Assaġġ TUNEL: Għodda Qawwija Għall-Evalwazzjoni ta' Korriment fil-Kliewi

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Astratt:Assaġġ terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) huwa assaġġ stabbilit fit-tul użat biex jikxef il-frammentazzjoni tad-DNA assoċjata mal-mewt taċ-ċelluli (terminijiet tad-DNA 3'-OH) minn endonucleases. Minħabba li dawn l-enzimi huma partikolarment attivi fil-kliewi, TUNEL huwa użat ħafna biex jidentifika u jikkwantifika l-frammentazzjoni tad-DNA u l-mewt taċ-ċelluli f'kultivazzjoni.kliewi ċelluli u kliewi tal-annimali u umani li jirriżultaw mill-korriment tossiku jew iposiku. Il-karatterizzazzjoni bikrija ta’ TUNEL bħala analiżi apoptotika wasslet għal bosta interpretazzjonijiet żbaljati tal-mekkaniżmi ta’ċellula tal-kliewi korriment.Madankollu, TUNEL qed isir dejjem aktar popolari għalkorriment fil-kliewivalutazzjoni għaliex tista’ tintuża b’mod universali f’ċelloli kkultivati ​​u tat-tessuti u għall-mekkaniżmi kollha tal-mewt taċ-ċelluli. Barra minn hekk, huwa sensittiv, preċiż, kwantitattiv, faċilment marbut ma 'ċelluli partikolari jew kompartimenti tat-tessuti, u jista' jiġi kkombinat ma 'immunoistokimika biex tippermetti identifikazzjoni affidabbli ta' tipi ta 'ċelluli jew mekkaniżmi probabbli ta' mewt taċ-ċelluli. Tradizzjonalment, l-analiżi TUNEL kienet limitata għall-preżenza jew in-nuqqas ta 'sinjal TUNEL. Madankollu, informazzjoni addizzjonali dwar il-mekkaniżmu tal-mewt taċ-ċelluli tista 'tinkiseb mill-analiżi tal-mudelli TUNEL.

Trattament ta 'disturb tal-kliewi ta' tqanqil sesswali bi trab ta 'suppliment ta' cistanche

Introduzzjoni Id-DNA hija l-unika molekula fiċ-ċellula li tista' tissewwa, iżda ma tistax terġa' tiġi sintetizzata kompletament wara l-ħsara. Il-qerda tad-DNA hija waħda mill-aħħar stadji ta 'proċess ta' mewt taċ-ċelluli f'diversi stadji, li huwa potenzjalment riversibbli sal-punt tal-frammentazzjoni terminali tad-DNA. Għalhekk, dan tal-aħħar huwa attribut komuni u markatur mekkanistiku ta 'mewt taċ-ċelluli irriversibbli [1,2]. Il-frammentazzjoni tad-DNA assoċjata mal-mewt taċ-ċelluli hija ġeneralment "viżwalizzata" mill-assaġġ tat-tikkettjar tan-nick-end dUTP (TUNEL) terminali deoxynucleotidyl transferase, sellum tad-DNA, jew assay tal-kometa [3]. L-elettroforeżi tal-kamp tal-impuls [4] u l-assaġġ ta' sintesi bl-oligonucleotide primad (ROPS) [5] huma żewġ analiżi sekondarji oħra li rarament jintużaw. L-użu tal-assaġġ tal-kometa huwa limitat għal in vitro (ċelluli kkultivati) biss, u l-kwantifikazzjoni tiegħu hija intensiva fil-ħidma [6]. It-twettiq ta 'assaġġi tal-kometa f'nuklei ta' ċelluli iżolati huwa possibbli, iżda huwa assoċjat ma 'fatturi ta' konfużjoni addizzjonali waqt l-iżolament tan-nuklei. It-tieni, assaġġ tas-sellum tad-DNA, mhuwiex metodu kwantitattiv, u t-tama inizjali li l-mudell tas-sellum vs smear jiddistingwi bejn l-apoptożi u n-nekrożi, rispettivament, ġiet imneħħija peress li dan l-approċċ wera li ma kienx affidabbli [7]. Mit-tliet metodi ewlenin, TUNEL huwa l-aktar sensittiv, li jieħu l-inqas ħin, u l-aktar applikabbli b'mod universali. Jista 'jintuża f'ċelloli u tessuti kkultivati ​​u għall-mekkaniżmi kollha tal-mewt taċ-ċelluli. Huwa preċiż, kwantitattiv, faċilment marbut ma 'ċelluli partikolari jew kompartimenti tat-tessuti, u jista' jiġi kkombinat ma 'immunoistokimika biex tippermetti identifikazzjoni affidabbli tat-tipi ta' ċelluli jew mekkaniżmi ta 'korriment taċ-ċelluli assoċjati ma' sinjali pożittivi għal TUNEL [2].

Pawżi tad-DNA li jistgħu jitkejlu minn TUNEL huma prodotti prinċipalment minn endonucleases apoptotiċi. L-aktar endonucleases attivi fil-kliewi huma deoxyribonuclease 1 (DNase I) u endonuclease G (EndoG) [8-10]. DNase I huwa l-aktar endonuclease apoptotiku attiv u abbundanti fil-mammiferi [11]. Il-kliewi, il-glandoli tal-bżieq, il-frixa, u l-imsaren huma organi magħrufa li jipproduċu ammonti għoljin ta 'DNase I. Ċelloli epiteljali fil-glandoli tal-bżieq, frixa, u l-imsaren inixxu DNase I bħala enzima diġestiva fl-apparat alimentari. Xi DNase I ċellulari jiġġieled kontra d-DNA "barranin" li jinvadi ċelloli ospitanti [12]. Id-DNase I mhux segreted jippreżenta periklu moħbi għad-DNA taċ-ċellula ospitanti, iżda normalment id-DNases ma jaġixxux fuq id-DNA taċ-ċellula ospitanti sakemm issir korriment jew il-mewt taċ-ċellula. Fil-kliewi, DNase I jiġi mnixxi minn ċelluli epiteljali tubulari, preżumibbilment biex jeqirdu viruses u batterji fl-awrina. Din il-funzjoni x'aktarx isseħħ flimkien ma 'proteinażi, b'mod partikolari, meprin, li hija l-proteinasi prinċipali fl-awrina [13]. Għalkemm huwa protettiv kontra l-infezzjoni, il-preżenza ta 'DNase attiva ħafna fil-kliewi tagħmel dan l-organu vulnerabbli għal korriment, fejn l-attività ta' DNase hija magħrufa li hija ċitotossika għaċ-ċelloli ospitanti. Id-DNases jippromwovu l-mewt taċ-ċelluli indotta minn stimuli tossiċi jew iposiċi u jeqirdu ċ-ċelluli kollha tad-DNA tal-kliewi ospitanti rilaxxati bħala riżultat tal-mewt taċ-ċelluli.

Kliewihuma organi li jiffiltraw li jneħħu komposti tossiċi mill-ġisem. L-attività għolja tad-DNase I fil-kliewi tagħmel iċ-ċelloli tal-kliewi sensittivi ħafna għall-ħsara minn komposti tossiċi u l-prodotti metaboliċi tagħhom. Dan jagħmel TUNEL l-aktar metodu xieraq u applikabbli biex titkejjel il-ħsara lill-kliewi. F'din ir-reviżjoni, se niffukaw fuq TUNEL bħala assaġġ użat ħafna, informattiv u preċiż għall-kejl tal-mewt taċ-ċelluli u l-ħsara fit-tessuti fil-kliewi. Se niddiskutu aspetti ta’ TUNEL kif japplika għal mard u korriment tal-kliewi u nidentifikaw kwalitajiet, tekniki u karatteristiċi ta’ TUNEL li ma jintużawx biżżejjed biex nippromwovu l-użu produttiv u xieraq ta’ dan l-assaġġ qawwi fir-riċerka, id-dijanjostika u t-terapija tal-mard tal-kliewi. Se niddiskutu wkoll diversi mudelli ta 'immaġni TUNEL li jistgħu jkunu marbuta ma' mekkaniżmi ta 'mewt taċ-ċelluli. Il-punti mqajma f'din ir-reviżjoni huma ġeneralment applikabbli għall-użu ta' TUNEL f'organi minbarra l-kliewi.

Kliem ewlieni:TUNEL; mewt taċ-ċelluli; kliewi; DNases; endonukleażi; korriment tat-tessut

Prinċipji TUNELL-assaġġ TUNEL ġie żviluppat fl-1992 minn Gorczyca et al. [14] u Gavrieli et al. [15], bl-użu ta' tikkettjar ta' fluorochrome u avidin-peroxidase, rispettivament. F'dak iż-żmien, kien hemm ħtieġa ddisprata għal metodi ġodda biex tiġi vvalutata l-apoptożi, u TUNEL imla dan il-vojt b'suċċess. Inizjalment imqiegħed fis-suq bħala assaġġ għal waqfiet tal-fergħat tad-DNA waqt jew assoċjati ma 'apoptożi [14,16], fin-nuqqas ta' analiżi aħjar, TUNEL malajr sar l-assaġġ standard għall-apoptożi [17,18]. Madankollu, ġie rikonoxxut kważi immedjatament mir-riċerkaturi li TUNEL kejjel b'mod indiskriminat kwalunkwe frammentazzjoni tad-DNA, mhux biss dik assoċjata mal-apoptożi [19-21]. Madankollu, il-ħtieġa għal analiżi apoptotiċi kienet tant kbira li r-rapporti rari ta 'TUNEL mhux speċifiku għall-apoptożi ġew ġeneralment injorati. Dan wassal għal ammont enormi ta’ rapporti pożittivi foloz ta’ apoptożi fil-kliewi u organi oħra, sal-grad fejn sa 20 fil-mija taċ-ċelluli totali kienu rrappurtati apoptotiċi anke mingħajr korriment [22–25] meta bidliet bħala żgħir daqs 0.01 fil-mija jista 'jkun statistikament evidenza sinifikanti ta' ħsara fit-tessuti.

L-assaġġ TUNEL esperjenza rinaxximent f'dawn l-aħħar snin mit-tmiem tal-isplużjoni fl-istudji tal-apoptosi ftit snin ilu. It-tfittxija tagħna PubMed ta' artikli ta' ġurnali li jinvolvu termini "kliewi" u "TUNEL" ipproduċiet aktar minn 1500 riżultat mill-1992 sal-2020. Fl-2019, ġew ippubblikati 170 artiklu, l-ogħla numru f'sena waħda matul l-aħħar 28 sena (Figura S1) u li jikkostitwixxu l-maġġoranza tal-artikoli mistħarrġa għal din ir-reviżjoni. Bosta studji użaw il-pożittività ta 'TUNEL bħala miżura universali tal-mewt taċ-ċelluli assoċjata mal-frammentazzjoni tad-DNA f'tipi oħra ta' mewt taċ-ċelluli minbarra l-apoptożi. Pereżempju, ferroptosis, forma li għadha kif ġiet skoperta ta 'mewt taċ-ċelluli programmata, mhux apoptotika ikkawżata minn ħsara ossidattiva li sseħħ waqt iskemija-riperfużjoni renali (IR) fil-ġrieden, tista' tiġi skoperta minn TUNEL [26]. Il-piroptosi, li hija forma infjammatorja ta 'mewt taċ-ċelluli programmata li hija distinta minn apoptożi u nekrożi, hija murija li hija assoċjata ma' sinjali pożittivi għal TUNEL [27,28]. Il-pożittività ta 'TUNEL ġiet osservata waqt necroptosis li kkontribwiet għat-tnaqqis progressiv taċ-ċelluli tat-tubuli renali fil-firien soġġetti għal nefrectomija subtotal [29]. Fil-kliewi u tessuti oħra, instabu sinjali pożittivi ta’ TUNEL fin-nekrożi [30,31], awtofaġija disregolata [32–35], anoikis [36,37], katastrofi mitotika [35,38], awtoliżi [39], Pautoliżi [39], proptożi [40], u aponewrożi [30], li juru TUNEL bħala analiżi tassew universali għall-mewt taċ-ċelluli irriversibbli.

L-assaġġ TUNEL huwa bbażat fuq it-tikkettjar tat-truf 3'OH minn enzima tad-DNA speċifika għat-tarf 3'OH, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) (Figura). L-użu ta 'DNA polymerase jew Klenow fragment DNA polymerase minflok TdT jista' jgħin biex jiddetermina t-tip ta 'truf 3'OH (nikkijiet, vojt, jew oligos imdendlin) minħabba li l-polimerażi tad-DNA jeħtieġu mudell (il-linja tad-DNA opposta) u għalhekk mhux se jittikkettjaw. truf tad-DNA li jiddendlu jew jisporġu 'l barra. Huwa importanti li wieħed jiftakar li l-produzzjoni tat-truf tad-DNA 3ZOH mhijiex unika għal endonucleases apoptotiċi (degradanti tad-DNA). It-truf tad-DNA 3'OH huma sinjal ewlieni ta '"komunikatur", denominatur komuni tal-maġġoranza tal-enzimi tad-DNA. Huma prodotti u użati minn kważi l-enzimi tad-DNA kollha fl-ewkarjoti, inklużi endonucleases (apurinic/apyrimidinic, AP) tad-DNA, exonucleases, DNA polymerases, DNA ligases, DNA transferases, u topoisomerases. Barra minn hekk, 3'Id 3z-zokkor, jew 3z-protein konjugates jistgħu jiġu kkonvertiti għal 3'OH terminis minn phosphatases, glycosylases, u proteinases, rispettivament. Huwa għalhekk li fehim preċiż ta 'dak li qed jitkejjel huwa meħtieġ għall-applikazzjoni b'suċċess ta' TUNEL u l-interpretazzjoni tar-riżultati tiegħu.

Meta mqabbel ma 'żewġ metodi primarji oħra ta' kejl tal-frammentazzjoni tad-DNA, sellum tad-DNA u assaġġ tal-kometa, TUNEL għandu l-vantaġġ li jkun ibbażat fuq l-identifikazzjoni tat-termini tad-DNA aktar milli frammenti (Figura 2). Teoretikament, TUNEL għandu jkun aktar sensittiv u lineari għall-identifikazzjoni tal-frammentazzjoni inizjali (baxxa) tad-DNA minn sellum tad-DNA jew kometa, li t-tnejn għandhom perjodu ta' dewmien ta' akkumulazzjoni ta' frammenti żgħar ta' mobilità għolja. Fi kwalunkwe każ, studji li jgħaqqdu TUNEL jew mal-kometa )41,42] jew is-sellum tad-DNA [43,44] għandhom xi vantaġġ li jaqbdu l-frammentazzjoni bikrija tad-DNA b'sensittività massima.

Applikazzjonijiet TUNELTUNEL jintuża biex jidentifika u jikkwantifika l-ħsara fil-kliewi fi studji tossikoloġiċi kliniċi u bażiċi f'firxa varjata ta' applikazzjonijiet, inklużi trattamenti mediċi [45], espożizzjonijiet ambjentali [46], agrikoli [41] u industrijali [47], u annimali [48] ] u x-xjenzi tal-ikel [49]. TUNEL huwa applikabbli għat-tipi kollha ta 'ċelluli, organi, u speċi li għandhom DNA u DNases, li jinkludi kważi l-ispeċi kollha. TUNEL intuża biex jidentifika u jikkwantifika l-ħsara fil-kliewi f'firxa wiesgħa ta' annimali, inkluż zebrafish [50], ħut tar-ross Ġappuniż [51], tiġieġ [48], gerbils [52], ġrieden [41], firien [45], rabb tiegħu [53], ħnieżer żgħar [54], u bnedmin [55]. Vantaġġ importanti ta 'TUNEL huwa li jista' jintuża f'ċelloli kkultivati ​​fissi kif ukoll f'tessuti fissi. Dan jipprovdi konsistenza metodoloġika għat-tqabbil bejn ir-riżultati in vitro u in vivo fi studji li fihom il-mekkaniżmi jistgħu jiġu investigati f'ċelloli kkultivati ​​tal-kliewi, filwaqt li implikazzjonijiet in vivo huma vvalutati fil-kliewi tal-annimali. Kwalunkwe ħaġa bejn ċelluli u tessuti sħaħ tista 'tintuża wkoll, inklużi spherojdi taċ-ċelluli kkultivati ​​[56] u slices tal-kliewi ex vivo [57,58].

L-intensità ta 'TUNEL f'termini tas-saħħa tas-sinjal jew in-numru ta' ċelluli pożittivi għal TUNEL jistgħu jvarjaw bejn l-ispeċi skond l-attività tad-DNases. Fl-esperjenza tagħna, il-kliewi tal-firien għandhom DNase I aktar attiv mill-kliewi tal-ġrieden, u s-saħħa tas-sinjal pożittiv għal TUNEL tikkorrelata ma 'dan. Meta l-kliewi jitqabbel ma 'organi oħra, is-sinjal pożittiv għal TUNEL tiegħu huwa intens ħafna u simili għal organi oħra b'attività għolja ta' DNase I, bħall-imsaren u l-glandola tal-bżieq. Fuq in-naħa l-oħra tal-ispettru, l-inqas qawwa tas-sinjal pożittiv għal TUNEL hija osservata fiċ-ċelloli tal-moħħ u tat-tumur/kanċer, fejn l-espressjoni tad-DNase I x'aktarx hija inattivata minn splicing alternattiv fir-reġjun tal-kodifikazzjoni [59]. Sinjal pożittiv għal TUNEL huwa osservat fit-tipi kollha ta 'ċelluli fil-kliewi. Bħala medja, l-epitelju tubulari huwa mħassra aktar spiss mill-glomeruli, speċjalment f'korrimenti akuti (Figura 3A). Dan jikkorrelata sew mal-attività DNase I prevalenti f'dawn it-tipi ta 'ċelluli. Meta wieħed jiġġudika mid-differenzi ta 'sess u età osservati fl-esperimenti tagħna, DNase I huwa aktar abbundanti u attiv fl-irġiel minn nisa u annimali ta' età medja meta mqabbel ma 'annimali qodma jew ta' età tat-twelid. Madankollu, l-ebda differenza ċara fil-pożittività TUNEL hija evidenti fir-rigward tas-sess jew l-età, probabbilment minħabba li l-prominenti jew hija predominata minn fatturi oħra. F'xi mudelli tal-kliewi (bħal iskemija-riperfużjoni), id-DNase I hija indotta [9]; filwaqt li f'oħrajn, mhuwiex u jista' saħansitra jiġi mrażżan (per eżempju, fit-tossiċità taċ-ċisplatin) [10]. L-attivazzjoni tal-endonukleażi, jekk preżenti, intweriet li sseħħ fl-ewwel 24 siegħa wara l-ħsara fil-kliewi [9,60,61]. Għalhekk, ma kienx sorprendenti li mill-inqas nofs l-applikazzjonijiet TUNEL fir-riċerka tal-kliewi f'din ir-reviżjoni ntużaw għal ħsara akuta fil-kliewi (AKI) peress li l-valutazzjoni tal-AKI ħafna drabi ssir fi żmien 24 sa 72 siegħa wara l-ħsara meta l-endonukleażi huma l-aktar attivi. . Il-lista ta 'studji AKI hija twila u tinkludi korrimenti tossiċi, settiċi, trapjant, u hypoxic. F'dan ix-xogħol, stħarrejna l-mudelli, it-tipi ta 'espożizzjoni, it-trattamenti, il-kalendarji tal-valutazzjoni, u t-tipi ta' ċelluli affettwati f'dawn l-istudji. L-istudji li ġew mistħarrġa koprew modi akuti u mħallta ta' korriment fil-kliewi u mard kroniku tal-kliewi.

Jekk tiġix osservata ħsara fil-kliewi b'sinjal pożittiv għal TUNEL fit-tubuli jew il-glomerulus jiddependi mit-tip ta 'aġent ta' ħsara jew marda. Pereżempju, in-nefrite tal-lupus fil-bnedmin u l-ħsara tan-nanopartiċelli tan-nikil kienet deskritta bħala li għandha sinjali stretti pożittivi għal TUNEL glomerulari [62,63]. Min-naħa l-oħra, iskemija-riperfużjoni u nefropatija dijabetika indotta minn streptozotocin fil-firien ipproduċew ċelluli pożittivi għal TUNEL biss fit-tubuli [64,65]. It-tubuli prossimili, il-linja ta 'Henle, it-tubuli distali, u l-katusi kollettivi ħafna drabi huma pożittivi għal TUNEL f'mudelli ta' iskemija-riperfużjoni. Ċelloli pożittivi għal TUNEL kemm fil-glomeruli kif ukoll fit-tubuli ġew deskritti fil-firien esposti għal mediċini bħal cyclosporine A [66] u doxorubicin [67] jew materjali ta’ prodotti għall-konsumatur bħal nanopartiċelli ta’ ossidu taż-żingu [68] u f’mudell ta’ firien tad-dijabete mellitus [68] . 69]. L-AKI indotta minn xokk settiku fil-bnedmin kienet assoċjata wkoll ma' ċelluli kemm glomerulari kif ukoll tubulari pożittivi għal TUNEL [70]. l-ostruzzjoni tal-musrana ż-żgħira ta' ċirku magħluq strangulat ikkawżat TUNEL-pożittività fil-kliewi fi 3h [87].

AKI jista 'jseħħ wara trapjant u korrimenti iposiċi. Ir-rifjut tal-allograft fil-bnedmin huwa komunement assoċjat mal-elevazzjoni taċ-ċelloli pożittivi għal TUNEL [88,89]. Wara l-iskemija kiesħa, iċ-ċelluli pożittivi għal TUNEL kienu ġeneralment osservati fi żmien 2-24 siegħa waqt ir-riperfużjoni [90], jew b’mod aktar dejjaq, bejn 14 u 17-il siegħa wara l-iskemija [91], u xi drabi għadna osservati sa 7 ijiem f’ rifjut tat-trapjant [92]. Bl-istess mod, f'mudelli ta 'iskemija-riperfużjoni, ċelluli pożittivi għal TUNEL kienu l-aktar spiss osservati 24 siegħa wara riperfużjoni [44,93,94], jew fil-medda ta' bejn 4 [95,96] u 72 siegħa [97]. Kemm fi studji ta 'trapjant kif ukoll ta' AKI iskemiku, ċelluli pożittivi għal TUNEL kienu lokalizzati għal ċelluli epiteljali tubulari distali u prossimali [44,93]. Fil-ġurdienkliewiwara korriment ta 'iskemija-riperfużjoni, ċelluli pożittivi għal TUNEL kienu deskritti bħala kkonċentrati fil-junction corticomedullary, il-mira tas-soltu ta' ħsara iskemika [98].

Korriment imħallat akut u kroniku, fejn esponimenti tossiċi, stati ta’ mard, u/jew valutazzjonijiet kienu kemm akuti (jiġifieri, sigħat, jiem) kif ukoll kroniċi (jiġifieri, ġimgħat, xhur, snin) fl-istess studju, kienu osservati fi trapjant uman rifjut (bijopsija ġimgħa sa 3 snin wara t-trapjant) [88], infezzjoni tal-virus tal-epatite E tal-ħnieżer (7 u 14-il jum wara l-inokulazzjoni) [52], stress indott minn CO2 pnewmoperitoneum f’idronefrotikukliewi(ġimagħtejn idronefrożi, jumejn wara l-pnewmoperitoneum) [53], glomerulonefrite proliferattiva mesanġjali indotta minn velenu tas-serp (1 sa 14-il jum wara l-injezzjoni) [99], ostruzzjoni ureteral unilaterali (1 sa 14-il jum ta’ ostruzzjoni) [100], espożizzjoni għall-uranyl acetate (espożizzjoni minn 1 sa 28 jum) [101], nefropatija tal-aċidu aristokoliku (espożizzjoni ta’ kuljum ta’ 5 u 30-ijiem) [102], u iperossja tat-twelid (ittestjata minn 1 sa 60 jum wara t-twelid, esposta għal iperossja l-ewwel 14) jiem) [103]. Erbatax-il jum wara l-impatt huwa punt ta' żmien ta' valutazzjoni komuni ħafna għal dawn it-tipi ta'korrimenti fil-kliewi[52,53,99,101,103]. Fil-maġġoranza tal-każijiet, ċelluli pożittivi għal TUNEL kienu lokalizzati f'tubuli u kanali kollettivi. L-unika eċċezzjoni kienet it-tossiċità tal-velenu tas-serp, li primarjament għamlet ħsara lill-glomeruli [99].

Kronikakliewimarda (CKD), definita bħala l-preżenza takliewiħsara jew rata ta’ filtrazzjoni glomerulari mnaqqsa (GFR) fil-bnedmin għal aktar minn 3 xhur, hija wkoll suġġett komuni għall-valutazzjoni TUNEL, li tista’ tiddetermina jekk CKD hijiex assoċjata ma’ progressiva.ħsara fil-kliewi.L-aktar CKD studjata b'mod komuni li fiha jiġi applikat TUNEL hija n-nefropatija dijabetika. Il-ħsara identifikata minn TUNEL-pożittività seħħet fit-tubuli u podocytes [69] f'pazjenti dijabetiċi b'bidu ta 'dijabete qabel l-ittestjar TUNEL li jvarjaw minn 7 sa 30 sena [104,105] u 2 sa 16-il ġimgħa wara trattament streptozotocin f'annimali gerriema [106,107]. Istopatoloġija simili pożittiva għal TUNEL kienet irrappurtata fin-nefropatija tal-immunoglobulina A [22]. Fil-lupus nefrite u glomerulonefrite membranoproliferattiva, il-pożittività ta 'TUNEL dehret primarjament fil-glomeruli [62,108,109]. Min-naħa l-oħra, studji dwar is-sigurtà tad-droga ta 'cisplatin [110], chloroquine [45], doxorubicin [67], finasteride [23], tacrolimus [111], u levetiracetam [24] osservaw l-aktar ħsara tubulari. Bl-istess mod, il-ħsara akuta kontinwa identifikata minn ċelluli tubulari pożittivi għal TUNEL ġiet deskritta fi studji ta 'nefropatija tal-aċidu uriku [112], defiċjenza ta' methionine [48], espożizzjoni għal tossini ambjentali microcystin-LR [50], u kadmju [113], u f' assoċjazzjoni mal-kalċju-oxalate indottakliewiġebel [114] u nanopartiċelli li jikkalċifikaw [115]. Filwaqt li l-identifikazzjoni tal-ħsara progressiva fil-kliewi waqt CKD bl-użu tal-assaġġ TUNEL hija għodda dijanjostika utli, il-kombinazzjoni tal-assaġġ TUNEL mal-immunoistokimika (IHC) forsi tkun saħansitra aktar informattiva biex jiġi ddeterminat il-mekkaniżmu tal-ħsara.

Tekniki ta' Kwantifikazzjoni u Kolokalizzazzjoni TUNEL

Il-metodi ta' kwantifikazzjoni ta' TUNEL ivarjaw. Fil-maġġoranza tar-rapporti, ċelluli/nuklei pożittivi għal TUNEL huma kkwantifikati bħala l-perċentwali taċ-ċelluli/nuklei totali [83,116,117]. Din tidher l-aħjar ħaġa li għandek tagħmel, għalkemm in-numru ta 'ċelloli pożittivi għal TUNEL x'aktarx ma jikkorrispondix eżatt man-numru ta' ċelloli mejta. Xi ċelluli jistgħu ma laħqux livelli identifikabbli ta 'frammentazzjoni tad-DNA, filwaqt li oħrajn setgħu diġà ġew eliminati mill-makrofagi. Il-kwantifikazzjoni tan-numru ta 'ċelluli pożittivi għal TUNEL għal kull unità kwadra (mm2) tintuża wkoll [118], iżda dan il-metodu jidher inqas preċiż minħabba li jiddependi fuq il-post u l-kontenut tat-tip taċ-ċellula taż-żoni. Is-sezzjonijiet kortikali fihom l-aktar glomeruli, tubuli, vini tad-demm, u raġġi medullari, filwaqt li sezzjonijiet medullari primarjament fihom loops ta 'Henle, kanali tal-ġbir, u vini tad-demm. Kwantifikazzjoni "għal kull Fifield" ċertament tiddependi fuq x'inhu l-qasam [72,119], u kwantifikazzjoni "għal kull sezzjoni" hija, saħansitra aktar, mhux definita [61,120]. Jidher li kejl identifikat ħażin, bħal "punteġġ istoloġiku" [121], "indiċi apoptotiku" [113], "rata ta' apoptożi" [92], "perċentwal ta' apoptożi" [122], jew perċentwal ta' kontroll mhux trattat [123,124] ikunu saħansitra inqas xierqa, u jagħmlu l-interpretazzjoni diffiċli u mhux komparabbli mal-maġġoranza tal-istudji.

Il-mewt taċ-ċelluli fiċ-ċelloli ġirien tibda b'mod irregolari minħabba li tiddependi fuq il-vaskularizzazzjoni, iċ-ċiklu taċ-ċelluli, u varjabbli oħra. Dan ta 'spiss jirriżulta fi tbajja' irregolari ta' TUNEL taċ-ċelloli fit-tessut [45,96,125]. B'mod sorprendenti, l-intensità ġenerali tas-sinjal pożittiv għal TUNEL ma tintużax għall-kejl ta 'TUNEL, minkejja li tiddependi direttament fuq il-grad ta' frammentazzjoni tad-DNA. Dan forsi minħabba li ċ-ċelloli jitqiesu mejta indipendenti mill-intensità tas-sinjal TUNEL, peress li ċellola ma tistax tkun "aktar mejta" jekk it-tbajja 'TUNEL tkun aktar intensa. Għalkemm huwa diffiċli li jitqabblu studji li jużaw varjetà wiesgħa ta 'metodi biex jikkwantifikaw ir-riżultati ta' TUNEL, l-ammont ta 'ċelluli pożittivi għal TUNEL f'annimali ta' kontroll huwa ġeneralment taħt it-2 fil-mija [75,99,100,116,126]. Korriment akut huwa assoċjat ma 'żieda ta' ~ 5-40× fil-pożittività ta 'TUNEL [79,126,127]. Waqt korriment kroniku, iż-żieda fiċ-ċelloli pożittivi għal TUNEL hija kemxejn aktar baxxa, ~2–20-darbiet, [29,43,65] meta mqabbla ma 'kontrolli mhux ittrattati.

L-assaġġ inizjali TUNEL ibbażat fuq it-tbajja tad-diaminobenzidine (DAB) kien iddisinjat għall-mikroskopija tad-dawl [14,15]. Dan il-metodu tradizzjonali kien għadu użat f'żewġ terzi tal-istudji mistħarrġa f'din ir-reviżjoni u fil-maġġoranza assoluta tal-istudji tal-bijopsija umana. Il-kwantifikazzjoni ssir bl-għadd manwali taċ-ċelluli u, filwaqt li hija preċiża, tieħu ħafna ħin. Ħafna drabi, il-kwantifikazzjoni ma tintuża xejn, u r-riżultati huma ppreżentati bl-użu ta 'immaġni ta' kampjuni ttrattati u mtebbgħin bħala evidenza sempliċi li seħħet il-mewt taċ-ċelluli. L-awtomazzjoni tista' tħaffef il-proċess ta' kwantifikazzjoni [128,129]. Madankollu, DAB ma jistax jiġi kkombinat ma 'xi tbajja oħra fl-istess kampjun, u għalhekk TUNEL ibbażat fuq DAB jista' jipprovdi biss in-numru ta 'ċelluli mejta, mingħajr ebda identifikazzjoni tat-tip ta' ċellula (ħlief rikonoxximent viżwali) jew mekkaniżmu ta 'mewt taċ-ċelluli.

Filwaqt li l-istudji umani jiddependu bil-kbir fuq TUNEL ibbażat fuq DAB li juża mikroskopija tad-dawl, madwar nofs l-istudji fuq l-annimali jużaw mikroskopija fluworexxenti FL (Figura 3). TUNEL fluworexxenti huwa viżwalment attraenti, faċilment interpretabbli, u għandu diversi vantaġġi kbar. Minbarra kwantifikazzjoni preċiża permezz ta 'identifikazzjoni ta' nuklei pożittivi għal TUNEL jew intensità medja tal-kulur, is-sinjal fluworexxenti FL TUNEL jista 'jiġi colocalized ma' kuluri oħra għall-istokimika (eż., DAPI) (Figura 3A) jew IHC (Figura 3B). F'dawn tal-aħħar, l-użu ta 'markaturi ta' proteini jista 'jgħin biex jiġu identifikati sinjali pożittivi għal TUNEL assoċjati ma' differentikliewikompartimenti jew agħti informazzjoni dwar it-tip ta’ mewt taċ-ċelluli. Ma stajna nsibu l-ebda eżempju ta’ TUNEL flimkien ma’ tbajja’ doppja ta’ antikorpi IHC. Filwaqt li kombinazzjoni bħal din tkun informattiva ħafna, pereżempju, għall-identifikazzjoni ta 'mekkaniżmu ta' mewt taċ-ċelluli f'ċerti tipi ta 'ċelluli, id-diffikultajiet tekniċi assoċjati ma' tali tbajja' jistgħu jegħlbu l-benefiċċji.

Identifikazzjoni ta'kliewitip ta 'ċellula hija ċertament mhux problema għal esperjenzakliewipatologu [104]. Minħabba dan, l-użu ta 'markaturi addizzjonali għall-identifikazzjoni tat-tip taċ-ċelluli, pereżempju, bl-użu ta' CD31 għall-identifikazzjoni ta 'ċelluli endoteljali [130], huwa rari. Madankollu, l-użu ta 'markaturi tal-proteini IHC għall-karatterizzazzjoni tal-ħsara fit-tessut huwa spiss użat. Ħafna studji jużaw il-pożittività TUNEL bħala l-unika evidenza ta 'apoptożi. Fi studji oħra, ir-rikonoxximent li l-pożittività TUNEL mhix speċifika għall-apoptożi wassal għal bosta markaturi morfoloġiċi (eż., ematossilin u eosin jew aċidu perjodiku–Schiff), bijokimiċi u IHC li għandhom jiġu kkombinati ma 'tbajja' TUNEL biex tikkonferma l-apoptożi. L-iktar markatur użat b'mod komuni għall-apoptożi dipendenti fuq il-kaspasi huwa caspase cleaved (attiv)-3 bl-użu ta' antikorp li ma jagħrafx il-caspase ta' daqs sħiħ-3 [131,132]. Kemm l-analiżi ta' TUNEL kif ukoll ta' caspase cleaved-3 wrew tebgħa esklussivament tubulari, mhux glomerulari, fl-iskemija-riperfużjoni tal-firien [64]. Studji oħra tal-caspase użaw caspase-1 [27], -9 [53], -11 [28], u -12 [75]. Markers apoptotiċi oħra kienu jinkludu l-familja tal-proteini Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49], u Bad taċ-ċelluli B 2 (Bcl2). [43]; riċettur apoptotiku Fas [52] u riċettur-ligand apoptotiku FasL [66]; fatturi ta' traskrizzjoni tal-proteini tal-forkhead box (FOX) Fox01 [133] u Fox03 [27]; u ċitokromu ċ [53]. L-infjammazzjoni ġiet identifikata mill-IHC tal-fattur-alfa tan-nekrożi tat-tumur (TNF) [134]; fatturi tat-tkabbir tat-tumur TGF [66] u TGF- 1 [135]; serine/threonine kinase 1 (SGK1) [135]; flavoprotein tat-trasferiment tal-elettroni, subunità beta (ETF) [136]; Janus kinase-2 (JAK2) [137]; transducer tas-sinjal u attivatur tat-traskrizzjoni 3 (STAT3) [137]; fattur nukleari kappa-light-chain enhancer ta 'ċelluli B attivati ​​(NF-κB) [137] u l-proteina inibitur tagħha IκB [137]. Għalkliewistima ta' korriment, molekula ta' korriment tal-kliewi-1 (KIM-1) [24], kanal tal-akkwaporin-1 (AQP-1) [45], fattur li jinduċibbli mill-ipoksja {{7} }fattur ta' traskrizzjoni alfa (HIF-1 ) [103], trasportatur ta' amino acid tat-tip Asc-1 (Asc-1) [121], mira mammiferi tar-rapamiċin (mTOR) [131] kinase , u transglutaminase II [89] ġew użati. Korriment ossidattiv tal-kliewi ġie studjat bl-użu ta' markaturi bħal 8-hydroxyguanosine (8OHdG) [102], lipokalin assoċjat ma' newtrophil gelatinase (NGAL) [102], deacetylase sirtuin dipendenti fuq NAD-1 (SIRT1) [138] , u heme oxygenase 1 (HO-1) [90]. Kinases ġew studjati b'mod intensiv, inkluż il-passaġġ c-Jun N-terminal kinase (JNK) [101], phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/nuclear factor erythroid 2-fattur ta' traskrizzjoni relatat mal-fattur 2 (PI3K/ Akt/Nrf2) mogħdija [46], pannexin-1 (PANX1) proteina tal-junction tal-membrana tal-plażma [26], u proteina kinase attivata minn mitoġenu/kinase regolata minn sinjal extraċellulari (MAPK/ERK) [26]. Studji ta' endonucleases apoptotiċi involvew DNase attivat b'caspase (CAD) [139], DNase I [108], u EndoG [139], u markaturi ta' ħsara fid-DNA kienu jinkludu proteina tat-tumur p53 (p53) [99] u proteina 1 relatata mad-dinamina (PARP1). ) [66]. Xi studji sabu wkoll utli l-valutazzjoni tal-apoptożi medjata mill-istress tar-retikulu endoplasmiku u l-ħsara fit-tessuti [75].

Minħabba numru kbir ta 'studji mekkanistiċi mistħarrġa u l-vantaġġ li tgħaqqad TUNEL ma' markaturi IHC għall-identifikazzjoni ta 'mekkaniżmi ta' mewt taċ-ċelluli, wieħed jistenna ħafna studji li jużaw colocalization bejn it-tnejn. L-analiżi tista 'titwettaq permezz ta' colocalization pixel b'pixel bejn ċelluli pożittivi TUNEL u markaturi IHC, intensità medja tal-markatur IHC f'żoni pożittivi għal TUNEL, jew sinjal pożittiv għal TUNEL tfisser intensità f'żoni pożittivi għall-markatur IHC. Sfortunatament, dan il-vantaġġ ta 'TUNEL intuża biss fi ftit studji. Iċ-ċelluli pożittivi għal TUNEL ġew kolokalizati b'caspase cleaved-3 inkliewitubuli waqt it-tossiċità tal-acetaminophen fil-firien [74]. Il-kololizzazzjoni tal-IHC b'sinjal pożittiv għal TUNEL ippermettiet l-identifikazzjoni tal-mewt taċ-ċelluli taċ-ċelluli mesanġjali waqt in-nefrite Habu [99]. Fil-mikroskopija tad-dawl, colocalization b'markaturi mekkanistiċi ta 'tossiċità saret f'sezzjonijiet serjali, kif irrappurtat minn Ott et al. [89].

TUNEL Problemi u Limitazzjonijiet

Jistgħu jseħħu diversi problemi potenzjali u għandhom ikunu mistennija meta taħdem ma' TUNEL. Waħda hija li t-terminali tad-DNA 30OH iseħħu mhux biss waqt il-mewt taċ-ċelluli bħala riżultat ta 'azzjoni ta' endonuclease iżda wkoll bħala metabolit intermedju normali fi kważi r-reazzjonijiet enżimatiċi kollha bid-DNA. Funzjoni taċ-ċellula primarja li tipproduċi 30OH termini hija s-sinteżi tad-DNA, li fiha bosta frammenti Okazaki jistgħu teoretikament jipproduċu sinjal TUNEL falz pożittiv, speċjalment f'modifiki sensittivi ħafna tal-assaġġ. Matulkorriment fil-kliewi,It-tiswija tad-DNA tista' tikkontribwixxi wkoll għal sinjali foloz pożittivi għal TUNEL bħala riżultat ta' azzjoni AP endonuclease. Korriment massiv ossidattiv tal-kliewi indott minn korriment kimiku (perossidu idroġenu, bleomycin) jew fiżiku (irradjazzjoni gamma) jista 'jżid man-numru ta' truf 30OH, u jżid il-qari ta 'TUNEL pożittiv falz apparti mill-frammentazzjoni tad-DNA medjata minn endonuclease.

Iktar ta 'spiss u aktar probabbli, kundizzjonijiet sperimentali stabbiliti b'mod mhux xieraq tar-reazzjoni TdT (ħin, temperatura, attività enżimatika, jew kofatturi) jistgħu jirriżultaw fi sfond ta' sinjal pożittiv għal TUNEL elevat artifiċjalment. Għalkemm jibqa' mhux definit dwar dak li hu meqjus bħala l-linja bażi normali għal kampjuni ta' tessut tal-kliewi mhux ittrattati, jidher plawsibbli li madwar 1 fil-mija taċ-ċelloli totali jkun numru raġonevoli. Ċertament, sfond ta '10 fil-mija jew ogħla huwa evidenza ċara ta' kundizzjonijiet ta 'assaġġ mhux karatterizzati u mhux raffinati jew devjazzjoni minn kundizzjonijiet xierqa ta' ħażna ta 'kampjuni.

Problema oħra li wieħed jistenna hija attività baxxa ta’ DNase I f’xi tipi ta’ ċelluli (eż. endotelju),kliewikompartimenti (eż., glomeruli), jew tessuti patoloġiċi (eż., tumuri). Dawn iċ-ċelloli għandhom ikunu mistennija li juru pożittività baxxa ta' TUNEL, mhux għax huma reżistenti għall-korrimenti, iżda minħabba li m'hemmx biżżejjed attività endonuclease biex tipproduċi sinjal li jista' jitkejjel f'TUNEL. Fl-esperjenza tagħna, anke bidliet bejn {{0}}.01 fil-mija u 0.1 fil-mija taċ-ċelloli pożittivi TUNEL jistgħu jkunu statistikament sinifikanti u użati bħala evidenza solida ta 'korriment fil-kliewi (ta' tessut ieħor).

Fl-aħħarnett, tqum problema bil-kwantifikazzjoni tat-tbajja’ ta’ TUNEL meta l-ammont ta’ frammentazzjoni tad-DNA jkun għoli wisq, pereżempju, fi stadji tard ta’ mewt taċ-ċelluli jew fi ġrieħi ta’ intensità għolja, fejn id-DNA li jifdal ma jistax jiġi kkontrosikkat b’mod xieraq bid-DAPI minħabba ż-żarmar tal- helix doppja (Figura 3D). F'dawn il-każijiet, sinjali pożittivi għal TUNEL huma "mdendlin fl-arja", u jidher li mhumiex assoċjati ma 'nukleu. Isir ir-responsabbiltà ta 'patologu li jinterpreta dawn bħala ċelluli pożittivi għal TUNEL aktar milli artifatt. B'TUNEL ittikkettat bil-fluworexxeina, hemm il-periklu li tiġi identifikata l-awtofluworexxenza fl-isfond fit-tessut bħala TUNEL-pożittività [140]. F'dawn il-każijiet, bidla għall-ispettru aħmar TUNEL [51,54] huwa rakkomandat.

Disinji TUNEL bħala Sors ta' Informazzjoni Addizzjonali

Diversi mudelli TUNEL jistgħu jiġu distinti b'mod ċar u użati biex jiddeterminaw mekkaniżmu potenzjali u grad ta 'korriment (Tabella 1, Figura 3). Normalment, tip ta' mudell TUNEL ta' nuklei biss huwa prodott minn korriment ħafif, filwaqt li korriment aktar qawwi (jiġifieri, espożizzjoni elevata) jirriżulta fi tbajja u diżintegrazzjoni aktar qawwija ta 'nuklei jew ċelloli. Mudell TUNEL strettament apoptotiku huwa frammentazzjoni nukleari bħala riżultat tal-formazzjoni ta 'korpi apoptotiċi (Figura 3E). Frammenti żgħar ta 'nuklei pożittivi għal TUNEL, li x'aktarx huma korpi apoptotiċi, dehru f'iskemija-riperfużjoni tal-firien f'24-72 siegħa [97]. Korpi apoptotiċi dehru wkoll b'tikkettjar TUNEL ta 'nuklei fl-epitelju tubulari renali u l-interstizju 14-il jum wara korriment ta' iskemija-riperfużjoni fil-firien [141]. Żieda fid-dożi ta 'żejt tal-lavanda naqqsu l-mudelli ta' TUNEL tan-nuklei biss u kkonvertituhom għal TUNEL bħal nekrożi bi tnixxija ċitoplasmika [94]. Dan tal-aħħar kien riżultat ta 'qerda tal-pakkett nukleari minħabba l-azzjoni ta' proteinases u lipases fin-nekrożi. TUNEL ċitoplasmika (Figura 3F) dehru bħala ċitoplasma pożittiva għal TUNEL kienet osservata f'mikroskopija tad-dawl fil-mudell rabdomijoliżi f'tubuli tal-firien [142] u f'podoċiti kkultivati ​​fil-preżenza ta 'glukożju għoli u f'nefropatija dijabetika fil-ġrieden [135]. TUNEL ċitoplasmika ġie deskritt ukoll f'iskemija-riperfużjoni renali fil-ġrieden bl-użu ta 'FL fluworexxenti TUNEL [98] u f'iskemija-riperfużjoni fil-firien bl-użu ta' mikroskopija tad-dawl [143]. Ħsara profonda u esklussivament tubulari indotta mill-klorur merkuriku bi tbajja qawwija ta 'TUNEL ċitoplasmika indikattiva ta' ħsara fil-membrana nukleari [60]. Jekk il-ħsara tkompli jew id-doża ta 'l-aġent ta' ħsara tiżdied, TUNEL ċitoplasmiku jista 'jiġi kkonvertit għal stampa "messy" ta' TUNEL imxerred (Figura 3G) attribwit għal stadji tard ta 'qerda taċ-ċelluli minħabba nekrożi u tixrid ta' ċitoplasma ċellulari u debris. Pereżempju, kemm TUNEL ċitoplasmiku kif ukoll imxerred kien osservat fi ġrieden ittrattati b'cisplatin [71,72] u firien [144], u f'korriment ta 'podocyte fi firien dijabetiċi indotti minn streptozotocin [145]. TUNEL nekrotiku mxerred kien osservat ukoll waqt nefrotossiċità indotta mill-uranyl acetate fil-ġrieden [101]. Fl-aħħar nett, varjabbli ieħor tas-sinjal TUNEL li għandha tingħata attenzjoni għaliha hija l-intensità tas-sinjali pożittivi għal TUNEL, li jistgħu jiddevjaw minn ċellula għal ċellula skont in-numru ta’ waqfiet (grad ta’ korriment) li kull ċellula tesperjenza, kif iddokumentat minn xi studji [45,96,125. ]. Għal mudelli li fihom tiġi osservata intensità tas-sinjal TUNEL li tvarja, il-kwantifikazzjoni kemm bin-numru ta 'oġġetti pożittivi għal TUNEL kif ukoll l-intensità medja tat-tbajja' hija rakkomandata.

Konklużjonijiet

Minħabba l-attività għolja ta’ endonucleases apoptotiċi fil-kliewi, partikolarment DNase I u EndoG, l-użu ta’ TUNEL għalriċerka u dijanjosi tal-kliewihija informattiva ħafna. Jista' jsir saħansitra aktar utli jekk TUNEL jiġi applikat lil hinn mill-użu inizjali tiegħu bħala metodu biex tiġi identifikata l-apoptożi. L-applikazzjoni ta' TUNEL esklussivament għal studji dwar l-apoptosi hija eżempju tajjeb ta' kif ix-xjenza tista' tiġi indirizzata ħażin b'mod involontarju b'metodu użat b'mod mhux xieraq. Minkejja l-użu tiegħu bħala analiżi ta 'korriment l-aktar akut, TUNEL jista' jiġi applikat b'suċċess biex jevalwa kemm AKI kif ukoll CKD. Madankollu, f'CKD, il-grad ta' TUNEL-pożittività għandu jkun mistenni li jkun aktar baxx milli f'korriment akut. Minħabba li l-attività ta 'endonucleases (prinċipalment, DNase I) hija ħafna ogħla fl-epitelju tubulari milli f'kompartimenti oħra tal-kliewi, il-ħsara fit-tubuli tal-kliewi ġeneralment titqies bħala aktar prominenti. Madankollu, il-korrimenti glomerulari jew vaskulari jistgħu jiġu studjati wkoll bl-użu ta 'TUNEL jekk il-korriment fil-fatt iseħħ f'dawn il-kompartimenti. Il-kolokazzjoni ta' FL TUNEL fluworexxenti b'markaturi IHC tippermetti l-identifikazzjoni u l-assoċjazzjoni ta 'tipi ta' ċelluli u mekkaniżmi ta 'mewt taċ-ċelluli b'sinjali TUNEL. Il-kwantifikazzjoni ta 'TUNEL tista' tikkontribwixxi informazzjoni siewja dwar il-grad ta 'mewt taċ-ċelluli, u l-applikazzjoni ta' softwer ta 'analiżi tal-immaġni tista' tkun utli ħafna f'dan ir-rigward. Meta wieħed iqis il-varjetà ta 'mudelli TUNEL, immaġini rappreżentattivi huma ssuġġeriti bil-qawwa biex jistabbilixxu u juru

Sinjali TUNEL li huma kkunsidrati pożittivi. Fl-aħħarnett, il-mudelli TUNEL għandhom jintużaw bħala sors ta 'informazzjoni addizzjonali, bħall-mekkaniżmu tal-mewt taċ-ċelluli u l-grad ta' tossiċità. Pereżempju, id-distinzjoni bejn korpi apoptotiċi pożittivi għal TUNEL, il-preżenza ta 'sinjali TUNEL ċitoplasmiċi, jew mudelli mxerrda ta' TUNEL tista 'tgħin biex jiġu identifikati ċelluli pożittivi għal TUNEL apoptotiċi vs.

trattament tad-disturb tal-kliewi ta' tqanqil sesswali