Strateġija ġdida għall-iskrinjar ta' Komponenti Attivi f'Cistanche Tubulosa Ibbażata fuq Analiżi ta' Relazzjoni Spettru-Effett U Farmakoloġija tan-Netwerk Ⅱ

3. Riżultati u Diskussjoni

3.1. Marki tas-swaba' HPLC

3.1.1. Validazzjoni tal-Metodu

Il-validazzjoni għall-metodu HPLC wriet li d-devjazzjoni standard relattiva (RSD) għall-preċiżjoni tal-metodu, ir-riproduċibbiltà u l-istabbiltà kienet inqas minn 2.85 fil-mija għaż-żona tal-quċċata relattiva (n = 11) u 0.77 fil-mija għall-ħin ta' żamma relattiv (n = 11). Il-preċiżjoni tal-istess soluzzjoni tal-kampjun dehret fil-medda ta' 0.05–{{10}}.77 fil-mija għal ħin relattiv u 0.28– 2.70 fil-mija għall-erja relattiva tal-qċaċet komuni. Ir-riproduċibbiltà tal-esperiment kienet fil-medda ta' 0.03–0.20 fil-mija għall-ħin relattiv u 0.23–2.59 fil-mija għall-erja relattiva tal-qċaċet komuni. L-istabbiltà tal-kampjun kienet 0.09-0.24 fil-mija għall-ħin relattiv ta 'żamma u 0.75-2.85 fil-mija għaż-żona relattiva tal-qċaċet komuni. Dawn ir-riżultati indikaw li l-marki tas-swaba' stabbilita kienet sodisfatta. Ir-relazzjonijiet lineari għall-aċidu ġeniposiku,echinacoside, acteoside, tubuloside A, uisoacteosidehuma murija fit-Tabella S4. Il-valur ta' R kwadru kien 1.0000, li jindika linearità tajba. Ir-riżultati tal-irkupru tal-kampjuni wrew li l-irkupri medji ta 'aċidu ġeniposiku, echinacoside,acteoside, tubuloside A, uisoacteosidekienu 100.37 fil-mija, 103.59 fil-mija, 98.46 fil-mija, 100.81 fil-mija, u 101.19 fil-mija, u l-RSD għall-irkupri tal-kampjuni kien inqas minn 2.68 fil-mija.

Ikklikkja Hawnhekk biex Ikseb aktar dettalji dwar il-Komponenti Attivi ta' Cistanche

3.1.2. Żona tal-Ogħla (PA) u Ħin ta' Żamma Relattiva (RRT)

Il-marki tas-swaba 'referenza u l-marki tas-swaba' ta 'HMs, WEs, u HRs minn 11-il lott ta' C. tubulosa huma ppreżentati fil-Figura 2. Ħdax-il quċċata, li wrew separazzjoni u riżoluzzjoni tajba, ġew identifikati bħala qċaċet komuni fost HMs, WEs u HRs. Il-ħames komposti standard ġew identifikati bħala aċidu ġeniposiku (A2),echinacoside(A8),acteoside (A9), tubulosideA (A10), uisoacteoside(A11). Il-kompost standard,echinacoside, li kien preżenti fil-kromatogrammi kollha (ħin medju ta' żamma ta' 12.86 min) b'erja ta' quċċata xierqa u stabbiltà tajba, intgħażlet bħala l-quċċata ta' referenza u użata biex tikkalkula l-ħinijiet ta' żamma relattivi (RRTs) tal-għaxar l-oħra qċaċet komuni. L-RRTs ta' dawn il-forom differenti huma fil-medda 0.16–1.51. Il-PA u l-koeffiċjent ta' varjanza (CV fil-mija) ta' dawn il-qċaċet komuni huma elenkati fit-Tabelli S5–S7. Mid-dejta, il-valuri fil-mija tas-CV għal PA f'diversi forom huma 25.78 fil-mija -142.02 fil-mija, 23.36 fil-mija -150.38 fil-mija, u 28.91 fil-mija -112.78 fil-mija għal HMs, WEs, u HRs, rispettivament. Dawn ir-riżultati juru differenzi sinifikanti fil-konċentrazzjoni ta 'kull wieħedCistanche tubulosakompost fost il-forom differenti. Il-marki tas-swaba' ta' HMs, WEs, u HRs huma murija fil-Figura 3.

Figura 2 Marki tas-swaba' HPLC ta' kampjuni standard

3.1.3. Kontenut ta' HMs, WEs, u HRs

Ħames kostitwenti standard ta 'C. tubulosaġew imkejla. Il-kontenuti tal-komponenti ewlenin huma murija fit-Tabella 1. Il-paragun bejn HMs, WEs, u HRs jidher fit-Tabella 2 u l-Figura 4. PhGs f'C. tubulosa huma bijoloġikament attivi iżda termosensittivi. Komponenti sensittivi għas-sħana li jinħall fl-ilma jistgħu jiġu estratti b'mod effiċjenti bl-użu ta 'metodu raġonevoli. Ġeneralment, Cistanche herba tiġi estratta bl-ilma u mbagħad evaporata f'soluzzjoni kkonċentrata għall-analiżi kimika li ġejja [26, 27, 30]. Wara l-estrazzjoni u l-konċentrazzjoni, intużat it-teknoloġija tat-tnixxif bl-isprej u l-proċedura ġiet modifikata mill-artikolu preċedenti. L-ilma tneħħa malajr mill-fwar likwidu, u mbagħad inkisbu estratti niexfa ta 'materja prima mill-pjanti. F'dan il-pass, iż-żieda ta 'maltodextrin hija kkunsidrata bħala trasportatur komuni biex ittejjeb it-tixrid u jestendi l-ħin tal-ħażna. Permezz ta 'serje ta' proċessi ta 'manifattura, pjanti erbali mbagħad ġew ippressati fi granuli ta' formula b'addittivi. Dan il-pass ta 'żieda ta' eċċipjenti ma kienx inkluż fl-esperiment. B'mod ġenerali, il-proċess ta 'produzzjoni tagħna jinkludi estrazzjoni, konċentrazzjoni u tnixxif bl-isprej, kif deskritt fit-Taqsima 2.2, b'mod parallel ma' proċess ta 'produzzjoni tal-granuli tal-formula. Sabiex jiġu prodotti dawn il-prodotti nofshom lesti, it-tliet passi ta 'hawn fuq għandhom jiġu segwiti. Il-proċedura tal-formazzjoni tal-WEs tinvolvi konċentrazzjoni u tnixxif bl-isprej, li faċilment jikkawżaw it-telf ta 'komponenti termosensittivi, iżda HRs jinkisbu wara l-estrazzjoni u t-tnixxif tal-HMs. Aħna nistaqsu jekk huwiex possibbli li l-komponenti attivi jibqgħu fl-HRs. Skont ir-riżultati tagħna, il-kontenut ta 'verbascoside naqas b'mod sinifikanti minn HMs għal WEs u HRs ( u , rispettivament). L-istabbiltà termali tal-verbascoside hija investigata billi jiġu mmonitorjati l-bidliet fiż-żona tal-quċċata permezz tal-HPLC matul il-proċess tat-tisħin. Wara t-tisħin għal 4 sigħat, jitħalla 41.6 fil-mija ta 'verbascoside. Tindika li verbascoside huwa termosensittiv [31]. Isoacteoside, tubuloside A, u echinacoside f'WEs baqgħu stabbli wara proċeduri ta 'proċessar kumplessi. Matul il-proċess ta 'tnixxif fit-tul, l-akkumulazzjoni ta' PhGs uriet tnaqqis sinifikanti, li jista 'jiġi attribwit għad-degradazzjoni termali ta' dawn il-komponenti termosensittivi [32]. F'termini tal-komponenti fil-mira l-oħra, HRs u WEs ma kinux differenti b'mod sinifikanti ħlief għal verbascoside. Il-fehim tagħna ta 'din id-differenza se jippermettilna niżviluppaw standards ta' kwalità aħjar għall-ħmieġ tal-ħxejjex fil-futur u navvanzawhom fi prodotti.

Tabella 1 Kontenut ta' 11-il lott ta' C. tubulosa

Tabella 2 Tqabbil tal-kontenut tal-komponenti ewlenin (n = 11).

,

Figura 4 Determinazzjoni tal-kontenut ta' ħames komponenti minn forom differenti (n = 11). , ns: mhux sinifikanti.

3.1.4. Analiżi ta' Xebh tal-Marki tas-Swaba'

Ix-xebh fost it-tliet gruppi ta 'C. tubulosa ġew evalwati. Il-valuri ta' xebh bejn il-materjal tal-ħxejjex-ilma, il-materjal tal-ħxejjex-fdal tal-ħxejjex, u l-valuri ta' xebh tal-estratt tal-ilma-residwu tal-ħxejjex kienu fil-meded 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995, u 0.938–1.000, rispettivament (Tabella 3).

Tabella 3 Xebh ta' HM-WE, HM-HR, u WE-HR għal 11-il lott ta' C. tubulosa.

3.2. Riżultati tat-Test tal-Attività Antiossidanti

L-attivitajiet antiossidanti tal-forom varji ta 'C. tubulosa ġew determinati bl-użu tal-analiżi tal-kapaċità ta' DPPH, , u scavenging, u r-riżultati rilevanti huma ppreżentati fil-Figura 5. Fit-Tabella S8, il-firxiet għad-DPPH, u r-riżultati tal-assaġġ tal-kapaċità ta 'scavenging kienu { {2}}.04–37.80, 0.98–843.90, u 0.32–27.65 mg/mL għat-tliet forom differenti fost il-11-il lott ta' C. tubulosa. Fi tliet testijiet ta 'attività antiossidanti, HMs u WEs urew attività ta' inibizzjoni mill-qrib, filwaqt li HRs wrew l-iktar inibizzjoni dgħajfa.

Il-WEs imnixxfa bl-isprej instabu li juru attivitajiet sinifikanti anke f'konċentrazzjonijiet baxxi. Rapport preċedenti indika li Vernonia amygdalina WE imnixxfa bl-isprej kisbet 50 fil-mija ta' inibizzjoni ta' scavenging f'0.17 mg/mL [33]. L-applikazzjoni ta 'ħinijiet twal ta' estrazzjoni u temperaturi għoljin hija xabla b'żewġ truf. Min-naħa waħda, iż-żieda fil-ħin tal-estrazzjoni u t-temperatura tad-daħla tat-tnixxif bl-isprej ttejjeb ir-rendiment u l-effiċjenza. Barra minn hekk, l-estratti jiksbu attività antiossidant qawwija u konċentrazzjonijiet ogħla ta 'komponenti bijoloġiċi minn dawk il-pjanti [34]. Min-naħa l-oħra, l-arja tad-dħul sħuna eċċessivament tiddegrada l-komposti bijoattivi. Tali temperaturi elevati tad-dħul ta 'l-arja wasslu għal telf ta' attività ta 'estratt ta' Bidens pilosa antiossidant u kienu attribwiti għal tnaqqis fil-komposti fenoliċi [35]. Ir-riżultati preżenti huma konsistenti mar-rapport imsemmi hawn fuq. Pereżempju, il-WE f'S6 wera abbiltajiet inibitorji radikali aktar dgħajfa kemm minn HM kif ukoll minn HR. Barra minn hekk, HR f'S5 wera kapaċitajiet aktar b'saħħithom ta' tneħħija tal-anjoni DPPH u superoxide minn HM u WE. L-istruttura tal-PhGs tikkonsisti f'bonds glikosidiċi u gruppi aċetil li huma idrolizzati faċilment taħt azzjoni enżimatika jew dekomposti f'temperaturi għoljin. Dawn ir-reazzjonijiet jistgħu jammontaw għal tnaqqis f'xi komponenti ewlenin matul il-produzzjoni fuq skala kbira. Madankollu, l-idroliżi jew iżomerizzazzjoni ta 'ċerti komponenti jistgħu jaċċelleraw is-sintesi ta' komponenti oħra. Trasformazzjonijiet bħal dawn huma komuni meta jiġu pproċessati ħwawar Cistanches [36-38]. PhGs li jinħallu fl-ilma jimplika li l-biċċa l-kbira tal-komponenti bijoloġiċi jistgħu jiġu utilizzati permezz tal-estrazzjoni tal-ilma. L-argument li l-maġġoranza tal-komponenti attivi jibqgħu f'WEs ilha tippersisti għal għexieren ta 'snin, għalhekk jidher raġonevoli li wieħed jassumi li l-materjali residwi mxarrbin jistgħu jintremew wara l-estrazzjoni. Madankollu, mhux korrett li l-HRs ta' C. tubulosa jitqiesu bħala skart. Ir-riċerkaturi jindikaw li PhGs huma instabbli, u huma suxxettibbli għal degradazzjoni enżimatika jew idrolitika [39]. Reazzjonijiet ta' idroliżi jew isomerizzazzjoni li jikkontribwixxu għal tnaqqis fl-ingredjenti bijoloġiċi fi ħdan il-fitomediċini matul l-ipproċessar jistgħu fl-istess ħin jippreżentaw opportunitajiet ġodda għall-isfruttament tal-HRs. Billi jikkonvertu metodi ta 'estrazzjoni tradizzjonali, ir-residwi mediċinali jistgħu jiġu żviluppati u utilizzati b'mod aktar effettiv. Twettqet idroliżi enżimatika biex tikkonverti r-residwu tal-ġinseng Panax f'zokkor mono. Ir-rendimenti tal-polisakkaridi u l-ġinsenosidi żdiedu, bħaz-zokkor, l-aċidu suċċiniku, il-polisakkaridi tal-ġinseng u l-ġinsenosidi [40]. Ir-residwi ta' Sophora flavescens jiġu estratti mill-ġdid b'mewġ ultrasoniku bl-aċetat tal-etil [41]. It-teknoloġiji aġġornati għall-użu tar-residwi tal-ħxejjex huma miġbura fil-qosor minn Huang et al. [42].

Ibbażat fuq ir-riżultati tal-PLSR u l-BCA, l-aqwa ħames qċaċet ta 'forom differenti ġew skrinjati bl-użu tal-analiżi DPPH, anjoni superossidu, u idroksil radikali biex jiġu identifikati l-aktar qċaċet importanti. Ir-riżultati huma illustrati fil-grafika Venn (Figura 7). A2, A6, A8, u A10 huma l-qċaċet komuni li huma kondiviżi minn HM, WE, u HR (Figuri 7(a) u 7(c)) fl-assaġġi ta’ scavenging radical anion superoxide u hydroxyl, filwaqt li HM, WE, u HR jaqsmu l-ebda qċaċet ta 'assay DPPH. Sadanittant, il-mudelli BCA juru li A1, A2, A3, u A6 huma l-qċaċet komuni kondiviżi minn HM, WE, u HR (Figuri 7(d)–7(f)). Notevolment, il-koinċidenzi fid-dijagramma Venn jindikaw li l-mudell BCA jidher aktar adattat mill-mudell PLSR, l-ewwel juri aktar ripetizzjoni. Il-koeffiċjenti tal-mudell BCA u l-valuri IC50 tal-kapaċità antiossidanti ġew analizzati permezz ta 'RDA. Kif l-RDA murija fil-Figura 8, A1, A3, u A6 minn HM u HR huma relatati b'mod pożittiv ma 'l-indiċi antiossidanti, ħlief li A3 huwa relatat b'mod negattiv mal-kapaċità ta' scavenging radical hydroxyl. A1 u A6 minn WE għandhom korrelazzjonijiet qawwija ma 'DPPH u l-anjoni superossidu. Il-qċaċet A6 innutati mill-forom varji juru l-aktar konnessjoni b'saħħitha mal-DPPH, l-anjoni superossidu, u s-radikali hydroxyl. A1 u A3 juru wkoll konnessjoni simili.

Figura 7

Dijagrammi Venn tal-mudell PLSR u BCA: (a) Assaġġ DPPH. (b) assaġġ ta' tneħħija. (c) l-assaġġ ta 'scavenging ġew analizzati mill-mudell PLSR. (d) Assaġġ DPPH. (e) assaġġ ta' scavenging. (f) l-assaġġ ta 'scavenging ġew analizzati mill-mudell BCA. Is-sezzjoni li tikkoinċidi kienet il-frak tal-qċaċet komuni minn HM, WE, u HR.

3.4. Analiżi Ibbażata fuq il-Farmakoloġija tan-Netwerk

3.4.1. Kostruzzjoni ta' CT Network

Total ta' 4359 mira relatati mal-attività antiossidanti nkisbu mid-database GeneCards u mid-database OMIM. Fl-istess ħin, il-komponenti attivi ġew skrinjati mid-database TCMSP u mid-database SwissTargetPrediction. Imbagħad, inġabru u standardizzati 198 mira permezz tad-database UniPort. Kien hemm 159 ġeni fil-mira kondiviżi minn komponenti attivi u mard relatat mal-antiossidanti (ara Figura S1). In-netwerk CT inbena biex juri l-korrelazzjoni bejn il-komposti u l-miri ewlenin tal-ġeni (Figura 9).

Figura 9 Netwerk CT. In-netwerk wera l-korrelazzjoni bejn il-komponenti attivi u l-miri ewlenin tal-ġeni.

3.4.2. Kostruzzjoni tan-Netwerk tal-PPI u Screening tal-Miri Ewlenin

PPI ġie viżwalizzat bl-użu tad-database STRING (Figura 10). In-netwerk kien jinkludi 159 node u 2528 truf. Fin-netwerk ta 'interazzjoni kollu, il-komponenti ta' konnessjoni jew in-nodi b'aktar punti fil-mira jistgħu jkunu l-komponent ewlieni jew il-ġene fil-mira li għandu rwol antiossidant f'C. tubulosa. Ir-riżultati ġew imniżżla u introdotti f'Cytoscape għall-viżwalizzazzjoni. Iktar ma jkun għoli l-valur DC, iktar ikun skur il-kulur, u iktar ikun kbir il-valur tal-punteġġ magħqud, iktar ikun eħxen it-tarf. Sibna li RAC-alpha serine/threonine-protein kinase (AKT1), interlukin-6 (IL6), fattur tan-nekrożi tat-tumur (TNF), u fattur tat-tkabbir endoteljali vaskulari A (VEGFA) kienu jinsabu ċentralment (Figura 11), li jindika li kienu miri ewlenin meta komponenti attivi eżerċitaw effett antiossidant. Huwa rrappurtat li l-echinacoside inaqqas id-disfunzjoni mitokondrijali permezz tar-regolamentazzjoni ta 'proteina kinases attivati ​​minn mitoġenu (MAPK) u AKT u l-forom fosforilati tagħhom [43]. Ir-riċerkaturi spekulaw li l-effett antidijabetiku tal-glikosidi ta 'C. tubulosa jista' jkun dovut għall-attività antiossidant tal-PhGs billi jirregolaw iċ-ċitokini proinfjammatorji, bħal IL-6 u TNF- [44]. Barra minn hekk, echinacoside jista 'jfixkel it-tkabbir taċ-ċelluli tal-kanċer tal-ovarji billi jirregola l-espressjoni ta' VEGFA biex jinibixxi l-anġjoġenesi [45], li hija korrelata mill-qrib mas-sistema ROS għal ROS jinduċi l-espressjoni ta 'sinjalazzjoni VEGF [46].

Figura 10 Netwerk PPI.

3.4.3. Analiżi ta' Arrikkiment u Stabbiliment tan-Netwerk tas-CTP

Il-komposti antiossidanti potenzjali aġixxew fuq bosta funzjonijiet bijoloġiċi, inklużi BP, CC, u MF. Fil-Figura 12(a), l-aqwa 10 mogħdijiet huma murija. Il-miri mbassra min-netwerk PPI wieġbu prinċipalment għal ħafna proċessi bijoloġiċi, bħal komposti ċikliċi organiċi, stimolu ksenobijotiku, sustanzi inorganiċi, livelli ta 'ossiġnu, u regolazzjoni pożittiva tal-moviment tal-komponent ċellulari. L-analiżi tal-komponenti ċellulari wriet li l-ġeni kienu prinċipalment relatati maċ-ċattra tal-membrana, il-matriċi extraċellulari, il-lumen tal-granuli sekretorji, il-kumpless tar-regolatur tat-traskrizzjoni u l-parti apikali taċ-ċellula. Dawn il-miri huma involuti wkoll f'ħafna funzjonijiet molekulari, inkluż it-twaħħil tal-fattur tat-traskrizzjoni li jgħaqqad id-DNA, l-attività ta 'omodimerizzazzjoni tal-proteini, l-irbit speċifiku tad-dominju tal-proteini, u t-twaħħil tar-riċettur taċ-ċitokini.

Figura 12 Analiżi ta' arrikkiment: (a) Analiżi ta' arrikkiment GO. (b) Analiżi ta' arrikkiment KEGG.

Biex tinvestiga l-funzjonijiet bijoloġiċi ta 'dawn iċ-ċentri ewlenin, saret analiżi ta' arrikkiment tal-mogħdija. Mir-riżultati tal-arrikkiment tal-KEGG, inġibdet dijagramma tal-bużżieqa biex turi l-aqwa 20 mogħdija. Iktar ma kien kbir il-post, aktar ġew inklużi ġeni fil-mogħdija. Kif muri fil-Figura 12(b), il-mogħdijiet ewlenin ta 'C. tubulosa kienu relatati ma' mogħdijiet fil-kanċer, lipidi u aterosklerożi, mogħdija ta 'sinjalazzjoni AGE-RAGE f'kumplikazzjonijiet dijabetiċi, karċinoġenesi kimika-attivazzjoni tar-riċettur, u mogħdija ta' sinjalazzjoni MAPK. Effetti ta 'C. tubulosa fuq l-apoptożi u l-omeostażi redox ċellulari ġew investigati. Id-dejta tissuġġerixxi li C. tubulosa jista' jkun kandidat promettenti għal terapija kontra l-kanċer tal-kolon [47]. L-estratt ta' C. deserticola jinstab f'nies ta' età [48].

Il-Figura 13 turi l-korrelazzjoni bejn il-mogħdijiet u l-miri relatati tagħhom u r-relazzjoni bejn il-ġeni fil-mira li jikkoinċidu u l-komponenti bijoloġikament attivi ta 'C. tubulosa. Ġiet ġġenerata ħarsa globali tan-netwerk tas-CTP, li kienet tikkonsisti fi 12-il ingredjent, 159 mira, u 20 mogħdija. Ħafna mill-miri kienu kondiviżi mill-komposti attivi kandidati. Dawn l-ingredjenti attivi kandidati bi gradi għolja ta' interkonnessjoni kienu responsabbli għall-interkonnettività għolja tan-netwerk CTP, speċjalment quercetin (grad = 131). Il-maġġoranza tal-miri, bħal AKT1, IL6, TNF, u VEGFA, ġew immappjati għal mogħdijiet KEGG assoċjati ma 'mogħdijiet fil-kanċer.

Figura 13 Netwerk tas-CTP.

4. Konklużjonijiet

F'dan l-istudju, aħna primarjament ippruvajna sitwazzjonijiet kumplessi meta kkunsidraw ir-relazzjonijiet tal-ispettru-effett fost HM, WE, u HR ta 'C. tubulosa. Il-marki tas-swaba' HPLC uanaliżi antiossidantiġew użati biex jidentifikaw id-differenzi bejn Hs, WEs, u HRs taC. tubulosa. Skont il-marki tas-swaba' HPLC, 11-il quċċata kienu komuni fost il-11-il lott ta' Hs, WEs, u HRs. Aċidu ġeniposiku,echinacoside, verbascoside, tubuloside A, uisoacteosideġew identifikati fost dawn il-qċaċet. Il-kontenut ta' dawn il-ħames komponenti ġew determinati. Barra minn hekk, l-effetti antiossidanti tal-C. tubulosaHs, WEs, u HRs varjaw minħabba l-alterazzjonijiet fil-kompożizzjonijiet kimiċi kkawżati minn kundizzjonijiet kumplessi tal-manifattura. Ibbażat fuq mudelli statistiċi diversifikati, l-istudju dwar ir-relazzjoni tal-ispettru-effett indika li l-quċċata A6 jista’ jkun l-aktar komponent deċiżiv fost it-tliet forom ta’C. tubulosa. L-istudju kien ibbażat fuq il-farmakoloġija tan-netwerk biex jesplora mekkaniżmi potenzjali ta 'C. tubulosafuqantiossidazzjonipermezz ta 'screening ta' komposti, tbassir ta 'miri ewlenin, kostruzzjoni ta' netwerks, u twettiq ta 'analiżi ta' arrikkiment. Ir-riżultati tagħna jipprovdu bażi teoretika għar-riċiklaġġ tar-residwi tal-ħxejjex u l-potenzjal ta 'C. tubulosafit-trattament tamard relatat mal-antiossidanti.