjuni tlaħlaħ tliet darbiet b'2% BSA għal 5 min kull tlaħliħ. 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) soluzzjoni (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, cat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) ġiet miżjuda ma' kull bir u rreaġixxa għal 10 minuti fid-dlam. L-analiżi kienet osservata b'sistema ta' immaġini EVOS™ M7000 (cat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Il-proteina SARS-CoV-2 S (1 µg/mL) ġiet miksija matul il-lejl fi 96-pjanċi tal-bir (100 µL/mL) bi 0. 05 M buffer tal-bikarbonat. Wara li taħsel b'PBST (0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4·12H2O, 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween-20, żid ilma ma' 1000 mL) ħamsa darbiet, ġiet miżjuda soluzzjoni ta 'imblukkar u inkubata f'37 ◦C għal siegħa. Il-kampjun tas-serum ġie dilwit u miżjud ma' kull bir (100 µL/bir). Wara siegħa inkubazzjoni f'37 ◦C, il-kampjuni ġew maħsula b'PBST ħames darbiet. L-antikorp primarju [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #{40591-T62, Sino Biological)] ġie miżjud u inkubat għal siegħa, imbagħad il-kampjuni ġew maħsula ħames darbiet b'PBST, segwiti minn 1 h inkubazzjoni f'37 ◦C b'antikorp sekondarju konjugat ma' horseradish peroxidase [mogħoż kontra l-fenek IgG H & L (HRP) (1:10,000, cat. #ab6721, abcam)] u ħamsa ħasliet bil-PBST. Wara li żiedet 3, 30, 5, u 50-tetramethyl biphenyl anhydride għal 5 min, ir-reazzjoni twaqqfet b'aċidu sulfuriku 2 M. Id-densità ottika ġiet imkejla f'450 nm u 630 nm permezz ta 'strument ta' tikkettjar ta 'enżimi (Apparat Molekulari, SpectraMax 190) u mbagħad imwaħħal ma' kurva standard.

Benefiċċji ta' cistanche tubulosa-ssaħħaħ is-sistema immuni

2.9. Determinazzjoni taċ-ċitokini 

Il-pjanċa (cat. #T-k15048D-1, MSD) ġiet maħsula tliet darbiet b'150 µL/buffer tal-ħasil tal-bir u kampjun ippreparat ta' 50 µL ġie miżjud ma' kull bir. Imbagħad, il-pjanċa ġiet issiġillata b'siġill tal-pjanċa li teħel u inkubata f'temperatura tal-kamra bi tħawwad għal 2 sigħat. Sussegwentement, il-pjanċa ġiet maħsula tliet darbiet b'150 µL/buffer tal-ħasil tal-bir u 25 µL soluzzjoni ta' antikorp ta' detezzjoni ġiet miżjuda ma' kull bir. Il-pjanċa reġgħet ġiet issiġillata u inkubata f'temperatura tal-kamra bi tħawwad għal 2 sigħat. Sussegwentement, il-pjanċa ġiet maħsula tliet darbiet b'mill-inqas 150 µL/buffer tal-ħasil tajjeb; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) ġie miżjud ma 'kull bir, u l-pjanċa ġiet analizzata fuq strument MSD.

2.10. Antikorp newtralizzanti

2.10.1. Assaġġ tan-newtralizzazzjoni tal-psewdovirus

L-attività tan-newtralizzazzjoni tas-serum tal-ġurdien ġiet ittestjata bl-użu ta' sistema psewdovirali tal-virus tal-istomatite vesikulari (VSV). Is-serum ġie inattivat f'banju ta' l-ilma għal {{0}}.5 sigħat f'56 ◦C, u mbagħad dilwit serjament għall-medda meħtieġa. Iċ-ċelloli HEK293 ġew ibbanjati fi 96-pjanċa tal-bir. Is-serum dilwit tħallat ma’ 200 CCID50 (id-doża tal-virus li tista’ tinfetta 50% tal-kultura taċ-ċelluli)/100 µL tas-sospensjoni tal-virus fi proporzjon ta’ 1:1 u tqiegħed f’inkubatur tas-CO2 (37 ± 1 ◦C) għal 2 h. Sussegwentement, 100 µL ta’ soluzzjoni ta’ manutenzjoni tal-virus li kien fiha 0.5% ta’ antikorp doppju tal-peniċillina-streptomycin ġew miżjuda ma’ kull bir, u t-taħlita newtralizzata ġiet imlaqqma fi 96-pjanċa tal-bir li kien fiha ċelloli f’100 µL kull bir, b’żewġ bjar ripetuti għal kull dilwizzjoni. Fl-istess ħin, ġie stabbilit kontroll normali taċ-ċelluli, u ċ-ċelloli ġew inkubati f'inkubatur tas-CO2 (37 ± 1 ◦C) għal 96 siegħa. Imbagħad, 200 CCID50/100 µL ta' soluzzjoni tal-virus ġew dilwiti għal 10-1~10-3. Il-medju tal-kultura taċ-ċelluli fil-{30}}pjanċa tal-bir ġie mormi, 150 µL tas-soluzzjoni ta' manutenzjoni tal-virus ġew miżjuda ma' kull bir, u d-dilwizzjoni tas-soluzzjoni tal-virus ġiet imlaqqma f'konċentrazzjoni ta' 10-1~{{33} } fil-bjar tal-96-pjanċa tal-bir (50 µL kull bir). Kull dilwizzjoni ġiet ripetuta fi 8 bjar; kontroll taċ-ċelluli normali ġie stabbilit fl-istess ħin, segwit minn kultura għal 96 siegħa. Il-bidliet fiċ-ċelluli CPE ġew osservati taħt mikroskopju maqlub. Il-kontroll taċ-ċelluli normali m'għandux ikollu bidliet ċitopatiċi, u l-kontroll pożittiv għandu jkollu bidliet CPE. L-endpoints tan-newtralizzazzjoni (dilwizzjonijiet tas-serum maqluba għal logaritmi) ġew ikkalkulati billi ġie osservat is-CPE. Il-kriterju seronegattiv/pożittiv kien 1:12 bħala l-kriterju pożittiv/negattiv,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Assaġġ ta' Newtralizzazzjoni Ħaj

L-attività tan-newtralizzazzjoni tas-serum tal-ġurdien ġiet evalwata b'test ta' newtralizzazzjoni ħaj. Is-serum dilwit tħallat ma' SARS-CoV-2 u inkubat f'37 ◦C għal siegħa. It-taħlita ġiet miżjuda ma' pjanċa ta' 96-bir biex tinfetta ċ-ċelloli Vero E6. Wara 72-h inkubazzjoni f'37 ◦C, l-effett ċitopatiku tal-virus (CPE) ġie osservat taħt ingrandiment ×40 u t-titer ta 'newtralizzazzjoni (ir-reċiproku ta' dilwizzjoni tas-serum ta '50% meħtieġa biex jinnewtralizza l-infezzjoni tal-virus) ġie kkalkulat. Il-proċeduri ta' hawn fuq twettqu kollha f'ambjent ta' livell 3 ta' bijosigurtà.

2.11. Analiżi Statistika

Analiżi statistiċi saru permezz ta' test t b'żewġ kampjuni bl-użu ta' SPSS 26. valuri p Inqas minn jew ugwali għal 0.05 tqiesu sinifikanti. It-tendenza ċentrali kienet imkejla bit-titer medju ġeometriku (GMT).

3. Riżultati

3.1. Kostruzzjoni ta' Adenovirus rikombinanti

Inkiseb il-plasmid shuttle tal-adenovirus rikombinanti pAdeno-CMV-S1 b'inserzjoni korretta; dijagramma tal-istruttura tagħha hija murija fil-Figura 1. L-adenovirus rikombinanti kien fih il-ġenoma HAdV-C5 nieqes mir-reġjun E1/E3. Dijagramma skematika tal-vettur tal-adenovirus rikombinanti miksub mit-trasfezzjoni tal-plasmid tax-shuttle u taċ-ċitoskeletru fiċ-ċelloli HEK293 tidher fil-Figura 1.

3.2. Karatterizzazzjoni ta 'Adenovirus Rikombinanti

Il-plasmid rikombinanti li fih il-ġene fil-mira ġie identifikat permezz tal-PCR (ara l-Figura 2A għar-riżultati tal-elettroforeżi tal-ġel). Dan kien esperiment ripetut. Is-sekwenzi tal-primer kienu MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag u S1-R acaataagtagggactgggtc, u s-sekwenzjar ikkonferma li s-sekwenza kienet konsistenti mad-disinn. L-espressjoni ta' SARS-CoV-2 S1 fiċ-ċelloli ġiet skoperta b'Western blotting (Figura 2B) u immunofluworexxenza indiretta (Figura 2C). Il-kulur tal-faxxa (~ 75 kDa) ġiet skoperta minn Western blotting u kienet konsistenti mal-pożizzjoni tal-faxxa mistennija. Fil-livell tat-traskrizzjoni, l-espressjoni in vitro ta 'S1 ġiet skoperta permezz ta' PT-PCR. Ir-riżultati wrew li l-espressjoni ta 'S1 mRNA fiċ-ċelloli HEK-293 kienet ogħla b'mod sinifikanti minn dik fil-grupp ta' kontroll.

Figura 1. Kostruzzjoni ta 'vaċċin ta' adenovirus rikombinanti u strateġija sperimentali. (A) pAdeno-CMV-S1 huwa adenovirus shuttle plasmid rikombinanti li fih il-ġene fil-mira S1. pBHGlox∆E1,3Cre huwa l-plasmid tal-iskeletru tal-adenovirus. pBHGlox∆E1,3Cre u pAdeno-CMV-S1 ġew estratti b'kit ta 'estrazzjoni ta' plasmidi QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, Ċina). Ġurnata qabel it-trasfezzjoni, iċ-ċelluli HEK293 ġew mgħoddija f'kunjett tal-kultura taċ-ċelluli ta' 25 cm2. Il-mezz tal-kultura kien DMEM li fih 5% FBS mingħajr antibijotiċi. Fit-tieni jum, 60-80% taċ-ċelloli ġew magħżula u s-soluzzjoni tat-trasfezzjoni ġiet miżjuda maċ-ċelloli. Wara 7 ijiem ta 'trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew mibruxa, ċentrifugati, is-supernatant mormi, u ċ-ċelloli ġew risuxxitati b'PBS. Iċ-ċelloli ġew iffriżati-mdewweb ripetutament f'-80 ◦C u 37 ◦C. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, is-supernatant kien fih is-soluzzjoni primarja tal-virus. Ir-razza tal-adenovirus rikombinanti ġiet ippurifikata, amplifikata, u miksuba wara aktar proċessar u nnominata Ad-S1. Il-vaċċin ġie injettat ġol-muskoli fil-ġrieden għal studji ta' segwitu. (B) L-iskala ta 'żmien murija ta' immunizzazzjoni u rtirar tad-demm.

3.3. Titer tal-adenovirus

F'dan l-esperiment, medja ta 'sitt ċelluli pożittivi ġiet ikkalkulata f'ħames oqsma mikroskopiċi, u l-virus fil-bir ġie dilwit 108 darbiet. Ibbażat fuq il-formula deskritta fit-taqsima Materjali u Metodu, it-titru tal-adenovirus kien 4.74 × 1011 unitajiet li jiffurmaw plakka (pfu)/mL (Figura 2D).

3.4. Immunità Ċellulari ta' wara t-tilqim

Matul il-perjodu tat-test, kien hemm bidliet statistikament sinifikanti fiċ-ċitokini tas-serum (p Inqas minn jew ugwali għal 0.05), li prinċipalment urew li l-konċentrazzjoni ta 'Keratinocyte chemoattractant/onkoġen regolat mit-tkabbir tal-bniedem (KC/GRO) kienet naqsu, u l-konċentrazzjonijiet ta' IFN- , IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } u TNF- żdiedu, filwaqt li l-konċentrazzjoni ta 'IL-6 ma nbidlitx b'mod sinifikanti (Figura 3).

Figura 2. Identifikazzjoni tal-proteina rikombinanti HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 u determinazzjoni tat-titer tal-adenovirus. (A) Sejbien tal-PCR tal-plasmid rikombinanti bil-ġene fil-mira S1. (B) Sejbien Western blot ta' SARS-CoV-2. Iċ-ċelloli HEK293 bi tkabbir esponenzjali ġew infettati b'SARS-CoV-2 għal 48 siegħa, imbagħad il-proteina ċellulari ġiet estratta u separata b'SDS-PAGE. L-espressjoni ta' SARS-CoV-2 ġiet ikkonfermata permezz ta' Western blotting b'IgG kontra l-fenek tal-mogħoż. (C) Mikroskopija ta 'immunofluworexxenza ta' ċelloli HEK-293 infettati b'Ad-S1 (aħdar). Iċ-ċelloli ġew kontrotebba b'40, 6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI) biex tebgħa n-nuklei. Skala bar 1000 µm. (D) Intuża l-assaġġ tal-plakka għall-kejl. Mikrografi li juru 10-5, 10-6, 10-7, u 10-8 dilwizzjoni (mix-xellug għal-lemin).

Figura 3. Ad-S1 indotta livelli tal-plażma mibdula ta 'ċitokini tat-tip 1/2, interferoni tat-tip 1, u ċitokini oħra. Ir-riżultati ġew skoperti billi tiġbed demm mill-ġrieden 7 ijiem wara l-ewwel tilqim. Id-dejta hija ppreżentata bħala scatterplots tal-kaxxa u tal-whisker. Kull ċirku jirrappreżenta individwu wieħed. Il-valuri p ġew ikkalkulati bl-użu ta' test t b'żewġ kampjuni.

3.5. Sejbien ta' Antikorpi Anti-SARS-CoV-2 S1 Wara l-Immunizzazzjoni

ELISA wriet li antikorpi speċifiċi tas-SARS-CoV-2-kienu preżenti fil-ġrieden injettati bl-ewwel u t-tieni Ad-S1, iżda mhux dawk injettati bil-kapsid tal-adenovirus tal-kontroll jew soluzzjoni PBS (Ad/PBS) (Figura 4A). Titri IgG ta' 1:210 u 1:212 ġew skoperti fil-ġrieden imlaqqma Ad-S1-ġimagħtejn wara l-ewwel u t-tieni tilqim, rispettivament. It-titer tad-dilwizzjoni fi 28 jum wara t-tilqim (D28, GMT 2297.4) kien 6.1-darbiet ogħla minn dak f'D14 (GMT 378.9).

Figura 4. Ad-S1 indotta titri għoljin ta 'antikorpi (A) u attività ta' newtralizzazzjoni (B, C) fil-ġrieden. (A) ELISA ta' SARS-CoV-2-serum speċifiku IgG minn ġrieden immunizzati Ad-S1-. (B) Analiżi tal-attivitajiet tal-psewdovirus tas-serum mill-ġrieden immunizzati Ad-S1-. (C) Analiżi ta' attivitajiet newtralizzanti tas-serum mill-ġrieden immunizzati Ad-S1-

3.6. Assaġġ ta' Antikorp newtralizzanti

L-isfida tas-SARS-CoV-2 taċ-ċelloli Vero E6 ippermettiet l-iskoperta ta 'attività newtralizzanti fis-serum tal-ġurdien immunizzat (Figura 4B, C). It-titri ta' newtralizzazzjoni D14 u D28 taċ-ċelluli Vero E6 immunizzati Ad-S{1-kontra l-isfida tal-virus ħaj SARS-CoV{{{{0}} in vitro kienu 1:24.3 u 1:26.3, rispettivament. L-assaġġ tal-psewdovirus ta riżultati simili għal dawk tal-assaġġ tal-virus ħaj, b'titri ta' newtralizzazzjoni sa 1:28.1 u 1:29.6 f'D14 u D28, rispettivament. It-titer newtralizzanti tal-psewdovirus D28 (GMT 769.0) kien 2.7-darbiet ogħla minn dak ta' D14 (GMT 283.7).

4. Diskussjoni

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 sa<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

F'dan l-istudju, bnejna vaċċin rikombinanti ta' adenovirus SARS-CoV-2 li fih is-subunità SARS-CoV-2 S1 u għamilnieha Ad-S1. Bħal CanSinoBIO, li ġie approvat għall-kummerċjalizzazzjoni [28], użajna HAdV-C5 f'dan il-vaċċin. Adenovirus huwa użat ħafna fit-terapija tal-ġeni rikombinanti u bħala vettur tal-vaċċin. Madankollu, ir-rata seropożittiva ta 'HAdV-C5 hija għolja daqs 75-80% fil-popolazzjoni normali [29]. Dan jimplika li l-immunità ta 'qabel il-ħażna kontra l-vettori HAdV-C5 tnaqqas b'mod sinifikanti l-immunità indotta mill-vaċċin. Żviluppat fl-Università ta’ Oxford fir-Renju Unit, ChAdOx1 nCoV-19 juża vettur tal-adenovirus taċ-chimpanzee li, għall-kuntrarju, għandu rata seropożittiva aktar baxxa fil-bnedmin, u meta pożittiv, ġeneralment jippreżenta titer ta’ antikorpi fis-serum aktar baxx [30] . Għalhekk, il-vettori tal-adenovirus li jistgħu jevadu l-immunità pre-eżistenti jistgħu jiġu esplorati biex itejbu l-effikaċja protettiva tal-vaċċin tal-adenovirus. Fl-istudju preżenti, l-istatus tas-serum tal-ġrieden qabel u wara l-immunizzazzjoni kien iddeterminat minn testijiet ELISA u newtralizzazzjoni u ta evidenza ta 'immunità umorali għall-kandidati tal-vaċċin. Is-serum prodott wara injezzjoni ġol-muskoli tal-vaċċin fil-ġrieden ipproteġi b'mod effettiv iċ-ċelloli Vero E6 mill-infezzjoni SARS-CoV-2 in vitro (Figura 4). Aħna skoprejna wkoll rispons immuni aktar b'saħħtu u protezzjoni aħjar fil-ġrieden wara t-tieni immunizzazzjoni (Figura 4). Ir-riżultati sperimentali tagħna huma simili għal riżultati sperimentali mainstream.

Hekk kif tkompli r-riċerka tas-SARS-CoV-2, bosta studji wrew li l-maltempata taċ-ċitokini sekondarja għall-infezzjoni tas-SARS-CoV-2 tista’ taffettwa l-produzzjoni taċ-ċelluli T, u tagħmilha diffiċli għall-pazjenti biex iżommu l-immunità fit-tul għal SARS-CoV-2 [31]. Għalhekk, huwa meħtieġ li jiġi ddeterminat jekk Ad-S1 jistax jinduċi immunità medjata minn ċelluli T fil-ġrieden. Ir-riżultati tagħna wrew li l-konċentrazzjonijiet ta' IFN- u IL-12 żdiedu, u l-konċentrazzjonijiet ta' IL-4 naqsu fil-grupp Ad-S1, li jindika li s-sopravivenza u t-tkabbir taċ-ċelluli Th1 indotti mill-vaċċin fil-ġrieden. Is-sekrezzjoni ta' IL-12, IL{-10, u TNF- miċ-ċelluli Th1 żdiedet bi ftit fil-grupp sperimentali. Dawn ir-riżultati indikaw li Ad-S1 effettivament indotta rispons Th1-preġudikat taċ-ċelluli T fil-ġrieden [32]. Iż-żieda fil-IL-5 indikat li ċ-ċelloli Th2 jipparteċipaw ukoll fir-rispons immuni u jipproduċu ċerti effetti. Il-konċentrazzjoni KC/GRO fil-grupp sperimentali tnaqqset b'mod sinifikanti meta mqabbla ma 'dik tal-grupp ta' kontroll tal-PBS, li seta 'kien minħabba l-kimotassi tan-newtrofili mnaqqsa li trażżan ir-rispons infjammatorju u ppermettiet li l-effetti sekondarji tal-vaċċin jiġu kkontrollati kemmxejn. Dan ikun aktar ta’ benefiċċju għal nies immunokompromessi, bħall-anzjani jew pazjenti li jkunu qed jagħmlu kimoterapija. Li M., et al. [29] żviluppaw vaċċin tal-adenovirus bl-użu ta' Ad68 bħala vettur. Ir-riżultati wrew li l-attività newtralizzanti in vivo tas-SARS-CoV-2 setgħet tiġi skoperta fi żmien ġimagħtejn wara l-immunizzazzjoni intramuskolari tal-ġrieden BALB/c u mbagħad kompliet tiżdied, u t-titer tal-antikorpi tan-newtralizzazzjoni (PRNT ID50) laħaq 957.3 fi tmienja. ġimgħat. Sadanittant, fl-istudju ta 'Liu J., et al. [33], ġew żviluppati vaċċini li jużaw AdC6 u AdC68 bħala vettori; kemm ir-risponsi ta 'antikorpi li jorbtu kif ukoll dawk li jinnewtralizzaw wara l-immunizzazzjoni ġew iġġenerati 14-il jum wara d-doża, b'titru IgG ta' 7108 (titer medju ġeometriku, GMT; AdC6) u 5489 (GMT, AdC68). It-titer tan-newtralizzazzjoni 50 (NT50) tal-assaġġ tan-newtralizzazzjoni tal-psewdovirus kien 125 (GMT, AdC6) u 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Fl-istudju preżenti, ġrieden imlaqqma b'Ad-S1 kellhom titri IgG ta' 1:1010 u 1:122 misjuba minn ELISA ġimgħatejn wara l-ewwel u t-tieni tilqim, rispettivament. It-titer ta' dilwizzjoni ta' ad-s1 kien 378.9 (GMT) fi 14-il jum wara t-tilqim u 2297.4 (GMT) fi 28 jum wara t-tilqim. Fit-test tal-antikorpi tan-newtralizzazzjoni, iċ-ċelloli Vero E6 immunizzati b'Ad-S1 wrew newtralizzazzjoni 1:24.3 u 1:26.3 f'D14 u D28 kontra l-isfida tal-virus SARS-CoV-2 ħaj in vitro, rispettivament. It-titri tan-newtralizzazzjoni tal-psewdovirus f'D14 u D28 kienu 283.7 (GMT) u 769.0 (GMT), rispettivament. Għalhekk, il-vaċċin f'dan l-istudju kien aktar effettiv f'termini tar-rispons immuni fil-mudell tal-ġurdien.

Minħabba l-limitazzjoni tal-kundizzjonijiet sperimentali, aħna ma għamilniex analiżi tal-post immunosorbenti marbuta mal-enżimi (ELISpot) taċ-ċelloli immuni tal-milsa tal-ġrieden sperimentali. Barra minn hekk, esperimenti ta 'protezzjoni ta' attakk ta 'SARS-CoV-2 fuq ġrieden ma setgħux jitwettqu minħabba l-limitazzjonijiet tal-laboratorju ta' protezzjoni fiżika. Madankollu, iddeterminajna li l-vaċċin kellu effikaċja għolja fil-mudelli tal-ġrieden u jista 'jintuża bħala razza ta' vaċċin ta 'riżerva ideali. Barra minn hekk, l-immunoġeniċità, is-sigurtà, u l-effettività tal-kandidati prospettivi tal-vaċċin SARS-CoV-2 għandhom jiġu eżaminati f’mudelli ta’ annimali addizzjonali (eż., fniek, primati, rakkuni, klieb), peress li l-mudelli tal-ġrieden jistgħu ma jidduplikawx għal kollox l-immunoloġiku uman. karatteristiċi.

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

5. Konklużjonijiet

Id-dejta miksuba mill-istudji prekliniċi tagħna tal-vaċċin tal-adenovirus uriet li l-vaċċin għandu sigurtà u effikaċja suffiċjenti. Għalhekk, jista' jkun vaċċin profilattiku promettenti u fattibbli kontra l-infezzjoni SARS-CoV-2.

Referenzi

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Tagħrif dwar iċ-ċiklu tal-ħajja tas-SARS-CoV-2, il-patofiżjoloġija, u t-trattamenti razzjonalizzati li jimmiraw għal kumplikazzjonijiet kliniċi tal-COVID-19. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gene tax-xahar: Il-2019-nCoV/SARS-CoV-2 proteina ġdida tal-koronavirus spike. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Rigressjoni tal-Kanċer tal-Pulmun fil-Ġrieden mill-Amministrazzjoni intranasali ta' SARS-CoV-2 Spike S1. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, il-koronavirus pandemiku: Tagħrif molekulari u strutturali. J. Microbiol Bażiku. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Karatteristiċi strutturali tal-koronavirus SARS-CoV-2 spike protein: Miri għat-tilqim. Ħajja Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Ħitan, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glycan shield u epitope masking ta 'proteina spike tal-koronavirus osservata permezz ta' mikroskopija krijo-elettron. Nat. Struttura. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 huwa superjuri għall-RBD bħala antiġen tal-vaċċin tas-subunità COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Kun konxju tal-proteina spike tas-SARS-CoV-2: Hemm aktar milli jidher. J. Biol. Regul. Homeost. Aġenti 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Mdendla, T.; Lu, Z.; Tan, W. Immunità sistemika u mukosali fil-ġrieden suscitata minn immunizzazzjoni waħda b'vaċċini bbażati fuq il-vettur tat-tip 5 jew 41 tal-adenovirus uman li jġorru l-proteina spike tal-koronavirus tas-sindromu respiratorju tal-Lvant Nofsani. Immunoloġija 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Vettoroloġija ta' adenovirus uman ta' l-aktar avvanzata għal approċċi terapewtiċi. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Effikaċja u sigurtà tal-vaċċini COVID-19: Reviżjoni sistematika. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Sigurtà u effikaċja tal-vaċċin ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) kontra SARS-CoV-2: Analiżi interim ta 'erba' provi kkontrollati randomised fil-Brażil, l-Afrika t'Isfel, u r-Renju Unit. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analiżi tal-Effikaċja Protettiva ta' Vaċċini approvati tal-COVID-19 Kontra Diversi Mutanti. Quddiem. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Effikaċja u sigurtà ta' vaċċin inattivat ta' virion sħiħ SARS-CoV-2 (CoronaVac): Riżultati interim ta' prova ta' fażi 3 double-blind, randomised, ikkontrollata bi plaċebo fit-Turkija. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Sigurtà u immunoġeniċità ta 'vaċċin SARS-CoV-2 inattivat, BBIBP-CorV: Prova randomizzata, double-blind, ikkontrollata bi plaċebo, fażi 1/2. Lancet Infetta. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; Hu, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Sigurtà u immunoġeniċità ta' vaċċin rikombinanti ta' subunità ta' proteina bbażat fuq RBD b'ripetizzjoni tandem rikombinanti (ZF2001) kontra COVID-19 fl-adulti: Żewġ provi randomised, double-blind, ikkontrollati bi plaċebo, fażi 1 u 2. Lancet Infetta. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Il-vaċċin tal-COVID tad-DNA tal-Indja huwa l-ewwel fid-dinja li ġej. Natura 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Miri tat-Tweġibiet taċ-Ċellola T għal SARS-CoV-2 Coronavirus fil-Bnedmin bil-Marda COVID-19 u Individwi Mhux Esposti. Ċellula 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Antikorpi Nnewtralizzanti qawwija kontra SARS-CoV-2 Identifikati minn Sekwenzar b'Ċellula Unika ta' Produttività Għolja taċ-Ċelloli B ta' Pazjenti Konvalexxenti. Ċellula 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vaċċini: Rapport tal-Istatus. Immunità 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. Formulazzjoni ġdida ta' vaċċin ta' DNA u proteini ta' kombinazzjoni COVID-19 tipprovdi protezzjoni sħiħa kontra SARS-CoV-2 f'rhesus macaques. Emerġenza. Il-mikrobi jinfettaw. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; Hu, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Il-proteina spike tas-SARS-CoV – mira għall-iżvilupp tal-vaċċin u terapewtiku. Nat. Dun Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Twil, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. Proteina nukleokapsid maqtugħa N-terminalment ta' SARS-CoV-2 bħala markatur seroloġiku aħjar minn proteina nukleokapsid sħiħa fl-evalwazzjoni tal-immunoġeniċità ta' SARS-CoV inattivat-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Ġentili, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Il-vaċċin SARS-CoV-2 mRNA-1273 iqanqal newtralizzazzjoni aktar iffukata fuq l-RBD iżda b'rabta usa' tal-antikorpi fi ħdan l-RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Evalwazzjoni ta' Risposti Ċellulari u Seroloġiċi għal Infezzjoni Akuta SARS-CoV-2 turi l-Importanza Funzjonali tad-Dominju li jorbot mar-Riċetturi. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. Hu, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Id-dominju li jorbot mar-riċetturi tal-proteina spike SARS-CoV jinduċi antikorpi newtralizzanti qawwija ħafna: Implikazzjoni għall-iżvilupp ta 'vaċċin ta' subunità. Biochem. Biophys. Riż. Komun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fann, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Żvilupp u Applikazzjoni ta' Vaċċini tal-Vetturi Viral matul il-Pandemija tal-COVID-19. Mikro-organiżmi 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Immunoġeniċità u sigurtà ta' vaċċin tal-COVID-19 tat-tip ta' adenovirus rikombinanti-5-vectored f'adulti b'saħħithom minn 18-il sena jew aktar: Prova ta' fażi 2 randomised, double-blind, ikkontrollata bi plaċebo. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Tilqim b'Doża Unika B'Tilqim Ibbażat fuq Adenovirus taċ-Chimpanzee Tinduċi Immunità Sostnuta u Protettiva Kontra Infezzjoni SARS-CoV-2. Quddiem. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Żvilupp ta 'vetturi tal-vaċċini ġodda: Vettori adenovirali taċ-Ċimpanzee. Hum. Vaċċini Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Bidwi, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Telf ta' Bcl-6-Esprimi Ċelloli T Helper Follicular u Ċentri Ġerminali fil-COVID-19. Ċellula 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- u IL-12 jissinerġizzaw biex jikkonvertu Th17 iġġenerat in vivo f'ċelluli Th1/Th17. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; et al. It-tilqim prime-boost eteroloġi b'vettori adenovirali taċ-chimpanzee jqanqlu immunità qawwija u protettiva kontra l-infezzjoni SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]