Studju Komparattiv ta 'Proprjetajiet U Mekkaniżmu Kontra x-Xjuħija: Resveratrol U Restrizzjoni Kalorika Ⅱ

Effett ta 'resveratrol u CR fuq l-espressjonijiet ta' mRNA ta 'SIRT1, p53, u Foxo3a fit-tessuti ta' firien li qed jixjieħu

Kundizzjonijiet ta' stress ossidattivspiss jinduċu espressjoni u attività SIRT1. SIRT1 jimmodula l-funzjonijiet ta 'fatturi ta' sopravivenza ewlenin inklużi p53 u Foxo3a [9]. Biex jiġi ddeterminat l-effett ta 'resveratrol u CR fuq il-livelli ta' mRNA ta 'SIRT1, p53, u Foxo3a f'firien li qed jixjieħu indotti minn D-Gal, saru analiżi kwantitattivi RT-PCR. Meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll negattiv korrispondenti, il-livelli tal-espressjoni tal-mRNA SIRT1 u Foxo3a naqsu b'mod sinifikanti, iżda l-livell ta' p53 żdied b'mod sinifikanti fil-grupp D-Gal (P <0.01; Figura 9A u 9B). Barra minn hekk, trattament simultanju resveratrol jew CR b'D-gal fil-firien ikkawża żieda fil-livelli ta 'espressjonijiet ta' mRNA SIRT1 u Foxo3a iżda naqas il-livelli ta 'p53 meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll mudell (P <{29}}.05). Madankollu, meta mqabbel mat-trattament CR, il-livell ta 'espressjoni mRNA SIRT1 żdied b'mod sinifikanti fil-fwied ta' doża għolja ta 'resveratrol flimkien ma' grupp D-gal, il-livell ta 'espressjoni mRNA p53 naqas b'mod sinifikanti fil-fwied u l-imħuħ ta' doża għolja ta 'resveratrol flimkien ma' D- grupp gal (P <0.05).

Ikklikkja Hawnhekk Biex Ikseb Supplimenti ta' Kontra l-Aging ta' Cistanche

Effett tar-resveratrol u CR fuq l-espressjonijiet tal-proteina prinċipali assoċjata SIRT1-fit-tessuti tal-moħħ tal-firien li qed jixjieħu

FOXO3a u p53, li huma regolati minn SIRT1, huma l-molekuli downstream ta 'SIRT1. Fl-istess ħin, l-attività SIRT1 hija regolata mill-molekuli upstream tagħha, pereżempju, DBC1 (magħruf ukoll bħala KIAA1967), AROS (magħruf ukoll bħala RPS19BP1) u s-soppressor tat-tumur HuR (magħruf ukoll bħala ELAVL1) [9, 10] . Biex jiġi ddeterminat l-effett ta 'resveratrol u CR fuq il-livelli ta' proteina ta 'p53, FOXO3a, HuR, AROS, u DBC1 fil-firien li qed jixjieħu kkaġunati minn D-Gal, saru testijiet tal-western blot. Meta mqabbla mal-grupp ta 'kontroll negattiv korrispondenti, il-livelli ta' espressjonijiet tal-proteini FOXO3a, AROS u HuR naqsu b'mod sinifikanti, iżda l-livelli ta 'p53 u DBC1 żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp D-gal (P <0.01. ; Figura 10). Barra minn hekk, trattament simultanju resveratrol jew CR b'D-gal fil-firien ikkawża żieda fl-espressjonijiet tal-proteini ta 'FOXO3a, AROS u HuR iżda naqas il-livelli ta' p53 u DBC1 meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll mudell (P <0.05). Madankollu, meta mqabbel mat-trattament CR, il-livell ta 'espressjoni tal-proteina HuR żdied b'mod sinifikanti iżda l-livell DBC1 naqas b'mod sinifikanti fl-imħuħ ta' doża għolja ta 'resveratrol flimkien ma' grupp D-gal (P <0.05). Ma kien hemm l-ebda differenzi bejn il-grupp resveratrol flimkien ma 'D-gal u l-grupp CR flimkien ma' D-gal f'livelli ta 'espressjoni ta' proteina p53, FOXO3a u AROS (P> 0.05).

Espressjonijiet FOXO3a u p53 fit-tessuti tal-moħħ u tal-fwied

L-istatus ta 'espressjoni ta' FOXO3a u p53 ġew determinati fit-tessuti tal-moħħ u tal-fwied permezz ta 'immunoistokimika. Analiżi immunoistokimika ta 'FOXO3a u p53 wriet li l-espressjoni ta' FOXO3a fit-tessuti tal-moħħ u tal-fwied naqset b'mod sinifikanti, u l-espressjoni ta 'p53 żdiedet b'mod sinifikanti fil-grupp D-Gal, meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll negattiv (P <0.{{13} }5, Figura 11). Barra minn hekk, trattament simultanju resveratrol jew CR b'D-gal fil-firien ikkawża żieda fl-espressjoni ta 'FOXO3a iżda naqas l-espressjoni ta' p53 meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll mudell (P <0.05). Madankollu, ma kien hemm l-ebda differenzi bejn il-grupp resveratrol flimkien ma 'D-gal u CR flimkien mal-grupp D-gal fl-espressjonijiet p53 u FOXO3a (P> 0.05).

DISKUSSJONI

Il-proċess kimiku bażiku sottostanti tixjiħ kien l-ewwel avvanzat mill-teorija radikali ħielsa tat-tixjiħ[11],ustress ossidattivhuwa maħsub li huwa fattur primarju fil-proċess normali tat-tixjiħ.Inizjatur radikali ħielsa AAPHkien użat biexjinduċi stress ossidattivu tistabbilixxi mudell ta 'ossidattivsenescenza ċellulari kkaġunata mill-istressfiċ-ċelloli IMR-90 tal-bniedem [12, 13]. Il-vantaġġi ta 'dan il-metodu huma li l-AAPH jiddekomponi termalment għaljiġġeneraw radikalimingħajr bijotrasformazzjonijiet jew enzimi, u r-rata ta 'ġenerazzjoni radikalijistgħu jiġu kkontrollati faċilment billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni tal-inizjatur [12]. AAPH instab lijinibixxi l-proliferazzjoni tal-bniedemIMR- 90 ċelluli b'mod li jiddependi fuq il-konċentrazzjoni u l-ħin. Ir-riżultati wrew li l-inkubazzjoni ta '2 d b'AAPH (1 mM) żiedet b'mod sinifikanti l-perċentwal ta' SA -Gal proporzjon pożittiv, il-popolazzjoni ta 'ċelluli apoptotiċi, naqqset l-espressjoni ta' mRNA ta 'SIRT1, u indotta morfoloġija mkabbra u ċċattjata. Dawn indikaw li l-istress ossidattiv irriżulta minn AAPH wassal liċ-ċelloli IMR-90 għas-senescence. Ibbażat fuq dan il-mudell ta 'senescence ċellulari, trattament ta' resveratrol ta '10 μM inibixxi b'mod aktar effiċjenti s-senescence u l-apoptożi indotti minn AAPH milli trattament CR.

Il-mudell tal-annimali D-gal huwa mudell tal-annimali li qed jixjieħ rikonoxxut internazzjonalment u ntuża ħafna fil-qasam tal-mediċini kontra t-tixjiħ. D-gal huwa nutrijent fiżjoloġiku li normalment jiġi metabolizzat minn D-galactokinase u galactose-1-phosphate fl-annimali. Madankollu, provvista żejda ta 'D-gal, li mhix metabolizzata mill-enzimi ta' hawn fuq iżda jakkumula fiċ-ċelloli, twassal għal stress ossidattiv u ħsara ċellulari [14]. Għalhekk, amministrazzjoni fit-tul ta 'D-gal jinduċi bidliet li jixbħu tixjiħ naturali fl-annimali, bħal ħajja mqassra, disfunzjoni konjittiva, newrodeġenerazzjoni, stress ossidattiv, risponsi immuni mnaqqsa, u formazzjoni avvanzata ta' prodott finali ta 'glycation (AGE) [15]. L-istudju preżenti indika l-istabbiliment b'suċċess tal-mudell ta 'tixjiħ mimetiku, evidenzjat minn indeboliment notevoli ta' tagħlim u memorja, produzzjoni ta 'MDA, akkumulazzjoni ta' lipofuscin, tnaqqis fit-T-AOC u SOD, u regolazzjoni 'l isfel tal-attività tat-telomerase fil-moħħ. Sadanittant, it-trattamenti ta 'resveratrol jew CR ipproteġu l-firien indotti minn D-gal kontra stress ossidattiv billi jgħollu l-attività ta' enzimi antiossidanti, naqqsu l-livelli ta 'prodotti ta' perossidazzjoni tal-lipidi, u jżommu l-bilanċ ta 'sistemi ossidattivi u antiossidattivi. F'testijiet tal-imġieba u tal-attività tat-telomerase, it-trattament ta 'resveratrol jew CR jista' jreġġa' lura l-indeboliment konjittiv indott minn D-gal u l-attività tat-telomerase. Barra minn hekk, firien mudell li qed jixjieħu ttrattati b'dożi għoljin ta 'resveratrol urew effett relattivament aktar sinifikanti fuq l-imġieba minn dawk ittrattati b'CR.

Figura 11: Analiżi immunoistokimika ta 'espressjonijiet p53 (A, B) u FOXO3a (C, D) fit-tessuti tal-fwied (A, C) u tal-moħħ (B, D) ta' firien li qed jixjieħu. L-ingrandiment kien 20×. NG, grupp ta 'kontroll negattiv; MG, grupp ta 'kontroll tal-mudell; RESL, doża baxxa ta 'grupp resveratrol; RESH, doża għolja ta 'grupp resveratrol; CR, grupp ta' restrizzjoni kalorika

Studji wrew li CR, tnaqqis ta’ 10-40 fil-mija fit-teħid ta’ dieta nutrittiva, jista’ittardja t-tixjiħ u żżid il-ħajja, għalhekk livell wieħed komunement użat ta 'CR (tnaqqis ta' 40 fil-mija fit-teħid ta 'ikel) ġie applikat fil-firien tal-grupp CR fl-istudju preżenti. Madankollu, xi investigazzjonijiet urew li l-ebda effett ta 'benefiċċju ta' CR fuq il-lonġevità fil-primati ta 'età naturali [16]. Bl-istess mod, għalkemm it-trattament ta 'resveratrol intwera li jinduċi effetti CR simili fuqmetaboliżmu tal-enerġijau l-profil metaboliku f'bnedmin obeżi [17], ma tejbitx il-funzjoni metabolika f'nisa mhux obeżi b'tolleranza normali għall-glukożju [18]. Ir-raġuni għad-differenzi bejn dawn l-istudji mhix ċara iżda jista 'jkun li CR u resveratrol jaħdmu biex jirrestawraw l-omeostażi f'individwi metabolikament kompromessi, u inqas f'individwi b'saħħithom, possibbiltà konsistenti mal-funzjonijiet magħrufa ta' SIRT1 fi studji fuq l-annimali [19]. Għalhekk, mudelli ta 'firien li qed tixjieħ indotti minn D-gal ġew applikati biex jitqabblu l-attivitajiet ta' kontra t-tixjiħ ta 'resveratrol jew CR, aktar milli l-mudell tal-firien ta' età naturali.

SIRT1, deacetylase dipendenti (NAD plus), kisbet ħafna attenzjoni minħabba r-rwoli multipli tagħha fl-estensjoni tal-ħajja, ir-reżistenza għall-istress u t-tnaqqis tal-apoptożi [20, 21]. Studji li jakkumulaw implikaw b'mod qawwi li SIRT1 kien mira ewlenija ta 'resveratrol u CR [22]. Hemm għadd kbir ta 'molekuli downstream ta' SIRT1, inklużi p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 u E2F1, li huma regolati minn SIRT1. Fl-istess ħin, l-attività SIRT1 hija regolata mill-molekuli upstream tagħha, pereżempju, p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR u AROS. L-irtirar akut tan-nutrijenti jattiva programm ta' traskrizzjoni fil-promotur SIRT1 li huwa dirett mill-fatturi ta' traskrizzjoni Foxo3a u p53. Peress li p53 irażżan l-espressjoni tal-ġene SIRT1, it-tneħħija tiegħu minn Foxo3a jattiva t-traskrizzjoni SIRT1 [23]. DBC1 u AROS ġew deskritti reċentement bħala regolaturi negattivi u pożittivi diretti ta 'attività SIRT1, rispettivament, HuR juri l-effett li jnaqqas il-livelli ta' espressjoni SIRT1 f'ċelluli senescent ta 'età [9, 10].

CRittardja t-tixjiħ u jestendi l-ħajja medjan u massimaf'varjetà ta 'speċi, inklużi firien, ġrieden, ħut, dubbien, dud, u ħmira. Madankollu, programmi ta' dieta rigorużi bħal dawn f'persuni li jgħixu ħielsa qajmu kwistjonijiet etiċi u metodoloġiċi [24]. Fil-preżent, iż-żieda fil-medda tas-saħħa tista 'tkun aktar importanti milli sempliċement ittawwal il-ħajja. Investigazzjonijiet riċenti jissuġġerixxu li r-resveratrol huwa wieħed mill-aktar instigaturi qawwija tal-attività SIR2 fost il-polifenoli tal-pjanti kollha [25], u jinfluwenza l-lonġevità permezz ta 'mekkaniżmi simili kif jidher fir-restrizzjoni tal-kaloriji. Dawn ir-riżultati wrew li CR u resveratrol kellhom attivitajiet simili ta 'rkupru ta' livelli ta 'espressjoni ta' mRNA SIRT1, iżidu l-espressjonijiet tal-proteini ta 'FOXO3a, AROS u HuR u jnaqqsu l-livelli ta' p53 u DBC1. Sadanittant, linji multipli ta 'evidenza konvinċenti jindikaw l-effetti ta' benefiċċju tar-resveratrol fuq is-sistemi newroloġiċi, epatiċi u kardjovaskulari.

MATERJALI U METODI

Kultura taċ-ċelluli, stress u trattamenti

Ir-razza tal-fibroblast diploid uman IMR-90 inkisbet minn ATCC. Iċ-ċelloli tkabbru f'mezz essenzjali minimu (MEM) (Gibco, UK) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS) (Gibco) f'37 grad f'5 fil-mija CO2. Wara li tkun intlaħqet il-konfluwenza, iċ-ċelluli ġew miżrugħa fi 6-pjanċi ta' koltivazzjoni ta' bir. Ġurnata wara, iċ-ċelloli ġew ittrattati għal 48 siegħa b'1 mM 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) (Sigma, USA) dilwit f'MEM flimkien ma' 10 fil-mija FBS. Inkubazzjoni ta '48 siegħa b'inizjatur ta' radikali ħielsa AAPH tistabbilixxi mudell ta 'senescence ċellulari indotta minn stress ossidattiv [12, 13]. Iċ-ċelloli tal-kontroll ġew inkubati f'mezz ta' kultura waħdu. Wara t-trattament AAPH, IMR-90 ġew maħsula b'melħ kiesaħ tal-phosphate buffer (PBS) pH 7.4 u inkubati b'medja ta' kultura friska jew mezz ta' kultura li kien fih resveratrol (grupp resveratrol) jew MEM supplimentat bi 3 fil-mija FBS (grupp CR) għal 48 siegħa addizzjonali qabel il-ħsad.

Attività tat-tbajja' ta' SA -gal

Id-dehra tal-bijomarkaturi tas-senescence ġiet iċċekkjata (tnaqqis tal-potenzjal proliferattiv u żieda fit-tbajja' ta' SA -gal) [26] mill-għada tat-trattament. Imbagħad iċ-ċelloli ġew imtebba wara l-istruzzjoni tal-manifattur tas-SA -gal Staining Kit (CST, USA). Wara t-tbajja ', ġew eżaminati mill-inqas 300 ċellula f'diversi oqsma u ġew magħduda ċelluli pożittivi SA -gal. Dawn l-esperimenti ġew ripetuti tliet darbiet, u r-riżultati ġew ippreżentati bħala l-valuri medji b'devjazzjonijiet standard (SD). Biex tiġi evitata tbajja mhux speċifika possibilment minħabba l-konfluwenza taċ-ċelluli, it-tbajja istokimika SA -gal saret b'ċelloli subkonfluwenti.

Analiżi tal-mikroskopija elettronika tal-iskannjar

Iċ-ċelluli tkabbru fuq coverslips fi 6-pjanċi tal-kultura tal-bir kif deskritt hawn fuq. Wara li resveratrol u CR ġew ittrattati, coverslips tneħħew mill-pjanċi, imbagħad iċ-ċelloli ffissati f'2.5 fil-mija glutaraldehyde buffered fosfat u ffissati wara f'1 fil-mija tetrossidu osmju buffered. Kampjuni fissi ġew mgħaddsa fl-alkoħol t-butil wara deidrazzjoni permezz ta 'serje gradata ta' etanol. Il-kampjuni ġew imnixxfa bil-friża mill-alkoħol t-butil, imbagħad miksija b'evaporazzjoni bid-deheb bl-użu ta' auto fine coater (JFC-1600, JEOC, Ġappun), u eżaminati bl-użu ta' mikroskopju elettroniku tal-iskannjar (JEOL, JSM{{11} }LV, il-Ġappun).

Analiżi apoptotika

Wara resveratrol jew inkubazzjoni CR, iċ-ċelluli kollha nħasdu bi trypsin u maħsula darbtejn b'PBS, segwit minn sospiżi mill-ġdid f'400 μL Annexin V buffer vinkolanti. Imbagħad iċ-ċelloli ġew imtebba wara l-istruzzjoni tal-manifattur tal-kit ta 'skoperta tal-apoptosi taċ-ċelluli Annexin V-FITC (BestBio, iċ-Ċina). Intuża ċitometru tal-fluss FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) biex jikxef il-fluworexxenza, u l-perċentwal ta 'ċelluli apoptotiċi ġie kkalkulat mis-sistema tas-softwer interna tal-FACSCalibur. Madwar 104 ċellula ġew analizzati għal kull traċċa.

Proċeduri għall-annimali

Firien maskili albini Wistar, li jiżnu madwar 200 ± 10 g, inkisbu miċ-Ċentru Sperimentali tal-Annimali tal-Kulleġġ Mediku Tongji, l-Università tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta 'Huazhong (SCXK 2010-0009). L-annimali ġew akklimatizzati għal ġimgħatejn qabel id-dożaġġ fiċ-Ċentru tal-Annimali Sperimentali tal-Università tal-Mediċina Ċiniża ta 'Hubei, li matulu kellhom aċċess liberu għall-ikel u l-ilma ad libitum. Wara l-akklimazzjoni, ġew magħżula 50 far u maqsuma f'ħames gruppi ta 'għaxra kull wieħed. L-annimali nżammu skont il-linji gwida nazzjonali u l-protokolli approvati mill-Kumitat Istituzzjonali tal-Etika tal-Annimali (IAEC).

Il-firien tal-Grupp I (Grupp ta 'kontroll negattiv) irċevew il-vettura waħedha (1 mL/kg piż tal-ġisem ta' 0.9 fil-mija ta 'salina) għal 6 ġimgħat. Il-firien tal-Grupp II (Grupp ta 'kontroll Mudell) irċevew D-gal (200 mg/kg piż tal-ġisem, Sigma Chemical, St. Louis, MO) għal 6 ġimgħat. Grupp III (Doża baxxa ta 'grupp resveratrol) firien irċevew D-gal u resveratrol (50 mg/kg piż tal-ġisem) maħlul f'5 fil-mija dimethyl sulfoxide (DMSO) għal 6 ġimgħat. Il-firien tal-Grupp IV (Doża għolja ta 'grupp ta' resveratrol) irċevew D-gal u resveratrol (100 mg/kg piż tal-ġisem). Il-firien tal-Grupp V (grupp CR) irċevew D-gal u CR (mitmugħa b'dieta li kienet 40 fil-mija inqas f'kaloriji mill-firien mitmugħa ad libitum [27]) għal 6 ġimgħat. D-gal ingħata intraperitonealment, filwaqt li resveratrol ingħata oralment għat-tul kollu tal-esperiment. Il-firien ġew sagrifikati fl-aħħar jum tat-trattament, imbagħad id-demm, is-serum u l-organi nġabru immedjatament għal bioassay jew maħżuna f'-80 grad għal użu aktar tard.

Testijiet tal-imġieba

It-test tal-labirint tal-ilma Morris kien iddisinjat biex jevalwa l-kapaċità tal-firien ta 'tagħlim spazjali u memorja wara 6 ġimgħat wara l-korriment [28]. It-test tal-labirint tal-ilma Morris kien jikkonsisti f'{3}}jum ta' tagħlim u taħriġ fil-memorja u prova tas-sonda fil-5 jum. L-annimali ġew imħarrġa f'ġabra ċirkolari (155 ċm fid-dijametru) b'indikazzjonijiet viżwali. Pjattaforma tal-ħarba (9.0 ċm fid-dijametru) kienet mgħaddsa 1.0 ċm taħt il-wiċċ tal-ilma tal-pixxina, li nżammet f'25 ± 2 gradi. Il-post tal-pjattaforma baqgħet fiċ-ċentru tal-kwadrant tal-majjistral matul il-perjodu ta' taħriġ ta' 4-jum. F'kull jum, il-firien ġew imħarrġa għal blokka waħda filgħodu u blokka waħda wara nofsinhar. Il-far għam liberament sakemm sab il-pjattaforma fi żmien 120 s. Jekk falla, tpoġġiet fuq il-pjattaforma għal 10 s. Ġew irreġistrati l-latency tal-ħarba (sejba tal-pjattaforma tal-ħarba mgħaddsa) u l-veloċità tal-għawm. Il-prova tas-sonda saret billi tneħħiet il-pjattaforma u ppermettiet lil kull far jgħum liberament għal 120 s ġewwa l-pixxina. In-numru ta 'qsim tal-pjattaforma fil-kwadrant imħarreġ (fejn il-pjattaforma tneħħiet) ġew irreġistrati b'sistema ta' vidjo kompjuterizzata. Il-verżjoni viżibbli tal-pjattaforma tal-labirint tal-ilma ma twettqitx wara li ġiet osservata differenza sinifikanti fil-veloċità tal-għawm bejn il-firien ittrattati b'D-gal u l-vettura.

Sejbien ta' indikaturi bijoloġiċi assoċjati ma' stress ossidattiv

Il-livelli ta 'MDA, SOD, u T-AOC fid-demm u fit-tessuti ġew determinati fotometrikament skont il-protokoll tal-manifattur bl-użu ta' kits ta 'assaġġ enżimatiku disponibbli kummerċjalment (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR China). L-esperimenti kollha deskritti f'din it-taqsima saru fi tliet kopji biex jinkisbu mezzi u SD.

Il-livell ta' Lipofuscin kien iddeterminat bil-metodu Sohal [29]. Fil-qosor, iżenna 200 mg tal-kortiċi ċerebrali, żidna 2 ml estratt tal-kloroform-metanol (2:1), omoġenizzajna u ffiltrat, imbagħad ħsilna r-residwu bl-estratt, għaqqadna l-filtrati, żidna l-estratt għal 5 ml u kejjel l-intensità tal-fluworexxenza fuq spettrometru tal-fluworexxenza. Il-wavelength tal-emissjoni kien 435 nm u l-wavelength tal-eċitazzjoni kien 365 nm. L-ispettrofluworometru kien standardizzat biex jagħti deflessjoni ta '50 fil-wavelengths ta' hawn fuq b'soluzzjoni ta '1 ug/ml ta' quinine bisulfate f'0.1 M H2 SO4. Ir-riżultati ġew espressi bħala unitajiet fluworexxenti relattivi/ml kloroform/g piż tat-tessut imxarrab.

Sejbien ta 'attività TE

Għall-estrazzjoni tat-telomerase madwar 30 mg ta 'tessut inħaslu darbtejn f'PBS kiesaħ bis-silġ, u finalment omoġenizzat f'madwar 150 ml ta' PBS. L-attività TE ġiet imkejla bl-użu ta 'kits TE ELISA skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, iċ-Ċina). Il-limiti tas-sensittività tal-analiżi kienu 0.8 IU/L għal TE.

Analiżi RT-PCR

Il-livelli ta 'espressjoni ta' mRNA ta 'SIRT1, Foxo3 u p53 fit-tessuti tal-fwied u tal-moħħ ġew analizzati bl-użu ta' analiżi RT PCR. L-RNA totali ġie estratt bl-użu ta 'Trizol, u l-kwantità u l-purità tagħhom ġew evalwati minn ultra mikrospettrofotometru (Thermo Fisher Scientific, USA) ibbażat fuq il-kejl tal-assorbiment f'260 u 280 nm. Wara l-kwantifikazzjoni, cDNA ġie sintetizzat bl-użu ta 'kit FastQuant RT (Tiangen Biotech, Beijing, iċ-Ċina) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-livelli ta 'espressjoni ta' SIRT1, Foxo3, p53 mRNA tkejlu permezz ta 'RT-PCR bl-użu ta' TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Beijing, Ċina) b'primers speċifiċi (Tabella 2). Twettqet PCR kwantitattiva f'ħin reali b'sistema ta 'PCR LightCycler 480 grad (Roche, Basel, l-Isvizzera) bl-użu ta' 20 μL bħala l-volum totali ta 'kull reazzjoni. L-amplifikazzjoni tal-PCR inbdiet bi 15-il minuta ta' denaturazzjoni f'95 grad, u mbagħad segwita minn 40 ċiklu ta' 95 grad għal 10 s, 59-63 grad (temperatura ta' ttemprar) għal 20 s u 72 grad għal 30 s, u inkubazzjoni finali f'72 s. grad għal 5 min. In-numru tal-limitu taċ-ċiklu miksub ta' kull ġene (valur Ct) ġie normalizzat f'darbiet ta' bidliet relattivi skont l-ekwazzjoni tal-metodu 2-∆∆CT [30].

Tabella 2: Lista tal-Primer

Analiżi Western blot

Il-livelli ta 'espressjoni tal-proteini ta' p53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1, u DBC1 fit-tessuti tal-moħħ ġew analizzati bl-użu ta 'analiżi western blotting. Il-proteina totali tat-tessuti tal-moħħ ġiet estratta bl-użu ta 'RIPA Lysis Buffer (Beyotime, iċ-Ċina) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini ġew determinati bl-użu tal-Kit tal-Assaġġi tal-Proteini BCA (Beyotime, iċ-Ċina). 5 mg ta 'proteini ġew separati bl-użu ta' 12 fil-mija SDS-polyacrylamide gels u trasferiti fuq membrana PVDF (0.45 μm, Millipore, USA). Il-blots ġew imblukkati b'5 fil-mija ħalib bla xaħam f'TBS, imbagħad inkubati matul il-lejl f'4 gradi bid-dilwizzjoni xierqa ta 'antikorpi primarji: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Cell Teknoloġija tas-Sinjali), kontra l-HuR (#12582, Teknoloġija tas-Sinjali taċ-Ċelluli), kontra l-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, Teknoloġija tas-Sinjali taċ-Ċelluli), azzjoni kontra - - (AC004, Teknoloġija ABclonal) . Wara l-ħasil tal-membrani biex tneħħi l-antikorpi primarji żejjed, il-membrani ġew inkubati għal siegħa f'temperatura tal-kamra bl-antikorpi sekondarji xierqa f'dilwizzjoni ta '1:2000-1:5000 (AC004 jew AS003, ABclonal Technology). Il-membrani ġew maħsula 3 darbiet u mbagħad viżwalizzati bl-użu ta 'Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). -azzjoni ntużat bħala kontroll intern.

Immunoistokimika

Il-kampjuni tat-tessut ġew iffissati f'formalin newtrali buffered ta '10 fil-mija fi żmien siegħa wara t-tneħħija kirurġika u inkorporati fil-paraffin bl-użu ta' proċeduri standard. Imbagħad il-kampjuni fissi inkorporati fil-paraffin inqatgħu f'sezzjonijiet ħxuna ta' 5-μm, li ġew deparaffinizzati fil-xylene, reidratati fl-etanol, u ttrattati bil-microwave għall-irkupru tal-antiġen. L-antikorp primarju dilwit b'mod xieraq, anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) u anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology), ġew inkubati għal 60 min f'temperatura ambjentali f'kamra ta 'umdità. Slajds imbagħad ġew mlaħalħa f'PBS u sussegwentement inkubati bl-antikorp sekondarju kontra l-antikorp kontra l-fenek u l-viżwalizzazzjoni ta 'HRP (konċentrazzjoni 1:300, #074-1506, KPL). Imbagħad is-slajds ġew maħsula u s-sezzjonijiet ġew żviluppati fis-soluzzjoni diaminobenzidine (DAB, Sigma) tas-sottostrat tal-enzima. Stampi ta' sezzjonijiet imtebba' b'mod immunoistokimiku nqabdu mill-mikroskopju diġitali Olympus (IX-73P1F, Olympus, il-Ġappun).

Analiżi statistika

Ir-riżultati ġew espressi bħala mezzi ± SD għal mill-inqas tliet esperimenti indipendenti u ġew analizzati bl-użu tas-softwer SPSS 18.0. Id-differenzi tal-grupp fil-latency tal-ħarba u l-veloċità tal-għawm fil-kompitu tat-taħriġ tal-labirint tal-ilma Morris ġew analizzati bl-użu ta 'analiżi ta' varjanza f'żewġ direzzjonijiet (ANOVA) b'miżuri ripetuti, il-fatturi jkunu jum ta 'trattament u taħriġ. Id-dejta l-oħra ġiet analizzata b'ANOVA one-way segwit minn test Tukey post-hoc. Il-valur ta 'P inqas minn 0.05 tqiesu sinifikanti.

KONKLUŻJONIJIET

Resveratrol u CR urew attivitajiet simili kontra t-tixjiħ kemm in vitro kif ukoll in vivo, evidenzjati mill-kapaċità tagħhom li jinibixxu s-senescence u l-apoptożi indotti minn AAPH, u jirrestawraw l-indeboliment konjittiv relatat ma 'l-età kkawżat mill-amministrazzjoni ta' D-gal. Il-mekkaniżmi tagħhom kontra t-tixjiħ kienu jinkludu attività ta 'TE li tirregola 'l fuq, tnaqqis fil-ħsara ossidattiva, u r-regolazzjoni tal-mogħdija SIRT1. B'mod ġenerali, 10 μM resveratrol in vitro u doża għolja ta 'resveratrol in vivo urew attivitajiet relattivament aktar b'saħħithom ta' livelli ta 'SIRT1 anti-aging u stimulanti. Dawn ir-riżultati implikaw il-potenzjal tar-resveratrol bħala mimetiku CR.

Abbrevjazzjonijiet

AAPH, 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride; AMPK, protein kinase attivat mill-adenosine monophosphate; ANOVA, analiżi tal-varjanza; AROS, regolatur attiv tas-SIRT1; CR, restrizzjoni kalorika; DBC1, imħassar fil-kanċer tas-sider 1; D-gal, D-galattożju; FBS, serum bovin tal-fetu; Foxo3a, kaxxa forkhead 3a; HuR, Hu antiġen R; MEM, mezz essenzjali minimu; PBS, phosphate buffer saline; PGC-1, koattivatur tar-riċettur G attivat mill-proliferatur tal-peroxisome-1; RES, resveratrol; SA -gal, -galactosidase assoċjat mas-senescence; SD, devjazzjonijiet standard; SIRT1, regolatur tal-informazzjoni tas-sajlenser; TE, telomerase.

Kontribuzzjonijiet tal-awtur

Konċepiment u disinn tar-riċerka: Gang Chen; akkwist, analiżi u interpretazzjoni tad-dejta: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; kisba ta 'finanzjament u reviżjoni kritika tal-manuskritt għall-kontenut intellettwali: Gang Chen, Ke-Li Chen; kitba tal-manuskritt: Juan Li. L-awturi kollha qraw u approvaw il-pubblikazzjoni ta’ dan il-manuskritt. RIKONOXXIMENTI U FINANZJAMENT

Dan ix-xogħol kien iffinanzjat miċ-Ċina Postdoctoral Science Foundation (2016M601237), il-proġett Natural Science Foundation (81373704, 30873292).

KONFLITTI TA' INTERESS

L-ebda konflitt ta' interess mill-awturi parteċipanti kollha.

REFERENZI

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Restrizzjoni kalkurika, resveratrol u melatonin: Rwol ta 'SIRT1 u implikazzjonijiet għat-tixjiħ u mard relatat. Mech Aging Dev. 2015; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Restrizzjoni kalorika tnaqqas il-mortalità relatata mal-età u għal kull kawża fix-xadini rhesus. Nat Commun. 2014; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. Stress ossidattiv, restrizzjoni kalorika, u tixjiħ. Xjenza. 1996; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Restrizzjoni ta 'kaloriji u mimetiċi ta' restrizzjoni tad-dieta: strateġija għat-titjib tat-tixjiħ b'saħħtu u l-lonġevità. Curr Pharm Des. 2014; 20:2950–77.

5. Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Mimetiċi ta' restrizzjoni kalorika: approċċ ġdid għall-bijoġrontoloġija. Metodi Mol Biol. 2007; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, et al. Resveratrol itejjeb is-saħħa u s-sopravivenza tal-ġrieden fuq dieta b'ħafna kaloriji. Natura. 2006; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P, et al. Resveratrol itejjeb il-funzjoni mitokondrijali u jipproteġi kontra mard metaboliku billi jattiva SIRT1 u PGC-1alfa. Ċellula. 2006; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Attivaturi ta' molekuli żgħar ta' sirtuini jestendu l-ħajja ta' Saccharomyces cerevisiae. Natura. 2003; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. It-tlugħ u l-inżul tas-SIRT1. Xejriet Biochem Sci. 2008; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. Kif is-SIRT1 jaffettwa l-metaboliżmu, is-senescence u l-kanċer? Nat Rev Cancer. 2009; 9:123–8.

11. Harman D. Teorija radikali ħielsa tat-tixjiħ. Mutat Re. 1992; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Ħsara ossidattiva lill-catalase indotta minn radikali peroxyl: protezzjoni funzjonali minn melatonin u antiossidanti oħra. Free Radic Res. 2003; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- u TGF -Nox4 sinjalazzjoni, stress ossidattiv u rispons għall-ħsara fid-DNA huma karatteristiċi kondiviżi ta 'replikattiv, indott mill-onkoġeni, u indott mid-droga 'senescence paracrine 'Bystander “. Tixjiħ (Albany NY). 2012; 4:932–51. https:// doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. L-espożizzjoni kronika sistemika għal D-galactose tinduċi telf ta 'memorja, newrodeġenerazzjoni, u ħsara ossidattiva fil-ġrieden: Effetti protettivi ta' R{{ 2}}aċidu lipoic. J Neurosci Res. 2006; 84:647–54.

Staqsi għal aktar:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: flimkien ma' 86 15292862950