Effett ta' Whitening Ta' Taħlita Ġdida ta' Peptidi Billi Tirregola l-Bijoġenesi, Trasferiment U Degradazzjoni tal-Melanosomi Parti 1

ASTRATT

Il-peptidi huma ktajjen qosra ta' aċidi amminiċi marbuta minn rabtiet peptidi. Jintużaw ħafna bħala ingredjenti attivi effettivi u bijokompatibbli fl-industrija tal-kosmetiċi. F'dan l-istudju, żviluppajna taħlita ġdida ta 'peptidi u identifikajna l-effett tagħha kontra l-pigmentazzjoni fuq melanoċiti u keratinoċiti. Ir-riżultati tagħna wrew li t-taħlita ta 'peptidi inibit il-bijoġenesi tal-melanosome permezz tar-regolazzjoni tal-fattur ta' traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmja, fattur ewlieni tal-melanoġenesi fil-melanoċiti. U aħna osservajna li t-taħlita ta 'peptidi inibita l-assorbiment tal-melanosome permezz tat-tnaqqis tar-riċettur 2 attivat bil-protease, riċettur relatat mal-fagoċitosi fil-keratinoċiti. Barra minn hekk, it-taħlita ta 'peptidi attivat is-sistema awtofaġika li tirriżulta fid-degradazzjoni ta' melanosomi trasferiti fil-keratinoċiti. L-effett kontra l-pigmentazzjoni ta 'taħlita ta' peptidi multi-targeting ġie vvalutat f'mudell ekwivalenti tal-ġilda umana (MelanoDerm). Il-kontenuti tal-melanin fis-saff epidermali naqsu b'mod sinifikanti permezz tat-trattament topiku tat-taħlita tal-peptidi, li jissuġġerixxi li jista 'jiġi applikat bħala materjal kożmetiku ġdid li jkollujbajdufunzjoni.

Skont studji rilevanti,cistanchehija ħaxixa komuni magħrufa bħala "l-ħaxix miraklu li jtawwal il-ħajja". Il-komponent ewlieni tiegħu huwacistanoside, li għandu diversi effetti bħall-promozzjoni tal-funzjoni anti-ossidanti, anti-infjammatorji u immuni. Il-mekkaniżmu bejn cistanche ujbajdu l-ġildatinsab fl-effett antiossidant tacistancheglikosidi. Melanin fil-ġilda tal-bniedem huwa prodott mill-ossidazzjoni tatyrosinekatalizzat minntyrosinase. Il-reazzjoni ta 'ossidazzjoni teħtieġ il-parteċipazzjoni ta' ossiġnu, sabiex ir-radikali ħielsa mill-ossiġnu fil-ġisem isiru fattur importanti li jaffettwa l-produzzjoni tal-melanin. Cistanche fih cistanoside, li huwa antiossidant u jista 'jnaqqas il-ġenerazzjoni ta' radikali ħielsa fil-ġisem, u b'hekkjinibixxi l-produzzjoni tal-melanin.

Ikklikkja Fuq Cong Rong Cistanche Għall Whitening

Staqsi għal aktar:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Kliem Ewlenin

Awtofaġija ·Melanosoma ·Fattur ta' traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmija ·PAR-2· Peptide

INTRODUZZJONI

Il-melanina hija prodotta minn melanoċiti li jinsabu fis-saff bażali tal-epidermide biex jipproteġu ċ-ċelloli tal-ġilda kontra aġenti esterni ta 'ħsara, inklużi raġġi ultravjola (UV), trab fin, u komposti kimiċi varji [1]. Il-fatturi mnixxija mill-keratinoċiti prinċipalment mill-irradjazzjoni UV, inkluż l-ormon li jistimula l-alfa-melanocyte (MSH), l-ormon adrenokortikotropiku, il-fattur taċ-ċelluli staminali, l-endothelin 1, il-fattur tat-tkabbir tal-epatoċiti, il-fattur bażiku tat-tkabbir tal-fibroblasti u l-fattur li jistimula l-kolonja tal-granuloċiti-makrofagi, jistimulaw kull riċettur fuq il-wiċċ tal-melanoċiti u l-melanin jiġi prodott f'organelle relatat mal-liżosomi msejħa melanosoma [2-7]. Fost dawn il-fatturi, MSH huwa ormon peptide żgħir derivat minn pro-opiomelanocortin. L-irbit ta '-MSH mar-riċettur tal-melanocortin 1 iżid il-livell ta' adenosine monofosfat ċikliku (cAMP) li jattiva protein kinase A (PKA) [8,9]. PKA imbagħad phosphorylates cAMP-responsive element binding protein (CREB) u t-traskrizzjoni tal-fattur ta 'traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmja (MITF) hija indotta minn phospho-CREB [10]. MITF jaġixxi bħala fattur ta 'traskrizzjoni għal tyrosinase, proteina 1 relatata mat-tyrosinase (TYRP1), u dopachrome tautomerase (Dct jew TYRP2), enzimi ewlenin fil-melanoġenesi, u jinduċi l-espressjoni tagħhom [11]. Il-melanosome matur jimxi lejn il-ponta tad-dendrite, u l-kumpless tal-proteini tal-mutur tal-melanosome li jikkonsisti minn Rab27a, Melanophilin, u Myosin Va għandu rwol f'dan il-proċess [12-14]. Melanophilin, li għandu dominji li jorbtu għal Rab27a, Myosin Va, u actin, jeħel simultanjament ma 'Rab27a fuq il-wiċċ tal-melanosome u ma' Myosin Va jinteraġixxi mal-filament tal-actin. L-assemblaġġ ta' dawn il-proteini tal-mutur huwa meħtieġ għat-trasport tal-melanosome lejn it-truf tad-dendrite tul il-filament tal-actin [15- 19]. Sussegwentement, melanosomes trasferiti mit-truf dendrite ta 'melanocytes għal keratinocytes ġirien u melanosomes inkorporati jillokalizza fiż-żona perinukleari ta' keratinocytes [20,21]. Għalkemm il-formazzjoni xierqa tal-melanin hija importanti għall-protezzjoni normali taċ-ċelluli, il-produzzjoni eċċessiva tal-melanin tinduċi iperpigmentazzjoni, inklużi melasma, freckles u lentigo solari, li jistgħu jwasslu għal stress mentali u kwalità fqira tal-ħajja [22,23]. Għalhekk, hemm talbiet għall-iżvilupp ta 'aġenti li jbajdu sodisfaċenti mingħajr effetti sekondarji bħal irritazzjoni tal-ġilda, induzzjoni ta' allerġija u karċinoġenesi, u twettqu ħafna studji li jimmiraw diversi mekkaniżmi li jbajdu [24,25].

Il-peptidi huma ktajjen qosra ta 'aċidi amminiċi, l-iżgħar unità ta' proteina, marbuta ma 'xulxin permezz ta' bonds peptidi. Riċentement, saru riċerka u żvilupp estensivi fir-rigward tal-peptidi bħala ingredjenti attivi fl-industriji tal-kosmetiċi u farmaċewtiċi minħabba l-bijokompatibilità għolja tagħhom u l-kapaċità li jimitaw il-proteini [26,27].

Aħna skrinjaw il-librerija tal-peptidi tagħna u sibna erba 'peptidi li jaffettwaw l-inibizzjoni tas-sintesi, il-migrazzjoni u t-trasferiment tal-melanin kif ukoll l-attività li tippromwovi d-degradazzjoni tal-melanosome. Sussegwentement, dan l-istudju kellu l-għan li jinvestiga l-attività ta 'tibjid ta' taħlita ta 'peptidi li fiha erba' peptidi bl-istess proporzjon molari.

METODI

Materjali

Ir-reżina 2-CTC użata fis-sintesi tal-peptidi nxtrat minn BeadTech (Seoul, Korea). Fmoc-amino acid, hydroxy benzotriazole (HOBt), u N, N, N', N'-tetramethyl-O-(1H-benzotriazole- 1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) inxtraw minn CS Bio Co. ( San Francisco, CA, l-Istati Uniti). Ir-reaġenti użati fis-sintesi, inklużi dimethylformamide (DMF), N, N-diisopropylethylamine (DIEA), piperidine, aċidu trifluoroacetic (TFA), thioanisole, phenol, ethane dithiol (EDT), triisopropylsilane (TIS), u diethyl ether, kienu mixtrija minn Daejung Chemical & Metal Co., Ltd. (Seoul, Korea).

Trab ta 'Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) għal melanoċiti u serum bovin fetali (FBS) inxtraw minn Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), u midja DMEM likwida u penicillin/streptomycin inxtraw minn Welgene Inc. (Gyeongsan, Korea) . Bikarbonat tas-sodju, idrossidu tas-sodju, arbutin, 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 3,{{ 7}}dihydroxy-L-phenylalanine (LDOPA), trypsin, u rapamycin inxtraw minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), u Solvable inxtara minn PerkinElmer (Waltham, MA, USA). Antikorpi kontra Rab27A, Melanophilin, MITF, Tyrosinase, u Actin inxtraw minn Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA), u antikorpi kontra Beclin-1, LC3, p62, p-CREB, u p-ERK1/2 inxtraw minn Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Is-sinteżi tal-primer saret f'Cosmo GENETECH (Seoul, Korea) u ntużat aktar fl-esperiment (Tabella 1).

Sintesi tal-peptidi

Ir-reżina CTC b'kapaċità ta' 0.84 mmol/g ġiet soġġetta għal reazzjoni ta' nefħa f'reattur li kien fih solvent DMF. Imbagħad, 2 ekwivalenti ta 'aċidu amminiku terminali Fmoc-C u 2.5 ekwivalenti ta' DIEA ġew miżjuda f'DMF mar-reattur u aktar suġġetti għal reazzjoni għal 2 sigħat. It-terminazzjoni tar-reazzjoni ġiet ikkonfermata b'kit tat-test Kaiser (Sigma-Aldrich), u r-reżina ġiet maħsula b'DMF. L-Fmoc tneħħa billi żżid 20 fil-mija piperidine/DMF darbtejn mar-reżina maħsula. It-terminazzjoni tar-reazzjoni ġiet ikkonfermata bil-kit tat-test Kaiser, u r-reżina ġiet maħsula b'DMF. Sussegwentement, il-proċess li ġej ġie ripetut skond is-sekwenza ta 'aċidi amminiċi fid-direzzjoni tat-terminal C sa N terminali. Wara li 2 ekwivalenti ta 'Fmoc-amino acid, 2 ekwivalenti ta' HBTU, 2 ekwivalenti ta 'HOBt, u 2.5 ekwivalenti ta' DIEA ġew miżjuda f'DMF, ir-reazzjoni saret għal 2 sigħat. It-terminazzjoni tar-reazzjoni ġiet ikkonfermata bil-kit tat-test Kaiser, u r-reżina ġiet maħsula b'DMF. L-Fmoc tneħħa minn aċidu amminiku billi żżid 20 fil-mija piperidine/DMF darbtejn mar-reżina maħsula. It-terminazzjoni tar-reazzjoni ġiet ikkonfermata bil-kit tat-test Kaiser, u r-reżina ġiet maħsula b'DMF. Fil-każ ta' Pep-3, il-konjugazzjoni tal-aċidu feruliku saret permezz tal-proċedura li ġejja. Wara li 2 ekwivalenti ta 'aċidu Ferulic, 2 ekwivalenti ta' HBTU, 2 ekwivalenti ta 'HOBt, u 2.5 ekwivalenti ta' DIEA ġew miżjuda f'DMF, ir-reazzjoni saret għal 2 sigħat. It-terminazzjoni tar-reazzjoni ġiet ikkonfermata bil-kit tat-test Kaiser, u r-reżina ġiet maħsula b'DMF. Wara li tlestiet is-sinteżi finali, ġiet miżjuda soluzzjoni ta' qsim (TFA:H2O: Ohioans ole:phenol:EDT: TIS=81.5:5:5:5:2.5:1) biex tissepara l-peptide mir-reżina . Il-peptide imbagħad ġie preċipitat bl-użu ta 'eteru dietiliku u maħsul ħames darbiet. Sussegwentement, tnixxif sar biex jiġi rkuprat il-prodott finali tal-peptide.

Il-purità tal-peptide sintetizzat ġiet identifikata b'analiżi HPLC (Thermo Fisher Scientific/U{{0}}), u ġiet skoperta f'UV 214 nm taħt ir-rata tal-fluss ta' 1 ml/min taħt fażi mobbli {{ 5}}.1 fil-mija TFA fl-ilma/0.1 fil-mija TFA f'acetonitrile bl-użu ta 'kolonna C18 (Agilent, Pursuit XRs, 250 × 4.6 mm, 5 m, 100Å).

Biex jiġi identifikat il-piż molekulari, saret analiżi LC-MS/MS (AB SCIEX, 3200 Q-trap), u ġiet skoperta minn MS/MS bir-rata tal-fluss ta' {{7 }}.25 ml/min taħt fażi mobbli 0.1 fil-mija aċidu formiku fl-ilma/0.1 fil-mija aċidu formiku fil-gradjent aċetonitrile bl-użu ta' kolonna C18 (Agilent, Pursuit XRs, 100 × 2.0 mm, 5 m, 100Å) . Il-kundizzjonijiet tal-analiżi MS/MS kienu jinkludu l-modalità ESI Pożittiva, Sors/Gass: CUR=20, CAD=Għoli, IS=5500, TEM=350, GS1=50 , GS2=50/Compound DP=50-80, EP=10, CE=10-50, u CES=1-10 (Tabella 2).

Kultura taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli tal-melanoma B16F10 użati f'dan l-esperiment inxtraw minn ATCC (Manassas, VA, USA). Iċ-ċelloli B16F10 ġew inkubati f'midja DMEM li fiha 10 fil-mija FBS inattivat bis-sħana, 1 fil-mija penicillin/streptomycin, u 1.5 g/L bikarbonat tas-sodju f'37 grad u taħt il-kundizzjoni ta '5 fil-mija CO2.

Il-keratinoċiti HaCaT inxtraw minn CLS (Eppelheim, il-Ġermanja). Iċ-ċelloli HaCaT ġew inkubati f'midja DMEM li fiha 10 fil-mija FBS inattivat bis-sħana u 1 fil-mija penicillin/streptomycin f'37 grad u taħt il-kundizzjoni ta '5 fil-mija CO2.

Vijabilità taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli B16F10 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 48-bir b'densità ta' 8 × 103 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'medja li fiha 2 fil-mija FBS għal 3 ijiem. Wara l-inkubazzjoni, 20 l ta '4 mg/ml MTT ġew ittrattati f'kull bir għal 4 sigħat u l-midja tneħħiet. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'500 l ta 'DMSO biex jinħall formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm bl-użu ta' spettrofotometru (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

Assaġġ tal-kontenut tal-melanin

Iċ-ċelloli B16F10 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta' 5 × 104 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'medja li fiha 2 fil-mija FBS għal 3 ijiem. Biex jinduċi l-produzzjoni tal-melanin, 100 ng/ml -MSH ġie kotrattat u 200 M arbutin intuża bħala kontroll pożittiv. Iċ-ċelloli ġew miġbura u lysed billi ttrattati b'200 l ta '1 M NaOH u l-assorbenza għal lysate f'490 nm ġiet imkejla bi spettrofotometru.

Test ta' attività ta' Tyrosinase

Iċ-ċelloli B16F10 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta' 5 × 104 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'medja li fiha 2 fil-mija FBS għal 3 ijiem. Biex jinduċi l-produzzjoni tal-melanin, 100 ng/ml-MSH ġie kotrattat u 200 M arbutin intuża bħala kontroll pożittiv. Kull bir ġie ttrattat b'200 l ta 'lysis buffer (Sigma-Aldrich) biex jiġbor il-lysate. Wara l-kwantifikazzjoni tal-proteina bl-użu ta 'kit BCA (Thermo Fisher Scientific), 90 g ta' proteina minn kull grupp ġew inkubati b'20 l ta '10 mM L-DOPA fi 96- platt tajjeb għal 30 min f'37 grad. L-assorbiment għat-taħlita f'475 nm ġiet imkejla bi spettrofotometru.

Iżolament tal-melanosome

Iċ-ċelloli B16F1{{10}} ġew miżrugħa fi pjanċa 6-bir b'densità ta' 5 × 104 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'100 ng/ ml-MSH għal 72 siegħa biex jinduċu s-sintesi tal-melanin u nħasdu permezz ta 'trattament ta' trypsin/EDTA. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula b'10 ml ta' 0.25 M sukrożju (f'10 mM HEPES buffer) u ġew sospiżi mill-ġdid f'10 ml ta' soluzzjoni ta' sukrożju 0.25 M. Sussegwentement, wara l-iffriżar bin-nitroġenu likwidu, it-tidwib sar f'37 grad , li ġie ripetut 10 darbiet. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'1,000 g għal 10 min, is-supernatant inġabar u aktar ċentrifugat għal 45 min f'20,630 g u 4 gradi. Sussegwentement, il-pellet kien soġġett għal sospensjoni mill-ġdid b'DPBS u maħżun fi -80 grad qabel l-użu.

Test tal-assorbiment tal-melanosome

Iċ-ċelloli HaCaT ġew miżrugħa fi 6-pjanċa bir-bir f'densità ta '1 × 105 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati bit-taħlita tal-peptidi f'midja ħielsa mis-serum għal siegħa u ttrattati aktar b'melanożomi iżolati għal 40 siegħa. Iċ-ċelloli ġew lysed billi ttrattati b'200 l ta '1 M NaOH u l-assorbiment għal lysate f'490 nm ġiet imkejla bi spettrofotometru. Barra minn hekk, it-tbajja’ tal-melanosome saret bl-użu ta’ Fontana-Masson Stain Kit (ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA), u immaġini taċ-ċelloli ġew skoperti permezz ta’ mikroskopju tad-dawl.

Test tad-degradazzjoni tal-melanosome

Iċ-ċelloli HaCaT ġew miżrugħa fi 6-pjanċa bir-bir f'densità ta '1 × 105 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Ġew ittrattati minn qabel b'melanożomi iżolati f'midja ħielsa mis-serum għal 48 siegħa u ttrattati addizzjonalment bit-taħlita tal-peptidi għal 72 siegħa. Mikromole wieħed ta' rapamycin intuża bħala kontroll pożittiv. Iċ-ċelloli ġew lysed billi ttrattati b'200 l ta '1 M NaOH u l-assorbiment għal lysate f'490 nm ġiet imkejla bi spettrofotometru. Barra minn hekk, it-tbajja’ tal-melanosome saret bl-użu ta’ Fontana-Masson Stain Kit, u immaġini taċ-ċelloli ġew skoperti permezz ta’ mikroskopju tad-dawl.

Analiżi tal-espressjoni tal-ġeni (RT-PCR)

Iċ-ċelloli B16F10 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta' 5 × 104 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'medja li fiha 2 fil-mija FBS għal 3 ijiem. Biex jinduċi l-produzzjoni tal-melanin, 100 ng/ml-MSH ġie kotrattat u 200 M arbutin intuża bħala kontroll pożittiv. L-RNA ġie iżolat miċ-ċelloli bl-użu ta 'kit ta' estrazzjoni ta 'RNA (Qiagen, il-Ġermanja), u s-sinteżi ta' cDNA saret bl-użu ta 'taħlit minn qabel RT-PCR (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea). Wara l-preparazzjoni tat-taħlita ta 'reazzjoni ma' PCR premix (iNtRON Biotechnology) u primers għal kull ġene, PCR twettqet bl-użu ta 'magna PCR (Eppendorf, il-Ġermanja). Sussegwentement, il-mudelli tal-espressjoni tal-mRNA ġew determinati bl-elettroforesi tal-ġel tal-agarose.

Iċ-ċelloli HaCaT ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta' 3 × 105 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi fil-midja ħielsa mis-serum għal siegħa u ttrattati addizzjonalment b'4U trypsin għal 16 siegħa. Iċ-ċelloli nġabru u RT-PCR twettaq bl-istess mod kif deskritt hawn fuq.

Analiżi tal-espressjoni tal-proteini (Western blotting)

Iċ-ċelloli B16F10 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta' 5 × 104 ċelluli/bir u inkubati għal ġurnata. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'medja li fiha 2 fil-mija FBS għal 3 ijiem. Biex jinduċi l-produzzjoni tal-melanin, 100 ng/ml -MSH ġie kotrattat u 200 M arbutin intuża bħala kontroll pożittiv. Iċ-ċelloli ġew lysed b'lysis buffer u l-proteina ġiet kwantifikata bl-użu ta 'kit BCA. Għoxrin mikrogramma ta 'proteina ġew separati fuq ġel tal-polyacrylamide 8 fil-mija u trasferiti elettroforetikament għal membrani tal-fluworidu tal-polyvinylidene. Il-membrani ġew imblukkati f'5 fil-mija w/v ħalib xkumat fil-PBS b'0.5 fil-mija Tween 20 (PBS-T). L-inkubazzjoni b'antikorpi primarji dilwiti f'soluzzjoni ta 'imblukkar saret matul il-lejl f'4 gradi u kienet segwita minn ħasil b'PBS-T. L-antikorpi sekondarji xierqa ġew dilwiti f'soluzzjonijiet ta 'imblukkar u inkubati mal-membrani għal siegħa f'temperatura tal-kamra segwiti minn ħasil b'PBS-T. Il-membrani ġew viżwalizzati permezz ta 'reaġent ta' sejbien tal-Punent (Elpis Biotech, Daejeon, Korea) b'Gel Doc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Għall-analiżi ta 'p-CREB u p-ERK, ċelluli B16F10 ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta '3 × 105 ċelluli/bir u inkubati għal ġurnata. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'medja li fiha 2 fil-mija FBS. Il-ħinijiet ta 'inkubazzjoni kienu 30 min għall-analiżi ta' p-CREB u 10 min għall-analiżi ta 'p-ERK. Biex jinduċi l-produzzjoni tal-melanin, 100 ng/ml -MSH ġie kotrattat, u 200 M arbutin intuża bħala kontroll pożittiv. Western blotting sar bl-użu ta 'proteini iżolati bl-istess mod kif deskritt hawn fuq.

Iċ-ċelloli HaCaT ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir b'densità ta' 3 × 105 ċelluli/bir u inkubati għal 16-il siegħa. Imbagħad ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'taħlita ta' peptidi f'midja mingħajr serum għal 3 ijiem. Mitejn nanogramma ta 'rapamicin ġew ittrattati għal 3 sigħat bħala kontroll pożittiv. Western blotting sar bl-użu ta 'proteini iżolati bl-istess mod kif deskritt hawn fuq.

Analiżi ekwivalenti tal-ġilda

Biex jiġi ttestjat l-effett li jbajdu tat-taħlita tal-peptidi bl-użu ta 'ekwivalenti tal-ġilda, ġie ppreparat kampjun ta' liposomi kif ġej. It-taħlita tal-peptidi ġiet maħlula f'ilma distillat f'konċentrazzjoni ta' 2,000 g/ml u aġġustata għal pH 7. Wara l-filtrazzjoni bl-użu ta' 0.22-m filtru tad-daqs tal-pori, 1 fil-mija idroġenat phosphatidylcholine buffer kien imħallat fi proporzjon ta '10 fil-mija. Il-kampjun ta' liposomi ta' daqs nano ġie ppreparat billi għadda miċ-ċelluli 75-m ħames darbiet f'1,000 bar bl-użu tal-Mikrofluidizer.

MelanoDerm MEL-300-B (MatTek Corporation, Ashland, MA, USA) kien ittrattat topikament b'25 l jew 50 l ta 'liposoma li kien fih taħlita ta' peptidi 2,{000 g/ml tliet darbiet fil-ġimgħa għal ġimagħtejn. L-istess volum ta 'vettura ġie applikat biex jikkontrolla t-tessut. L-ekwivalenti tal-ġilda trattati nħaslu b'DPBS u saret mikroskopija tad-dawl biex tiċċekkja l-morfoloġija tal-melanoċiti. Sussegwentement, biex tanalizza l-produzzjoni ta 'melanin, l-ekwivalenti tal-ġilda ġew iffriżati fi -80 grad għal 30 min u mdewweb f'temperatura tal-kamra. Kampjuni tat-tessut ġew inkubati b'1 fil-mija bikarbonat tas-sodju għal 30 min u mnixxfa. Wara t-trattament b'300 l ta' Solvable, il-kampjuni tħallew matul il-lejl f'95 grad u mbagħad tkessħu f'temperatura tal-kamra. L-assorbiment tal-estratt tat-tessut f'490 nm tkejjel bi spettrofotometru.

Biex tosserva d-distribuzzjoni tal-melanin fit-tessuti permezz tal-istoloġija, il-kampjuni kollha ġew iffissati f'formalin buffered bil-fosfat ta '4 fil-mija għal 24 siegħa. Kampjuni fissi ġew inkorporati fil-paraffin u maqtugħin f'sezzjoni 5-m bl-użu ta' mikrotomu (Leica Biosystems, Wetzlar, il-Ġermanja). Is-sezzjonijiet tal-paraffin kienu mtebbgħin bl-użu ta 'Fontana-Masson Stain Kit skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur u saret mikroskopija tad-dawl.

Statistika

L-esperimenti li saru f'dan l-istudju ġew ripetuti tliet darbiet jew aktar. Is-sinifikat statistiku tad-dejta ġiet ittestjata permezz tat-test t ta' Student. Il-valuri li rriżultaw ġew espressi bħala medja ± devjazzjoni standard u tqiesu statistikament sinifikanti meta l-valur p kien inqas minn 0.05.

RIŻULTATI

It-taħlita tal-peptidi tinibixxi s-sintesi tal-melanin indotta mill-MSH u l-attività tat-tyrosinase fiċ-ċelloli B16F10

Biex jiġi ddeterminat l-effett tat-taħlita tal-peptidi fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli, iċ-ċelluli tal-melanoma B16F10, u l-keratinoċiti HaCaT ġew ittrattati bit-taħlita tal-peptidi f'konċentrazzjonijiet ta '10, 50, 100, u 200 M, u sar test MTT. Ir-riżultati wrew li t-taħlita tal-peptide ma kinitx ċitotossika fil-konċentrazzjonijiet ta 'trattament ġenerali, u esperimenti sussegwenti saru fil-medda ta' konċentrazzjoni ta 'hawn fuq (Fig. 1A).

Biex jiġi identifikat l-effett inibitorju tat-taħlita tal-peptidi fuq is-sintesi tal-melanin, iċ-ċelloli B16F10 ġew ittrattati f'konċentrazzjonijiet ta '10, 50, 100, u 200 M biex iqabblu r-rati tal-produzzjoni tal-melanin. Ir-riżultati wrew inibizzjoni dipendenti fuq id-doża tal-produzzjoni tal-melanin mit-taħlita tal-peptidi. Ir-rati ta 'inibizzjoni kienu 3 fil-mija fl-inqas konċentrazzjoni ta' 10 M u 26 fil-mija fl-ogħla konċentrazzjoni ta '200 M (Fig. 1B).

Tyrosinase hija waħda mill-enzimi ewlenin fis-sintesi tal-melanin. L-assaġġ ta 'attività ta' tyrosinase sar biex jivverifika li l-effett inibitorju tal-melanoġenesi tat-taħlita ta 'peptidi kien ikkawżat mir-regolamentazzjoni ta' tyrosinase. Ir-riżultati wrew inibizzjoni sinifikanti tal-attività tyrosinase mit-taħlita tal-peptidi fiċ-ċelloli B16F10. Ir-rati ta 'inibizzjoni kienu 8 fil-mija fl-inqas konċentrazzjoni ta' 10 M u 33 fil-mija fl-ogħla konċentrazzjoni ta '200 M (Fig. 1C).

Staqsi għal aktar: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501