Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Defiċjenza tal-fattur A tat-traskrizzjoni mitokondrijali mmirata għall-epitelju tal-kliewi tirriżulta fi tnaqqis progressiv mitokondrijali assoċjat mal-marda ċistika severa--Parti I

Ken Ishii^1,2,11 et al

Funzjoni mitokondrijali anormali hija karatteristika magħrufa sew ta 'akuta u kronikakliewi mard. Biex tikseb għarfien dwar ir-rwol tal-mitokondrija fikliewiomeostażi u patoġenesi, aħna mmirati fattur ta 'traskrizzjoni mitokondrijali A (TFAM), proteina meħtieġa għar-replikazzjoni u t-traskrizzjoni tad-DNA mitokondrijali li għandha rwol kritiku fiż-żamma tal-massa u l-funzjoni mitokondrijali. Biex teżamina l-konsegwenzi tal-funzjoni mitokondrijali mfixkla fikliewiċelluli epiteljali, aħna inattivajna TFAM f'homeobox relatata mas-sine oculis 2-esprimikliewiċelluli proġenitriċi. Id-defiċjenza ta 'TFAM irriżulta fi tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-ġeni mitokondrijali, tnaqqis mitokondrijali, inibizzjoni tal-maturazzjoni tan-nephron, u l-iżvilupp ta' mard ċstiku sever wara t-twelid, li rriżulta f'mewt prematura. Dan kien assoċjat ma 'morfoloġija mitokondrijali anormali, tnaqqis fil-konsum tal-ossiġnu, u żieda fil-fluss glikolitiku. Barra minn hekk, sibna li l-espressjoni TFAM tnaqqset fil-marieni u fil-bniedemkliewi poliċistiċi, li kien akkumpanjat minn tnaqqis mitokondrijali. Għalhekk, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li d-disregolazzjoni tal-espressjoni TFAM u t-tnaqqis mitokondrijali huma karatteristiċi molekulari ta 'kliewimarda ċistika li tista’ tikkontribwixxi għall-patoġenesi tagħha.

KELMI EWLENIN: glikolisi; żvilupp tal-kliewi; mitokondrija;mard poliċistiku tal-kliewi; TFAM

cistanchehuwa tajjeb għalmard poliċistiku tal-kliewi

Dikjarazzjoni Translazzjonali

Użajna l-ġenetika tal-ġrieden biex nifhmu r-rwol ta 'disfunzjoni mitokondrijali fihakliewiomeostażi. L-inattivazzjoni tal-fattur ta’ traskrizzjoni mitokondrijali A (TFAM) f’ċelluli proġenitriċi epiteljali homeobox 2 relatati mas-sine oculis irriżulta f’renalifallimentminħabba severakliewi poliċistiċi mard. Is-sejbiet tagħna juru li disfunzjoni mitokondrijali progressiva hija assoċjata ma 'divrenzjar epiteljali difettuż urenaliċistoġenesi. Barra minn hekk, waqqafna li l-espressjoni TFAM u n-numru mitokondrijali tnaqqsu fil-bniedemkliewi poliċistiċitessut. L-istudji tagħna jissuġġerixxu li l-istrateġiji terapewtiċi, li għandhom l-għan li jtejbu s-saħħa mitokondrijali, jistgħu jkunu ta’ benefiċċju fit-trattament ta’ pazjenti b’awtosomali dominanti.kliewi poliċistiċimard.

Disfunzjoni mitokondrijali (mt) hija karatteristika patoloġika magħrufa sew ta' komuni.kliewi mardu jistgħu jikkawżaw korriment ċellulari, infjammazzjoni, u fibrożi.1 Fil-kliewi, ċelluli epiteljali tubulari huma dipendenti ħafna fuq adenosine triphosphate (ATP) iġġenerat minn fosforilazzjoni ossidattiva (OXPHOS) minħabba li jwettqu funzjonijiet multipli ta 'trasport epiteljali li jikkunsmaw l-enerġija. Għalhekk, is-sosteniment tal-produzzjoni effiċjenti ta 'mt ATP huwa essenzjali għall-funzjoni normali tal-kliewi u l-omeostażi sistemika tal-elettroliti. Barra minn hekk, evidenza reċenti tindika li l-mitokondrija għandhom rwol ewlieni fir-regolamentazzjoni tal-ġeni, is-sinjalar ċellulari, u d-divrenzjar taċ-ċelluli permezz tal-ġenerazzjoni ta 'metaboliti intermedjarji u speċi ta' ossiġnu reattivi (ROS).kliewimardmhux mifhum tajjeb.

Biex tinvestiga mt funzjoni inrenaliomeostażi u patoġenesi, aħna mmirati fattur ta 'traskrizzjoni mitokondrijali A (TFAM). TFAM huwa fattur nukleari kodifikat essenzjali għall-funzjoni mt, iż-żamma tan-numru tal-kopja mt, u l-istabbiltà strutturali ta 'mt DNA minħabba li jirregola r-replikazzjoni u t-traskrizzjoni tal-ġenoma mt billi tgħawweġ id-DNA tal-promotur. li minnhom jikkodifikaw is-subunitajiet tal-proteini tal-kumpless tal-katina respiratorja, 22 jikkodifikaw RNAs tat-trasferiment, u 2 RNAs ribosomiali. MT-CYB), subunit 1 cytochrome c oxidase kodifikata mitokondrialment (MT-CO1) u subunità 6 tal-membrana ATP synthase kodifikata mitokondrialment (MTATP6).3,5 Mingħajr TFAM, iċ-ċelloli jitilfu l-kapaċità tagħhom li jipproduċu ATP permezz ta 'OXPHOS, ma jistgħux jiġġeneraw ammonti sinifikanti ta' mt. ROS, u progressivament jonqsu mill-mitokondrija.6–9 Studji ġenetiċi wrew li TFAM huwa essenzjali għall-embrijoġenesi normali minħabba li l-inattivazzjoni globali ta’ Tfam omozigote rriżultat f’in-utru. letalità minn jum embrijoniku 10.5, billi d-defiċjenza eterozigota, għalkemm naqqset in-numru ta 'kopja mt b'~40 fil-mija u wasslet għal defiċjenza tal-katina respiratorja, ma wasslitx għal letalità embrijonika.6 Għalhekk, l-immirar ġenetiku ta' TFAM huwa strateġija sperimentali utli biex jiġi eżaminat ir-rwol ta 'mt disfunzjoni progressiva fid-divrenzjar ċellulari u l-omeostażi tat-tessuti. L-inattivazzjoni kondizzjonali speċifika għat-tip taċ-ċelluli tat-Tfam issuġġeriet li l-ġenerazzjoni OXPHOS u/jew mt ROS hija kritika għad-divrenzjar ċellulari, il-funzjoni u l-fiżjoloġija normali.6–10

Disturbi mt primarji minħabba mutazzjonijiet tal-ġeni nukleari jew mt jistgħu jippreżentawkliewi mardl-aktar komunement manifestat bħala korriment tubulointerstizjali jew disfunzjoni tubulari iżolata.11,12 Għalkemm implikat fil-patoġenesi ta 'ċertu mard uman bħal disturbi newrodeġenerattivi,13 mutazzjonijiet speċifiċi fit-TFAM li jikkawżawrenalimarda ma ġewx irrappurtati. Aktar reċentement, espressjoni mnaqqsa ta 'TFAM ġiet marbuta ma' kronikakliewimard. Telf tal-integrità tal-mt minħabba l-inattivazzjoni tat-Tfam ikkawża mard tubulointerstizjali urenali fallimentfil-ġrieden, li kien parzjalment dovut għall-attivazzjoni ta 'mt DNA stress-induced cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)–stimulator of interferon genes (STING)–reazzjonijiet infjammatorji dipendenti.14

Hawnhekk nirrapportaw li ġrieden b’inattivazzjoni kondizzjonali ta’ Tfam f’homeobox 2 (SIX2) relatat mas-sine oculis – li jesprimu ċelluli proġenitriċi ta’ nephron15 jiżviluppaw mard ċstiku sever u jmutu qabel iż-żmien minnrenalifallimentbħala ġrieden żgħar żgħar.Tfam^-/- il-ġrieden kienu kkaratterizzati minn difetti fil-maturazzjoni tan-nephron, li kienet assoċjata ma’ tnaqqis tal-mt, tnaqqis fl-OXPHOS, u bidla metabolika lejn glikolisi fil-ġrieden.Tfam^-/- renaliepitelju. Minħabba s-severità tal-marda ċistika fiTfam^-/- ġrieden, aħna analizzat 2 mudelli tal-ġriedenkliewi poliċistiċimard(PKD), li jirriżultaw minn mutazzjonijiet fi kwalunkwe polycystin-1 (PKD(mard poliċistiku tal-kliewi)1) jew cystin-1 (Cys1), kif ukoll tessuti umani minn pazjenti b'mard tal-kliewi poliċistiku awtosomali dominanti (ADPKD). Aħna nistabbilixxu liTfam^-/- hija disregolata fiċ-ċisti kemm minn PKD murina kif ukoll umana(mard poliċistiku tal-kliewi), tessuti. Meħuda flimkien, l-istudji tagħna jissuġġerixxu li d-disregolazzjoni tat-TFAM u t-tnaqqis tal-mt huma karatteristiċi karatteristiċi ta’renalimard ċstiku u jista 'jkollhom rwol kontributorju fil-patoġenesi tagħhom.

cistanchehuwa tajjeb għalmard poliċistiku tal-kliewi

RIŻULTATI

L-inattivazzjoni ta 'Tfam fiċ-ċelloli tan-nisel SIX2 tikkawża mard ċistika sever li jirriżulta firenalifallimentSabiex tinvestiga mt funzjoni fil-renaliepitelju, aħna inattivajna Tfam f'SIT2-ċelluli proġenitriċi li jesprimu, li jagħtu lok għas-segmenti kollha tan-nephron, ħlief il-katusa tal-ġbir (CD).15 Għal dan, qsamna l-allel floxed Tfam ma 'ġrieden transġeniċi tal-kromożomi artifiċjali batterjali li jesprimu. proteina fluworexxenti ħadra mtejba/proteina tal-fużjoni Cre recombinase (eGFP/Cre) taħt il-kontroll traskrizzjoni tal-promotur Six2 (Figura 1a).16 Ġrieden omozigoti għall-allel floxed Tfam u eterozigoti għat-transġene eGFP/Cre (Sitt2-eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) minn hawn 'il quddiem tissejjaħ Sitta2-Tfam^-/- mutanti. Sitt2-Tfam^-/- ġrieden twieldu fi proporzjonijiet Mendeliani mistennija u ma kinux distinti mill-kontrolli Cre littermate permezz ta 'spezzjoni viżwali mat-twelid. Madankollu, differenzi fil-piż tal-ġisem bejn Sitta2-Tfam^-/- mutanti u kontrolli Cre littermate saru evidenti mill-jum ta' wara t-twelid (P) 14 (5.7 flimkien ma' -0.3 g għal mutanti vs. 7.5 flimkien ma' -0.3 g għall-kontrolli, n=4 kull wieħed, P =0.004; Tabella Supplimentari S1). Sitt2-Tfam^-/- ġrieden mutanti kienu kkaratterizzati minn imkabbrakliewimeta mqabbla mal-kontrolli (kliewi/proporzjon tal-piż tal-ġisem ta' 1.45 fil-mija flimkien ma' -0.19 fil-mija għal mutanti vs. 0.60 fil-mija flimkien ma' - 0}.02 fil-mija għall-kontroll, n {{8} } kull wieħed, P < 0.001;="" figura="" 1b,="" tabella="" supplimentari="" s1)="" u="" miet="" bejn="" l-età="" p20="" u="" p30="" (figura="" 1b).="" letalità="" tal-minorenni="" fil-koorti="" mutanti="" kienet="" assoċjata="">renalifallimentminn marda ċistika severa b'livelli ta' nitroġenu urea fid-demm ta' 68.40 flimkien ma' -5.32 mg/dl għall-ġrieden mutanti kontra 16.8 2.0 mg/dl għall-kontrolli ( n= 6 u 7, rispettivament; P < 0.0001;="" figura="" 1b="" u="" c).="" barra="" minn="" hekk,="" sitt2-tfam="" mutanti="" żviluppaw="" albuminurja="" sinifikanti="" (proporzjon="" ta'="" albumina/krejatinina="" fl-awrina="" 43.58="" flimkien="" ma'="" -362.475.18="" mg/g="" f'sitta{2-tfam="" mutanti="" vs.="" 3.39="" mg/g="" fil-kontrolli="" fi="" p14,="" n="6" u="" 10="" rispettivament;="" p="">< 0.0001).="" dan="" huwa="" konsistenti="" mal-mudell="" ta'="" espressjoni="" ta'="" cre="" recombinase="" f'ċelluli="" proġenitriċi="" ta'="" nephron="" six2,="" li="" jagħtu="" lok="" għal="" cap="" mesenchyme="">renalitubuli u podocytes.15 B'kuntrast ma' Sitt2-Tfam^-/- mutanti, ġrieden b’defiċjenza eterozigota ta’ Tfam f’ċelluli proġenitriċi SIX2 żviluppaw b’mod normali, kienu fertili, u ma żviluppawx ċar;kliewimard(Figura Supplimentari S1).

Figura 1|L-inattivazzjoni ta' Tfam fiċ-ċelloli tan-nisel SIX2 tirriżulta f'mard ċistic sever u insuffiċjenza renali. (a) Skematika li turi l-approċċ sperimentali u l-post tas-sekwenzi mmirati fi ħdan l-allel floxed Tfam. Analiżi tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi tad-DNA totali tal-kliewi ġenomika iżolat mill-kontroll tal-littermate (Cre ) u Six2-Tfam^-/-ġrieden fl-età jum wara t-twelid (P) 7; l-allel nonrecombining Tfam floxed huwa indikat b'2-lox (2); l-allel rikombinat minn 1-lox, l-allel tat-tip selvaġġ b'wt; þ jew - indika l-preżenza jew l-assenza tas-Six2-eGFP/Cre transgene. (b) Pannelli tax-xellug, ritratti ta' kliewi minn Cre control u Six2-Tfam^-/- ġrieden fl-età P20. Il-piżijiet tal-kliewi (KWs) huma espressi bħala perċentwal tal-piż tal-ġisem (BW) (n= 4–14). Pannelli tal-lemin, livelli ta' nitroġenu urea fid-demm (BUN) f'Cre littermate control (ko) u Six2-Tfam^-/-ġrieden fl-età P7 (n=7 u 6, rispettivament) u kurvi ta' sopravivenza Kaplan-Meier għall-kontroll Cre u Six2-Tfam^-/- ġrieden meta mqabbla mat-test log-rank (n=10–13). (c) Immaġini rappreżentattivi ta' sezzjonijiet tal-kliewi ffissati fil-formalina u inkorporati fil-paraffin mill-kontroll Cre u Six2-Tfam^-/-ġrieden fl-età P7 u P29 mtebbgħin b'ematossilina u eosina (H&E) u analizzati mill-immunoistokimika għal actin tal-muskolu lixx (ACTA2) u antiġenu tad-divrenzjar tar-raggruppamenti (CD) 31. Is-sinjali tan-numri juru strutturi ċistiċi u l-asterisks juru glomeruli. Bars ¼ 1 mm għal cross-sections sħaħ tal-kliewi, 100 mm għal immaġini H&E ta' qawwa għolja, u 50 mm għal immaġini IHC. Id-dejta hija espressa bħala medja plus - SEM u ġiet analizzata bit-test t ta' 2-Istudenti. ***P < 0.001.="" biex="" tottimizza="" l-wiri="" ta'="" din="" l-immaġni,="" jekk="" jogħġbok="" ara="" l-verżjoni="" onlajn="" ta'="" dan="" l-artikolu="" fuq="">

L-analiżi tas-Sitta2-Tfam^-/- ġrieden, li esprimew ukoll l-ALLele reporter ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, hawnhekk imsejħa Sitt2-mT/mG;Tfam^-/- ġrieden, li jindika li l-maġġoranza l-kbira tal-istrutturi cystic filTfam^-/- kliewi ġew derivati ​​minn ċelluli bi storja ta 'Six2-eGFP/Cre espressjoni (Figura Supplimentari S2). Ċisti f'Sitta2-Tfam^-/- kliewiwera evidenza ta' proliferazzjoni kif muri mill-preżenza ta' ċelluli epiteljali tal-kisi taċ-ċisti Ki67-pożittivi (b'medja ta' w40 fil-mija taċ-ċelluli epiteljali kollha tal-kisi taċ-ċisti), filwaqt li ċelluli pożittivi għal caspase 3 maqsuma ma nstabux fi ħdan iċ-ċisti (Figura Supplimentari S3 ). Dawn is-sejbiet huma konsistenti maż-żieda fil-livelli ta' kinażi regolati bis-sinjali extraċellulari fosforilati (p-ERK) u b-catenin f'Sitta2-Tfam^-/- tessut tal-kliewi (Figura Supplimentari S3). Meħuda flimkien, id-dejta tagħna tindika li Sitt2-Tfam^-/- kliewi juru karatteristiċi molekulari li huma spiss assoċjati magħhomrenalimard ċstiku.

Figura 3 |Tfam^-/-ċisti ma jesprimux markaturi komuni speċifiċi għas-segment tan-nephron. (a) Immaġini rappreżentattivi ta 'sezzjonijiet tal-kliewi ffissati fil-formalina, inkorporati fil-paraffin minn Sitt2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Immaġini rappreżentattivi ta 'sezzjonijiet tal-kliewi ffissati fil-formalina, inkorporati fil-paraffin minn Sitt2-mT/mG;Tfam^-/-ġrieden fl-età P14 imtebba għal eGFP u uromodulin minn IF. L-asterisks juru ċisti b'uromodulin intraluminali. Il-preżenza ta’ uromodulin intraluminali ġiet eżaminata f’ċisti b’dijametru massimu ta’ jew 50–100μm jew f'ċisti akbar minn 100 mm fid-dijametru massimu. Bars=(a,b) 100 mm. Biex tottimizza l-wiri ta' din l-immaġni, jekk jogħġbok ara l-verżjoni online ta' dan l-artikolu fuqwww.kidney-international.org.

cistanchehuwa tajjeb għalkliewi

Il-maturazzjoni tan-nephron hija difettuża f'Six2-Tfam^-/-ġrieden

Minħabba li jista’ jieħu sa diversi ġimgħat qabel ma ġrieden b’inattivazzjoni ta’ Tfam speċifika għat-tessuti jiżviluppaw patoloġija,17 imbagħad eżaminajna l-kors taż-żmien ta’renaliżvilupp tal-mard fis-Sitta2-Tfam^-/-ġrieden. Ġbarna kliewi minn ġrieden ta’ kontroll u mutanti fl-etajiet P0, P7, u P14 u użajna metodi istoloġiċi, tbajja ta’ immunofluworexxenza (IF), u analiżi tal-espressjoni tal-ġeni b’mod sħiħkliewiestratti għall-valutazzjoni. Tbajja IF għal SIX2 u E-cadherin fl-età P0 wera li l-kliewi mill-kontroll u Six2-Tfam^-/-kienu istoloġikament simili. Il-formazzjoni ta’ strutturi ta’ żona nefroġenika kortikali, bħal SIX2þ cap mesenchyme, E-cadherin – li jesprimu l-ponot ureteriċi, u strutturi ta’ nephron naxxenti bħalrenalivesikuli u korpi f'forma ta' virgola u forma ta' S ma ġewx imblukkati f'Sitta2-Tfam^-/-kliewi (Figura 2a). Dawn is-sejbiet istoloġiċi kienu konsistenti mal-livelli ta' espressjoni ta' ġeni li jikkodifikaw markaturi nefroġeniċi. Six2, paired box 2 (Pax2), LIM homeobox protein 1 (Lhx1), u livelli ta' mRNA tal-fattur ta' traskrizzjoni 1 spalt-like (Sall1) ma kinux differenti b'mod sinifikanti bejn il-kontroll u Six2-Tfam^-/- ġrieden b'kolloxkliewiomoġenati minn P0kliewi(Figura 2b). Dan issuġġerixxa li l-inattivazzjoni ta 'TFAM fil-proġenituri nephron SIX2 ma kellux impatt sinifikanti fuq il-formazzjoni ta' strutturi nefroġeniċi.

Għalkemm il-formazzjoni tal-istruttura tan-nephron naxxenti ma ġietx inibita, it-tbajja' b'alcian blue/periodic acid–Schiff u lotus tetragonolobus lectin indikat maturazzjoni terminali difettuża tan-nephron f'Sitta2-Tfam^-/-ġrieden fl-età P{{0}}. Alcian blu/perijodic acid–Schiff, li tbajja l-membrani tal-kantina tubulari u l-bord tal-pinzell, u lotus tetragonolobus lectin, li jidentifika oligosakkaridi speċifiċi fil-bord tal-pinzell taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali, it-tnejn tnaqqsu fil-kliewi mutanti. Figura 2c turi alcian blu/aċidu perjodiku – tbajja ta' Schiff fil-punti tal-ħin P0, P7, u P14. L-istokimika tal-lectin tal-Lotus tetragonolobus u t-tbajja' IF għall-proteina tat-tumur 1 ta' Wilms fil-punti tal-ħin P{{10}}, P7, u P14 huma murija fil-Figura Supplimentari S4. Fl-età P0, l-erja relattiva li mtebbgħa b'mod pożittiv bil-lotus tetragonolobus lectin kienet 2.10 fil-mija, 0.51 fil-mija u {{30}}.39 fil-mija 0.1 fil-mija fl-età P7 kontra 6.25 fil-mija 0.28 fil-mija u 6.2 fil-mija 1.1 fil-mija għall-kontrolli, rispettivament (n ¼ 3-4, P ¼ 0.0004 u 0.0007, rispettivament; Figura Supplimentari S4). Konsistenti ma' dawn is-sejbiet istoloġiċi huwa t-tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-ġeni li jikkodifikaw markaturi speċifiċi għas-segment glomerulari u nephron podocin, nephrin, aquaporin 1 (Aqp1), sodium-phosphate cotransporter 2a (NaPi2a), uromodulin, sodium-potassium chloride cotransporter 2 ( Nkcc2), u kotrasportatur tal-klorur tas-sodju sensittiv għat-thiazide (Ncc) f'Sitta2-Tfam^-/-ġrieden (Figura 2b). Meħuda flimkien, din id-dejta tissuġġerixxi li Sitt2-Tfam^-/- kliewijuru tnaqqis progressiv fin-numru ta 'segmenti ta' nephron prossimali maturi u glomeruli.

Minħabba li l-attività ta' Sitt2-eGFP/Cre tirriżulta f'segmenti ta' nephron derivati ​​minn cap mesenchyme defiċjenti minn TFAM, aħna mbassar li l-maturazzjoni taċ-ċelloli epiteljali CD, li huma derivati ​​mill-bud ureteri, ma tkunx affettwata f'Sitta{{2} }Tfam^-/-kliewi. Konsistenti ma' dan il-kunċett huwa li t-tbajja 'b'Dolichos biflorus agglutinin, li jirreaġixxi ma' N-acetyl-D-galactose fit-tubuli distali u s-CD, indika rappreżentazzjoni żejda relattiva ta 'strutturi pożittivi ta' Dolichos biflorus agglutinin f'Sitta 2-Tfam^-/-kliewi. Fl-età P7, żoni mtebbgħin b'mod pożittiv għal Dolichos biflorus agglutinin kienu jinkludu 13.91 fil-mija 0.9 fil-mija tal-erja totali għal mutanti kontra 1.93 fil-mija 0.1 fil-mija għall-kontroll (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Figura Supplimentari S4). L-espressjoni tal-mRNA tas-subunità 1 alfa epiteljali tal-kanal tas-sodju (Scnn1a) jew aquaporin 2 (Aqp2), li t-tnejn huma espressi f'ċelluli epiteljali CD, ma naqsetx b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll (Figura 2b). B'kuntrast mas-Sitta2-Tfam^-/-kliewi, inattivazzjoni ta 'Tfam f'ċelluli proġenitriċi homeobox B7 (HOXB7), li jagħtu lok għal ċelluli epiteljali CD, li jirriżultaw fit-telf tal-espressjoni tal-markatur CD nephron u dilatazzjoni tubulari ħafifa iżda mhux ċistoġenesi (Figura Supplimentari S5). Meħuda flimkien, id-dejta tagħna tindika li t-telf tal-funzjoni TFAM fiċ-ċelloli proġenitriċi SIX2 ma jimblokkax l-iżvilupp ta 'strutturi ta' nephron li għadhom jibdew iżda jinibixxi l-maturazzjoni terminali tan-nephron.

Tfam^-/-iċ-ċisti huma defiċjenti f'markers komuni tas-segment tan-nephron

Biex tikkaratterizza l-oriġini istoġenetika ta'Tfam^-/- renaliċisti, għamilna analiżi IF ta 'Tfam^-/- kliewiat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm kienu kkaratterizzati minn depożiti intraluminali ta 'uromodulin, li ssuġġerew oriġini minn segmenti nephron distal għat-tubuli prossimali u l-linja dixxendenti ta' Henle (Figura 3b).

Anormalitajiet progressivi fil-funzjoni mt u morfoloġija inTfam^-/- ċelluli epiteljali

Biex nikkaratterizzaw il-kors taż-żmien tal-konsegwenzi metaboliċi tat-tħassir ta’ Tfam, l-ewwel eżaminajna l-livelli ta’ mRNA ta’ Tfam u mt-Co1, mt-Cyb u mt-Atp6 regolati minn TFAM f’Tfam^-/- kliewifl-età P0, P7, u P14. Kif mistenni, il-livelli ta 'mRNA Tfam, mt-Co1, mt-Cyb, u mt-Atp6 tnaqqsu b'mod sinifikanti (Figura 4a).Tfam^-/-ċelluli epiteljali mmarkati b'eGFP (Sitta {{0}}mT/mG; Tfam / ġrieden) urew tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-proteina MT-CO1 (Figura Supplimentari S7). In-numru tal-kopja tad-DNA tal-mt tnaqqas bi 63 fil-mija, li huwa konsistenti mat-tnaqqis tal-mt, karatteristika tad-defiċjenza tat-TFAM (Figura 4a). B'kuntrast, l-espressjoni ta 'ġeni nukleari li jikkodifikaw nicotinamide adenine dinucleotide: ubiquinone oxidoreductase core subunit 3 (Ndufs3) u succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A (Sdha) ma kinitx affettwata fl-età P0 iżda tnaqqset fl-età P7 u P14 (Figura 4a). Dawn is-sejbiet mill-analiżi tal-ġene u l-proteina mt huma konsistenti mat-telf progressiv tan-numru tal-kopja mt f'Tfam / epitelju.

Imbagħad investigajna l-effetti metaboliċi tal-inattivazzjoni tat-Tfam fiċ-ċelloli epiteljali tat-tubuli prossimali primarji (PTECs) iżolati fl-età P7.Tfam^-/- Il-PTECs urew tnaqqis sinifikanti fir-rati bażali tal-konsum tal-ossiġnu (40.77 4.10 għal mutanti vs. 61.75 5.18 pmol/min/104 ċelluli għall-kontrolli, n=3 kull wieħed, P =0.034), respirazzjoni marbuta mal-ATP (33.11 3.91 għal mutanti vs. 46.92 4.91 pmol/min/104 ċelluli għall-kontrolli, n{{18} } kull wieħed, P=0.093), respirazzjoni massima (116.8 14.19 għal mutanti vs. 225.{5 13.55 pmol/min/104 ċelluli għall-kontrolli, n{{ 28}} kull wieħed, P=0.005), u kapaċità respiratorja żejda (76.05 10.18 għal mutanti vs. 163.7 8.61 pmol/min/104 ċelluli għall-kontrolli , n =3 kull wieħed, P=0.003; Figura 4b).

Biex tikkaratterizza aktar il-grad ta 'tnaqqis u ħsara mt, eżaminajnaTfam^-/- kliewipermezz ta' mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni u mikroskopija ta' illuminazzjoni strutturata {{{0}}dimensjonali (3D SIM). Fl-età P7, il-mitokondrija wrew forom irregolari u ballooning, li huma konsistenti mas-sejbiet preċedenti fil-ġrieden knockout Tfam. Analiżi mikroskopika tal-elettroni tat-trażmissjoni indikat li l-anormalitajiet strutturali tal-mitokondrija, bħal żieda fid-daqs u cristae anormali, avvanzaw wara t-twelid minħabba li d-differenzi morfoloġiċi bejn mutanti u l-kontroll kienu inqas evidenti fl-età P0 u saru aktar severi bl-età (Figura 4c ). 3D SIM intuża biex jeżamina mt volum u daqs tan-netwerk f'Sitt2-mT/mG; Tfam/mutanti meta mqabbla ma' Sitt2-mT/mG ġrieden ta' kontroll fl-età P7; volum mt tkejjel f'sezzjonijiet trasversali ta '5 sa 8 tubuli għal kull sezzjoni, eżamina 25 sa 40 ċelluli epiteljali kortikali pożittivi eGFP mtebbgħin għal kanal 1 selettiv anjoniku dipendenti mill-vultaġġ permezz ta' tbajja IF. Sibna li l-volum totali mt għal kull ċellula pożittiva eGFP naqas b'mod sinifikanti (62.66 16.46 mm3/ċellula għal mutanti vs. 177.4 30.17 mm3 /ċellula għall-kontrolli, n ¼ 3 kull wieħed , P ¼ 0.0289) u kien assoċjat ma' bidla fil-proporzjon tal-volum totali ta' mt għal kull volum totali taċ-ċellula minn 0.230 0.01 fil-kontrolli għal 0.{{ 33}}.016 f'Sitta2-Tfam / mutanti (n ¼ 3 kull wieħed, P ¼ 0.0017; Figura 4c). Id-daqs massimu tan-netwerk mt, li jkejjel l-akbar netwerk mt li ltaqa' magħhom fiċ-ċelloli kollha pożittivi għall-eGFP eżaminati, naqas f'Sitta2-Tfam^-/- kliewi(143.2 23.2 mm3 għal mutanti vs. 318.3 49.45 mm3 għall-kontrolli, n ¼ 3 kull wieħed, P ¼ 0.0327). Meħuda flimkien, is-sejbiet ultrastrutturali u SIM u s-sejbiet mill-analiżi tal-ġeni u l-proteini mt huma konsistenti mat-telf progressiv tan-numru tal-kopja mt f'Tfam^-/- epitelju.

Cistanchehuwa tajjeb għalmard poliċistiku tal-kliewi

Id-defiċjenza ta' TFAM tbiddel il-metaboliżmu epiteljali tal-kliewi lejn il-glikolisi

PTECs fil-kliewiuża aċidu xaħmi b-ossidazzjoni u OXPHOS għall-ġenerazzjoni ATP u huma glukoneġenetiċi.kliewimis-Sitta2-Tfam^-/-u Cre littermate kontroll ġrieden fl-età P7. Sibna li l-ġeni regolatorji ewlenin involuti fil-glikolisi, bħal hexokinase 2 (Hk2) u enolase 2 (Eno2), kienu regolati. B'kuntrast, l-espressjoni tal-biċċa l-kbira tal-ġeni involuti fiċ-ċiklu tal-aċidu tricarboxylic naqset (eż., isocitrate dehydrogenase 1 [Idh1]), kif kienet l-espressjoni tal-ġeni involuti fl-ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi, bħal acetyl-coenzyme A acyltransferase 1B ( Acaa1b), acyl-coenzyme A dehydrogenase ta' katina medja (Acadm) (Figura 5a u b, Figura Supplimentari S8). Konsistenti ma' espressjoni mnaqqsa ta' ġeni involuti fiċ-ċiklu ta' l-aċidu trikarbossiliku -ġeni ta' ossidazzjoni kienet l-akkumulazzjoni ta' lipidi newtrali kif misjuba minn tbajja 'O aħmar taż-żejt fil-friża.kliewisezzjonijiet fl-età P14 (Figura 5c).

L-espressjoni mnaqqsa ta' TFAM fit-tessuti tal-PKD murini u umani hija assoċjata ma' tnaqqis ta' mt

Għax Sitta2-Tfam^-/- kliewikellu xebh qawwi mal-PKD(mard poliċistiku tal-kliewi) kliewi, imbagħad ivvalujna jekk TFAM kienx disregolat fil-PKD(mard poliċistiku tal-kliewi)tessuti. L-ewwel eżaminajna l-espressjoni tal-ġeni regolata TFAM u TFAM f'2 mudelli ta 'ġurdien PKD ġenetiċi stabbiliti sew. Il-livelli ta' mRNA ta' Tfam tnaqqsu b'mod sinifikanti f'omoġenati tal-kliewi sħaħ minn Pkd^-/- u Cys^cpk/cpkġrieden, li jġorru mutazzjonijiet jew fi PKD1(mard poliċistiku tal-kliewi)jew Cys1. Dan kien assoċjat ma 'tnaqqis fl-espressjoni ta' ġeni mt kodifikati b'mod mitokondrijali u nukleari kif ukoll espressjoni tal-ġeni glikolitika disregolata. Simili għal Sitt2-Tfam^-/-kliewi, PKD(mard poliċistiku tal-kliewi)^-/- u Cys^cpk/cpk kliewikienu kkaratterizzati minn Eno2 u Hk2 elevati u naqsu b'mod sinifikanti phosphoglycerate kinase (Pgk) 1, pyruvate dehydrogenase kinase (Pdk) 1, u livelli ta 'traskrizzjoni Pdk4 (Figura 6a). L-espressjoni tal-proteina TFAM, kif evalwata bit-tbajja 'IF, tnaqqset fiċ-ċelloli epiteljali tal-kisi taċ-ċisti meta mqabbla ma' ċelloli epiteljali minn tubuli mhux ċistiċi adjaċenti (Figura 6b). Dan kien assoċjat ma 'mt-Co1 u mt-Atp6 espressjoni mnaqqsa permezz ta' ibridizzazzjoni in situ tal-fluworexxenza tal-RNA (Figura 6b, Figura Supplimentari S9); Il-volum mt, kif determinat minn 3D SIM, tnaqqas b'55 fil-mija meta mqabbel ma' jew ċelluli epiteljali minn tubuli maġenb, mhux ċistiċi jew PTECs minn kontroll normalikliewi. Differenzi fil-volum mt bejn PTECs ta 'kontroll normali u PTECs minn tubuli noncystic ma nstabux (Figura 6c).

Biex teżamina jekk it-telf tal-espressjoni TFAM huwiex karatteristika molekulari komuni tal-PKD tal-bniedem(mard poliċistiku tal-kliewi), analiznajna kampjuni ta 'nefrectomy minn 5 pazjenti ADPKD permezz ta' immunoistokimika, tbajja IF, ibridizzazzjoni in situ tal-fluworexxenza tal-RNA, u 3D SIM. Espressjoni mnaqqsa ta' TFAM kienet osservata f'75.2 fil-mija flimkien ma' -7.5 fil-mija ta'renaliċisti analizzati mill-immunoistokimika. Dan kien assoċjat ma 'espressjoni mnaqqsa ta' MT-CO1 u MT-ATP6 permezz ta 'ibridizzazzjoni in situ ta' fluworexxenza RNA (Figura 7a, Figura Supplimentari S10); Il-volum mt fiċ-ċelloli epiteljali tal-kisi taċ-ċisti naqas b'madwar 70 fil-mija kif evalwat minn 3D SIM (Figura 7b). Meħuda flimkien, l-analiżi ta '2 PKD(mard poliċistiku tal-kliewi)mudelli tal-ġrieden u tessuti tal-ADPKD tal-bniedem issuġġerew li d-defiċjenza ta’ TFAM u t-tnaqqis tal-mt huma sejbiet komuni fil-PKD(mard poliċistiku tal-kliewi)tessuti u x'aktarx li jkollhom impatt fuq il-patoġenesi tarenalimarda ċistika.

cistanche hija tajba għalmard poliċistiku tal-kliewi

Diskussjoni

Ikklikkja hawn għal informazzjoni dwar it-Tieni Parti (Diskussjoni) ta’ dan l-artikolu.

Estratt minn: 'KilwaDefiċjenza ta' fattur ta' traskrizzjoni mitokondrijali epiteljali mmirata A tirriżulta f'deplezzjoni mitokondrijali progressiva assoċjata ma' marda ċistika severa 'minn Ken Ishii1,2,11 et al.

---KilwaInternazzjonali (2021) 99, 657–670