Acteoside fil-Pjanti Naturali Ċiniżi-Cistanche Biex Ittejjeb il-Mard tal-Kliewi--Parti I

Kuntatt: emily.li@wecistanche.com

Prodott naturali ta 'acteoside ittejjeb il-ħsara fil-kliewi fil-ġrieden tad-dijabete db/db u ċelluli HK-2 permezz tar-regolazzjoni NADPH/oxidase-TGF-/Smad passaġġ ta' sinjalazzjoni

Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

Dan l-istudju kien imfassal biex jinvestiga l-effetti protettivi u l-mekkaniżmi ta 'acteosidefuq DKD fil-ġrieden maskili db/db tad-dijabete u ċelluli HK-2 indotti minn glukożju għoli. Il-ġrieden tad-dijabete db/db ġew maqsuma b'mod każwali fil-grupp mudell, grupp metformin, grupp irbesartan, uacteosidegrupp. Osservajna l-prodott naturali ta 'acteosidejuru effett sinifikanti filprotezzjoni tal-kliewipermezz ta 'analiżi ta' indikaturi bijokimiċi u metaboliti endoġeni, osservazzjonijiet istopatoloġiċi, u western blotting. Iċ-ċelloli HK-2 soġġetti għal glukożju għoli ntużaw f'esperimenti in-vitro. Il-mekkaniżmi molekulari ġew investigati permezz ta 'RT-PCR u western blot.Acteosidejipprevjeni ċelluli HK-2 indotti minn glukożju għoli u ġrieden db/db bid-dijabete billi jinibixxi l-passaġġ tas-sinjalar NADPH/oxidase-TGF-/Smad.Acteosideirregolat il-passaġġ metaboliku disturbat tal-metaboliżmu tal-lipidi, il-metaboliżmu ta 'glyoxylate u dicarboxylate, u l-metaboliżmu tal-aċidu arakidoniku. Skoprejna l-prodott naturali ta 'acteosidejuri effett sinifikanti fuqprotezzjoni tal-kliewi.Dan l-istudju witta t-triq għal aktar esplorazzjoni tal-patoġenesi, dijanjosi bikrija, u l-iżvilupp ta 'aġent terapewtiku ġdid għal DKD.

KLIEM EWLENIN acteoside, dijabetikamard tal-kliewi, profili metaboliċi, NADPH/oxidase-TGF-/Smad mogħdija tas-sinjalar, ROS

Parti I

Acteoside jikkura l-Mard tal-Kliewi

1|INTRODUZZJONI

Acteosidehuwa komponent rappreżentattiv ta 'phenylethanoid glycosides, imqassam b'mod wiesa' f'79 ġeneri ta 'pjanti, bħal Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticola, u pjanti mediċinali oħra.Acteosidehuwa kkaratterizzat minn aċidu caffeic u hydroxytyrosol marbut ma 'moety ta' glukożju permezz ta 'bonds ester u glycosidic, rispettivament, b'unità rhamnose marbuta mal-molekula tal-glukożju (Zhao et al., 2015). Huwa rrappurtat liacteosidejippossjedi attivitajiet farmakoloġiċi ħafna, bħalkliewiprotezzjoni (Gan et al., 2018), antiossidazzjoni (He et al., 2011), newroprotezzjoni (Li, Zhou, Xu, Song, & Lu, 2018), protezzjoni tal-fwied (Lee et al., 2004), kontra l-kanċer (Ohno , Inoue, Ogihara, & Saracoglu, 2002), eċċ. Madankollu, l-effetti protettivi taacteosidefid-dijabetekorriment renalimhumiex ċari.

Id-dijabete hija waħda mill-emerġenzi tas-saħħa globali li qed jikbru malajr tas-seklu 21. Fl-2019, huwa stmat li 463 miljun ruħ għandhom id-dijabete u dan in-numru huwa mbassar li jilħaq 578 miljun sal-2030, u 700 miljun sal-2045. Il-prevalenza globali tad-dijabete qed tikber malajr, speċjalment fid-dinja li qed tiżviluppa, u l-prevalenza tad-dijabetemard tal-kliewi(DKD) u l-istadju finalimard tal-kliewi(ESRD) tkompli tiżdied (Hu, 2011). DKD hija waħda mill-aktar kumplikazzjonijiet mikrovaskulari kroniċi dijabetiċi li jibżgħu u l-kawża ewlenija ta 'ESRD. Il-mortalità minn kull kawża f'individwi b'DKD hija madwar 30 darba ogħla minn dik f'pazjenti dijabetiċi mingħajr nefropatija. Studji riċenti jindikaw lirenalitransizzjoni tubulari epiteljali-mesenkimali (EMT) u akkumulazzjoni ta' matriċi estraċitoplasmika (ECM) fil-renalil-interstizju għandu fatturi ewlenin fil-patoġenesi tad-DKD (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Żieda fl-istudji rrappurtaw li l-progressjoni tarenalifibrożi fin-nefropatija dijabetika kienet medjata minn ħafna mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni. TGF- ġie implikat bħala fattur patoġeniku ewlieni fil-biċċa l-kbira tat-tipi ta 'CKD assoċjati ma' fibrożi, inkluż DKD (Lv & Zhang, 2019). Il-kumpless ta' sinjalar eteromeriku, li jirriżulta mit-twaħħil ta' TGF- 1 mar-riċettur tat-tip II u min-naħa tiegħu riċettur tat-tip I, jittrasduċi sinjali permezz ta' Smads regolati mir-riċetturi (Smad2/3) u Smad sieħeb komuni (Smad4), li jwassal għal regolazzjoni traskrizzjoni tal-ġeni fil-mira (Sierra et al., 2015). L-akkumulazzjoni ta 'ROS tista' twassal għal stress ossidattiv fiċ-ċellula, li twassal għal ħsara lill-komponenti ċellulari inklużi proteini u DNA. Fl-aħħar mill-aħħar, l-istress ossidattiv iwassal għalrenalifibrożi u tnaqqis filfunzjoni renali. NADPH oxidases (NOX) huma aċċettati bħala sorsi ewlenin ta 'ġenerazzjoni ta' ROS fin-nefropatija dijabetika u kronika.mard tal-kliewi. Ir-regolamentazzjoni 'l fuq u l-iper-attivazzjoni ta' NOX x'aktarx jikkontribwixxu wkoll għal stress ossidattiv fi stadji patofiżjoloġiċi. Elevazzjoni tal-renaliIl-livell ta 'ROS permezz ta' attivazzjoni NOX medjata mill-ipergliċemija jirriżulta fi stress ossidattiv, li jinduċi ħsara liltessuti tal-kliewi, li tikkawża DKD (Lee, An, Kim, & Bae, 2020).

Il-metabolomika hija teknoloġija omika ġdida u importanti għall-analiżi kwalitattiva u kwantitattiva tal-metaboliti molekulari żgħar kollha fiċ-ċelloli ħajjin, fit-tessuti u fil-fluwidi tal-ġisem. Bħala dixxiplina ġdida biex tidentifika l-bidliet metaboliċi ġenerali ta 'organiżmi ħajjin, il-metabolomika tipprovdi għarfien ġdid fl-istudju tad-dijabete u kumplikazzjonijiet dijabetiċi (Lu, Xie, Jia, & Jia, 2013).

L-iskop ta 'dan l-istudju kien li jinvestiga l-effett protettiv tal-prodott naturaliacteosidefuq DKD ta' ġrieden maskili dijabetiċi db/db u ċelluli HK-2 indotti minn glukożju għoli in vitro u l-mekkaniżmu tiegħu. Allura, f'dan l-istudju, ġrieden db/db ġew adottati biex jevalwaw il-renalieffetti protettivi taacteoside, u r-regolamentazzjoni ta 'metaboliti differenti fis-serum ġiet analizzata biex idawwal il-mekkaniżmi ta'acteoside. Barra minn hekk, il-mudell in vitro HK-2 indott minn glukożju għoli jevalwa l-effikaċja ta'acteosidefuq ġrieden db/db bid-determinazzjoni tal-livelli ta' espressjoni tal-passaġġi tas-sinjalar NADPH/oxidase-TGF-/Smad.

2|MATERJALI U METODI

2.1|Kimiċi u strumenti

Acetonitrile ta 'grad UPLC inxtara minn Merck (Darmstadt, il-Ġermanja); l-aċidu formiku nxtara minn Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).Acteoside(Purità akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija) inxtrat mill-Istituti Nazzjonali għall-Kontroll tal-Ikel u d-Droga (Beijing, iċ-Ċina). L-istruttura tal-acteosidehuwa muri fil-Figura 1A. Kit tar-reaġenti tan-nitroġenu urea tas-serum (BUN), kit tar-reaġent aspartate aminotransferase (GOT), kit tar-reaġent alanine aminotransferase (GPT), kit tar-reaġent tal-kolesterol totali (TCHO), kit tar-reaġent tat-trigliċeridi (TG), kit tar-reaġent tal-krejatinina tas-serum (Scr), mikroalbumina urinarja (mALB) kit ta 'reaġent, u kit ta' reaġent ta 'l-insulina (INS) inxtraw minn Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, iċ-Ċina). Metformin hydrochloride pilloli nxtraw minn Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartan inxtara minn Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd DMEM u F12 inxtraw minn GIBCO, l-Amerika; NOX1 (numru tal-katalgu: ab121009), NOX2 (numru tal-katalgu: ab129068), NOX4 (numru tal-katalgu: ab154244), u Smad7 (numru tal-katalgu: ab216428) l-ewwel antikorp inxtara minn Abcam (Cambridge, ir-Renju Unit). -SMA (numru tal-katalgu: 19245), E-cadherin (numru tal-katalgu: 3195), NF-κB p65 (numru tal-katalgu: 8242), TGF- 1 (numru tal-katalgu: 3711), Smad2 (numru tal-katalgu: 5339) , Smad3 (numru tal-katalgu: 9523), Smad4 (numru tal-katalgu: 46535), u PSmad2/3 (numru tal-katalgu: 8828) l-ewwel antikorp inxtraw mingħand CST. Il-kimiċi u r-reaġenti l-oħra kollha użati f'dan l-istudju kienu ta 'grad analitiku u magħmulin fiċ-Ċina.

Sistema Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) mgħammra bi spettrometru Quattro Micro MS u Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). L-ilma dejonizzat ġie ppurifikat fuq sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, Massachusetts). Stazzjoni tax-xogħol Mass Lynx v4.1 ġiet adottata biex tanalizza d-dejta, u ntużaw ċentrifuga ta 'veloċità ultra-għolja f'temperatura baxxa (Thermo Scientific, ir-Renju Unit) u mikroskopju DMI3000M (Leica, il-Ġermanja).

2.2|Kundizzjonijiet sperimentali fuq l-annimali

Il-proċeduri u l-protokolli sperimentali kollha użati f'dan l-istudju ġew riveduti u approvati mill-Kumitat Istituzzjonali tal-Etika tal-Annimali tal-Università ta 'Nanjing tal-Mediċina Ċiniża (Nanjing, iċ-Ċina). Il-protokolli deskritti fl-istudju preżenti kienu bi qbil mal-linji gwida istituzzjonali għall-kura u l-użu ta 'annimali tal-laboratorju. Il-ġrieden inxtraw miċ-Ċentru ta 'Riċerka tal-Mudell tal-Annimali tal-Università ta' Nanjing (Ċertifikat Nru. Su 2015-0001). L-esperimenti kollha saru bi ġrieden maskili db/db ta' 8-ġimgħat u ġrieden tat-tip selvaġġ littermates db/m imqabbla mal-età b'piż inizjali tal-ġisem ta' 30 40 g. Il-mudell tal-ġurdien dijabetiku db/db huwa mudell tal-annimali rikonoxxut internazzjonalment tad-dijabete. Studji wrew li l-mekkaniżmu tad-DKD fil-ġrieden db/db huwa simili għal dak tal-bnedmin. L-annimali kienu miżmuma f'gaġeġ b'umdità kostanti (madwar 60 fil-mija ± 2 fil-mija) u temperatura (ca. 23 ± 2 grad) u b'ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 12-il siegħa. L-annimali kienu għaddejjin minn perjodu ta 'adattament ta' 3 ġimgħat, li matulu tħallew aċċess illimitat għal chow u ilma tal-vit. Wara l-perjodu ta 'akklimazzjoni, il-ġrieden db/db ġew maqsuma b'mod każwali f'erba' gruppi b'sitta f'kull grupp: grupp mudell (salina normali, M), grupp metformin (250 mg kg^-1 d^-1, EJSG), irbesartan group (50 mg kg^-1 d^-1, EBST),acteosidegrupp (70 mg kg^-1 d^-1, MRHTG), darba kuljum (Gao, Peng, Huo, Liu, & Yan, 2015). Barra minn hekk, f'dan l-istudju, metformin u irbesartan intgħażlu bħala mediċini ta' kontroll pożittiv. Ġie rrappurtat li irbesartan jista 'jnaqqas il-pressjoni tad-demm, il-lipidi tad-demm, ulipidi tal-kliewi.M'għandu l-ebda effett fuq il-glukożju fid-demm u l-lipidi tal-fwied. Jista 'jtejjeb il-funzjoni u l-bidla patoloġika ta'kliewital-ġrieden db/db. L-effett protettiv tal-metformin fuq il-kliewihija riflessa fit-tnaqqis tal-proteinurja fil-firien dijabetiċi u pazjenti bid-dijabete tat-tip 2. Id-doża tal-annimali ta' metformin u irbesartan ġiet estrapolata mid-doża ta' kuljum tal-bniedem, bl-użu tal-metodu ta' normalizzazzjoni tal-erja tas-superfiċje tal-ġisem. Imbagħad, il-ġrieden ingħataw il-mediċina korrispondenti darba kuljum permezz ta 'lavage gastriku għal 6 ġimgħat, u l-ġrieden db/m intużaw bħala l-grupp ta' kontroll, li ngħataw l-istess volum ta 'salina fl-istess ħin.

2.3|Ġbir ta' kampjuni

Matul il-perjodu sperimentali, il-piżijiet tal-ġisem u l-livelli ta 'glukożju fid-demm sawm (FBG) ġew irreġistrati kull ġimgħa, il-livelli ta' FBG ġew imkejla b'sistema ta 'monitoraġġ tal-glukożju fid-demm One Touch Ultra II (Life Scan, Milpitas, California) bil-vina tad-denb kull nhar ta' Tnejn (fit-8 ta' filgħodu). ). Wara 6 ġimgħat ta 'amministrazzjoni, il-ġrieden sawmu f'gaġeġ metaboliċi b'aċċess ħieles għall-ilma biex jiġbru l-awrina ta' 24 siegħa. Il-kampjuni kollha ta 'l-awrina ġew immedjatament ċentrifugati f'3000 rpm għal 10 minuti wara l-ġbir, u s-supernatanti ġew separati u maħżuna fi grad -80 sal-analiżi. Fl-aħħar tal-istudju, il-ġrieden ġew sagrifikati taħt anestesija b'10 fil-mija chloral hydrate (3 mg/kg), u nġabar id-demm għall-konċentrazzjoni ta 'parametri bijokimiċi u studju metabolomics. Imbagħad, il-kampjuni tad-demm ġew ċentrifugati fi 3000 rpm għal 10 min, u l-kampjuni tas-serum ġew separati u maħżuna fi grad -80 sal-analiżi. Il-kilwa tal-lemin tneħħiet b'biċċa waħda mwaħħla b'formalin buffered newtrali ta '10 fil-mija għal eżami istoloġiku. Il-renalikortiċi ġie iżolat mill-biċċa l-oħra u ffriżat fin-nitroġenu likwidu għal western blotting.

Cistanche għat-trattament ta' insuffiċjenza renali

2.4|Kultura taċ-ċelluli u trattament

Il-linja RTEC umana HK{{0}} inkisbet minn Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Il-mezz sħiħ kien DMEM baxx ta 'glucose b'10 fil-mija FBS u 1 fil-mija soluzzjoni ta' penicillin-streptomycin. Iċ-ċelloli HK-2 ġew ikkultivati ​​f'37 grad, 5 fil-mija CO2, u umdità saturata. Iċ-ċelloli ġew subkultivati ​​f'80 fil-mija ta 'konfluwenza, li tneħħa mill-inkubatur, u l-medju oriġinali fid-dixx ġie mormi. Iċ-ċelloli tlaħlaħ bl-użu ta '0.5 ml phosphate buffer saline (PBS) u ġew diġeriti bi trattament b'0.5 ml trypsin għal 1-2 min f'temperatura ta' 37 grad. Id-diġestjoni ġiet mitmuma bl-użu ta 'medja DMEM ta' 2 ml, u s-sospensjoni taċ-ċelluli ġiet sussegwentement ċentrifugata f'450g għal 5 min f'4C. Is-supernatant ġie mormi u ċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid f'2 ml medju DMEM korrispondenti biex tinkiseb sospensjoni ta 'ċellula waħda. Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi dixxijiet / mikropjanċi differenti f'densitajiet differenti għal esperimentazzjoni sussegwenti, kif deskritt hawn taħt. Iċ-ċelloli HK-2 ġew ibbanjati fuq 96-pjanċi u dixxijiet, ittrattati minn qabel b'DMEM glukożju baxx (5 mmol/L), inkubati f'37C u 5 fil-mija CO₂għal 6 sigħat, u mbagħad ġew sinkronizzati. Il-gruppi sperimentali ġew maqsuma kif ġej: grupp ta 'kontroll (C), mingħajr fattur ta' intervent; grupp mudell (M), li fih iċ-ċelloli kienu kkultivati ​​f'soluzzjoni DMEM ta 'glukożju għoli (30 mmol/L); grupp ta 'kontroll tal-pressjoni osmotika (DMEM flimkien ma' 24.5 mmol / L mannitol, GLC); grupp irbesartan (25 mmol/L) uacteoside(MRHTG) grupp f'ħames dożaġġi (5, 10, 25, 50, u 100 μmol/L), rispettivament.

2.5|Morfoloġija taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli HK-2 ġew maħsula darbtejn bil-PBS u ġew ikkunsidrati taħt mikroskopju maqlub (OLYMPUS IX51). Il-morfoloġija taċ-ċelloli kienet osservata taħt 100 ingrandiment.

2.6|Kejl ta' indikaturi bijokimiċi

L-effikaċja terapewtika ta 'acteosidefuq ġrieden db/db ġie evalwat għal-livelli ta 'mALB fl-awrina u FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT, u BUN fis-serum, li ġew skoperti segwiti mid-deskrizzjoni fornuta mill-manifattur tal-kit.

2.7|Analiżi patoloġika

Parti mill-renalikortiċi twettqet għal ematossilin-eosina (HE) u aċidu perjodiku-Schiff (PAS) sabiex jiġu osservati bidliet patoloġiċi fil-tessut renali, gradi ta 'iperplażja tat-tessut tal-fibrożi, strutturi ta' glomeruli u tubuli permezz ta 'mikroskopju elettroniku (400). Meta tieħu ritratt, ipprova imla l-kamp viżiv kollu bihtessut tal-kliewibiex jiġi żgurat li d-dawl fl-isfond ta 'kull ritratt huwa l-istess. Image-Pro Plus 6.0 intuża softwer biex jintgħażel l-istess kulur aħmar-vjola bħall-kriterju unifikat biex jiġi ġġudikat il-pożittiv tar-ritratti kollha. Id-densità ottika akkumulata (IOD) tal-espressjoni pożittiva tal-membrana tal-kantina u l-erja tal-pixels tal-plexus vaskulari glomerulari (AREA) inkisbu bl-analiżi ta 'kull ritratt, u ġiet ikkalkulata d-densità ottika medja (IOD/AREA).

2.8|Western blotting

Tessut tal-kliewiu ċ-ċelloli ġew estratti b'liżi buffer; il-lysates ġew ċentrifugati. Wara piroliżi sħiħa, ċentrifuga għal 5 minuti f'12000 rpm, u ħu s-supernatant u s-supernatant inġabru. Il-kit tal-konċentrazzjoni tal-proteina tal-aċidu bicinchoninic (BCA) intuża biex jiddetermina l-konċentrazzjoni tal-proteina. Wara l-kwantifikazzjoni, il-proteina ġiet solvuta b'10 fil-mija SDS-PAGE, trasferita fuq membrani PVDF, imbagħad imblukkata f'5 fil-mija BSA f'TBST, u inkubata b'antikorpi primarji segwiti mill-antikorpi sekondarji korrispondenti. Ir-reattività tal-antikorpi mbagħad ġiet skoperta mill-ECL u kkwantifikata bis-softwer ImageJ.Tessuti renalikampjuni ġew analizzati permezz ta' western blotting biex jinstabu l-livelli ta' espressjoni ta' -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500). ), Smad4 (1:1000), u Smad7 (1:1000) proteina.

2.9|Analiżi ELISA

Is-sekrezzjoni ta' proteina kimoattrattant tal-monoċiti -1 (MCP-1), interleukin –1 (IL-1 ), fattur tan-nekrożi tat-tumur- (TNF- ), u interleukin-6 (IL) -6) fis-supernatant ta' kull ċellula ġew imkejla permezz ta' kit ELISA.

2.10|PCR f'ħin reali

Barra minn hekk, dawn iċ-ċelloli ġew ippreparati għall-PCR f'ħin reali biex jeżaminaw il-livelli ta' espressjoni ta' NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-cadherin, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4, u Smad7 mRNA. Inġabru ċ-ċelloli f'kull grupp (madwar 1 107 ċelloli). L-RNA totali ġie estratt skont il-metodu ta 'pass wieħed ta' Trizol, u l-purità u l-konċentrazzjoni tiegħu ġew determinati. B'GAPDH bħala referenza interna, is-sekwenza tal-primer kienet din li ġejja. TGF- 1, primer tas-sens: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, primer antisens: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT{-3;E-cadherin, primer tas-sens: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, primer antisens: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, primer tas-sens: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, primer antisens: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, primer tas-sens: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, primer antisens: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, primer tas-sens: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, primer antisens: 5-TCTGCAAACCACTCAAAAGGC-3; NOX4, primer tas-sens: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, primer antisens: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, primer tas-sens: 5-TGGCACGTGAGGTGAGATT-3, primer antisens: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, primer tas-sens: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, primer antisens: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, primer tas-sens: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, primer antisens: 5-ATCCATTCTGCTGCTTGTCCT-3; Smad7, primer tas-sens: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, primer antisens: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGGG-3; -SMA, primer tas-sens: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, primer antisens: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, primer tas-sens: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, primer antisens: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.

2.11|Analiżi statistika

Id-dejta u l-analiżi statistika jikkonformaw mar-rakkomandazzjonijiet dwar disinn sperimentali u analiżi fil-farmakoloġija. L-esperimenti kollha kienu randomised u blinded. Ir-riżultati huma espressi bħala l-M ± SD/SEM tan-numru indikat (n) ta' esperimenti indipendenti. Id-dejta fl-istudju attwali hija ppreżentata bħala l-M ± SD/SEM minn mill-inqas tliet esperimenti indipendenti. Is-sinifikat tad-differenzi ġie analizzat b'ANOVA one-way segwit mit-test ta' Tukey (aktar minn żewġ gruppi) jew it-test t ta' Student (żewġ gruppi). It-testijiet post hoc jitwettqu biss meta F kiseb p < .05,="" u="" ma="" kien="" hemm="" l-ebda="" varjanza="" sinifikanti="" inomoġeneità.="" it-testijiet="" kollha="" kienu="" fuq="" żewġ="" naħat,="" u="" p=""><.05 kien="" ikkunsidrat="" statistikament="" sinifikanti.="" analiżi="" statistika="" saret="" bl-użu="" tas-softwer="" graphpad="" prism="">

Cistanche acteoside għat-titjib tal-Kliewi

2.12|Kundizzjonijiet UPLC-QTOF/MS u analiżi tad-dejta

Il-kampjuni kollha tas-serum ġew imdewweb f'temperatura tal-kamra qabel il-preparazzjoni. It-300 ul acetonitrile ġie miżjud ma' kampjuni tas-serum ta' 100 ul għal proteina preċipitata, u mħallta b'mod vigoruż għal 60 s. Il-kampjuni kollha ġew ċentrifugati f'13000 rpm għal 10 minuti f'4 gradi. Fl-aħħarnett, is-supernatant ġie injettat fl-analiżi UPLC-QTOF/MS. Is-separazzjoni tal-metaboliti saret bl-użu ta' sistema Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) mgħammra b'Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). Alikwot ta '2 ul ta' soluzzjoni tal-kampjun ġiet injettata fuq Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2.1 mm, 1.7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) f'35 grad u r-rata tal-fluss kienet 0.4 ml/min. L-aħjar fażi mobbli kienet tikkonsisti f'ilma (A) (li fih 0.1 fil-mija aċidu formiku) u aċetonitrile (B). Il-kundizzjonijiet ottimizzati tal-eluzzjoni tal-UPLC għall-analiżi tas-serum kienu 0 3 min, 95 fil-mija 55 fil-mija A; 4 13 min, 55 fil-mija 5 fil-mija A; 13 14 min, 5 fil-mija A. L-awtosampler inżamm f'4 gradi.

L-ispettrometrija tal-massa twettqet bl-użu ta' Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), quadrupole, u trometru tal-massa tandem tal-ħin tat-titjira ta' aċċelerazzjoni ortogonali. Leucine-enkephalin intuża bħala l-massa tal-lock li tiġġenera [M plus H]^plusjone (m/z 556.2771) u [MH]^-jone (m/z 554.2615) f'modi pożittivi u negattivi, rispettivament. Il-konċentrazzjoni ta' leucine-enkephalin kienet 200 pg/ml u r-rata tal-fluss tal-infużjoni kienet 100 ul/min biex tiġi żgurata l-eżattezza waqt l-analiżi MS permezz ta' pompa tas-siringa. Id-dejta nġabret fil-modalità taċ-ċentru minn 100 sa 1,000 m/z. Kemm għall-modi ta 'electrospray pożittivi kif ukoll negattivi, il-vultaġġ kapillari u tal-koni kien issettjat għal 3.0 kV u 30 V, rispettivament. Il-gass tad-desolvazzjoni ġie ssettjat għal 600 L/hr f'temperatura ta '350 grad, il-gass tal-koni ġie ssettjat għal 50 L/hr u t-temperatura tas-sors ġiet issettjata għal 120 grad. Ir-rata ta 'akkwist tad-dejta ġiet issettjata għal 30 ms, b'dewmien interscan ta' 0.02 s.

Barra minn hekk, 10 kampjuni tas-serum ġew magħżula b'mod każwali minn kull grupp u mħallta flimkien bħala l-kampjuni tal-kontroll tal-kwalità (QC), rispettivament. Il-kampjun QC intuża biex jottimizza l-kundizzjoni ta 'UPLCQTOF/MS, peress li kien fih il-biċċa l-kbira tal-informazzjoni tal-kampjun kollu. Il-kampjuni tal-QC ġew injettati sitt darbiet fil-bidu tal-ġirja sabiex tiġi kkundizzjonata jew ekwilibrata s-sistema u mbagħad kull 10 kampjuni biex tissorvelja aktar l-istabbiltà tal-analiżi. Kull jum, wara li l-istrument ġie kkalibrat, il-kampjun QC l-ewwel ġie analizzat biex tittestja l-istabbiltà tal-istrument sabiex tiġi żgurata l-prestazzjoni konsistenti tas-sistema.

L-akkwist tad-dejta u l-analiżi kollha tad-dejta kienu kkontrollati mis-softwer Waters MassLynx v4.1. Il-matriċi tad-dejta multivarjata ġiet analizzata bis-softwer EZinfo 2. 0 (Waters Corp.). Il-parametri ewlenin jinkludu medda ta' ħin ta' żamma 0 14 min; proporzjon tal-massa m/z 100 1,000, medda ta' tolleranza tal-massa 0.{{10}}1 Da, limitu tal-ogħla intensità 50, tieqa tal-kwalità 0.05 Da, żamma twieqi tal-ħin 0.20 min, u skoperta awtomatika ta '5 fil-mija għoli massimu u storbju. L-intensità ta 'kull jone ġiet normalizzata fir-rigward tal-għadd totali tal-joni biex tiġġenera matriċi tad-dejta li kienet tikkonsisti fil-ħin ta' żamma, il-valur m/z, u ż-żona tal-quċċata normalizzata.

Il-matriċi tad-dejta riżultanti ġew introdotti fis-softwer EZinfo 2.0 għall-analiżi tal-komponenti prinċipali, analiżi diskriminanti parzjali tal-inqas kwadri (PLS-DA), u analiżi tal-projezzjoni ortogonali għal strutturi latenti (OPLS-DA). Mill-OPLS-DA, diversi metaboliti setgħu jiġu identifikati bħala responsabbli għas-separazzjoni bejn il-grupp ta 'kontroll u l-grupp mudell u għalhekk tqiesu bħala markaturi potenzjali. Markers potenzjali ta 'interess ġew estratti minn S-plots mibnija wara analiżi b'OPLS-DA, u varjabbli li kellhom kontribuzzjonijiet sinifikanti għad-diskriminazzjoni bejn il-gruppi ġew soġġetti għal aktar identifikazzjoni tal-formula molekulari.

L-importanza varjabbli (VIP) fil-valur tal-projezzjoni hija somma peżata ta 'kwadri tal-piżijiet PLS, u l-varjabbli b'VIP> 1 tqiesu li huma influwenti għas-separazzjoni tal-kampjuni fil-plots tal-punteġġ iġġenerati mill-analiżi OPLS-DA. Fl-esperimenti kollha, il-livell ta' kunfidenza ġie stabbilit għal 95 fil-mija biex jiddetermina s-sinifikat tad-differenza (p < .{10}}5).="" dawk="" il-varjabbli="" eventwalment="" ġew="" magħżula="" bħala="" bijomarkaturi="" potenzjali.="" il-plots="" tal-punteġġ="" pls-da="" ġew="" deskritti="" mill-parametru="" ta="" 'validazzjoni="" inkroċjata="" r2y="" u="" q2,="" li="" jirrappreżenta="" l-varjazzjoni="" spjegata="" totali="" għall-matriċi="" x="" u="" l-prevedibbiltà="" tal-mudell,="" rispettivament.="" mudelli="" eċċellenti="" jinkisbu="" meta="" l-valuri="" kumulattivi="" ta="" 'r2y="" u="" q2="" huma="" 'l="" fuq="" minn="" 0.8.="" id-distanzi="" relattivi="" bejn="" il-gruppi="" ta="" 'amministrazzjoni="" u="" l-grupp="" ta'="" kontroll="" mill-plott="" tal-punteġġ="" pls-da="" ġew="" ikkalkulati="" bil-valur="" medju="" (assi="" x="" u="" assi="" y)="" tal-kampjuni="" kollha="" tal-grupp="" ta="" 'kontroll="" bħala="" l-punt="" ta'="">

Il-metaboliti potenzjali magħżula ġew identifikati skont id-determinazzjoni tal-m/z preċiż, il-ħin ta 'ritenzjoni, u l-framment u l-mudell MS/MS tipiku tal-bijomarkaturi potenzjali hawn fuq, li nkisbu fil-modi tal-jone pożittiv u negattiv. Il-kostruzzjoni tal-mogħdija metabolika twettqet b'Metabo Analyst, li hija għodda bbażata fuq il-web għall-viżwalizzazzjoni tal-metabolomika (https://www.metaboanalyst.ca/) ibbażata fuq sorsi ta' database inkluż il-KEGG (HTTP: // www.genome). .jp/kegg/) u d-databases tal-HMDB (http://www.hmdb.ca/) għat-tiftix. Il-ħin ta 'żamma u l-framment u l-mudell MS/MS tipiċi kellhom vantaġġ kbir biex inaqqsu l-firxa ta' molekuli possibbli.

Acteoside f'Cistanche jista 'jtejjeb il-funzjoni tal-kliewi

3|RIŻULTATI

Ikklikkja hawn għal informazzjoni dwar il-Parti II (riżultati) ta' dan l-artikolu.

Estratt minn: 'Prodott naturali ta'acteosideittejjebkorriment fil-kliewifil-ġrieden tad-dijabete db/db u ċelluli HK-2 permezz tar-regolazzjoni NADPH/oxidase-TGF-/Smad signaling pathway' -----minn Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

----Riċerka dwar il-Fitoterapija. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196