Peptide Derivat ta' Netrin-1-Ġdid Ittejjeb il-Protezzjoni Kontra Mewt Newronali U Jtaffi l-Emorraġija Intraċerebrali fil-Ġrieden Parti 1

Astratt:

Ġie rrappurtat li Netrin-1 huwa involut fin-newroprotezzjoni wara korriment lis-sistema nervuża ċentrali. Madankollu, id-dominju funzjonali minimu ta' Netrin-1 li jista' jippreserva n-newroprotezzjoni iżda jevita l-effetti sekondarji ewlenin ta' Netrin jibqa' elużiv.

Is-sistema nervuża ċentrali hija waħda mis-sistemi nervużi l-aktar importanti fil-ġisem tal-bniedem, li tikkontrolla l-ħsieb, is-sentimenti u l-azzjonijiet tan-nies. Meta s-sistema nervuża ċentrali tkun bil-ħsara, il-memorja tan-nies tkun affettwata wkoll. Imma tinkwetax, nistgħu nieħdu xi modi pożittivi biex ngħinu biex nirrestawraw il-memorja.

L-ewwel, trid tifhem l-impatt tal-ħsara fil-memorja. Il-ħsara lis-sistema nervuża ċentrali tista 'taffettwa l-kapaċitajiet konjittivi tan-nies, il-proċessi tal-ħsieb u l-attenzjoni, li kollha jaffettwaw direttament il-memorja tan-nies. Barra minn hekk, ħsara lis-sistema nervuża ċentrali tista 'wkoll tikkawża instabbiltà emozzjonali, u tagħmel lin-nies aktar suxxettibbli għall-paniku, ansjetà u dipressjoni, u b'hekk jaffettwaw l-irkupru tal-memorja.

Madankollu, għalkemm il-ħsara lis-sistema nervuża ċentrali tista 'ġġib xi effetti negattivi, nistgħu nieħdu xi miżuri pożittivi biex nippromwovu l-irkupru tal-memorja. L-ewwel, nistgħu nippruvaw xi taħriġ konjittiv, bħal qari, kitba, u soluzzjoni ta 'puzzles. Dawn l-attivitajiet jistgħu jistimulaw il-moħħ biex jipproduċi newroni ġodda u jgħinu lill-moħħ jibni memorji u modi ġodda ta 'ħsieb.

It-tieni nett, nistgħu wkoll nippromwovu l-irkupru tal-memorja permezz ta 'xi eżerċizzju fiżiku. Studji wrew li eżerċizzju xieraq jista 'jistimula l-moħħ biex jipproduċi newroni ġodda u konnessjonijiet newronali u jippromwovi l-ipproċessar tal-moħħ ta' informazzjoni ġdida. Huwa għalhekk li xi nies f'daqqa waħda joħorġu b'idea tajba jew isolvu problema diffiċli waqt li jkunu qed jiġru jew jimxu.

Fl-aħħarnett, irridu nagħtu attenzjoni għar-rwol tal-konsum nutrittiv korrett fuq il-memorja. Il-funzjonament normali tal-moħħ jeħtieġ xi nutrijenti meħtieġa, bħal proteini, vitamini, u oligoelementi. Jekk l-ikel tagħna m'għandux dawn in-nutrijenti, se jaffettwa l-memorja tagħna u l-ħila tal-ħsieb. Għalhekk, għandna nagħżlu xi ikel rikk f'dawn in-nutrijenti fid-dieta tagħna, bħal ħut, laħam dgħif, ħaxix, u frott.

Fil-qosor, il-ħsara lis-sistema nervuża ċentrali se jkollha ċertu impatt fuq il-memorja tan-nies, iżda nistgħu nippromwovu l-irkupru tal-memorja permezz ta 'taħriġ konjittiv xieraq, eżerċizzju fiżiku u kontroll tad-dieta. Nittama li kulħadd jista 'jiffaċċja l-isfidi fil-ħajja b'mod pożittiv, iżomm attitudni ottimista, u jistinka biex jirrestawra sistema nervuża ċentrali b'saħħitha u memorja tajba. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche jista' jtejjeb il-memorja b'mod sinifikanti minħabba li Cistanche hija mediċina tradizzjonali Ċiniża b'ħafna effetti uniċi, li wieħed minnhom huwa li jtejjeb il-memorja. L-effikaċja ta 'Cistanche ġejja mid-diversi ingredjenti attivi li fih, inkluż aċidu tanniku, polisakkaridi, glikożidi flavonojdi, eċċ., Li jistgħu jippromwovu s-saħħa tal-moħħ f'ħafna modi.

Ikklikkja Kun af biex ittejjeb il-memorja għal żmien qasir

Hawnhekk, investigajna l-effett newroprotettiv ta' peptide E1 derivat mid-dominju EGF3 ta' Netrin-10 (residwi 407–422). Sibna li jinteraġixxi ma 'karċinoma tal-kolorektum imħassar (DCC) biex jattiva l-fosforilazzjoni fokali ta' adeżjoni kinase li tesibixxi newroprotezzjoni.

L-amministrazzjoni tal-peptide E1 kienet kapaċi ttejjeb l-irkupru funzjonali permezz ta 'apoptożi mnaqqsa f'mudell murini sperimentali ta' emorraġija intraċerebrali (ICH).

Fil-qosor, aħna niżvelaw sekwenza funzjonali ta' Netrin-1 li hija involuta fil-proċess ta' rkupru wara l-ICH u nidentifikaw peptide kandidat għat-trattament tal-ICH.

Kliem ewlieni: emorraġija intraċerebrali; emina; newroprotezzjoni; Netrin-1; peptide.

1. Introduzzjoni

L-emorraġija intraċerebrali (ICH) hija sottotip ta' puplesija devastanti b'rata għolja ta' mortalità u morbidità [1-3] li tinvolvi qsim anormali tal-vini ċerebrali fil-moħħ [4,5].

It-tneħħija kirurġika tal-ematomi hija ppreferuta għall-kisba tal-emostasi u biex ittaffi l-pressjoni intrakranjali [6]. Madankollu, residwi ematiċi fdalijiet u prodotti tat-tqassim tad-demm xorta jistgħu jippromwovu korriment sekondarju fil-moħħ wara l-ICH, jinduċu ħsara newronali u jdewmu l-irkupru funzjonali [7-9].

Għalhekk, l-iżvilupp ta' strateġiji effettivi li jimmiraw għal ħsara newronali kkawżata minn korriment fil-moħħ sekondarju jkun ta' benefiċċju għat-trattament tal-puplesija. Netrin-1 hija waħda mill-aktar proteini studjati sew li jirregolaw il-gwida assonali u s-sinaptoġenesi [10-12] permezz ta' interazzjoni mar-riċetturi tagħha. imħassra fil-kanċer tal-kolorektum (DCC) u UNC5H (omologu mhux koordinat -5) biex jattiva s-sopravivenza, id-divrenzjar, u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli [13–15].

Ir-riċetturi jinduċu sinjal tal-mewt biex jimmedja l-apoptożi meta n-Netrin-1 ikun assenti [16]. Huwa magħruf li l-irbit ta 'Netrin-1 ma' DCC jirriżulta fid-dimerizzazzjoni ta 'DCC u jibda tyrosine 861 fosforilazzjoni ta' adhesionkinase fokali (FAK) biex jinduċi tkabbir tan-newrite u gwida assonali [17,18].

L-irbit ta' Netrin-1 ma' DCC jinvolvi d-dominju EGF3 ta' Netrin-1 u d-dominju FN5 ta' DCC fl-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar Netrin-1 [19,20]. Riċentement, Netrin-1 intwera li jeżerċita effetti neuroprotettivi f'reġjuni iskemiċi [21].

Il-livell ta' espressjoni tas-serum ta' Netrin-1, li jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli u jippromwovi r-riġenerazzjoni newronali, huwa korrelatat b'mod pożittiv mal-irkupru tal-pazjent minn puplesija iskemika [22,23].

Interessanti, it-trapjant ta' ċelluli staminali mesenkimali tal-mudullun li secreteNetrin-1 fin-nerv xjatiku tal-firien bil-ħsara jibda r-riġenerazzjoni assonali [24] u jnaqqas il-mewt tan-newroni tal-mutur [25]. Injezzjoni stereotassika tal-proteina Netrin-1 fil-ventrikoli tnaqqas il-mewt taċ-ċelluli tan-nervituri wara emorraġija subarachnoid permezz tal-attivazzjoni tas-sinjalar DCC/APPL1/AKT [26].

Polipeptide derivat mid-dominju EGF3 ta 'Netrin-1 (aċidi amminiċi 423-433) jattiva b'mod notevoli l-fosforilazzjoni ERK u jippromwovi l-produzzjoni ta' NO, li għandu effetti kardjoprotettivi [27,28]. Madankollu, Netrin-1 ġie identifikat bħala bijomarkatur potenzjali għat-tumuriġenesi [29–31] minħabba r-regolazzjoni tal-istatus tan-Netrin-1 misjub f'kanċer multipli derivati ​​mit-tessuti [32].

Meta Netrin-1 ikun marbut mar-riċettur DCC jew Unc5H tiegħu, ir-riċetturi jittrasduċi sinjal pożittiv li jwassal għal sopravivenza, infjammazzjoni, anġjoġenesi, u anti-apoptosis, li mbagħad jirregola t-tumoreġenesi [31].

Għalhekk, huwa importanti ħafna li jiġi identifikat id-dominju funzjonali minimu ta 'Netrin-1 li jista' jippreserva n-newroprotezzjoni u jevita l-effetti sekondarji ewlenin ta 'Netrin-1. Hawnhekk, sibna li l-peptide E1 (residwi 407–422), li huwa derivat mid-dominju EGF3 ta 'Netrin-1, jinteraġixxi ma' DCC biex jipproteġi n-newroni mit-tossiċità indotta mill-emin.

F'mudell sperimentali ta 'ġrieden ICH, l-applikazzjoni ta' peptide E1 tejbet l-irkupru funzjonali, kif determinat minn analiżi ta 'mġieba. Barra minn hekk, il-peptide E1 jista 'jipprevjeni li n-newroni jiddeġeneraw wara l-ICH.

Abbażi ta' dawn ir-riżultati, aħna identifikajna sekwenza funzjonali ta' Netrin-1 li hija involuta fl-irkupru wara l-ICH u ddeterminajna li dan il-peptide jista' jintuża għat-trattament tal-ICH.

2. Riżultati

2.1. Id-Dominju EGF3 Huwa Kritiku għall-Interazzjoni Netrin-DCC

Netrin-1 jikkonsisti f'dominju VI, tliet ripetizzjonijiet EGF, u dominju C-terminal [33]. L-istruttura tal-kristall tal-kumpless uman Netrin-1/DCC turi li d-dominju Netrin-1 EGF3 huwa kruċjali għall-interazzjoni Netrin-1/DCC, iżda mhux id-dominji EGF1 u EGF2 [34].

Il-mutaġenesi tar-residwi ewlenin tal-amino acids (His407, Gln442, jew Gln443) fid-dominju EGF3 ħarbat kompletament l-irbit ta' Netrin-1/DCC [19]. Id-dominji EGF1/2 huma meħtieġa għall-bidla tas-sinjalar attraenti f'sinjalar repulsiv meta Unc5 jikkoeżisti ma' DCC [20].

Għalhekk, l-ewwel iġġenerajna kostruzzjonijiet ta' tul sħiħ u EGF3-imħassar (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (Figura 1A) u esprimejna dawn il-kostruzzjonijiet b'mod temporanju f'ċelloli HEK293T ikkultivati ​​għal GSTpulldown .

L-irbit kien osservat għall-kostruzzjonijiet li esprimew Netrin-1 iżda mhux Netrin-1(∆407–443) (Figura 1C). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li d-dominju ta 'EGF3 li fih l-aminoaċidi 407–443 huwa responsabbli għall-interazzjoni ta' Netrin-1 mad-DCC. Biex tinvestiga r-rwol tad-dominju EGF3 f'Netrin-DCC, l-ewwel ippurifikajna myc-taggedNetrin{{12 }} jew Netrin maqtugħ-1 (∆407–443) (Figura 1B).

Sussegwentement, iċ-ċelluli HEK293T ġew trasfettati bi plasmid li jġorr id-DCC cDNA u inkubati mal-proteina Netrin-1, u mbagħad it-twaħħil ta 'Netrin-1 ġie vvalutat permezz ta' immunostaining.

Sibna li Netrin fit-tul sħiħ-1, iżda mhux Netrin maqtugħ-1, kien kapaċi jorbot ma 'DCC fil-membrana tal-plażma (Figura 1D). Biex niddeterminaw jekk id-dominju EGF3 jistax jinteraġixxi ma 'DCC, aħna ġġeneraw GST-EGF3construct biex niġbdu 'l isfel ċelluli lisati li jesprimu żżejjed DCC. Aħna osservajna rabta speċifika ta 'DCC ma' GST-EGF3 (Figura 1E).

Barra minn hekk, aħna sintetizzajna l-peptideEGF3 ittikkettat bil-FITC u kkonfermajna li, bħal Netrin full-length-1, kien kapaċi jorbot ma 'DCC fil-membrana tal-plażma (Figura 1F). Meħuda flimkien, id-dejta tagħna tindika li d-dominju EGF3 huwa responsabbli għall-interazzjoni ta' Netrin-1 mad-DCC.

2.2. Id-Dominju EGF3 Jinduċi Fosforilazzjoni ta' Mogħdijiet Downstream ta' Netrin-1

L-interazzjoni ta 'Netrin-1 u DCC jattiva mogħdijiet ta' sinjalazzjoni multipli, inklużi FAK, SFK, u ERK [16,35]. Focal adhesion kinase (FAK) hija waħda mill-attivitajiet ewlenin ta' tyrosinephosphorylation marbuta mas-sinjalar Netrin-1/DCC.

Netrin-1 jattiva FAKphosphorylation u Src family protein tyrosine kinases (SFKs) fosforilazzjoni [17]. Kemm il-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni FAK kif ukoll SFK għandhom rwol ċentrali fl-istadju ta' żvilupp tas-sistema nervuża u t-tiswija tal-korrimenti [36,37]. Barra minn hekk, Netrin-1 jista' jattiva l-kinase irregolata b'sinjal extraċellulari-1/2 (ERK1/2), li timmedja l-azzjoni tal-mogħdija ta' proteinkinase attivata minn Mitogen (MAPK) [38-40].

Biex ninvestigaw jekk id-dominju EGF3 huwiex kritiku għall-attivazzjoni ta' mogħdijiet ta' sinjalazzjoni downstream permezz tal-irbit ta' Netrin-1 ma' DCC, l-ewwel eżaminajna l-effett tad-dominju EGF3 fuq il-fosforilazzjoni tat-tyrosine 861 ta' FAK (Figura 2A) . Sibna li t-tħassir ta 'EGF3 inibixxi l-fosforilazzjoni ta' FAK fin-newroni tal-korsija koltivata (Figura 2B, C), u b'hekk ikkonferma rwol essenzjali għal EGF3 fil-mogħdija ta 'sinjalazzjoni Netrin-1.

Sussegwentement, in-newroni kortikali kkultivati ​​ġew stimulati bil-proteina GST-EGF3fusion għal 20 min, u western blotting ikkonferma aktar li t-trattament bil-proteina tal-fużjoni GST-EGF3 indotta FAK, ERK, u fosforilazzjoni SFK (Figura 2D-G).

Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li d-dominju EGF3 ta 'Netrin-1 jiffunzjona bħala stimulatur potenti biex jattiva mogħdijiet ta' sinjalazzjoni 'l isfel.

Figura 1. Id-dominju EGF3 ta' Netrin-1 huwa r-reġjun kritiku għall-interazzjoni Netrin-1/DCC. (A) Illustrazzjonijiet ta' bini ta' Netrin-1. Il-kostruzzjonijiet Netrin-1 huma Netrin-1 full-length, Netrin-1-(∆407–443) u GST-EGF3. (B) Netrin purifikat-1-(∆407–443)-Myc/His ġew ikkwantifikati permezz ta' paragun mal-kurva standard tal-BSA. (C) Immunoblotting tal-frazzjoni pull-down mill-proteina tal-fużjoni tad-dominju GST-DCC FN5 u GST biss. (D) Immaġini ta' immunofluworexxenza ta'Flag-DCC li jesprimu ċelluli 293T inkubati b'mezz ta' kontroll, Netrin-1-myc/his u Netrin{-1-(∆407–443) -Myc/his għal 30 min, rispettivament, u l-kwantitattivi analiżi. Skala bar, 10 µm. (E) Immunoblotting tal-frazzjoni pull-down mill-proteina tal-fużjoni GST-EGF3 u GST flimkien. (F) Immaġini ta 'immunofluworexxenza ta' Flag-DCC li jesprimu ċelluli 293T inkubati b'mezz ta 'kontroll u FITC ittikkettati Pep EGF3 għal 30 min, rispettivament, u l-analiżi kwantitattiva. Skala bar, 10 µm.

Figura 2. Id-dominju EGF3 jattiva mogħdijiet downstream ta' Netrin-1. (A) Proċedura sperimentali. (B) In-newroni kortikali (E17 u DIV3) ġew stimulati b'Netrin-1, Netrin-1-(∆407-443) jew mezz ta' kontroll għal 20 min. Lisati taċ-ċelluli ġew inkubati b'antikorp anti-p-FAK-861 biex tiġi kkonfermata l-attività ta' Netrin-1. (C) Analiżi kwantitattiva tar-riżultati tal-western blot tidher f'(B). n=3. (D) In-newroni kortikali (DIV3) ġew ittrattati b'1.5 µM GST (+), 1.5 µM proteina tal-fużjoni GST-EGF3 (+), jew 1.5 µMNetrin-1 (+) medju għal 20 min. Lisati taċ-ċelluli ġew inkubati b'anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 u anti-p-ERK-202/204.(E-G) Analiżi kwantitattiva tal-punent blot riżultati murija f'(D). n=3. Id-dejta hija ppreżentata bħala l-mezzi ± SEM.One-way ANOVA kienet użata għall-analiżi statistiċi kollha murija f'din il-figura (* p < 0.05, ** p < 0.01; ns, mhux sinifikanti). Id-dettalji tal-analiżi tad-dejta jidhru fit-Tabella Supplimentari S1.

2.3 peptide E1 u E2 jinteraġixxu ma 'DCC biex Jattivaw il-Pathway ta' Sinjali Downstream ta 'Netrin-1

Kif deskritt qabel, peptide żgħir derivat mid-dominju EGF3 ta 'Netrin-1(aċidi amminiċi 423–433) indotta fosforilazzjoni ERK [27]. Aħna sintetizzati peptidi E1 (residwi 407-422) u E2 (residwi 423-433) li ġew derivati ​​mid-domainof EGF3 ta Netrin -1 (Figura 3A).

Sibna li l-inkubazzjoni tal-peptide E1 żiedet il-livelli ta 'FAK fosforilati u SFK (Figura 3B, D, E) fiċ-ċelloli tal-kultura b'mod dipendenti fuq id-doża iżda ma bidlitx il-livelli ta' ERK fosforilat (Figura 3B, F).

B'differenza peptideE1, peptide E2 mhux biss indotta l-fosforilazzjoni tat-tyrosine ta 'FAK (Figura 3C, G) u l-fosforilazzjoni tat-tyrosine ta' SFK (Figura 3C, H) iżda wkoll indotta l-fosforilazzjoni tat-tyrosine ta 'ERK (Figura 3C, I) f'newroni kortikali kkultivati.

Il-peptide ta 'kontroll (Pep Ctrl) ma kellu l-ebda effett li jista' jinduna fuq il-fosforilazzjoni tat-tyrosine ta 'FAK, SFK, u ERK (Figura S1). Barra minn hekk, osservajna li l-fosforilazzjoni ta' komponenti tal-passaġġ ta 'sinjalazzjoni FAK indotta mill-peptide E1 kienet dipendenti fuq il-ħin (Figura S2). Dawn ir-riżultati jindikaw li E1 u E2 huma l-peptidi funzjonali minimi ta' Netrin-1.

Figura 3. Is-sekwenzi minimi tad-dominju EGF3 jattivaw mogħdijiet downstream ta' Netrin-1. (A) Illustrazzjonijiet tal-peptidi. (B) In-newroni kortikali (DIV3) ġew stimulati b'konċentrazzjonijiet ta 'gradjent ta' peptide E1. Lisati taċ-ċelluli ġew inkubati b'anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 u anti-p-ERK-202/204. (C) In-newroni kortikali kkultivati ​​ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet gradwali ta 'peptide E2.

Lysates inġabru u inkubati bl-antikorpi indikati biex titkejjel il-fosforilazzjoni ta 'FAK, SFK, u ERK. (D – F) Il-kwantifikazzjoni tal-firxa tal-fosforilazzjoni FAK, SFK, u ERK indotta mill-peptide E1 fin-newroni hija murija f'(B). n=3. (G-I) Il-kwantifikazzjoni tal-firxa tal-fosforilazzjoni FAK, SFK, u ERK indotta mill-peptide E2 tidher f'(C). n=3. (J) In-newroni kortikali derivati ​​minn DCC wild-type u mutantembryos omozigoti ġew stimulati b'peptidi derivati ​​minn Netrin-1 jew Netrin-1- u ġew lysed.

Il-lisati li rriżultaw ġew soġġetti għal immunoblotting. (K) Kwantifikazzjoni tal-livelli FAK PY{{0}} u DCC fin-newroni mutanti DCC tidher f'(J). n=3. Id-data huma ppreżentati bħala l-mezzi ± SEMs. ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat għall-analiżi statistiċi kollha murija f'din il-figura (* p < 0.05; ns, mhux sinifikanti). Id-dettalji tal-analiżi tad-dejta jidhru fit-Tabella Supplimentari S1.

Biex niddeterminaw jekk l-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar tal-FAK hijiex dipendenti fuq id-DCC, kejlna l-estent tal-fosforilazzjoni tat-tyrosine tal-FAK indotta minn dawn il-peptidi fin-newroni DCC+/+ u DCC-/-. Sibna li ż-żewġ peptidi E1 u E2 naqsu milli jinduċu l-fosforilazzjoni ta 'FAK fin-newroni DCC-/- (Figura 3J, K).

Sibna wkoll li l-peptidi E1 u E2 (Bandiera-E1 u Bandiera-E2) sintetizzati N-terminalment jorbtu direttament mad-dominju DCCFN5 (Figura S3).

2.4. Peptide E1 Jipproteġi n-Newroni mill-Mewt taċ-Ċelloli Indotti mill-Hemin In Vitro

Biex nuru l-protezzjoni kontra l-ħsara newronali tal-peptide E1, użajna reazzjoni ta 'tossiċità li tista' tinduċi aHemin biex timita korriment sekondarju tal-moħħ wara emorraġija intraċerebrali [41,42].

Ċelloli newronali kkulturati li jesprimu GnRH (NLT) [43-45] ġew inkubati b'emin f'konċentrazzjonijiet u tul ta 'żmien differenti. L-inkubazzjoni taċ-ċelluli NLT bl-emina fid-doża letali medjali (60 µM) rriżultat fi tnaqqis dipendenti fuq iż-żmien fir-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelluli, li tissuġġerixxi li l-emina ġiet meħuda min-newroni u metabolizzata (Figura S4).

Biex teżamina jekk l-espressjoni ta 'Netrin-1 u DCC rrispondewx għall-mewt taċ-ċelluli newronali indotta mill-emina, ċelluli NLT kkultivati ​​ġew inkubati b'emin għal tul ta' żmien differenti. Ir-riżultati tal-western blot wrew li l-livelli ta 'espressjoni ta' Netrin -1 u DCC żdiedu b'mod sinifikanti f'6 sigħat wara l-inkubazzjoni tal-emin u mbagħad naqsu gradwalment (Figura 4A, B).

Biex ninvestigaw jekk il-peptidi E1 u E2 kinux kapaċi jtaffu l-mewt newronali indotta mill-emina, għamilna analiżi CCK-8 b'Netrin-1, PepCtrl, peptide E1, u peptide E2.

Sibna li dawn il-peptidi ma kellhom l-ebda effett rilevabbli fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli (Figura 4C u Figura S5). Meta mqabbel ma 'inkubazzjoni ma' Pep Ctrl u peptideE2, peptide E1 u Netrin-1 tjiebu l-mewt newronali indotta minn emin (Figura 4D). Aħna wkoll imtebba 'b'calcein-AM u PI biex niddistingwu ċelluli ħajjin u mejta.

Ir-riżultati wrew li kemm Netrin-1 kif ukoll peptide E1 ipproteġu kontra l-mewt indotta mill-emina in vitro (Figura 4E-G). Barra minn hekk, 1.5 µM peptide E1 ttaffi l-mewt indotta mill-emina f'newroni kkultivati ​​primarji (Figura 4H, I). B'kollox, dawn ir-riżultati wrew li l-peptide E1 jipproteġi n-newroni mill-mewt taċ-ċelluli indotta mill-emin.

2.5. Netrin-1-Peptide Derivat E1 Jippromwovi l-Irkupru Funzjonali wara l-ICH

Biex tinvestiga jekk il-peptide E1 derivat minn Netrin-1 għandux rwol importanti irkupru infunzjonali wara puplesija ta 'emorraġija, waqqafna inmice mudell ICH sperimentali billi injetta collagenase imħallat bil-linka fl-istriatum (Figura S6A).

Wara tlett ijiem, intwerew immaġini tal-porzjon tal-moħħ li jsegwu l-pożizzjoni tal-injezzjoni u l-volum tal-collagenase bil-linka (Figura S6B, C). Ġrieden b'emorraġija strijatali urew dgħjufija fuq in-naħa ipsilaterali minħabba ħsara fil-moħħ (Figura S7A–C).

L-ematoma fl-ICH ta' wara l-istriatum kienu viżibbli meta mqabbla ma' injezzjoni ta' salina (Figura S7D). Il-livelli relattivi ta' proteina ta' Netrin-1 u DCC fil-kortiċi periematomali żdiedu fil-ġrieden ICH meta mqabbla mal-ġrieden ta' kontroll fit-2 jum u n-Netrin-1 kien għadu ogħla b'mod sinifikanti fit-3 jum, li jindika li Netrin-1 huwa importanti għall-irkupru ta 'korriment fil-moħħ (Figura S7E, F).

Sussegwentement, it-tikketta TAT-peptide E1 FITC (FITC-Pep TE1), li żiedet sekwenza TAT tat-tmiem N tal-peptide E1, ġiet injettata fil-ġrieden ICH u l-FITC-Pep TE1 intwera li jaqsam il-barriera tad-demm-moħħ ( Figura S8).

L-ICH u l-ġrieden ta 'kontroll ġew injettati b'mod intraperitoneal bil-peptide (12 mg/kg) kuljum jew volum ugwali ta' salina (Figura 5A). Sibna li l-amministrazzjoni bil-peptide TE1 tejbet ir-rata ta 'sopravivenza u salvaw id-difetti fil-piż tal-ġisem wara l-ICH (Figura 5B, C).

Sibna wkoll collagenasevolume traċċat bi proporzjon ugwali ta 'linka f'kull grupp kien simili, li jikkonferma dan il-mudell standardICH ta' collagenase irriżulta f'ematomi intrastrijatali riproduċibbli (Figura 5D). ) u test taċ-ċilindru (Figura 5F).

Kif mistenni, il-peptide TE1 naqqas il-volum tal-infart wara ICH (Figura 5G, H). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-peptide E1 kien kapaċi jnaqqas il-volum tal-ematoma u jtejjeb l-irkupru funzjonali f'mudell tal-ġurdien tal-ICH.

Figura 4. Peptide E1 itejjeb il-mewt taċ-ċelluli indotta mill-emin in vitro. (A) Western blot ta 'Netrin-1 u DCC f'ċelloli NLT kkultivati ​​esposti għal Hemin (60 µM). (B) Analiżi kwantitattiva tal-blotresults tal-Punent hija murija f'(A). n=3. (C) Assays CCK-8 wrew li l-peptidi tas-serje ma biddilx il-vijabilità taċ-ċellula. n=4. (D) 1.5 µM Pep E1 ippreservat il-vijabbiltà taċ-ċelluli NLT meta miżjuda sew wara espożizzjoni għall-emina (60 µM). n=4. (E) Assaġġ ħaj (aħdar)/Mejta (aħmar) ta' ċelluli NLT esposti għall-emina (60 µM,6 h). Skala bar, 50 µm. (F, G) Analiżi kwantitattiva tal-assaġġ ħaj/mejjet f'(E). n=9. (H) Assaġġi CCK-8urew li Pep E1 jista' jnaqqas il-mewt taċ-ċelluli indotta mill-emina fin-newroni tal-kultura primarja. n=8.(I) Immaġini tal-assaġġ Ħaj/Mejjet ta' newroni tal-kultura primarja (50 µM, 6 h). Skala bar, 50 µm. Id-dejta hija ppreżentata bħala l-mezzi ± SEM. ANOVA f'direzzjoni waħda jew ANOVA f'żewġ direzzjonijiet intużat għall-analiżi statistika kollha murija f'din il-figura (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, mhux sinifikanti). Id-dettalji tal-analiżi tad-dejta jidhru fit-Tabella Supplimentari S1.

Figura 5. Il-peptide E1 derivat minn Netrin-1-jippromwovi l-proċess ta' rkupru wara l-ICH. (A) Skematika tal-paradigma sperimentali ta 'injezzjoni intraperitoneali (IP) ta' peptide TE1 fl-immudellar ICH tal-ġrieden. (B) Il-proporzjon ta 'sopravivenza wara l-ICH ta' kull grupp ġie rreġistrat, u l-metodu Kaplan-Meier ġie impjegat. n=10. (C) Il-piż tal-ġisem jinbidel f'5 ijiem wara l-ICH. n=6.(D) Taħlita ta' kollaġġ/salina bi proporzjon ugwali ta' linka (total 0.6 µL) injettat fl-istriatum tal-ġrieden C57, immaġini rappreżentattivi li juru l-erja tal-linka kienet simili fil-ġrieden ittrattati bi/ mingħajr peptide TE1 5 jiem wara ICH. (E, F) IP injezzjoni ta 'peptide TE1 (12 mg/kg) iżda mhux kontroll TAT (12 mg/kg), imġieba mtejba kif immonitorjat minn kompitu ta' tneħħija ta 'tejp (E) jew kompitu tal-kantuniera (F).

Salina,n=10 annimali individwali; ICH, n=6 annimali individwali; ICH + TAT, n=6 annimali individwali; ICH + TE1, n=8 annimali individwali. (G) Sezzjonijiet rappreżentattivi ta 'ematossilina u eosina mtebbgħin fil-ġrieden ittrattati bi/mingħajr peptide TE1 5 jiem wara ICH. Skala bar, 1 mm. (H) Kwantifikazzjoni tal-volum ta 'emorraġija f'sezzjonijiet tal-moħħ murija f'(G).

Salina, n {{0}} annimali individwali; ICH, n=6 annimali individwali; ICH + TAT, n=6 annimali individwali; ICH + TE1, n=8 annimali individwali. Id-dejta hija ppreżentata bħala l-mezzi ± SEM. ANOVA f'direzzjoni waħda jew ANOVA f'żewġ direzzjonijiet intużat għall-analiżi statistiċi kollha murija f'din il-figura (* p < 0.0 5, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, mhux sinifikanti). Id-dettalji tal-analiżi tad-dejta jidhru fit-Tabella Supplimentari S1.

2.6. Netrin-1-Peptide E1 Derivat Inaqqas l-Apoptożi Newronali wara ICH

Biex tesplora l-mekkaniżmi sottostanti tal-peptide E1 fil-proċess ta 'rkupru funzjonali ta' ICH. Aħna misjuba deġenerazzjoni newronali fir-reġjun perihematomal byfluoro-jade C (FJC) tbajja.

Sibna li l-amministrazzjoni tal-peptide TE1 naqqset b'mod sinifikanti n-numru ta 'ċelluli pożittivi FJC f'reġjuni perihematoma, li jindika li pep TE1 inibit id-deġenerazzjoni newronali wara ICH (Figura 6A, B). Aħna wettaqna tbajja 'TUNEL u sibna li l-peptide TE1 naqqas b'mod sinifikanti n-numru ta' newroni pożittivi għal TUNEL (Figura 6C, D).

In-numru ta 'astroċiti pożittivi għal TUNEL ma kienx bidla skoperta wara t-trattament ta' peptide TE1 (Figura 6E, F). Barra minn hekk, bl-użu ta '4 kDa dextran tikkettat FITC bħala atracer biex tindika l-permeabilità tal-barriera tad-demm-moħħ (BBB), sibna li l-peptide TE1 ma affettwax l-irkupru tal-permeabilità BBB (Figura S9A, B).

Il-livelli ta 'fluorescenceunits mhux ipproċessati fis-serum (RFUs) kienu simili, u kkonfermaw il-preżenza ta' traċċatur injettat fl-annimali kollha analizzati (Figura S9C). Aħna użajna wkoll lectin ittikkettat bil-fluworexxeina biex nittikkettjaw microvessels iżda naqas milli josserva xi titjib wara t-trattament TE1 (Figura S9D, E). Fuq kollox, dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-peptide E1 jippromwovi l-irkupru newronali wara l-ICH billi jinibixxi l-apoptosi newronali.

Figura 6. Netrin-1-peptide derivat E1 jista 'jipproteġi kontra l-mewt newronali u d-deġenerazzjoni, iżda mhux l-astroċiti wara ICH. (A) Sezzjonijiet rappreżentattivi mtebbgħin Fluoro-jade C fil-ġrieden ittrattati bi/mingħajr TE1 f'5 ijiem wara ICH. Skala bar, 50 µm, u 10 µm, rispettivament. (B) Kwantifikazzjoni ta 'ċelluli pożittivi Fluoro-jade C fir-reġjun perihematomali (n=4). (C) Tbajja ta 'TUNEL li turi l-effetti ta' TE1 fuq ħsara fil-moħħ sekondarja (SBI) f'5 ijiem wara l-bidu tal-ICH. Immaġini rappreżentattivi minn gruppi Saline, ICH, ICH + TAT, u ICH + TE1.

Kull grupp kien soġġett għal ICH ħlief għall-grupp Saline. Skala bar, 50 µm, u 10 µm rispettivament. (D) Analiżi kwantitattivi għall-perċentwali ta 'newroni pożittivi għal TUNEL huma murija f'(C). n=4. (E) Kolokalizzazzjoni ta 'TUNEL ma' GFAP f'5 ijiem wara ICH. Immaġini rappreżentattivi minn Saline, ICH, ICH + TAT, u ICH + TE1groups. Skala bar, 50 µm, u 10 µm, rispettivament. (F) Analiżi kwantitattivi għall-perċentwali ta 'astroċiti pożittivi għal TUNEL huma murija f'(E). n=4. Id-dejta hija ppreżentata bħala l-mezzi ± SEM.

ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat għall-analiżi statistiċi kollha murija f'din il-figura (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 ns, mhux sinifikanti). Dettalji tal-analiżi tad-dejta jidhru fit-Tabella Supplimentari S1.

3. Diskussjoni

L-istudju tagħna identifika sekwenza tal-peptidi ċentrali ta' Netrin-1 li hija kruċjali għall-irkupru funzjonali wara l-ICH. Billi jinteraġixxi mad-DCC, dan il-peptide derivat minn Netrin-1-jipproteġi kontra l-mewt newronali minħabba ħsara sekondarja wara l-ICH u għalhekk huwa trattament promettenti għall-ICH.

L-applikazzjoni terapewtika ta' Netrin-1, proteina ta' piż molekulari għoli, teħtieġ l-identifikazzjoni tas-sekwenza funzjonali minima ta' Netrin-1 li tippromwovi downstreamsignaling. Fl-istudju tagħna, ġew iġġenerati peptidi E1 (residwi 407-422) u E2 (residwi 423-433), li huma derivati ​​mid-dominju EGF3 ta 'Netrin-1, rispettivament. Aħna sibna li l-peptide E1 (residwi 407-422) protett kontra l-mewt newronali wara l-ICH.

Sibna li l-livelli ta' espressjoni ta' Netrin-1 u DCC żdiedu fiċ-ċelloli NLT wara t-trattament bl-emina. Hemin jiġi rilaxxat mill-emoglobina wara l-ICH u jinduċi ħsara sekondarja kemm għaċ-ċelluli glia kif ukoll newronali [46-48].

Barra minn hekk, osservajna wkoll livelli ogħla ta' proteina ta' Netrin-1 u DCC wara ICH sperimentali. Barra minn hekk, osservajna wkoll livelli ogħla ta' proteina ta' netrin-1 u DCC wara ICH sperimentali.

Dawn ir-riżultati huma konsistenti mar-riżultati preċedenti li juru li n-netrin-1 għandu rwol importanti fl-irkupru wara l-ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com